CN117752799A - 一种用于骨关节退行性疾病的组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于骨关节退行性疾病的组合物,该组合物包含能够促进干细胞定向分化为软骨组织的干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质,通过抗炎效应调控骨关节微环境,改善干细胞定向分化形成软骨组织效应,用于骨关节退行性疾病的治疗;其中,干细胞定向分化剂为分子量小于1000Da的小分子化合物,包括具有联苯胺结构的分子;具有抗炎功能的活性物质,通过调节炎症微环境,辅助干细胞的定向分化,包括核酸结构和/或其他具备相应功能的活性分子化合物和/或化合物片段;所述骨关节退行性疾病,优选为骨关节炎。该发明增强了干细胞的软骨修复作用,极大地改善了骨关节炎的治疗效果,有效地用于骨关节退行性疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域,尤其涉及一种用于骨关节退行性疾病的组合物及制备方法。
背景技术
骨关节退行性疾病,比如骨关节炎(OA)是严重影响人类生活质量的常见疾病,它在全球范围内的患病率极高,特别是在老年人群中,具有发病率高、致残率高、复发率高以及并发症多的特点。据世界卫生组织的数据,OA正越来越严重的影响患者的生活质量和工作能力。目前,治疗骨关节炎的主要手段包括药物治疗、物理治疗、手术治疗以及生活方式的改变,如合理增加运动、控制体重等。然而,骨关节炎的治疗仍面临许多挑战,如药物的副作用、手术的风险以及患者的依从性等,因此,研发更有效、更安全的治疗手段是当前的重要任务。
OA状态下的炎症贯穿整个疾病的进程,炎症不仅可以导致关节软骨磨损和骨质增生,也会引起关节疼痛和功能受损。在炎症状态下,巨噬细胞能够响应于炎症信号,从而被募集在滑膜中,同时巨噬细胞也会被激活为促炎表型,进而释放出一系列炎症因子,包括TNF-α、IL-1β、IL-6等,加剧骨关节炎的发展进程。因此,重塑炎症微环境是治疗骨关节炎的一种重要策略。一些研究已经证实,通过减少关节腔内促炎巨噬细胞的数量或将其重编程为抗炎表型的方式,可以有效地减轻炎症反应,从而改善OA的进展。此外,也有研究表明,调节炎症微环境中的细胞因子和信号通路,如通过抑制NF-κB信号通路或调节JAK/STAT信号通路,可以有效地降低炎症水平,从而减轻OA的症状。
然而,炎症微环境重塑后,已受损的软骨组织的修复是极为困难的。受损的软骨细胞产生的病理相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)刺激周围的组织细胞如滑膜成纤维细胞或软骨细胞持续产生炎症,同时促进软骨基质的降解,因此,修复受损软骨组织是治疗骨关节炎的另一个重要策略。当前,在骨关节炎的炎症条件下实现有效的关节软骨的修复和再生仍然是一个挑战。干细胞是关节内软骨更新的唯一来源,因此,干细胞疗法被认为是治疗OA的重要手段之一。一方面,干细胞能够分化成软骨细胞,更新受损的软骨细胞;另一方面,干细胞软骨化过程中能够促进软骨基质的再生,从而实现软骨组织的修复。然而,在炎性条件下,干细胞的增殖及分化行为会受到一定的抑制;此外,在正常生理条件下干细胞软骨化过程十分缓慢,难以有效补充受损软骨。因此,以改善OA滑膜炎症微环境为基础,联合提高干细胞的软骨分化效率以实现软骨修复和再生的策略,具有有效改善OA疾病进程的潜力。
干细胞定向分化剂,比如Kartogenin(KGN)是一种小分子化合物,具有很高的促进间充质干细胞成软骨分化的活性(EC50=100nM),能显著地促进MSCs的软骨化,是一种潜在的促干细胞分化剂候选药物。Kartogenin促进干细胞向软骨细胞的分化主要通过与细胞内的核心结合因子β(Cbf-β)结合来实现。Cbf-β是一个关键的转录共激活因子,对多种基因表达具有调控作用。KGN与Cbf-β的结合激活了一系列信号传导途径,从而促进干细胞中与软骨生成相关的基因表达。这些基因表达的变化导致干细胞逐渐向软骨细胞分化,进而促进软骨的形成和再生。此外,KGN还可能影响其他与软骨细胞生成和维持相关的信号通路,但这些机制的细节仍在研究之中。总的来说,KGN通过精确调控细胞内的分子机制,有效地推动干细胞向软骨细胞的转化。尽管KGN在软骨再生方面具有显著优势,但由于其代谢不稳定性导致的短半衰期、强烈的疏水性导致的药物形成不佳以及可能的副作用,如刺激正常组织过度生长的非靶向效应等,使得直接注射KGN的应用受到限制。
纳米技术在药物递送领域的应用为关节治疗提供了新的思路和方法。与传统治疗方法相比,纳米***具有特殊的物理和化学特性,可以应对关节治疗给药的特殊性需求。在之前的研究中,骨关节炎(OA)患者和碘乙酸诱导的骨关节炎模型小鼠的关节组织滑膜巨噬细胞中碳酸酐酶IX(CA9)蛋白表达显著增加,通过沉默M1型巨噬细胞中CA9基因表达,炎症微环境得到重塑,显著改善了OA进展。这表明,CA9基因的沉默对于有效改善OA炎症状态十分有利。目前尚缺乏将纳米技术与关节治疗相结合的更为有效的药物应用。
当前骨关节退行性疾病治疗缺乏具有显著治疗作用的方式,细胞疗法是OA治疗中一类重要手段,应用最为广泛的是间充质干细胞(MSCs)。然而,MSCs等的临床应用面临着许多挑战。首先,由于患者之间的个体差异,MSCs等的临床效果不稳定;其次,干细胞在应用时必须考虑具体的分化方向即干细胞特异性分化,促干细胞分化剂能够有效促进干细胞软骨化进程,实现OA病症的缓解。同时,在联合抗炎策略时,对整体微环境的考虑也非常重要。当前亟需解决骨关节退行性疾病治疗中,干细胞疗法及干细胞定向分化剂在OA等领域应用,如何减少副作用、同时增强治疗有效性的问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷,本发明提供了一种包含干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物及制备方法,以期实现滑膜炎症微环境重塑,并结合外源性骨髓来源间充质干细胞软骨细胞分化的双重功效,探索有效改善OA进展的新型药物治疗策略。
本发明提供了一种用于骨关节退行性疾病的组合物,该组合物包含能够促进干细胞定向分化为软骨组织的干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质,通过抗炎效应调控骨关节微环境,从而改善干细胞定向分化形成软骨组织效应,用于骨关节退行性疾病的治疗;其中,干细胞定向分化剂为分子量小于1000Da的小分子化合物,包括具有联苯胺结构的分子,优选为Kartogenin(KGN)、葡萄糖胺和/或其变体结构;具有抗炎功能的活性物质,通过调节炎症微环境,辅助干细胞的定向分化,包括核酸结构和/或其他具备相应功能的活性分子化合物和/或化合物片段;骨关节退行性疾病,优选为骨关节炎。
骨关节退行性疾病,比如OA的炎症微环境与关节滑膜巨噬细胞失衡密切相关。发明人发现,骨关节退行性疾病患者及碘乙酸诱导的骨关节炎模型小鼠关节组织滑膜巨噬细胞中碳酸酐酶IX(CA9)等蛋白表达显著增加。通过将干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质进行组合,尤其是与核酸结构的组合,能够沉默相关基因,比如CA9基因的siRNA(CA9siRNA)可以下调巨噬细胞CA9基因的表达,可以促进滑膜M1型巨噬细胞向M2表型转化,从而有利于炎症微环境重塑,显著改善OA进展。由此,发明人通过促进巨噬细胞M1向M2表型复极化,和介导骨关节退行性疾病的炎症微环境的重塑等起效路径,增强了干细胞的软骨修复作用,极大地改善了骨关节炎的治疗效果,用于骨关节退行性疾病的治疗。
