CN117777288A - 抗密蛋白18.2的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗‑CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及编码所述抗‑CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、载体、宿主细胞和制备方法，以及用于诊断、预防和/或治疗与CLDN18.2相关的肿瘤的药物组合物和用途。

Description

抗密蛋白18.2的抗体
技术领域
本发明属于肿瘤免疫领域，更具体地，本发明涉及抗密蛋白18.2的抗体及其肿瘤免疫领域应用。
背景技术
基于单克隆抗体的免疫疗法现在已经是肿瘤治疗的主要组成部分，与手术、放射和化学疗法并驾齐驱。单克隆抗体具有多种临床相关的作用机制，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，以及直接受体或配体阻断。此外，抗体可以同时促进长效抗肿瘤免疫反应的诱导(Welschof&Krauss，2003)。抗体作为治疗平台的多方面特性导致了新的癌症治疗策略的发展，这将对癌症治疗产生重大影响。
胃癌是起源于粘膜上皮的恶性肿瘤，是全世界范围内发病率最高的癌症之一。据世界卫生组织癌控项目的统计数据，全球每年死于癌症的患者高达700万，其中死于胃癌的患者占了70万例。相比于常规的胃癌治疗方案，如手术治疗、化疗等，肿瘤免疫疗法具有高特异性和低副作用特点，具有更深远的应用前景(Yasui et al.，2011)。
密蛋白18(Claudin-18，基因CLDN18)是位于上皮和内皮的紧密连接中的内在膜蛋白，其具有四个跨膜疏水区和两个胞外环，分子量约为27.9KD(Krause et al.，2008)。Claudin-18以两种不同剪接体存在：Claudin-18.1(基因CLDN18.1)和Claudin-18.2(基因CLDN18.2)。Claudin-18.1在正常肺或胃的细胞中选择性表达，而Claudin-18.2正常情况下仅在胃的已分化的胃上皮短周期细胞中表达，但是在多种肿瘤组织中高表达，如胃癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、胰腺癌、食管癌、支气管癌、乳腺癌等。Claudin-18.2在正常细胞和肿瘤细胞中的差异表达，使其成为癌症免疫治疗的具有吸引力的靶标。
第一个针对Claudin18.2靶点开发的药物是GANYMED Pharmaceuticals公司的Zolbetuximab(IMAB362)，这是一种并没有进行人源化的嵌合抗体，目前已进入临床阶段(Sahin et a1.，2018；Woll et al.，2014)。开发更高特异性结合Claudin-18.2而不结合Claudin-18.1，且具有低免疫原性的抗体对上述癌症的治疗和检测具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，获得特异性结合CLDN18.2，而不结合CLDN18.1，且亲和力高、低免疫原性，并且具有良好的临床前景的抗体。
针对上述技术问题，本发明的提供一种抗CLDN18.2的抗体或抗体片段，并基于该抗体或其片段，提供其用途。
第一方面，本发明提供了一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含：
具有如下三个重链互补决定区的重链可变区：SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的HC-CDR2，和包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的HC-CDR3；和具有如下三个轻链互补决定区的轻链可变区：SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的LC-CDR2，和SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗-CLDN18.2抗体可以是人源化的抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：所述轻链可变区包含选自对应于23L、54I、59A和116S的一个或多个氨基酸；和/或所述重链可变区包含选自对应于181W、201N、218K、245G/S和250F的一个或多个氨基酸，其中所述氨基酸参考图4编号。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：所述轻链可变区包含对应于23L、54I、59A、116S、23L/59A、23L/116S、59A/116S或23L/59A/116S的氨基酸；和/或所述重链可变区包含对应于181W、201N、218K、245G、245S、250F、181W/250F或201N/245S的氨基酸，其中所述氨基酸参考图4编号。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：所述轻链可变区包含对应于23L、59A、23L/59A、23L/116S、59A/116S或23L/59A/116S的氨基酸；和/或所述重链可变区包含对应于201N、218K、245G、245S、250F，或201N/245S的氨基酸，其中所述氨基酸参考图4编号。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含对应于23L和116S的氨基酸，并且所述重链可变区包含对应于218K的氨基酸，其中所述氨基酸参考图4编号。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：4、16、35-40、43和46中所示的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：3、14、31-34、41、42、44和45中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：包含选自SEQ ID NO：19、22和26中所示的氨基酸序列的重链；和/或包含选自SEQ ID NO：18、20和24中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自：Fab、Fab′、F(ab′)2、双抗体、Fd和Fd′片段。
在本发明的第二方面，提供了编码本发明的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：11、12、15、17、21、23、25和27中所示的核苷酸序列。
在进一步的方面，本发明提供了包含本发明第二方面的多核苷酸的载体，并且进一步提供了包含本发明第二方面的多核苷酸，或者包含本发明所述的载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。优选地，所述宿主细胞选自CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞，例如HEK 293细胞。
