CN117752860A - 一种基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法和应用。将葡半乳聚糖多糖溶解于NaOH水溶液中，经搅拌至均匀，再加入适量的交联剂搅拌均匀，在适当条件下反应，最后得到葡半乳聚糖水凝胶。该制备条件温和，方法简单，试剂少且无剧烈反应，成本低，容易实现产业化，所制备的多糖水凝胶耐降解性能优良，机械性能优秀，生物相容性好，在体内持续时间长。适用于皮下填充、除皱及关节腔润滑液替代等场景。

Description

一种基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于生物材料及水凝胶技术领域，具体涉及一种基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤切除、创伤性损伤、脂肪萎缩、先天性缺陷和衰老过程会导致皮下脂肪、胶原蛋白和肌肉等软组织的正常结构缺损。为了修复缺损，有许多人工填充物已被广泛应用于临床软组织填充。

理想的软组织填充物应具有良好的生物相容性、柔韧性和生物稳定性。以多糖为基础的水凝胶具有天然来源丰富的优点。透明质酸是天然细胞外基质的重要组成部分，在保健和化妆品市场占据主导地位。然而，由于透明质酸酶的存在，透明质酸在体内极易被降解。现有的商用透明质酸水凝胶是将透明质酸和交联剂按一定条件制成的，虽然延长了降解时间，但仍需在一年以内重复注射，增加了病人的痛苦。

申请人在另一个专利公开号为CN111286466A中公开了一株土壤杆菌及其所产抗炎症反应的胞外多糖的生产和制备方法。同时，申请人发表的论文(Anti-tumor activityand immunogenicity of a succinoglycan riclin.Carbohydr Polym.2021 Mar 1；255:117370.)提供了上述胞外多糖的结构解析。葡半乳聚糖是通过上述多糖经过碱热法处理得到的去琥珀酰基团的一种多糖。

发明内容

本发明要解决的问题在于提供一种安全性高、力学性能优良、生物相容性好的可注射多糖水凝胶以满足皮下填充的需求。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过碱热法处理琥珀酰聚糖Riclin以获得葡半乳聚糖纯品。

(2)将葡半乳聚糖溶解于NaOH水溶液中，在室温下搅拌，得到透明溶液，为葡半乳聚糖溶液；

(3)在葡半乳聚糖溶液中加入所需的交联剂，在室温下搅拌，经化学反应交联后得到葡半乳聚糖水凝胶；

(4)将葡半乳聚糖水凝胶用酸性溶液中和，再用中性去离子水清洗8～15次，得到中性的葡半乳聚糖水凝胶；

(5)将中性葡半乳聚糖水凝胶溶胀到一定体积，于高温灭菌，得到无菌、中性的葡半乳聚糖水凝胶。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中琥珀酰聚糖Riclin溶液浓度为0.5-2wt％，NaOH浓度为0.1wt％，反应条件为105℃，10分钟。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(2)中葡半乳聚糖溶液浓度为8-10wt％，NaOH水溶液的浓度为0.1-0.2M。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(3)中，使用聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)作为交联剂，葡半乳聚糖溶液和交联剂的体积比为1:0.036-1:0.108。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(3)中，交联温度为30-60℃，反应时间为8-16h。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(4)中，酸性溶液为0.1-0.2M的HCl溶液。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(4)中，得到的中性葡半乳聚糖水凝胶中葡半乳聚糖含量为20mg/mL。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(5)中，高温灭菌条件为121℃，20min。

本发明的另一目的在于提供一种能在皮下长效保持的可注射皮下填充葡半乳聚糖水凝胶。

本发明的另一目的在于提供上述葡半乳聚糖水凝胶在制备皮下软组织填充材料或者制备关节腔润滑液中的应用。

本发明的有益效果是：

聚乙二醇(PEG)是一种无毒的，经FDA批准的两亲性聚醚化合物。低分子量(Mw<1000)的PEG可以从体内降解清除。本发明在碱性条件下，通过聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)与葡半乳聚糖的交联反应制备了一种新型多糖基水凝胶。结果表明，葡半乳聚糖水凝胶是一种很有前途的软组织增强生物材料。