优选地,干细胞包括间充质干细胞,和/或诱导多能干细胞,和/或胚胎干细胞中的一种或多种,优选为间充质干细胞;间充质干细胞从一种或多种组织中提取,该组织包括骨髓、脂肪组织、脐带血和/或牙髓。
优选地,干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质分别发挥炎症调控和促干细胞分化效力,在组合物中质量配比范围为1∶50至50∶1范围;干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质的组合形式包括微球、纳米粒子、凝胶包载物和/或骨架填充物中的一种或多种形式;其中该组合物优选为纳米制剂。
优选地,干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合形式为纳米粒子,该纳米粒子包括外壳载体材料和金属离子配合物内核;其中,外壳载体材料,包括磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物、氢氧化物和/或单氧化物中的一种或多种、透明质酸和/或其衍生物,与干细胞定向分化剂的偶联和/或交联化物;偶联和/或交联,包括形成稳固作用力的键合作用,键合作用力大于25℃下水分子的相互作用力;
金属离子配合物内核,包括核酸结构与金属离子的螯合化物;其中,核酸结构包括小分子核酸、大分子核酸和/或其变体结构,和/或结构片段中的一种或多种;金属离子包括Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、La3+、Al3+、Zn2+、Mg2+中的一种或多种;纳米粒子的组装形式还包括配位作用。
上述外壳载体材料与金属离子配合物内核的结合,具有高度生物相容性和生物降解性,通常不会引起显著的免疫反应或毒性反应。核酸结构与金属离子的螯合后,包裹在外壳载体材料中,能够有效保护和递送具有抗炎功能的上述核酸结构,并具有pH响应敏感解散释药的功能特征。另外,相较于脂质膜涂覆层而言,使用透明质酸和/或其衍生物连接能够更好的实现核酸结构及疏水性药物的共递送。巨噬细胞及干细胞过表达CD44受体,含有高分子量透明质酸的纳米载体能够通过受体配体相互作用增强肿瘤细胞的靶向性,有利于增强细胞摄取,提高胞内药物摄取能力。
发明人经过多次试验研究表明,干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合的上述纳米粒子形态,纳米粒在pH 3.0~9.0范围内,随着介质环境pH的提升,粒径逐渐增大,形貌由均匀分散的颗粒状重新分布为不规则的聚集体;处于细胞介质环境中,所述核壳型纳米粒在100h左右逐渐释放所述促干细胞分化剂;在含血清的介质中,所述核壳型纳米粒中的核酸结构能够完整稳定存在超过36h;经过opti介质稀释200倍,所述核壳型纳米粒的粒径变化范围不超过50nm。
同时,发明人通过多层次的细胞学研究和动物实验设计,研究结果表明,干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合的上述纳米粒子形态,不仅重塑了OA的炎症微环境,促进M1型巨噬细胞向M2表型巨噬细胞复极化,同时也实现软骨保护和修复功能,并改善体内干细胞治疗OA的效应,为高效安全治疗OA提供了新的治疗策略。
优选地,磷酸化物为单磷酸类化合物、双磷酸类化合物和/或包含磷酸结构的其他小分子;单磷酸类化合物包括磷酸锰、磷酸钙、磷酸镧、磷酸钠中的一种或多种;双磷酸化物包括阿仑膦酸、利塞膦酸、氯膦酸、唑来膦酸、特立帕肽中的一种或多种;碳酸化物和/或硫酸化物包括碳酸钙和/或硫酸钙;羧酸化物包括羧酸钙和/或羧酸锰;氢氧化物包括氢氧化铁、偏铝酸、氢氧化镁中的一种或多种;单氧化物包括氧化铁、氧化锌和/或其修饰物中的一种或多种;
透明质酸和/或其衍生物为天然和/或合成的高分子聚合物材料,分子量范围在1~1000kDa之间;优选地,透明质酸和/或其衍生物,包括透明质酸、水解透明质酸、乙酰化透明质酸、透明质酸钠交联聚合物、硅烷化透明质酸、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸中的一种或多种;
小分子核酸包括siRNA、microRNA(miRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、small nucleolar RNA(snoRNA),和/或转运RNA(tRNA)中的一种或多种;大分子核酸包括mRNA、DNA和/或其变体结构中的一种或多种。
磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物、氢氧化物和/或单氧化物与金属离子的结合,比如磷酸钙,就是一种天然骨组织成分,具有高度生物相容性和生物降解性,不会引起显著的免疫反应或毒性反应,同时金属离子配合物内核的纳米核心载体能够有效保护和递送核酸结构,并具有pH响应敏感解散释药的功能特征。凝胶电泳实验表明纳米粒子在血清中具有保护核酸结构免受核酶降解的能力达36h及以上。SEM及DLS测定法表明,纳米粒子可响应酸性环境释放相应的核酸结构。液相色谱-质谱(LC-MS)法表明上述纳米粒子具备胞内缓慢释放干细胞定向分化剂的潜力。
优选地,该纳米粒子通过DLS检测,水合粒径在20nm~2000nm间,电位大于-50mV;其中,水合粒径优选在100nm~1000nm之间;电位优选在-30mV~+20mV。
优选地,该纳米粒子具有改善骨关节炎(OA)的炎症微环境、促进骨关节炎(OA)状态下体内外干细胞治疗效应、改善骨关节炎(OA)条件下体内外干细胞定向软骨分化、和/或显著改善骨关节炎(OA)进程中一种或多种的用途。
经发明人多次试验,比如RT-PCR和流式细胞术表明,上述纳米粒子能够有效将促炎性M1巨噬细胞复极化为抗炎性M2巨噬细胞。阿利新蓝染色实验证明,上述纳米粒子能够有效促进干细胞分化并能够显著改善炎症微环境对干细胞软骨化的抑制行为。免疫荧光染色实验以及Western Blot实验表明纳米粒子介导的炎症微环境改善,显著提升干细胞软骨化相关基因的表达。通过观察小鼠治疗期间的体重变化来评估制剂的整体安全性。小鼠血常规、血生化及主要脏器的H&E染色实验表明纳米粒在体内具有良好的安全性。进一步通过MIA诱导的小鼠OA模型考察了制剂对外部注射间充质干细胞治疗OA的效应改善情况。对所得到的膝关节样本进行了H&E染色和番红O-固绿染色。根据染色结果,采用国际骨关节炎研究协会(OARSI)组织病理学评分标准,本发明提供的纳米粒子制剂具有相较于以往的制剂类型,具有更好的软骨下骨保护作用。这些结果表明,上述纳米粒子能够很好地改善干细胞疗法的疗效。由此,具有改善OA炎症微环境、促进OA状态下体内外干细胞治疗效应、改善OA条件下体内外干细胞定向软骨分化、和/或显著改善OA进程中一种或多种的用途。
优选地,该组合物还包括磷酸盐缓冲体系和/或金属盐溶液中的一种或多种。磷酸盐缓冲体系和/或金属盐溶液为组合物,尤其是纳米粒子提供了相应的环境稳定剂。
优选地,该组合物与干细胞联合用药,包括关节腔注射给药、肌肉注射、透皮吸收中的一种或多种;通过关节腔注射给药的干细胞单次用量不超过1000w/kg,干细胞定向分化剂和所述核酸结构的单次用药剂量分别不超过50μM及5μM。
本发明还提供了一种上述组合物的制备方法,其中,将外壳载体材料、核酸结构的水溶液、缓冲体系和金属离子溶液分步混合,均质化后得到所述纳米粒子;均质化过程包括超声波混合、涡旋振荡混合、移液枪吹打混合和/或其他包含剪切力、惯性力、吸附力、空化作用的混合方式;优选地,缓冲体系包括Hepes,NaCl和Na2HPO4,浓度范围分别为5~500mM,200~600mM和0.1~2mM;缓冲体系的pH范围在3.0~10.0之间,优选在6.0~9.0之间。