在进一步的方面，本发明提供了用于产生本发明的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：培养根据本发明所述的细胞；和从培养物回收所述抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
在进一步的方面，本发明提供了用于诊断、预防和/或治疗与CLDN18.2相关的肿瘤的组合物，其包含根据本发明所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段、多核苷酸或载体。
在进一步的方面，本发明提供了本发明所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗与CLDN18.2相关的肿瘤的组合物中的用途。
在一些实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、胰腺癌、食管癌、支气管癌和乳腺癌。
本发明的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段显示CLDN18.2具有高亲和力和特异性，可以有效地结合具有相对低密度的CLDN18.2表达丰度的靶细胞。进一步地，本发明的人源化抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段还显示显著增强的整体免疫活性，包括内吞活性、CDC活性、ADCC活性和ADCP吞噬作用。
定义
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
本文提供的是特异性结合CLDN18.2的抗体(例如，单克隆抗体)及其抗原结合片段。在具体的方面，本文提供的是特异性结合CLDN18.2的单克隆抗CLDN18.2抗体，其中所述抗CLDN18.2抗体包括亲本抗体的变体。在具体的方面，本文提供的是特异性结合CLDN18.2(例如，人CLDN18.2)的抗体。术语“CLDN18.2”是指本领域技术人员已知的任何CLDN18.2膜蛋白。例如所述CLDN18.2可以来自哺乳动物，例如CLDN18.2可以来自人或食蟹猴。
如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
在本文中，氨基酸的三字母或单字母缩写已以其常规含义使用，如下表中所示：
氨基酸 三字母代码 单字母代码
甘氨酸 Gly G
脯氨酸 Pro P
丙氨酸 Ala A
缬氨酸 Val V
亮氨酸 Leu L
异亮氨酸 Ile I
甲硫氨酸 Met M
半胱氨酸 Cys C
苯丙氨酸 Phe F
酪氨酸 Tyr Y
色氨酸 Trp W
组氨酸 His H
赖氨酸 Lys K
精氨酸 Arg R
谷氨酰胺 Gin Q
天冬酰胺 Asn N
谷氨酸 Glu E
天冬氨酸 Asp D
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
。
在本说明书中采用数字与单字母缩写的形式表示氨基酸序列中的氨基酸残基，其中所述数字表示所指的氨基酸残基在氨基酸序列中的位置，数字左侧的字母表示取代之前的氨基酸，数字右侧的字母取代后的不同氨基酸。例如，所述氨基酸取代“M23L”是指其中在氨基酸序列的位置23处的甲硫氨酸替换为亮氨酸。在缺少左侧字母的情况下，表示在所指示的氨基酸序列位置的具体氨基酸。例如，对应于“245G/S”的氨基酸是指其中在氨基酸序列的位置245处的氨基酸为甘氨酸或丝氨酸。
就抗体的可变结构域而言，术语“可变”系指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些部分，且被用于针对其特异靶的特定抗体的特异识别和结合。可变性集中在被称为互补决定区域(CDRs；即CDR1、CDR2和CDR3)或超变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变结构域内。可变结构域内保守程度更高的部分被称为框架(FR)区或框架序列。天然重链和轻链的每个可变结构域均包括四个框架区，其主要采用β-折叠构型，它们由三个CDRs连接起来形成环，有助于抗体靶结合位点(表位或决定簇)的形成(参见Kabat等人(Kabat，1991))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号***而进行的，除非另有说明。一个CDR可具有特异结合关联表位的能力。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、双抗体、Fd和Fd′片段以及其他片段，包括修饰的片段(Welschof&Krauss，2003)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被***抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗原的抗体。
“功能片段”或“抗CLDN18.2抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段”含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab′)2等等。“Fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用，以确定VH-VL二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个CDRs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的CDRs的Fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本公开所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
如本文所用，术语“CDR”指互补决定区(complementarity-determining region)，已知抗体分子的每个重链和轻链具有3个CDR。CDR也称作高变区，且存在于抗体的每个重链和轻链的可变区中，在CDR的一级结构中具有非常高的变异性位点。本说明书中，重链的CDR由来自重链的氨基端序列的氨基端的CDR1、CDR2、CDR3表示，轻链的CDR由来自轻链的氨基端序列的氨基端的CDR1、CDR2、CDR3表示。这些位点在三级结构中彼此临近，并决定抗体所结合的抗原的特异性。
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×107M-1或1x108M-1或更大的亲和常数Ka(或者1x10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”可互换使用，指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞***时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“诊断”是指评估个体患有疾病或病症或处于发展疾病或病症的风险的可能性。特别地，如本领域技术人员将理解的，这种评估虽然优选对于100％的待诊断受试者都是正确的，但通常并非如此。在一个实施方案中，所述术语要求统计学上显著部分的受试者可以被鉴定为患有疾病或具有其易感体质。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。如本文所用，“预防”指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1表示了本发明的杂交瘤克隆上清与hCLDN18.2和hCLDN18.1的结合活性，其中：