(1)本发明提供了一种新型微生物多糖化学交联的可注射的水凝胶，该微生物多糖水凝胶生物相容性好、力学性能优越，体内持续时间长，在美容医疗中显示出巨大的潜力。

(2)本发明公开的制备工艺简单，反应条件温和，易于合成，适于推广使用。

附图说明

图1为葡半乳聚糖水凝胶成胶的形态图；

图2为葡半乳聚糖水凝胶可注射性示意图，其中图2中的(a)图为葡半乳聚糖水凝胶剪切速率扫描曲线和葡半乳聚糖水凝胶通过25号和27号针注射的注射力图，图2中的(b)图为R-0.5水凝胶、R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶通过27号针注射的示意图；

图3为葡半乳聚糖水凝胶在小鼠背部注射的效果图，其中图3中的(a)图为术后第1周、第6周和第16周剖开小鼠背部皮肤后所展现的葡半乳聚糖水凝胶的宏观照片，图3中的(b)图为水凝胶在小鼠体内的降解趋势图；

图4为葡半乳聚糖水凝胶生物安全性的效果图，其中图4中的(a)图为用不同浓度的葡半乳聚糖水凝胶提取物培养24小时的L929细胞的存活率图，图4中的(b)图为皮下注射葡半乳聚糖水凝胶1周后主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的组织学评估。

具体实施方式

除非另有限定，本发明所用所有技术和科学术语都具有为本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的含义。如无特殊说明，下述实施例中采用的试剂或材料可通过商业购买或参考现有方法合成。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

实施例1

葡半乳聚糖的制备：

(1)将琥珀酰聚糖Riclin粉末溶解于纯水中，得到浓度为0.5wt％的Riclin多糖溶液。

(2)在Riclin多糖溶液中加入0.1wt％的NaOH，搅拌混匀，在105℃下反应10分钟。

(3)将反应后的多糖溶液用1μm纤维膜过滤，调节滤液pH到中性，加入酒精以得到多糖沉淀，即为葡半乳聚糖；葡半乳聚糖的结构式为：

其中，n为1000-2000。

实施例2

葡半乳聚糖可注射皮下填充水凝胶的制备：

(1)将实施例1制备的葡半乳聚糖多糖粉末溶解于浓度为0.1M的NaOH水溶液中，在室温下均匀，得到糖浓度为8wt％的透明溶液，为葡半乳聚糖溶液；

(2)在葡半乳聚糖溶液中加入一定量的聚乙二醇二缩水甘油醚交联剂，使得多糖溶液和交联剂的体积比为1:0.036、1:0.072、1:0.108，在室温下以搅拌均匀，在40℃条件下经化学反应交联反应8h后得到葡半乳聚糖水凝胶；

(3)将葡半乳聚糖水凝胶用0.1M的HCl溶液中和，再用中性去离子水清洗8～15次，得到中性的葡半乳聚糖含量为20mg/mL的葡半乳聚糖水凝胶；

(4)将中性葡半乳聚糖水凝胶于121℃，20min条件下高温高压灭菌，得到无菌、中性的葡半乳聚糖水凝胶。

按上述制备方法，将8wt％的葡半乳聚糖多糖溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚分别以体积比为1:0.036、1:0.072、1:0.108进行交联反应，经过溶胀后，分别得到葡半乳聚糖多糖含量为20mg/mL的R-0.5水凝胶、R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶。

如图1所示，是葡半乳聚糖多糖经交联反应形成的R-0.5水凝胶、R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶形态。

实施例3

基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的可注射性的测定：

将上述R-0.5水凝胶、R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶依次进行测试，用流变仪对葡半乳聚糖水凝胶的可注射性进行了表征。在复合粘度测试中测量水凝胶的粘度随剪切速率(0.1-10001/s)的变化。再使用25号和27号针头分别将R-0.5水凝胶、R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶分别装入1mL针筒中进行可注射性测试。

如图2中的(a)图所示，随着剪切速率的增加，R-0.5水凝胶、R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶的粘度迅速降低了三个数量级。在宏观水平上验证了可注射性。

如图2中的(b)图所示，三种水凝胶都能通过25号和27号针头顺利挤出，并整合在一起形成有粘性的整个凝胶，进一步直观地验证了葡半乳聚糖水凝胶的可注射性。

实施例4

基于葡半乳聚糖可注射皮下填充水凝胶的小鼠体内试验：

造模过程中，将小鼠随机分为4组，R-0.5、R-1.0、R-1.5和对照组，对小鼠背部进行脱毛处理，将葡半乳聚糖水凝胶或者商用透明质酸水凝胶(华熙生物，润百颜，注射用修饰透明质酸钠凝胶，生产许可证编号：鲁食药监械生产许20120123号)注射入小鼠背侧。在注射水凝胶第1周、第6周、第16周后对小鼠进行处死，切下水凝胶区域的皮肤组织和水凝胶，观察水凝胶形态、大小以及测量水凝胶的质量变化。