本发明中具体地,将磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物和/或氢氧化物中的一种或多种,和透明质酸和/或其衍生物通过酰胺化反应,形成所述磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物和/或氢氧化物中的一种或多种,接枝修饰的透明质酸和/或其衍生物(I);将促干细胞分化剂与I偶联或交联,处理得到外壳载体材料;将外壳载体材料包裹核酸结构与金属离子螯合作用形成的内核,构建了纳米粒。上述构建方式形成纳米粒稳定、路线简便易行,可以实现工业化应用,具有市场价值。
本发明的目的是构建一种包含干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物,其中,该组合物通过抗炎效应调控骨关节微环境,从而改善干细胞定向分化形成软骨组织效应,用于骨关节退行性疾病的治疗。该组合物利用相关基因的沉默效应,协同小分子干细胞定向分化剂的促干细胞分化能力,在改善炎症微环境的同时促进炎症部位干细胞的定向分化。
因此,在本发明中,我们设计以干细胞定向分化剂和含氧化物、透明质酸聚合物为骨架,形成外壳载体材料,又通过具有抗炎功能活性物质、金属离子的络合作用,形成金属离子配合物内核。保证纳米粒子在介质中粒径的稳定性,实现具有抗炎功能活性物质,比如核酸结构和干细胞定向分化剂的共递送的目的。通过纳米沉淀法所制备的粒子的水合粒径,可以在200nm左右,电位接近-15mV。所制备的纳米粒子能够有效递送相关核酸结构,并有效沉默相关基因的表达。此外,所制备的纳米粒子能够在体外模拟条件下缓慢释放干细胞定向分化剂,并对间充质干细胞具有显著的促软骨分化作用。在体内应用方面,同时含有干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物,对OA的改善是最为显著的,因此具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为纳米粒子改善疾病进程治疗OA策略设计思路示意图(举例);
图2为纳米粒子中AHK材料合成路线图(举例);
图3为AHK材料合成主要成分核磁表征;
图4为纳米粒子制备工艺示意图;
图5为纳米粒子的粒径及电位表征图;
图6为纳米粒子siRNA及KGN药物释放曲线图;磷酸钙纳米粒子稀释稳定性及放置稳定性表征;磷酸钙元素分析表征图谱;
图7为在RAW 264.7细胞及间充质干细胞上纳米粒子的摄取分析;
图8为在RAW 264.7细胞上纳米粒子对CA9基因沉默效力分析;
图9为在间充质干细胞上纳米粒子的促软骨化效力分析;
图10为在RAW 264.7细胞上纳米粒子改善炎症微环境中M1型巨噬细胞效力分析;
图11为在间充质干细胞上纳米粒子通过RAW 264.7细胞改善的条件培养基促进干细胞软骨化效力分析;
图12为碘乙酸诱导OA小鼠模型检测纳米粒子关节腔给药后小鼠的OA进展评价;
图13为碘乙酸诱导OA小鼠模型检测纳米粒子关节腔给药后增强外源性干细胞改善OA进展评价;
图14为纳米粒子体内安全性评价。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明,下面给出实施例。需要指出的是,这些实施例完全是例证性的。给出这些实施例的目的是为了充分明示本发明的意义和内容,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1包含干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物
本发明提供了一种包含干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物,其中,该组合物通过抗炎效应调控骨关节微环境,从而改善干细胞定向分化形成软骨组织效应,用于骨关节退行性疾病的治疗;其中,干细胞定向分化剂包括Kartogenin(KGN),和/或可从结构中解离出联苯胺结构的分子量小于1000Da的小分子化合物和/或,葡萄糖胺和/或其变体结构、***和/或其变体结构一种或多种;具有抗炎功能的活性物质为具有炎症微环境相关因素调节功能的活性分子化合物或化合物片段,优选为核酸结构;所述骨关节退行性疾病,优选为骨关节炎。在一种实施方式中,该组合物还包括磷酸盐缓冲体系和/或金属盐溶液中的一种或多种。磷酸盐缓冲体系和/或金属盐溶液为组合物,尤其是纳米粒子提供了相应的环境稳定剂。在另一种实施方式中,该组合物与干细胞联合用药,包括关节腔注射给药、肌肉注射、透皮吸收中的一种或多种;通过关节腔注射给药的干细胞单次用量不超过1000w/kg,干细胞定向分化剂和所述核酸结构的单次用药剂量分别不超过50μM及5μM。
再一种实施方式中,干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质分别发挥炎症调控及促干细胞分化效力,在组合物中质量配比范围为1∶50至50∶1范围;干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质的组合形式包括微球、纳米粒子、凝胶包载物和/或骨架填充物中的一种或多种形式;其中该组合物优选为纳米制剂。
又一种实施方式中,干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合形式为纳米粒子,该纳米粒子包括外壳载体材料和金属离子配合物内核;其中,外壳载体材料,包括磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物、氢氧化物和/或单氧化物中的一种或多种、透明质酸和/或其衍生物,与干细胞定向分化剂的偶联和/或交联化物;金属离子配合物内核,包括核酸结构与金属离子的螯合化物;其中,核酸结构包括小分子核酸、大分子核酸和/或其变体结构,和/或结构片段中的一种或多种;金属离子包括Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、La3+、Al3+、Zn2+、Mg2+中的一种或多种;偶联和/或交联,包括形成稳固作用力的键合作用,键合作用力大于25℃下水分子的相互作用力;纳米粒子的组装形式还包括配位作用,如图1所示。
其中,磷酸化物为单磷酸类化合物、双磷酸类化合物和/或包含磷酸结构的其他小分子;单磷酸类化合物包括磷酸锰、磷酸钙、磷酸镧、磷酸钠中的一种或多种;双磷酸化物包括阿仑膦酸、利塞膦酸、氯膦酸、唑来膦酸、特立帕肽中的一种或多种;碳酸化物和/或硫酸化物包括碳酸钙和/或硫酸钙;羧酸化物包括羧酸钙和/或羧酸锰;氢氧化物包括氢氧化铁、偏铝酸、氢氧化镁中的一种或多种;单氧化物包括氧化铁、氧化锌和/或其修饰物中的一种或多种;
透明质酸和/或其衍生物为天然和/或合成的高分子聚合物材料,分子量范围在1~1000kDa之间;优选地,透明质酸和/或其衍生物,包括透明质酸、水解透明质酸、乙酰化透明质酸、透明质酸钠交联聚合物、硅烷化透明质酸、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸中的一种或多种;
小分子核酸包括siRNA、microRNA(miRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、small nucleolar RNA(snoRNA),和/或转运RNA(tRNA)中的一种或多种;大分子核酸包括mRNA、DNA和/或其变体结构中的一种或多种。