A)本发明的杂交瘤克隆6H5D5与HEK293-hCLDN18.2的结合活性；
B)本发明的杂交瘤克隆D11与HEK293-hCLDN18.2的结合活性。
图2表示了本发明的D11嵌合抗体425和已报道抗体(224、224-1和435)与CLDN18.2的结合活性比较。
图3表示了本发明的D11人源化抗体432与HEK293/203 B3细胞的结合活性。
图4表示了本发明的D11人源化过程中氨基酸突变的位置。
图5表示了本发明的不同突变体克隆和CLDN18.2的结合活性。
图6表示了hCLDN18.2和hCLDN18.1第一个胞外环氨基酸的比对，以及突变位置P1到P8。
图7显示了不同工程细胞系的人CLDN18.2表达强度的比较。
图8表示了本发明的432-M147-全抗与不同人CLDN18.2过表达细胞系结合能力的比较，其中：
A)为CT26-hCLDN18.2细胞；
B)为MC38-hCLDN18.2-C4细胞；
C)为293T-hCLDN18.2细胞；
D)为MC38-hCLDN18.2-A11细胞；
E)为KATOIII-hCLDN18.2细胞。
图9表示了本发明的432-M147全抗与人CLDN18.1的交叉结合活性。
图10表示了本发明的432-M147全抗与小鼠CLDN18.2的交叉结合活性。
图11表示了本发明的432-M147全抗的内吞活性。
图12表示了本发明的432-M147全抗的CDC活性。
图13表示了本发明的432-M147全抗在ADCC报告细胞系活性，其中：
A)MC38-hCLDN18.2-A11为靶细胞；
B)KATOIII-hCLDN18.2为靶细胞。
图14表示了本发明的432-M147基于原代NK细胞介导的ADCC活性。
图15表示了本发明的432-M147基于原代BMDM细胞介导的ADCP活性。
具体实施方式
实施例1：产生针对CLDN18.2的小鼠抗体及表征
用稳定表达人CLDN18.2(SEQ ID NO 2)的HEK293(B3)细胞免疫6-8周龄的Balb/c小鼠。具体来说，在第一天，用2x10^6个HEK293细胞，采用腹腔注射的方式预免疫小鼠，接着在第二天和第三天，分别用200mg/kg的环磷酰胺腹腔注射小鼠，抑制小鼠抗HEK293免疫。然后分别在第14、15、29、30、64、65天，用2x10^6个B3细胞，腹腔注射免疫小鼠。最后在第88大的时候，用3x10^6个B3细胞，腹腔注射的方式免疫小鼠。在第91天，取小鼠脾脏进行细胞融合实验。
用免疫后的小鼠脾脏，使用杂交瘤技术和基于细胞的ELISA测定，获得结合B3但不结合HEK293亲本细胞的杂交瘤。通过单细胞克隆和流式细胞术比较杂交瘤细胞培养上清与B3细胞、表达人CLDN-18.1(SEQ ID NO：1)的HEK293(HEK293/202)的细胞以及HEK293亲本细胞的结合力，选择CLDN18.2单克隆杂交瘤，例如，杂交瘤6H5D5和D11，其结果分别如图1A和图1B所示。
用D11的杂交瘤细胞株，按照RNA提取说明书要求，从细胞沉淀中提取总RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，使用PCR扩增抗体VL和VH区。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化回收DNA片段，克隆到TA载体中。然后对片段进行测序以获得D11 VL(SEQ ID NO：3)和D11 VH(SEQ ID NO：4)序列。
最终确定的D11的3个轻链CDR序列：LCDR1(SEQ ID NO：5)，LCDR2：WAS(SEQ ID NO：6)，和LCDR3(SEQ ID NO：7)；3个重链CDR序列：HCDR1(SEQ ID NO：8)，HCDR2(SEQ ID NO：9)，和HCDR3(SEQ ID NO：10)。
实施例2：抗CLDN18.2抗体的构建及其在真核细胞中的表达采用同源重组的方法将D11的VL(SEQ ID NO：3)和VH(SEQ ID NO：4)构建到包含hIgG1Fc的载体上，这样就得到了表达抗CLDN18.2的嵌合抗体425。根据已知嵌合抗体ch-163E12(WO2014/146778A1)、ch-175D10(WO2014/146778A1)和ch-CL-1(WO2020/025792A1)，同样采用同源重组的方法分别得到质粒224(163E12)、224-1(175D10，Zolbetuximab(IMAB362))、和435(CL-1))。接着通过转染试剂PEI将这些质粒转导到293T细胞中，64h后收集上清，用Protein A纯化上述抗体。参照实施例1，得到对应融合抗体224、224-1、和435，用表达人CLDN18.2的细胞B3检测这些融合抗体的相对亲和力。如图2所示，425的EC50为0.29nM，而已知嵌合抗体224、224-1、和435的EC50值分别为47.52nM、1.99nM、和1.78nM，表明D11嵌合抗体与人CLDN18.2有较强的亲和力。
实施例3：D11的人源化抗体的制备
为获得最初的VL和VH人源化框架序列，本发明人分别用D11 VL和D11 VH已知抗体数据库搜索和序列比对(http：//www.imgt.org DomainGapAlign)，选取IMGT数据库中GKV4-1*01作为人源化抗体轻链的模板，IGHV4-59*01作为人源化抗体重链的抗体模板。将425的轻链和重链CDR区替换掉抗体模板的CDR区，然后根据同源重组说明书要求，将其同源重组到质粒210HindIII/XhoI位点，得到质粒432(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17)。如图3所示，人源化抗体432与HEK293/203B3细胞的结合相对亲和力EC50为11.95nM。与EC50为0.29nM的425相比，432与CLDN18.2亲和力较低(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16)。
实施例4：人源化抗体432的变体的制备
由于种属间的差异，人源化的过程往往会导致人源化抗体亲和力的降低。为了提高CLDN18.2结合亲和力，本发明人以432为模板进行定点突变。首先参照Williams D.G等人的描述(Lo，2004)，在432VL和VH区域中确定了9个氨基酸，它们与亲本相应位置的保守氨基酸不一致或是修饰热点(图4)。这些位置的保守氨基酸可能在VL和VH结构和功能中具有重要作用。例如，亲本序列中第2位的疏水性氨基酸和第7位的带正电荷的K对于稳定抗体环(loop)结构至关重要。位置4和8的S和位置9的F可能参与VL和VH相互作用。位置3的A和位置5的W可能参与氢键。这些保守氨基酸的突变将导致亲和力的改变。D在位置6后跟一个G创造一个潜在的D异构化位点DG.。位置1的M有潜在的容易被氧化的可能性。这些氨基酸的突变将可以提高蛋白产量、稳定性和成药性，降低抗体碎片化和异构化的潜在风险。接着采用点突变试剂盒，对人源化抗体432进行定点突变，得到了人源化抗体432的单位点突变体：432-M1、432-M2b、432-M3、432-M4、432-M5、432-M6、432-M7、432-M8b、432-M8c、432-M9、和多位点突变体432-M13、432-M14、432-M34、432-M134、432-M147、432-M59、432-M68c。