如图3中的(a)图所示，对照组为商用透明质酸水凝胶，随着植入体内时间的变化，由于体内透明质酸酶的存在，对照组水凝胶的形态大小发生了较明显的变化。葡半乳聚糖水凝胶形态大小也发生了变化，R-0.5水凝胶稀软，可能是因为交联强度较弱，机械性能难以在皮下长时间维持，而R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶则有较好的维持效果。

如图3中的(b)图所示，商品透明质酸水凝胶在体内时间超过16周后已经降解到原来的50％左右。而R-1.0水凝胶和R-1.5水凝胶则保有80％以上的质量，在体内不易降解，R-0.5水凝胶由于交联强度较弱，其降解到原来质量的60％左右。

实施例5

基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的安全性评价：

(1)细胞毒性实验：

本实验采取MTT法和活/死显像法评价葡半乳聚糖和葡半乳聚糖水凝胶的体外细胞毒性。将L929细胞接种于96孔板中，培养24小时。将1mL水凝胶在DMEM中孵育48小时，在37℃下制备葡半乳聚糖水凝胶提取物，然后用含有不同浓度的葡半乳聚糖水凝胶提取物的常规DMEM培养基代替继续培养24小时。MTT处理后，在570nm处测定细胞活力。

(2)内脏安全性评价：

本实验通过在Balb/c小鼠背部皮下植入评估葡半乳聚糖水凝胶的体内降解和生物相容性。用27号针头皮下注射200μL无菌水凝胶至小鼠背侧。在植入7天后对小鼠进行安乐死。取主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)进行H&E染色和Masson染色，分析葡半乳聚糖水凝胶是否对小鼠内脏器官具有毒性。

如图4中的(a)图所示，细胞活力在所有范围内都超过90％，这些结果表明葡半乳聚糖水凝胶具有良好的体外生物相容性。

如图4中的(b)图所示，从H&E染色图像中没有观察到明显的炎症反应或组织坏死。这进一步证实了葡半乳聚糖水凝胶的低体内毒性，具有良好的生物相容性。

由以上实施例可知：本发明将葡半乳聚糖多糖溶解于NaOH水溶液中，经搅拌至均匀，再加入适量的交联剂搅拌均匀，在适当条件下反应，最后得到葡半乳聚糖水凝胶。该制备条件温和，方法简单，试剂少且无剧烈反应，成本低，容易实现产业化，所制备的多糖水凝胶耐降解性能优良，机械性能优秀，生物相容性好，在体内持续时间长。适用于皮下填充、除皱及关节腔润滑液替代等场景。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将葡半乳聚糖溶解于NaOH水溶液中，在室温下搅拌，得到透明糖溶液，为葡半乳聚糖溶液；

(2)在葡半乳聚糖溶液中加入所需的交联剂，在室温下搅拌，经化学反应交联后得到葡半乳聚糖水凝胶；

(3)将葡半乳聚糖水凝胶用酸性溶液中和，再用中性去离子水清洗8～15次，得到中性葡半乳聚糖水凝胶；

(4)将中性葡半乳聚糖水凝胶溶胀到一定体积，于高温灭菌，得到无菌、中性的葡半乳聚糖水凝胶。

2.根据权利要求1所述的基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，葡半乳聚糖的结构式为：

其中，n为500-10000。

3.根据权利要求1所述的基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，葡半乳聚糖溶液浓度为8-10wt％，NaOH水溶液的浓度为0.1-0.2M。

4.根据权利要求1所述的基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，葡半乳聚糖溶液和交联剂的体积比为1:0.036-1:0.108，所述的交联剂包括以下的一者或者多者：碳二亚胺、二乙烯基砜、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚。

5.根据权利要求1所述的基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，交联温度为30-60℃，反应时间为8-16h。

6.根据权利要求1所述的基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，酸性溶液为0.1-0.2M的HCl溶液。

7.根据权利要求1所述的基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所得中性葡半乳聚糖水凝胶中葡半乳聚糖含量为20mg/mL。

8.根据权利要求1所述的基于葡半乳聚糖的可注射皮下填充水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，高温灭菌条件为121℃，20min。

9.权利要求1～8任意一项所述的制备方法得到的葡半乳聚糖水凝胶。

10.权利要求9所述的葡半乳聚糖水凝胶在制备皮下软组织填充材料或者制备关节腔润滑液中的应用。