该纳米粒子通过DLS检测,水合粒径在20nm~2000nm间,电位大于-50mV;其中,水合粒径优选在100nm~1000nm之间;电位优选在-30mV~+20mV。发明人经过多次试验研究表明,干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合的上述纳米粒子形态,纳米粒在pH3.0~9.0范围内,随着介质环境pH的提升,粒径逐渐增大,形貌由均匀分散的颗粒状重新分布为不规则的聚集体;处于细胞介质环境中,所述核壳型纳米粒在100h左右逐渐释放所述促干细胞分化剂;在含血清的介质中,所述核壳型纳米粒中的核酸结构能够完整稳定存在超过36h;经过opti介质稀释200倍,所述核壳型纳米粒的粒径变化范围不超过50nm。
如图1所示,该纳米粒子具有改善OA炎症微环境、促进OA状态下体内外干细胞治疗效应、改善OA条件下体内外干细胞定向软骨分化、和/或显著改善OA进程中一种或多种的用途。
实施例2纳米粒子的制备方法
如实施例1所示的纳米粒子,其制备方法包括以下步骤:将磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物和/或氢氧化物中的一种或多种,和透明质酸和/或其衍生物通过酰胺化反应,形成所述磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物和/或氢氧化物中的一种或多种,接枝修饰的透明质酸和/或其衍生物(I);将促干细胞分化剂与I偶联或交联,处理得到外壳载体材料;将外壳载体材料包裹核酸结构与金属离子螯合作用形成的内核,构建了纳米粒。
其中,将外壳载体材料、核酸结构的水溶液、缓冲体系和金属离子溶液分步混合,均质化后得到所述纳米粒子;均质化过程包括超声波混合、涡旋振荡混合、移液枪吹打混合和/或其他包含剪切力、惯性力、吸附力、空化作用的混合方式;优选地,缓冲体系包括Hepes,NaCl和Na2HPO4,浓度范围分别为5~500mM,200~600mM和0.1~2mM;缓冲体系的pH范围在3.0~10.0之间,优选在6.0~9.0之间。本发明中具体地,上述构建方式形成纳米粒稳定、路线简便易行,可以实现工业化应用,具有市场价值。
实施例3磷酸钠、KA34、乙酰化透明质酸偶联材料的合成
在本实施例中,制备磷酸钠、KA34、乙酰化透明质酸偶联材料聚合物,以乙酰化透明质酸和磷酸钠为原料,通过偶联反应将磷酸钠连接到乙酰化透明质酸侧链,得到磷酸接枝修饰的乙酰化透明质酸。再以邻苯二甲酸和Boc保护的乙二胺为原料,通过控制两者的投料比(1∶1)得到中间产物,将此中间产物与联苯胺按照合适的投料比(1∶1)得到Boc保护的乙二胺化的KA34,再用HCl将Boc保护脱除得到乙二胺化的KA34。将KA34通过酰胺化反应偶联在磷酸接枝修饰的乙酰化透明质酸上,以透析和冻干的后处理方式得到终产物磷酸钠、KA34、乙酰化透明质酸偶联材料。
实施例4唑来膦酸、KGN、硅烷化透明质酸偶联材料的合成
在本实施例中,制备唑来膦酸、KGN、硅烷化透明质酸偶联材料聚合物,以硅烷化透明质酸和唑来膦酸为原料,通过酰胺化反应将唑来膦酸连接到硅烷化透明质酸侧链,得到唑来膦酸接枝修饰的硅烷化透明质酸。再以邻苯二甲酸和Boc保护的乙二胺为原料,通过控制两者的投料比(1∶1)得到中间产物,将此中间产物与联苯胺按照合适的投料比(1∶1)得到Boc保护的乙二胺化的KGN,再用HCl将Boc保护脱除得到乙二胺化的KGN。最后再通过将乙二胺化的KGN与唑来膦酸接枝修饰的硅烷化透明质酸偶联,以透析和冻干的后处理方式得到终产物唑来膦酸、KGN、硅烷化透明质酸偶联材料。
实施例5碳酸钙、TD-198946(干细胞定向分化剂)、水解透明质酸偶联材料的合成
在本实施例中,制备碳酸钙、TD-198946、水解透明质酸偶联材料聚合物。以水解透明质酸和碳酸钙为原料,通过偶联反应将碳酸钙连接到水解透明质酸侧链,得到碳酸接枝修饰的水解透明质酸。将TD-198946通过酰胺化反应偶联在碳酸接枝修饰的水解透明质酸上,以透析和冻干的后处理方式得到终产物碳酸钙、TD-198946、水解透明质酸偶联材料。
实施例6氢氧化镁、GlcN、透明质酸钠交联聚合物偶联材料的合成
在本实施例中,制备氢氧化镁、GlcN、透明质酸钠交联聚合物偶联材料。以透明质酸钠交联聚合物和氢氧化镁为原料,通过偶联反应将氢氧化镁连接到透明质酸钠交联聚合物侧链,得到氢氧化镁接枝修饰的透明质酸钠交联聚合物。将GlcN通过酰胺化反应偶联在氢氧化镁接枝修饰的透明质酸钠交联聚合物上,以透析和冻干的后处理方式得到终产物氢氧化镁、GlcN、透明质酸钠交联聚合物偶联材料。
实施例7氧化铁、DEX、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸偶联材料的合成
在本实施例中,制备氧化铁、DEX、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸。以羟丙基三甲基氯化铵透明质酸和氧化铁纳米粒为原料,通过偶联反应将氧化铁连接到羟丙基三甲基氯化铵透明质酸侧链,得到氧化铁接枝修饰的羟丙基三甲基氯化铵透明质酸。将DEX通过酰胺化反应偶联在氧化铁接枝修饰的羟丙基三甲基氯化铵透明质酸上,以透析和冻干的后处理方式得到终产物氧化铁、DEX、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸偶联材料。
实施例8阿仑膦酸钠、KGN、透明质酸偶联材料(AHK)合成及聚合物表征
在本实施例中,以透明质酸和阿仑膦酸钠为原料,通过酰胺化反应将阿仑膦酸连接到透明质酸侧链,得到阿仑膦酸接枝修饰的透明质酸,即AHA材料。再以邻苯二甲酸和Boc保护的乙二胺为原料,通过控制两者的投料比(1∶1)得到中间产物,将此中间产物与联苯胺按照合适的投料比(1∶1)得到Boc保护的乙二胺化的KGN,再用HCl将Boc保护脱除得到乙二胺化的KGN。最后再通过将乙二胺化的KGN与AHA偶联,以透析和冻干的后处理方式得到终产物AHK。此外,分别通过核磁共振氢谱图验证产物结构,如图2和图3所示。
实施例9磷酸钠、KA34、乙酰化透明质酸偶联材料/miRNA纳米粒的构建
采用实施例3的合成方法,制备磷酸钠、KA34、乙酰化透明质酸偶联材料作为外壳载体材料,在Hepes,NaCl和Na2HPO4组成的缓冲体系下,与miRNA和Fe2+溶液分步混合,包裹miRNA与Fe2+螯合作用形成的金属离子配合物内核,通过涡旋振荡混合,均质化后构建了磷酸钠、KA34、乙酰化透明质酸偶联材料/miRNA纳米粒。其中,缓冲体系中Hepes,NaCl和Na2HPO4,浓度分别为5mM,600mM和0.1mM;缓冲体系的pH值在3.0左右。
实施例10唑来膦酸、KGN、硅烷化透明质酸偶联材料/snoRNA纳米粒的构建
采用实施例4的合成方法,制备唑来膦酸、KGN、硅烷化透明质酸偶联材料作为外壳载体材料,在Hepes,NaCl和Na2HPO4组成的缓冲体系下,与snoRNA和Fe3+溶液分步混合,包裹snoRNA与Fe3+螯合作用形成的金属离子配合物内核,通过超声波混合,均质化后构建了唑来膦酸、KGN、硅烷化透明质酸偶联材料/snoRNA纳米粒。其中,缓冲体系中Hepes,NaCl和Na2HPO4,浓度分别为500mM,200mM和2mM;缓冲体系的pH值在10.0左右。
实施例11碳酸钙、TD-198946、水解透明质酸偶联材料/piRNA纳米粒的构建
采用实施例5的合成方法,制备碳酸钙、TD-198946、水解透明质酸偶联材料作为外壳载体材料,在Hepes,NaCl和Na2HPO4组成的缓冲体系下,与piRNA和Mg2+溶液分步混合,包裹piRNA与Mg2+螯合作用形成的金属离子配合物内核,通过移液枪吹打混合,均质化后构建了碳酸钙、TD-198946、水解透明质酸偶联材料/piRNA纳米粒。其中,缓冲体系中Hepes,NaCl和Na2HPO4浓度分别为100mM,400mM和1.0mM,pH值在6.0左右。