参照实施例1，采用Protein A纯化这些人源化抗体，并用B3细胞检测它们与人CLDN18.2的亲和力。如表1所示，432-M2b(Q54I)、432-M5(V181W)、432-M6(D201N)和432-M59(V181W和S250F)在293T中不能表达，突变体可能影响了抗体结构和稳定性。因此在这项研究中没有对他们进行进一步的测试。其他突变体和人CLDN18.2亲和力测定结果示于图5和表1。所获得的的人源化抗体的变体与CLDN18.2的亲和力都高于或接近432(图5)。总之，通过亲和力成熟，不仅提高了人源化抗体的亲和力，而且增加了抗体的稳定性和成药性。
表1：不同432突变体的总结
抗体 突变位点 氨基酸序列 EC50(nM)
432 WT SEQ ID NO：14/16 12
432-M1 M23L SEQ ID NO：31/16 3.7
432-M2b Q54I SEQ ID NO：32/16 /
432-M3 T59A SEQ ID NO：33/16 64
432-M4 N116S SEQ ID NO：34/16 3.0
432-M5 V181W SEQ ID NO：35/14 /
432-M6 D201N SEQ ID NO：36/14 /
432-M7 V218K SEQ ID NO：37/14 1.9
432-M8b P245G SEQ ID NO：38/14 7.5
432-M8c P245S SEQ ID NO：39/14 86
432-M9 S250F SEQ ID NO：40/14 5.8
432-M13 M23L和T59A SEQ ID NO：41/16 3.2
432-M14 M23L和N116S SEQ ID NO：42/16 2.8
432-M34 T59A和N116S SEQ ID NO：44/16 3.7
432-M134 M23L、T59A和N116S SEQ ID NO：45/16 8.4
432-M147 M23L、N116S和V218K SEQ ID NO：24/26 28
432-M59 V181W和S250F SEQ ID NO：43/14 /
432-M68c D201N和P245S SEQ ID NO：46/14 14.9
。
实施例5：单克隆抗体的表位定位(Epitope mapping)
抗体发挥功能很大程度取决于其与靶抗原结合的表位。表位是抗原的一部分，与抗体的可变区结合；抗体与不同表位结合可能产生不同的功能，这些功能可能表现为抑制活性或激活某个信号等，抗原表位定位显得尤为重要。在前文提到，CLDN18.1和CLDN18.2是两种不同的剪切突变体，它们在不同细胞中表达有明显差异。在肿瘤细胞，CLDN18.2蛋白高表达，而CLDN18.1不表达。如上所述，425和人源化融合抗体432特异性结合表达人Cludin18.2的HEK-293T细胞，但不结合表达CLDN-18.1的细胞。CLDN-18.1与CLDN18.2结构极为相似，但胞外结构域ECD1上有8个氨基酸残基的差异(图6)。因此本发明采用定点突变的方法，将质粒203CLDN18.2蛋白8个氨基酸突变成CLDN-18.1对应位置的氨基酸，得到了8个质粒P1(Q29M)、P2(N37D)、P3(A42S)、P4(N45Q)、P5(Q47E)、P6(E56Q)、P7(G65P)和P8(L69I)。将这些质粒转到HEK293T。此后，表达CLDN-18.1和野生型或突变型CLDN-18.2的HEK-293T细胞用于融合抗体结合测定。
如表2所示，224-1、435、425，432和432-突变体都与表达CLDN18.2的HEK-293T(203)特异性结合，而它们不与表达CLDN-18.1的HEK-293T(202)或亲本HEK-293T结合。氨基酸突变在P1、P2、P5、P7和P8不影响它们的结合，表明这些CLDN-18.2位置的氨基酸不参与抗体结合。相反，基酸突变在P4和P6完全消除了与所有测试抗体的结合。因此，CLDN18.2的氨基酸在CLDN18.2 P4(N45)和P6(E56)是抗CLDN18.2抗体特异性相互作用的关键表位氨基酸。在这里，本发明人表明除了氨基酸在P4和P6，P3上的氨基酸也是224-1(IMAB362)结合的关键位点。另一种已知的融合抗体435(CL-1)和本发明的单克隆抗体425的结合不受CLDN18.2 P3位置突变的影响。然而，D11和其人源化抗体及其突变体展示CLDN18.2 P3不同的灵敏度：432，432-M8c，和432-M9结合力下降；432-M8b完全失去结合力。由此可知，P3(A42)突变位点对不同的CLDN18.2单克隆抗体的影响不一样，表明该位置可能在稳定的抗体结构中发挥作用。
表2：432、432突变体及对照抗体与CLDN18.2不同表位结合比较
实施例6：人源化全抗432-M147的制备
分别在432-M147的VL和VH的可变区序列的N端引入含有分泌信号的信号肽(SP2，SEQ ID NO：30)，同时采用同源重组的方法将SP2-LC构建到含有轻链恒定区片段的质粒pCDNA3.4上，这样就得到了432-M147抗体的轻链432-M147-LC(SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25)，同样采用同源重组的方法得到432-M147的重链432-M147-HC(SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：27)。接着通过转染试剂PEI将这些质粒转到293T细胞中，5天后收集上清，用Protein A纯化上述IgG1抗体。
实施例7：432-M147抗体与人CLDN18.2结合的FACS检测
为了研究432-M147全抗的活性，本发明人比较了5株不同基因工程改造的细胞系包括过表达人的CLDN18.2(后续以hCLDN18.2表示)工程细胞系CT26-hCLDN18.2(由本公司构建)、MC38-hCLDN18.2-C4(由本公司构建)、MC38-hCLDN18.2-A11(由本公司构建)和KATOIII-hCLDN18.2(细胞编号KC-1453，购自康源博创生物科技(北京)有限公司)和293T-hCLDN18.2细胞(细胞编号-KC-0986购自康源博创生物科技(北京)有限公司)等5株细胞其膜表面CLDN18.2表达量的差异，本发明人用6.67nM-的432-M147抗体与8x10^4个上述不同的细胞进行孵育，加入1∶100的稀释的PE标记的二抗(PE抗-人IgG Fc抗体，Biolegend)染色液，在实验组、二抗对照组中加入100μL二抗染色液，空白对照孔加入等体积的流式缓冲液；混匀后，放于4℃避光孵育1小时；使用流式缓冲液洗涤细胞2次，每次200μL，1500r/min速度下，离心4分钟。最后100μL体系重悬，用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测PE信的平均荧光强度，实验结果见图7和表3。结果显示这5株细胞系膜表面CLDN18.2蛋白的表达水平从低到高排序为CT26-hCLDN18.2＜MC38-hCLDN18.2-C4＜293T-hCLDN18.2＜KATOIII-hCLDN18.2＜MC38-hCLDN18.2-A11。