实施例12氢氧化镁、GlcN、透明质酸钠交联聚合物偶联材料/lncRNA纳米粒的构建
采用实施例6的合成方法,制备氢氧化镁、GlcN、透明质酸钠交联聚合物偶联材料作为外壳载体材料,在Hepes,NaCl和Na2HPO4组成的缓冲体系下,与lncRNA和Mn2+溶液分步混合,包裹lncRNA与Mn2+螯合作用形成的金属离子配合物内核,通过均质机混合,均质化后构建了氢氧化镁、GlcN、透明质酸钠交联聚合物偶联材料/lncRNA纳米粒。其中,缓冲体系中Hepes,NaCl和Na2HPO4浓度分别为300mM,100mM和0.5mM,pH值在9.0左右。
实施例13氧化锌、DEX、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸偶联材料/DNA纳米粒的构建
采用实施例8的合成方法,制备氧化锌、DEX、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸偶联材料作为外壳载体材料,在Hepes,NaCl和Na2HPO4组成的缓冲体系下,与DNA和Zn2+溶液分步混合,包裹DNA与Zn2+螯合作用形成的金属离子配合物内核,通过均质机混合,均质化后构建了氧化锌、DEX、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸偶联材料/DNA纳米粒。其中,缓冲体系中Hepes,NaCl和Na2HPO4浓度分别为100mM,200mM和0.9mM,pH值在7.0左右。
实施例14 AHK-CaP/siRNA纳米粒的构建与制剂学表征
1、使用动态光散射法、透射电镜、扫描电镜考察纳米制剂的粒径、电位、多分散系数和形貌;使用琼脂糖凝胶电泳、动态光散射法、荧光定量法,考察纳米粒血清保护能力、稳定性、pH响应性、载体解散和siRNA药物的释放能力。
2、采用实施例8的合成方法,制备AHK,选用接枝阿仑磷酸和KGN的透明质酸聚合物AHK作为外壳载体材料,在Hepes,NaCl和Na2HPO4组成的缓冲体系下,与siRNA和Ca2+溶液分步混合,包裹siRNA与Ca2+螯合作用形成的磷酸钙内核,均质化后构建了核壳型AHK-CaP/siRNA纳米粒,同时构建AHA-CaP/siRNA纳米粒作为对照组,如图4所示。
均质化过程包括超声波混合、涡旋振荡混合、移液枪吹打混合和/或其他包含剪切力、惯性力、吸附力、空化作用的混合方式;缓冲体系中Hepes,NaCl和Na2HPO4,浓度分别为100mM,300mM和1.2mM;缓冲体系的pH值在6.0左右。
利用动态光散射(DLS),研究了不同处方比例下纳米粒的粒径和PDI,并确定了较优的处方组成。随后,对纳米粒的粒径、PDI和Zeta电位进行了基本表征,如图5所示。通过琼脂糖凝胶电泳实验,评估了纳米粒在血清中保护siRNA免受核酶降解的能力。通过DLS测定,考察了纳米粒的放置稳定性和稀释稳定性。此外,还研究了在不同pH条件下纳米粒的粒径变化、形貌变化以及siRNA释放行为。并通过液相色谱-质谱(LC-MS)法,对AHK-CaP/siRNA纳米粒中KGN的释放行为进行了表征,如图6所示。
实施例15纳米粒子对细胞的摄取行为
1、将RAW 264.7细胞密度调至2×105细胞/mL,将1mL细胞悬液接种至12孔板中,将孔板放入37℃,5%CO2的培养箱中,培养24h。分别用Opti-MEM培养基稀释的各组制剂转染Cy5-siRNA,终浓度为100nM,给药体积为1mL,继续培养6h。随后,用PBS洗涤细胞3次。将细胞用0.25%胰酶消化,收集细胞悬液。将收集到的细胞悬液用1000rpm离心5min,弃去上清液。用PBS洗细胞2次,再次离心。将细用流式细胞仪测定各组细胞对纳米粒的摄取情况,分析细胞内Cy5的荧光强度。(采集10000个细胞,激发波长为650nm,发射波长为670nm,采集数据使用FCS Express V3软件分析)。
2、将RAW 264.7细胞分散至2×105细胞/mL,以2mL/皿接种到含有玻璃盖玻片的培养皿中,37℃,5%CO2培养至60-70%密度。向培养皿中加入用Opti-MEM培养基稀释的各组制剂转染Cy5-siRNA,终浓度为100nM,给药体积为2mL,继续培养6h。培养结束后,用PBS洗涤细胞,以去除未被摄取的纳米粒。使用4%多聚甲醛固定细胞30min,配制罗丹明-鬼笔环肽(终浓度500nM)与Hoechst 33342(终浓度5μg/mL)的混合液,加入小皿进行室温染色10min后,PBS洗三次,最后使用1mL甘油/PBS封片液(V/V=9∶1)覆盖,4℃避光保存。使用蔡司超分辨率激光共聚焦(LSM880+airyscan)进行观察拍摄。其中,Hoechst 33342激发光波长346nm,发射光波长为460nm;Rhodamine激发光波长567nm,发射光滤片为长波通(LP)590nm;Cy5激发光波长为650nm,发射滤光片波长670nm。
3、针对纳米粒子在干细胞中的摄取行为,除使用细胞系替换为小鼠间充质干细胞外,其余操作与本实施例(实施例15)相同。
4、激光共聚焦显微镜考察纳米粒溶酶体逃逸能力:将RAW 264.7细胞分散至20万/mL,接种2mL到直径20mm的玻底小皿中。培养24h后加入LPS(终浓度5μg/mL)诱导细胞活化,并培养过夜。使用Opti-MEM稀释含Cy5-siRNA的不同纳米粒制剂(终浓度为100nM),每孔给药1.5mL换液。将玻底小皿放入37℃,5%CO2的培养箱中进行培养。3h、6h、9h后将药液吸去,使用PBS洗涤细胞以去除未被摄取的纳米粒。多聚甲醛固定后向细胞中加入Lyso TrackerRed(终浓度为300nM),孵育30min染色溶酶体。将Hoechst 33342(终浓度为10μg/mL)加入到细胞培养液中,孵育约15min以染色细胞核。使用PBS洗涤细胞,去除多余的染料。使用激光共聚焦显微镜观察细胞内纳米粒与溶酶体的共定位情况。分析Cy5-siRNA、Lyso TrackerRed和Hoechst 33342信号在细胞内的分布及其重叠程度,以评估纳米粒的溶酶体逃逸能力。其中,Hoechst 33342激发光波长346nm,发射光波长为460nm。Cy5激发光波长为650nm,发射滤光片波长670nm;Lyso Tracker Red激发光波长577nm,发射光滤片为长波通(LP)590nm。
试验结论:
如图7所示,流式细胞术和激光共焦显微镜结果表明,该纳米粒子能被RAW 264.7细胞及间充质干细胞高效摄取。同时,在RAW 264.7细胞中,纳米粒子在6h内可有效发生溶酶体逃逸行为。
实施例16纳米粒子体外基因沉默效应——RT-PCR
1、细胞准备及给药:
将RAW 264.7细胞以每孔30万接种于6孔板中,待细胞生长至60-70%的密度后加入LPS(终浓度10μg/mL)诱导细胞活化,并继续培养10h。加入2mL Opti-MEM培养基稀释的各组含siRNA的制剂(siRNA给药终浓度为100nM;浓度依赖测试时siRNA终浓度为100nM,50nM,25nM)。转染6h后,弃去上清并使用PBS洗2遍,添加2mL新鲜DMEM完全培养基,继续培养24h。
2、RNA提取:
弃去培养基,用预冷的PBS洗涤细胞2次,每孔加入1mL试剂,室温15min,4℃静置1h,充***解细胞,随后使用枪头吹打细胞至无明显聚集物。吸取溶液至1.5mL无核酶离心管。每孔收集液加入0.2mL氯仿,涡旋混匀1min后在冰浴中静置5min。然后在4℃条件下,对样品进行15min的离心,离心力为12000g。离心后,将上层水相转移到新的无核酶管中(每份样品保持一致,约400μL)。随后等体积的异丙醇加入后,涡旋5s并将样品在冰浴中静置10min,4℃12000g条件下离心10min。上清液被废弃,然后加入1mL 75%乙醇并轻柔震荡混合。在4℃条件下,7500g离心5min,上清液再次被废弃,这个过程重复一次。最终,上清被完全弃去,RNA溶液在超净台中干燥10min,随后使用移液枪将多余残留溶液吸弃,再加入10μL无核酶的水进行溶解。