表3：不同工程细胞系人CLDN18.2表达量的比较
细胞系 MFI
CT26-hCLDN18.2 10995
MC38-hCLDN18.2-C4 37452
293T-hCLDN18.2 384124
MC38-hCLDN18.2-A11 589028
KATOIII-hCLDN18.2 589410
。
接下来，本发明人利用这些携带不同膜表面CLDN18.2分子密度的细胞系对432-M147和参照抗体Zolbetuximab进行全面的结合活性检测，实验步骤如上所述，不同之处在于432-M147抗体的浓度从667nM起始，316倍稀释8个浓度，阴性对照为hIgG1和空白二抗对照。
用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测PE的信号，使用GraphPad Prism7.0软件分析数据，利用非线性S曲线四参数拟合回归来拟合数据得出剂量-效应曲线：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))，其中Bottom表示荧光信号下限值，代表S曲线的下渐进线，Top表示荧光信号的上限值，代表着S曲线的上渐近线。EC50为荧光信号增长速度开始发生变化的浓度值，即半效反应浓度(EC50)，并由此计算EC50值。HillSlope为吸光度增加速率参数，相当于曲线的斜率，并由此计算IC50值。
实验结果见图8A-8E，和表4(亲和力EC50的倍数差异由参照抗体ZolbetuximabEC50/432-M147抗体EC50计算得出；最大结合英冠强调Emax(MFI)倍数差役由432-M147抗体Emax MFI/参照抗体Zolbetuximab Emax MFI计算得出)。
表4：432-M147在不同人CLDN18.2抗原强度细胞系的结合活性总结
在人CLDN18.2荧光强度最低的细胞CT26-hCLDN18.2中，如图8A所示，432-M147显示明显的亲和力优势，虽然没有得到有效的EC50，但是本发明人看到432-M147的结合活性显示浓度梯度依赖的升高，而参照抗体Zolbetuximab在低抗原密度的情况下，完全没有结合活性。
在低抗原密度的细胞MC38-hCLDN18.2-C4中，如图8B所示，432-M147和Zolbetuximab结合活性EC50分别为4.7nM和17.8nM，亲和力相差3.8倍；432-M147的最大结合荧光强度Emax较参照抗体提高了6.7倍。
在中等抗原密度的细胞293T-hCLDN18.2中，如图8C所示，432-M147和参照抗体Zolbetuximab结合活性的EC50分别为6.0nM和12nM，实验结果显示432-M147在293T-hCLDN18.2细胞中结合活性增强了2倍，432-M147的最大结合荧光强度Emax较参照抗体提高了2.6倍。
在高抗原密度的细胞MC38-hCLDN18.2-A11中，如图8D所示，432-M147和Zolbetuximab结合活性EC50分别为8.2nM和57.8nM，亲和力提高了7倍，432-M147的最大结合荧光强度Emax较参照抗体提高了6.5倍；另一株高抗原密度的细胞KATOIII-hCLDN18.2中，如图8E所示，432-M147和Zolbetuximab结合活性EC50分别为5.7nM和9.7nM，亲和力相差1.7倍，432-M147的最大结合荧光强度Emax较参照抗体提高了2.6倍。
综上，本发明中的432-M147抗体较参照抗体Zolbetuximab在不同抗原表达强度的细胞系上都有显著的亲和力提升，尤其是在低抗原丰度的情况下，由于CLDN18.2肿瘤抗原在肿瘤表达中的异质性，432-M147在CLDN18.2低抗原丰度下的高亲和力结合表明，该抗体与参照抗体相比，可以用于CLDN18.2肿瘤抗原低表达患者的治疗，将为其中后续的应用中提供重要的理论依据。
实施例8：432-M147抗体与人CLDN18.1结合的FACS检测
CLDN18.1和CLDN18.2同属于CLDN18家族，序列同源性约92％(240/261)，仅在N端第一个跨膜区存在21个氨基酸差异(Sahin et al.，2008)，为了进一步研究432-M147抗体的特异性，本发明人测试了432-M147抗体与人的CLDN18.1抗原的结合活性，实验方法参考实施例5，不同之处是所用细胞为工程化改造的高表达人CLDN18.1(后续以hCLDN18.1表示)蛋白的细胞系293T-hCLDN18.1细胞(购买自康源博创，细胞编号-KC-0990)，使用GraphPadPrism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值，实验结果见图9。如图所示，432-M147和参照抗体Zolbetuximab在浓度高达667nM的处理条件下，没有与人CLDN18.1抗原的交叉结合活性，提示432-M147具有很高的特异性。
实施例9：432-M147抗体与小鼠CLDN18.2结合的FACS检测
随后，本发明人验证了432-M147交叉识别鼠源CLDN18.2抗原的交叉识别活性，交叉识别活性将极大的方便动物药效评价。交叉识别实验方法参考实施例5，不同之处是所用细胞为工程化改造的过表达小鼠CLDN18.2(后续以mCLDN18.2表示)的细胞293T-mCLDN18.2(购买自康源博创，细胞编号-KC-1014)，使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值，实验结果见图10和表5。
表5：432-M147抗体与小鼠CLDN18.2结合活性总结
交叉识别的实验结果显示：432-M147和参照抗体Zolbetuximab均具有交叉识别小鼠CLDN18.2的能力，EC50分别为5.3nM和18.7nM，432-M147结合小鼠CLDN18.2的亲和力比参照抗体Zolbetuximab提高了3.5倍。
实施例10：抗体的内吞实验
受体介导的内吞是很多膜蛋白介导抗体以及抗体偶联药物进入细胞重要的途径，因此本发明人评价了432-M147的内吞活性。收集对数生长期的MC-38-hCLDN18.2-A11细胞，1000rpm/min速度下离心5分钟后弃上清，使用PBS洗涤细胞一次，使用流式缓冲液重悬细胞计数，调整密度为5×10^6个细胞/mL加到流式管中，加入测试抗体，工作终浓度为66.7nM，置于4℃避光孵育1小时，使用预冷的流式缓冲液洗涤细胞2次，并用100μL洗液重悬细胞后加入2μL的PE标记的二抗(PE抗人IgG Fc抗体)，置于4℃避光孵育40分钟，使用预冷的流式缓冲液洗涤细胞2次，并用100μL洗液重悬于200μL完全培养基(DMEM+10％FBS)，分别0小时，1小时，1.5小时，2小时放置于在37℃孵箱中培养2小时，1小时，0.5小时，0小时。解离：流式缓冲液洗涤细胞1次，使用200ul的解离缓冲液重悬细胞，室温孵育7min。中和：加入中和缓冲液离心，最后使用100μL流式缓冲液重悬细胞。用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测PE的信号。实验结果见图11和表6(倍数差异由各时间点432-M147的内吞率/参照抗体Zolbetuximab的内吞率计算得来)。
表6：432-M147抗体的内吞活性总结
实验结果显示，与参照抗体Zolbetuximab相比，432-M147显示出显著的内吞增强活性，2小时后的内吞率高达98.3％，而Zolbetuximab只有32.5％，内吞率提高了3倍。
实施例11：432-M147抗体的CDC活性检测
补体依赖的细胞毒性作用(CDC)很多抗体引起肿瘤杀伤的作用机制，当抗体的Fab端与抗原结合后，抗体Fc端与血清中的补体C1q结合，激活补体***形成攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应，因此，本发明人进一步比较了432-M147和参照抗体Zolbetuximab的CDC活性。将KATOIII-hCLDN18.2(购自康源博创，细胞编号-KC-1453)细胞离心计数，以每孔1*10^5个细胞接种到U形底96孔板，加入待测抗体后分别加入56℃30min灭活的人AB血清和非灭活人AB血清，37℃孵育4h，用流式缓冲液清洗细胞两遍，每孔加入100μL含1μL 7-AAD(559925，BD)的PBS溶液染色，室温避光孵育10分钟，用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测靶细胞的活性。使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值。实验结果见图12和表7。
表7：432-M147抗体的CDC活性总结
结果显示432-M147抗体具有较强的CDC活性，EC50为14.7nM，而参照抗体Zolbetuximab在最高浓度667nM处理条件下，没有CDC的活性。因此，较参照抗体，432-M147可通过抗体介导的补体杀伤介导CLDN18.2抗原阳性的肿瘤细胞杀伤，显示出其优于参照抗体的临床应用价值。
实施案12：432-M147抗体的ADCC报告细胞系活性检测
抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是许多抗体药物杀伤肿瘤细胞的主要作用机制。FcγRIIIA(CD16a)可以介导NK细胞对肿瘤细胞的ADCC作用，在此利用Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-V15(由康源博创公司构建)作为替代的效应细胞分别与两种过表达人的CLDN18.2的靶细胞MC38/203-A11，KATO III CLDN18.2(细胞购白康源博创，细胞编号KC-1453)以效靶比为1∶1的比例共同孵育，此效应细胞的胞外区过表达高亲和力FcγRIIIACD16a-V158，与靶细胞和不同浓度的测试抗体(133.4nM起始，5倍稀释，9个浓度点)共孵育，抗体Fc端结合胞外区高亲和力CD16a-V158激活NFAT-luc2荧光素酶报告***，通过Plus多功能酶标仪(BMG LABTECH)检测荧光素酶的含量可以检测抗体的ADCC活性的情况。使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值。实验结果见图13A-13B和表8。
表8：432-M147抗体的ADCC报告细胞系活性总结
Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-V158报告细胞系荧光信号显示，432-M147抗体和参照抗体Zolbetuximab在在高密度的细胞系MC38-hCLDN18.2-A11，432-M147的ADCC活性明显优于参照抗体Zolbetuximab，EC50分别为0.08nM和1.8nM，在另一株高密度细胞系KATOIII-hCLDN18.2中，432-M147的ADCC活性也明显优于参照抗体Zolbetuximab，EC50分别为0.03nM和2nM，在两种细胞系中，432-M147的ADCC活性较参照抗体Zolbetuximab分别提高了22.5倍和66.7倍，表明432-M147的ADCC活性显著提高。
因此，较参照抗体，432-M147可通过抗体介导的补体杀伤途径和抗体介导的细胞毒作用杀伤CLDN18.2抗原阳性的肿瘤细胞，显示出其优于参照抗体的临床应用价值。
实施案13：432-M147抗体的ADCC活性检测
在体内，ADCC是由抗体的Fab端结合肿瘤细胞的抗原表位，其Fc端与自然杀伤细胞(NK细胞)表面的FCγR结合，NK细胞活化释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质，介导NK细胞杀伤靶细胞致使靶细胞凋亡。本实验中，本发明人利用外周血单核细胞PBMC来源的原代NK细胞作为效应细胞，用293T-hCLDN18.2作为靶细胞建立共培养***，在体外模拟ADCC作用。首先用1.6μM的CFSE(565082，BD)标记靶细胞293T-hCLDN18.2(购买自康源博创，细胞编号-KC-0986)，室温避光标记10min，用5倍体积预冷的无血清培养基洗2遍，将标记好的细胞重悬在ADCC培养液中并计数，向96孔U型板中加入每孔5x10^4个细胞，之后加入测试抗体进行梯度稀释，起始浓度为333.5nM，用完全培养基梯度稀释3.16倍，共10个浓度点，500转离心30秒后加入1.5x10^5个PBMC细胞/孔，效靶比为30∶1。将靶细胞效应细胞抗体复合物在在37℃共孵育4小时。孵育结束后，用流式缓冲液清洗细胞两遍，每孔加入100μL含1μL 7-AAD(559925，BD)的PBS溶液染色，室温避光孵育10分钟，用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测靶细胞的活性。使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值。实验结果见图14和表9。
表9：432-M147抗体的原代NK细胞介导的ADCC活性总结
处理组 EC50(nM) ％Emax
432-M147 0.18 72
Zolbetuximab 740.5 67.2
倍数差异 2.7 1.07
。
实验结果显示，在原代NK细胞介导的ADCC杀伤实验中，与报告细胞系的结果相似，432-M147依然显示很强的ADCC活性，EC50为0.18nM，而参照抗体Zolbetuximab的EC50为0.5nM，432-M147原代NK细胞介导的ADCC活性提高了2.7倍，显示其优于Zolbetuximab的肿瘤杀伤活力。
综上，Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-V158报告细胞系和原代NK细胞介导的ADCC活性均显示与参照抗体相比，本发明的432-M147的ADCC活性有显著提升，抗体的ADCC活性是重要的肿瘤杀伤作用机制，高ADCC活性将为临床应用提供重要的理论基础。
实施案14：432-M147抗体的ADCP活性检测
抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)是另一个抗体类药物杀伤肿瘤细胞的重要作用机制，抗体的Fab通过与抗原结合，引起构象变化，并促进抗体的Fc端与巨噬细胞表面的FcγRIIA(CD32a)的结合，并激活FcγRIIA下游信号ITAM信号，促进巨噬细胞对肿瘤抗原阳性细胞的吞噬。在本实验中，本发明人利用小鼠骨髓分化来源的巨噬细胞与293T-hCLDN18.2细胞共培养来评价432-M147抗体的ADCP活性。无菌解剖小鼠取股骨和胫骨剃掉表面的肌肉组织，用剪子剪断两端将骨髓用注射器吹出并收集离心，用1640+10％FBS+1％PS重悬计数，用小鼠M-CSF分化BMDM。将诱导好的BMDM用1mL accutase消化下来，1200rpm离心5分钟，用1640+5％FBS重悬计数备用。吞噬实验当天，将靶细胞1.6μM/mL的终浓度CFSE标记，室温避光染色用1640+5％FBS重悬计数，以5X10^4cell/well铺到低吸付96孔U形底板，每孔80μL，加入梯度稀释的测试药40μL/well后低速瞬离，将诱导好的BMDM按照对应的效靶比的细胞数铺到低吸付96孔U形底板，每孔80μL，用排枪混匀后37度孵育4小时。用流式缓冲液两遍，加入100μL PBS中含有1μL的APC-F4/80，混匀后4度孵育30分钟，用流式缓冲液洗两遍，加入100μL PBS中含有1μL的7-AAD，混匀后室温孵育10分钟，用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测ADCP的吞噬比例，结果得出后利用公式计算吞噬指数(％)＝％(F4/80+CFSE+)/％(F4/80+)×100％。使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值。实验结果见图15。虽然未得到有效的EC50，依然可以看到432-M147显示浓度梯度依赖的吞噬活性的增加，相比参照抗体Zolbetuximab在各浓度点都有显著增强的吞噬活性。
实施案15：432-M147 ADCC增强型抗体的制备
在FUT8基因敲除的HEK293/FUT8-细胞中的表达432-M147，该细胞购自康源博创生物科技有限公司(KC-2300)。细胞株在Expi293TMexpression medium中传代用于生产，传代密度0.2～0.3*E6/ml，传代周期2～3天。转染前一天将细胞稀释至2*E6/ml，转染当日，检测细胞密度应在6E6/ml左右，活率大于95％。转染当日按照并使用转染试剂盒使用说明操作转染，质粒使用432-M147-LC和432-M147-HC，轻链和重链摩尔浓度比为1∶1。转染后18-22小时按终浓度0.6％v/v加入Enhancer1和Enhancer2。转染第五天以后，监测细胞活率，细胞活率小于70％时收获细胞，纯化蛋白，命名为ICP。
实施案16：蛋白ICP糖型分析
取500μg蛋白加入4μL PNGaseF糖苷酶，于37℃孵育16h，样品加入预冷好的300μL无水乙醇补至400μL，混匀后放如-20℃冰箱，1h。取出后12000rpm离心10min，用移液枪小心吸取上清。将上清放入真空离心浓缩仪中，室温浓缩干燥(10h～15h)，直至没有液体。加入DMSO和乙酸混合液(350∶150)：2-AB：氰基硼氢化钠＝100μL∶5mg∶6mg的比例混合液20μL。65℃避光环境中，反应4h。加乙腈和水混合液(8∶2)200μL，振荡，离心2min，取上清检测。
色谱条件：柱温65℃；进样池温度8℃；进样量10μL。流动相A：50mmol·L-1甲酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度为25min内B相从70％到63％，5min内B相从63％到10％，流速为0.4mL·min-1。2-AB标记的检测波长为：激发波长330nm，发射波长330nm。
实施案17：蛋白ICP活性检测
ICP的ADCC活性检测方法如实施例13所述，用293T-hCLDN18.2(细胞购自康源博创，细胞编号KC-0986)细胞作为靶细胞和PBMC来源的原代NK细胞共培养，检测融合蛋白Fc端介导的ADCC活性。
综上所述，本发明的432-M147抗体与参照抗体相比，在亲和力、内吞活性、CDC活性、ADCC活性和ADCP活性均有显著提升。
参考文献
1.Krause，G.，Winkler，L.，Mueller，S.L.，Haseloff，R.F.，Piontek，J.，&Blasig，I.E.(2008).Structure and function of claudins.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes，1778(3)，631-645doi：https：//doi.org/10.1016/j.bbamem.2007.10.018；
2.Lo，B.K.(2004).Antibody humanization by CDR grafting.Methods MolBiol，248，135-159.doi：10.1385/1-59259-666-5：135；
3.Sahin，U.，Koslowski，M.，Dhaene，K.，Usener,D.，Brandenburg，G.，Seitz，G.，Türeci，O.(2008).Claudin-18 splice variant 2is a pan-cancer target suitable fortherapeutic antibody development.Clin Cancer Res，14(23)，7624-7634.doi：10.1158/1078-0432.Ccr-08-1547；
4.Sahin，U.，Schuler，M.，Richly，H.，Bauer，S.，Krilova，A.，Dechow，T.，Tureci，O.(2018).A phase I dose-escalation study of IMAB362(Zolbetuximab)in patientswith advanced gastric and gastro-oesophagealjunction cancer.Eur J Cancer，100，17-26doi：10.1016/j.ejca.2018.05.007；
5.Welschof，M.，&Krauss，J.r.(2003).Recombinant antibodies for cancertherapy：methods and protocols.Totowa，N.J.：Humana Press.；
6.Woll，S.，Schlitter，A.M.，Dhaene，K.，Roller，M.，Esposito，I.，Sahin，U.，&Tureci，O.(2014).Claudin 18.2is a target for IMAB362 antibody in pancreaticneoplasms.Int J Cancer，134(3)，731-739.doi：10.1002/ijc.28400；
7.Yasui，W.，Sentani，K.，Sakamoto，N.，Anami，K.，Naito，Y.，&Oue，N.(2011).Molecular pathology of gastric cancer：Research and practice.Pathology-Research and Practice，207(10)，608-612.doi：https：//doi.org/10.1016/j.prp.2011.09.006。

Claims (18)