3、RNA纯度及浓度测定:
反复吹打上述样品,取2μL RNA溶液,使用NanoDrop超微量分光光度计测定其A280和A260值,并读取RNA浓度。纯RNA样品的A260/A280比值在1.9-2.1之间。
4、RNA反转录为cDNA:
统一稀释各组RNA溶液,终浓度125ng/μL。剩余RNA样品立即放入-80℃冰箱。在八联管中混合下表中各物质作为溶液A,使用PCR扩增仪设定程序:70℃5min,4℃15min。之后取出并置于冰上静置备用。
按下表混合溶液B,并加入上述样品中。依次:25℃5min,42℃1h,70℃15min,最后4℃保存。
5、聚合酶链式反应扩增cDNA:
按照下表在八联管中加样;内参和目的基因(CA9)组分别同时进行。
6、使用Bio-Rad定量PCR仪(CFX ConnectTM)进行扩增,预变性步骤为95℃10min,PCR共进行60个循环,循环步骤分别为95℃30s,57℃60s,72℃60s。融解曲线分析步骤为95℃60s,55℃5s,95℃30s。最终,使用CFX Manager软件处理数据。将未给药组的mRNA水平设为100%,并计算给药组相对mRNA表达(%)水平。具体计算公式如下:
试验结论:
如图8所示,在RAW 264.7细胞上,纳米粒子可有效沉默CA 9基因的水平,基因沉默效率达70%,表明纳米粒子有效发挥了siCA9的效应,可见,纳米离子可以沉默相应核酸结构的基因水平,发挥相应核酸结构的效应。
实施例17纳米粒子体外基因沉默效应——Western Blot
RAW 264.7细胞以30万/孔接种于六孔板中,每孔加入2mL DMEM完全培养基,待培养细胞融合度至60-70%后,向每孔加入LPS(终浓度10μg/mL)培养过夜。将培养基弃去后,使用Opti-MEM将各组制剂稀释至100nM的siRNA终浓度,每孔添加2mL。将细胞板置于细胞培养箱中,进行6h的培养。之后,更换培养基为DMEM完全培养基,再继续进行24h的培养。按如下方式继续进行蛋白含量检测实验:
胞内蛋白提取:
将培养基弃去后,每孔加入1mL PBS进行三次洗涤。之后,加入200μL细胞裂解剂(按照RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂的比例为99∶1,v/v),并将细胞板置于冰上进行30min的裂解。随后,使用刮刀将细胞刮下并吸取至1.5mL离心管中,探头超声处理2min,在4℃下以12000rpm的速度离心15min。将上清液吸取备用。
蛋白定量:
(1)使用BCA试剂盒定量蛋白质,按照试剂盒说明书操作。准备工作液:将BCA试剂和Cu试剂按照50∶1的比例配制成BCA工作液。
(2)稀释标准品:将10μL BSA标准品用PBS稀释至100μL,浓度为0.5mg/mL。将标准品按照0、2、4、6、8、12、16、20μL的体积加入96孔板的蛋白标准品孔中,并用PBS补足至20μL。
(3)稀释样品:将样品适当稀释后,加入96孔板的样品孔中,每孔加入20μL。
(4)测量和计算:将200μL BCA工作液加入各孔中,37℃静置15-30min后,在多功能酶标仪上测定A562nm值。根据标准曲线计算出样品的实际蛋白浓度(单位:μg/μL)。
(5)蛋白变性保存:将各组样品的蛋白浓度稀释至相同浓度。加入6×Proteinloading buffer,煮沸15min使蛋白质变性,然后置于-20℃保存。
SDS-PAGE凝胶电泳:
(1)使用一步法凝胶快速制备试剂盒进行操作:将等体积的4mL下层胶溶液和4mL下层胶缓冲液混合,加入80μL改良型过硫酸铵溶液并混匀灌胶;再将等体积的1mL上层胶缓冲液和1mL上层胶溶液混合,加入20μL改良型过硫酸铵溶液并混匀,使用平移枪头灌胶。***梳齿后,待上层胶凝固即可进行电泳。
(2)上样:加入足量电泳缓冲液,将保存的蛋白质样品在100℃下煮沸5min,并按照每个孔相同的蛋白质量(20-30μg)上样。
(3)电泳:以80V电泳30min,然后将电压提高至120V,继续电泳直至蓝色的loadingbuffer条带至玻璃板底部。
转膜:
根据所检测的蛋白质分子量和Marker的结果,将含有目标蛋白的凝胶切割下来并放入冰转膜液中平衡10min。准备6张与转膜夹等大的滤纸和1张稍大于凝胶的PVDF膜。将PVDF膜放置在无水甲醇中至少活化15s以上,然后与滤纸一同浸泡在转膜液中10min。按照阳极到阴极的顺序,依次安放:海绵、3张滤纸、凝胶、PVDF膜、3张滤纸、海绵,做成电转“三明治”,并将其放入转移槽中。接通电源,在冰浴条件下按照恒流200mA的条件转移2.5h。
显色:
(1)封闭:将膜用TBST缓冲液洗除转膜液,然后在室温下用含有5%脱脂奶粉的适量TBST液中封闭2h。
(2)洗涤:用TBST溶液洗膜五次,每次4min。
(3)孵育一抗:用5%脱脂奶粉的TBST液将一抗稀释到一定比例(anti-β-actin 1∶2000,其他蛋白一抗1∶1000),然后将膜与一抗溶液置于4℃的摇床中过夜。
(4)洗涤:用TBST溶液洗膜五次,每次4min。
(5)孵育二抗:将不同的二抗用5%脱脂奶粉的TBST液稀释1000倍,然后在室温下孵育2h。
(6)再次用TBST溶液洗膜五次,每次4min,然后将PVDF膜与显色剂试剂(HPR显色液,现用现配,1mL)反应,发出化学发光信号。立即拍摄结果。
试验结论:
如图8所示,在RAW 264.7细胞上,纳米粒子可有效抑制CA 9蛋白的表达,表明纳米粒子有效沉默siCA9基因,即纳米离子可以有效沉默相应核酸结构的基因。
实施例18体外纳米粒子促干细胞分化
1.使用全骨髓培养法提取并表征了小鼠BMSCs。随后我们采用CCK-8试剂盒、流式细胞技术、激光共聚焦显微镜研究了AHK-CaP/siRNA纳米粒在小鼠BMSCs中的细胞毒性以及摄取能力。随后通过RT-PCR实验考察制剂对BMSCs的软骨化进程中的基因表达(Col2α1、ACAN);另外,为了进一步考察纳米粒重塑后的炎症微环境对BMSCs的软骨化的影响,我们将纳米粒预处理后的LPS激活的RAW 264.7巨噬细胞条件培养基用于BMSCs的培养,并通过RT-PCR实验考察BMSCs软骨化进程相关的基因表达。除此以外,我们还通过阿利新蓝染色实验表征了纳米粒促进干细胞分化的能力。最后,通过免疫荧光染色实验(ICH)以及WesternBlot实验表征了经由纳米粒介导的炎症微环境重塑后,BMSCs的二型胶原蛋白表达情况,探究制剂介导的炎症微环境重塑对干细胞软骨化的影响。
2.主要实验材料:
Cy5-siRNA,苏州瑞博生物技术有限公司;C57BL/6 2周龄小鼠,75%乙醇;阿利新蓝染液、CCK-8活细胞检测试剂盒,上海碧云天;96孔板,康宁;LPS(BR),上海源叶生物;酶标仪;离心机;细胞计数器;细胞筛70μm;组织剪、剪刀、镊子;上海治宇医疗器械有限公司;1mL一次性无菌注射器,上海碧迪医疗器械有限公司;20mm共聚焦玻底小皿;45mm细胞培养皿;25mm培养瓶;15mL离心管,DMEM培养基、α-MEM培养基,中科迈晨;阿利新蓝,塞维尔公司;胎牛血清,江苏ExCell Bio;双抗,胰酶,RAW 246.7细胞,中国医学科学院基础医学研究所;FITC-CD44抗体、PE-SCA-1抗体、PC5.5-CD31抗体、APC-CD117抗体、FACS管,盛世中方;小鼠BMSCs,浙江美森细胞科技有限公司;Anti-Collagen II抗体(兔抗鼠,一抗),abcam公司;Goat Anti-Rabbit IgG HL(FITC),北京永泰兴城有限公司。