1.一种抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含：
具有如下三个重链互补决定区(HC-CDR)的重链可变区：SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列的HC-CDR2，和包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的HC-CDR3；和
具有如下三个轻链互补决定区(LC-CDR)的轻链可变区：SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列的LC-CDR2，和SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的LC-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其为人源化的抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求1或2所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：
所述轻链可变区包含选自对应于23L、54I、59A和116S的一个或多个氨基酸；和/或
所述重链可变区包含选自对应于181W、201N、218K、245G/S和250F的一个或多个氨基酸，
其中所述氨基酸参考图4编号。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：
所述轻链可变区包含对应于23L、54I、59A、116S、23L/59A、23L/116S、59A/116S或23L/59A/116S的氨基酸；和/或
所述重链可变区包含对应于181W、201N、218K、245G、245S、250F、181W/250F或201N/245S的氨基酸，
其中所述氨基酸参考图4编号。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含对应于23L和116S的氨基酸，并且所述重链可变区包含对应于218K的氨基酸，其中所述氨基酸参考图4编号。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：
所述重链可变区包含选自SEQ ID NO: 4、16、35-40、43和46中所示的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO: 3、14、31-34、41、42、44和45中所示的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
包含选自SEQ ID NO: 19、22和26中所示的氨基酸序列的重链；和/或
包含选自SEQ ID NO: 18、20和24中所示的氨基酸序列的轻链。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。
9.多核苷酸，编码根据权利要求1-8中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO: 11、12、15、17、21、23、25和27中所示的多核苷酸序列。
11.载体，其包含根据权利要求9或10所述的多核苷酸。
12.宿主细胞，其包含根据权利要求9或10所述的多核苷酸，或根据权利要求11所述的载体。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞，优选地所述宿主细胞选自CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞，例如HEK 293细胞。
14.用于产生抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：
培养根据权利要求12或13所述的宿主细胞；和
从培养物回收所述抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
15.用于诊断、预防和/或治疗与CLDN18.2相关的肿瘤的组合物，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，根据权利要求9或10所述的多核苷酸、根据权利要求11所述的载体，或根据权利要求14的方法产生的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述肿瘤选自胃癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、胰腺癌、食管癌、支气管癌和乳腺癌。
17.根据权利要求1-8中任一项所述的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，根据权利要求9或10所述的多核苷酸、根据权利要求11所述的载体，或根据权利要求14的方法产生的抗-CLDN18.2抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断、预防和/或治疗与CLDN18.2相关的肿瘤的组合物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述肿瘤选自胃癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、胰腺癌、食管癌、支气管癌和乳腺癌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3762031A4 (en) * 2018-03-08 2021-12-22 Phanes Therapeutics, Inc. ANTI-CLAUDINE ANTIBODIES 18.2 AND THEIR USES
AU2019235033A1 (en) * 2018-03-14 2020-07-30 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. Anti-claudin 18.2 antibodies
WO2020082209A1 (zh) * 2018-10-22 2020-04-30 上海吉倍生物技术有限公司 抗cldn18.2抗体及其用途
JP2022515318A (ja) * 2018-12-28 2022-02-18 四川科倫博泰生物医薬股▲フン▼有限公司 抗体及びその用途
US11407828B2 (en) * 2019-02-01 2022-08-09 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-CLauDiN 18 antibodies and methods of use thereof
WO2021047599A1 (en) * 2019-09-13 2021-03-18 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. Humanized anti-claudin 18.2 (cldn18.2) antibodies

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