3.实验方法:
1)小鼠BMSCs提取及分离:取10-14天C57BL/6小鼠5只进行骨髓收集。在无菌条件下,处死小鼠并使用75%乙醇浸泡10min。将小鼠的髋骨和股骨剪断并去除肌肉和韧带。将骨头转移到无菌培养皿中,用无菌钳子固定骨头,用1mL针头注射器中的细胞培养基冲洗骨髓腔,1000rpm离心收集骨髓细胞。使用含有10%胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞。将收集到的骨髓细胞在离心管中离心,弃去上清液,用培养基重悬细胞。将重悬的细胞倒入含有10%胎牛血清和1%抗生素(如青霉素/链霉素)的培养基中。将细胞密度调整为1×106细胞/mL,并将细胞接种到25cm2细胞培养瓶中。将细胞培养瓶放入37℃,5%CO2的细胞培养箱中。观察细胞贴壁生长情况,分别于3h、10h、24h、48h进行半量换液(在25瓶中取出一半培养基并补加新培养基到原液中),随后使用含有10%FBS的胎牛血清的α-MEM完全培养基每隔48h换液一次。当细胞贴壁生长达到80%-90%时,用0.25%胰酶/EDTA消化液进行传代。将细胞离心后(1000rpm,4min),用新鲜培养基重悬细胞,并将细胞根据实际的密度情况按1∶2或1∶3的比例进行传代培养。
2)取第二代提取分离的BMSCs,细胞以每孔30万接种于6孔板中。待细胞融合度达到70-80%后加入2mL Opti-MEM培养基稀释的各组含siRNA的制剂(siRNA给药终浓度为100nM),转染6h后,弃去制剂。更换为2mL新鲜α-MEM完全培养基,继续培养24h后,弃去培养基,用预冷的PBS洗涤细胞三次,加入1mL试剂,4℃静置1h,使其充***解细胞,用枪头吹打细胞至无明显聚集物,吸取溶液至1.5mL无核酶离心管。分别通过提取总RNA、RNA纯度及浓度测定、RNA反转录为cDNA及聚合酶链式反应扩增cDNA进行操作,具体步骤同前所述。相关的引物序列如下表所示:
试验结论:
如图9~11所示,在小鼠骨髓来源的间充质干细胞上,纳米粒子可有效发挥KGN等促干细胞分化行为。
实施例19纳米粒子在OA模型小鼠的体内疗效和安全性评价
1.首先通过1%碘乙酸钠(MIA)关节腔内注射成功构建了小鼠OA模型。接着,对这些小鼠进行了不同制剂的治疗,并通过监测缩爪痛阈值来间接评估各制剂的综合疗效。治疗结束后,对小鼠膝关节进行了解剖,观察并记录了股骨髁、胫骨平台和滑膜的外观。为了进一步分析膝关节软骨下骨的改善情况,采用MicroCT技术研究了软骨损伤程度、骨赘生成等微观结构变化。随后,膝关节样本进行了H&E染色和番红O-固绿染色。根据染色结果,采用国际骨关节炎研究协会(OARSI)组织病理学评分标准,对滑膜及软骨的染色结果进行组织学评分,以分析滑膜炎症和软骨修复情况。同时,实验还通过ELISA方法检测了小鼠膝关节局部及全身血清中炎症因子的表达水平,并利用PCR技术进一步考察了小鼠膝关节组织中与软骨修复和炎症相关的基因表达水平。此外,还通过观察小鼠治疗期间的体重变化来评估制剂的整体安全性。在治疗终点,通过小鼠血常规、血生化及主要脏器的H&E染色实验来评价纳米粒在体内的安全性。
2.实验方法:
1)Von Frey电子测痛仪测定小鼠足底疼痛:
将待测小鼠放在有底笼中;用一只手轻轻固定小鼠,避免其活动过度;使用VonFrey电子测痛仪的探针,自下而上逐渐增加力度触碰小鼠的足底,直至小鼠产生明显的缩足反应;在触碰引发缩足反应的瞬间,记录Von Frey电子测痛仪上的阈值(单位:g):对同一只小鼠,重复上述步骤测试两次,共进行三次测量,求平均值作为其疼痛阈值;对所有小鼠重复步骤上述步骤,记录各组小鼠的疼痛阈值。
2)膝关节MicroCT观测:
将小鼠膝关节放置于组织固定液中,以4℃固定72h(充分固定)。使用高分辨率Inveon microCT扫描仪(德国Siemens)扫描固定的关节。扫描参数设置为有效像素尺寸为8.82μm,电流为500μA,电压为80keV,每360个旋转步骤中的曝光时间为1500ms。通过对扫描数据进行分析和重建,包括骨体积/总组织体积BV/TV(Bone Volume/Total Volume)、骨小梁分离度Tb.Sp(Trabecular Separation)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁数量Tb.N(trabecular bone number)等指标进行分析。
3)膝关节组织切片制备及染色观察和组织病理学评分
将组织浸入固定液中,放置于4℃过夜。然后分别进行石蜡包埋制作切片。具体步骤如下:
i.去钙:将标签与组织按一一对应的顺序放入有孔管或包埋盒中,接着放入容器中,加入新型去钙液,密封。将容器置于恒温摇床上,控制温度在25℃至30℃范围内,进行去钙处理。摇床速度控制在110-120rpm,去钙液更换周期为2-3天。观察去钙过程,当针可穿透组织时,用刀片将组织沿矢状面切开,以加快软化速度。
ii.脱水浸蜡:取出软化的骨组织,用流水冲洗半天,放入脱水篮中,在脱水机内依次使用梯度酒精进行脱水。75%酒精2h-85%酒精2h-90%酒精1.5h-95%酒精2h-无水乙醇I 2h-无水乙醇II 2h-醇苯40min-二甲苯I 40min-二甲苯II 40min-65℃熔化石蜡I 0.5h-65℃熔化石蜡II 1h-65℃熔化石蜡III 2h 45min。
iii.包埋:在包埋机内对浸蜡组织进行包埋。首先将熔化的石蜡倒入包埋盒,在蜡凝固前将组织从脱水盒中取出,按照包埋面要求放入包埋盒并贴上相应标签。在-20℃冷冻台冷却,待蜡凝固后将蜡块从包埋盒中取出并修整。
iv.切片:将修整好的蜡块放置在石蜡切片机上进行切片,厚度为4μm。将切片在摊片机40℃水上漂浮,使组织展平,用载玻片捞起组织。将玻片放入60℃烘箱内烘烤,待水分蒸发、石蜡熔化后取出,室温保存备用。
v.对于滑膜炎的程度,根据滑膜的特征(如滑膜衬里细胞层、基质细胞密度和炎症浸润),在H&E染色切片上进行滑膜分级,改变的等级按比例排列从无(0)、轻(1)和中(2)到重(3)。参考滑膜炎评分建议标准对结果进行半定量分析比较。
vi.关于关节软骨,使用国际骨关节炎研究协会(OARSI)提议的评分标准对软骨退化进行分级和评分,适用于关节的四个象限:股骨内侧髁(MFC)、胫骨内侧平台(MTP)、股骨外侧髁(LFC)和胫骨外侧平台(LTP)
试验结论:
如图12、图14所示,在早期骨关节炎小鼠模型上,纳米粒子可通过有效改善骨关节炎的炎症微环境,促进骨关节炎软骨化进程,实现关节炎疾病状态改善的治疗效应。
实施例20纳米粒子改善炎症微环境促进外源性干细胞OA治疗效应
1.目的和原理:
利用1%MIA关节腔内注射方式构建小鼠OA模型。并在不同纳米粒给药治疗的同时补充外源性小鼠间充质干细胞进行辅助治疗。并在治疗终点,通过MicroCT实验考察了小鼠软骨损伤程度、骨赘生成等微观结构变化。通过H&E染色和番红O-固绿染色,并采用国际骨关节炎研究协会(OARSI)组织病理学评分标准,对滑膜及软骨的染色结果进行组织学评分,分析滑膜炎症和软骨损伤缓解情况。通过RT-PCR实验考察小鼠膝关节组织中与软骨修复和炎症相关的基因表达水平。
2.材料与方法:
1)材料:MIA来自于上海Adamas公司;氯化钠注射液由山东华鲁制药有限公司提供;OCT包埋剂、苏木素染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、二甲苯、中性树胶、番红固绿(骨组织)染液套装、DAB显色剂均为武汉赛维尔生物科技有限公司产品;1mL BD一次性无菌注射器来自上海碧迪医疗器械有限公司;微量注射器(尖头/50μL/OD:0.50mm)由北京爱特蒙科技有限公司提供;水合氯醛产自安耐吉化学有限公司;4%组织细胞固定液、***(DEX)来自北京索莱宝科技有限公司;氯仿、75%乙醇北京通广公司;Trizol,THERMO15596026;Promiga反转录试剂盒,(北京)生物技术有限公司;小鼠BMSCs,浙江美森细胞科技有限公司。
2)方法:使用组织匀浆器将获取的小鼠组织进行充分研磨(n=4),按每份组织1mL的量加入制剂,在室温下裂解1h,随后进行RNA提取及后续操纵,操作与细胞水平RT-PCR相同。其中,使用到的引物序列列表如下:
使用Bio-Rad定量PCR仪(CFX ConnectTM)进行扩增,预变性:95℃10min;PCR(55个循环):95℃30s,55℃60s,72℃60s;融解曲线分析:95℃60s,55℃5s,95℃30s,最后使用CFXManager软件处理数据。实验得到的靶基因Ct值使用β-Actin的Ct值进行校正,以未给药组的mRNA水平作为100%计算给药组的mRNA表达水平。相对mRNA表达(%)的具体计算公式同前所述。
3.统计学方法:
采用GraphPad Prism软件(Version 5)进行数据的统计处理。所有数据均采用均数±标准差的方式表示。对于两组独立数据,使用单因素t检验进行分析;对于多组独立数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验,利用Tukey法进行事后检验。p<0.05,认为有统计学差异。
试验结论:
如图13所示,在外源性干细胞条件下,纳米粒子可有改善骨关节炎炎症状态,并促进关节内软骨化进程,较只使用干细胞条件而言,具有更佳的炎症缓解及软骨形成能力,更好的改善骨关节炎的疾病进程。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种用于骨关节退行性疾病的组合物,其特征在于,所述组合物包含能够促进干细胞定向分化为软骨组织的干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质,通过抗炎效应调控骨关节微环境,改善干细胞定向分化形成软骨组织效应,用于骨关节退行性疾病的治疗;其中,所述干细胞定向分化剂为分子量小于1000Da的小分子化合物,包括具有联苯胺结构的分子,优选为Kartogenin(KGN)、葡萄糖胺和/或其变体结构;所述具有抗炎功能的活性物质,通过调节炎症微环境,辅助干细胞的定向分化,包括核酸结构和/或其他具备相应功能的活性分子化合物和/或化合物片段;所述骨关节退行性疾病,优选为骨关节炎。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述干细胞包括间充质干细胞,和/或诱导多能干细胞,和/或胚胎干细胞中的一种或多种,优选为间充质干细胞;所述间充质干细胞从一种或多种组织中提取,所述组织包括骨髓、脂肪组织、脐带血和/或牙髓。
3.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述干细胞定向分化剂和所述具有抗炎功能的活性物质分别发挥促干细胞分化和/或炎症调控效力,在所述组合物中质量配比范围为1∶50至50∶1范围;所述干细胞定向分化剂和所述具有抗炎功能的活性物质的组合形式包括微球、纳米粒子、凝胶包载物和/或骨架填充物中的一种或多种形式;所述组合物优选为纳米制剂。
4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述干细胞定向分化剂和所述具有抗炎功能的活性物质组合形式为纳米粒子,所述纳米粒子包括外壳载体材料和金属离子配合物内核;
其中,所述外壳载体材料,包括磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物、氢氧化物和/或单氧化物中的一种或多种、透明质酸和/或其衍生物,与所述干细胞定向分化剂的偶联和/或交联化物;所述偶联和/或交联,包括形成稳固作用力的键合作用,键合作用力大于25℃下水分子的相互作用力;
所述金属离子配合物内核,包括所述核酸结构与金属离子的螯合化物;其中,所述核酸结构包括小分子核酸、大分子核酸和/或其变体结构,和/或结构片段中的一种或多种;所述金属离子包括Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、La3+、Al3+、Zn2+、Mg2+中的一种或多种;
所述纳米粒子的组装形式还包括配位作用。
5.如权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述磷酸化物为单磷酸类化合物、双磷酸类化合物和/或包含磷酸结构的其他小分子;所述单磷酸类化合物包括磷酸锰、磷酸钙、磷酸钠、磷酸镧中的一种或多种;所述双磷酸化物包括阿仑膦酸、利塞膦酸、氯膦酸、唑来膦酸、特立帕肽中的一种或多种;碳酸化物和/或硫酸化物包括碳酸钙和/或硫酸钙;羧酸化物包括羧酸钙和/或羧酸锰;氢氧化物包括氢氧化铁、偏铝酸、氢氧化镁中的一种或多种;单氧化物包括氧化铁、氧化锌和/或其修饰物中的一种或多种;
所述透明质酸和/或其衍生物为天然和/或合成的高分子聚合物材料,分子量范围在1~1000kDa之间;优选地,所述透明质酸和/或其衍生物,包括透明质酸、水解透明质酸、乙酰化透明质酸、透明质酸钠交联聚合物、硅烷化透明质酸、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸中的一种或多种;
所述小分子核酸包括siRNA、microRNA(miRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、small nucleolar RNA(snoRNA),和/或转运RNA(tRNA)中的一种或多种;所述大分子核酸包括mRNA、DNA和/或其变体结构中的一种或多种。
6.如权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述纳米粒子通过DLS检测,水合粒径在20nm~2000nm间,电位大于-50mV;其中,所述水合粒径优选在100nm~1000nm之间;电位优选在-30mV~+20mV。
7.如权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述纳米粒子具有改善骨关节炎的炎症微环境、促进骨关节炎状态下体内外干细胞治疗效应、改善骨关节炎条件下体内外干细胞定向软骨分化、和/或显著改善骨关节炎进程中一种或多种的用途。
8.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物还包括磷酸盐缓冲体系和/或金属盐溶液中的一种或多种。
9.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物与干细胞联合用药,包括关节腔注射给药、肌肉注射、透皮吸收中的一种或多种;通过关节腔注射给药的干细胞单次用量不超过1000w/kg,所述干细胞定向分化剂和所述核酸结构的单次用药剂量分别不超过50μM及5μM。
10.一种如权利要求4-7任一项所述的组合物的制备方法,其特征在于,将所述外壳载体材料、核酸结构的水溶液、缓冲体系和金属离子溶液分步混合,均质化后得到所述纳米粒子;所述均质化过程包括超声波混合、涡旋振荡混合、移液枪吹打混合和/或其他包含剪切力、惯性力、吸附力、空化作用的混合方式;优选的,所述缓冲体系包括Hepes,NaCl和Na2HPO4,浓度范围分别为5~500mM,200~600mM和0.1~2mM;所述缓冲体系的pH范围在3.0~10.0之间,优选在6.0~9.0之间。
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