CN117741148B - 一种用于免疫治疗疗效预测的标志物组合及模型构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于免疫治疗疗效预测的标志物组合及模型构建方法和应用，属于免疫组织化学检测领域。本发明的标志物组合由以下标志物组成：Granzyme B、CD68、CD8、PD‑L1、PANCK、Foxp3和CD45RO。本发明利用多色免疫组化/免疫荧光相较于传统PD‑L1 IHC技术的优势，全面分析患者的肿瘤免疫微环境，获得了更加准确的针对免疫治疗的疗效预测模型。
Description
技术领域
本发明属于免疫组织化学检测领域，具体涉及一种用于免疫治疗疗效预测的标志物组合及模型构建方法和应用。
背景技术
免疫检查点抑制剂（ICIs）作为免疫治疗的主要组成部分，已经成为多种肿瘤治疗的基础。抗PD-1单抗通过阻断PD-L1和PD-1的相互作用来重新激活对肿瘤细胞的免疫反应，多项研究证明其相较传统化疗可以给患者带来更高的临床获益。尽管如此，抗PD-1单抗的客观反应率(ORR)仅约为24%（95% CI，21%-28%）。因此，亟需开发针对抗PD-1单抗具有稳健预测能力的方法和产品，从而更好地指导患者分层和临床决策。
针对抗PD-1单抗治疗疗效预测的方法主要包括评估PD-L1蛋白表达、肿瘤突变负荷(TMB)和基因表达谱(GEP)：
PD-L1免疫组织化学（IHC）检测PD-L1蛋白的表达是目前应用最广、证据最多的免疫治疗疗效预测方法，可作为非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌患者的伴随或补充诊断。尽管PD-L1表达已被证明与某些肿瘤类型的治疗反应相关，但作为一种诊断检测方法，PD-L1 IHC现阶段存在许多局限性：（1）每张切片只能检测单一靶标，能提供的信息非常有限。（2）PD-L1在肿瘤内表达的异质性使得局部视野分析具有局限。（3）不同PD-L1检测产品存在抗体、检测环境、判读方法以及PD-L1阳性阈值的差异，现阶段面临检测和判读标准化的问题。（4）不同病理学家之间检测结果的重现性存在问题。（5）更为重要的是：PD-L1的表达只是影响肿瘤进展的肿瘤免疫微环境（TIME）因素之一，单独检测PD-L1，缺乏对肿瘤免疫微环境的整体观察。此外，传统的IHC检测并不能对不同细胞的空间分布进行分析，而TIME中细胞的空间分布被认为是肿瘤空间异质性的主要原因之一，并且与肿瘤的预后相关；
在临床实践中，一方面并不是所有的PD-L1高表达患者均能从免疫治疗中获益，另一方面部分PD-L1低表达的患者仍然能从免疫治疗中获益，PD-L1 IHC检测对免疫治疗疗效预测较为有限。因而除PD-L1 IHC检测以外，其他预测免疫检查点治疗疗效的标志物也在不断出现。TMB就是其中之一，并已从临床研究逐步走向临床应用。但TMB作为预测标志物同样存在诸多不足之处：（1）TMB的数量并不能准确预测免疫疗效，因为它和能够激发免疫反应的基因突变数量并不成严格的比例；（2）不同类型肿瘤TMB水平差异较大；（3）年龄对TMB表达水平影响较大，并且两者之间的关系因疾病类型的不同而有所差异；（4）TMB的检测由于依赖基因测序，成本远高于依靠免疫组化的PD-L1检测；（5）不同平台的检测标准不统一；
此外，不少研究也提示GEP对免疫治疗也有一定的疗效预测价值。但基于普通转录组测序（Bulk RNA-seq）的GEP同样存在不足之处：（1）肿瘤内RNA的表达存在异质性，BulkRNA-Seq由于缺失了组织原位的信息，因而无法体现该异质性；（2）RNA层面的异常并不一定能导致蛋白质功能的异常，因此可能仍需蛋白质层面的检测；（3）RNA测序分析在临床实践中并没有被广泛接受的参考标准。
除了上述生物标志物外，越来越多的数据表明TIME中免疫细胞及其表面其它生物标志物在指导肿瘤患者药物选择和预后评估方面也具有重要意义。譬如，PD-1发现者陈列平教授等研究者基于TIME中PD-L1的表达和肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的浸润情况将TIME分成了四种不同的类型：I型：PD-L1-/TILs-；II型：PD-L1+/TILs+；III型：PD-L1-/TILs+；IV型：PD-L1+/TILs-。这四种不同TIME类型与免疫治疗疗效密切相关。同样有研究显示巨噬细胞表面蛋白CD68与PD-L1的共定位不仅与NSCLC免疫治疗疗效密切相关，还与三阴性乳腺癌预后相关。此外，数项免疫治疗队列分析显示，B细胞相关生物标志物与黑色素瘤免疫治疗疗效以及NSCLC免疫治疗疗效相关。
上述研究报道印证了TIME中不同免疫细胞亚群与免疫治疗效果均密切相关，亟须一种可以检测和评估TIME中复杂免疫细胞亚群及其相互关系的方法，从而更精准地指导免疫治疗的患者分层。
多重免疫组化/免疫荧光（mIHC/IF）正是这样一种新技术。数项研究表明mIHC/IF在抗PD-1/PD-L1免疫治疗疗效判断中较其他方法优越。有现有技术***分析了56篇文献中不同检测方法 (PD-L1 IHC、TMB、GEP、mIHC/IF) 与抗PD-1/PD-L1免疫治疗反应的相关性。研究发现，相较于PD-L1 IHC、TMB及GEP评估方法，mIHC/IF方法对于肿瘤免疫治疗具有更高的疗效预测价值。其中PD-L1 IHC、TMB、GEP三种评估方法对肿瘤免疫治疗疗效预测评估指标AUC值分别为0.650、0.688、0.650，而荟萃分析获得的mIHC/IF的AUC值高达0.790，显著高于其余三种方法。此外，PD-L1 IHC、TMB、GEP三种评估方法的两两组合的疗效预测评估指标AUC为0.736，同样低于mIHC/IF的单一指标结果（Lu, S., et al., Comparison ofBiomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 CheckpointBlockade: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol, 2019. 5(8): p.1195-1204）。
以抗PD-1/PD-L1免疫治疗为核心的单药治疗以及联合化疗已经成为NSCLC的标准治疗方案，并且逐渐进入到了早期肺癌的围手术期新辅助以及辅助治疗方案中。大量的基于mIHC/IF研究显示，TIME中多个免疫细胞亚群对NSCLC免疫治疗具有显著的疗效预测价值：CD8+T细胞和空间免疫异质性（Lopez de Rodas, M., et al., Role of tumorinfiltrating lymphocytes and spatial immune heterogeneity in sensitivity toPD-1 axis blockers in non-small cell lung cancer. J Immunother Cancer, 2022.10(6)）、PD-L1和CD68的共定位（Liu, Y., et al., Immune Cell PD-L1 Colocalizeswith Macrophages and Is Associated with Outcome in PD-1 Pathway BlockadeTherapy. Clin Cancer Res, 2020. 26(4): p. 970-977）以及PD-1和CD8的共定位（Mazzaschi, G., et al., Low PD-1 Expression in Cytotoxic CD8(+) Tumor-Infiltrating Lymphocytes Confers an Immune-Privileged Tissue Microenvironmentin NSCLC with a Prognostic and Predictive Value. Clin Cancer Res, 2018. 24(2): p. 407-419）等是肺癌免疫治疗疗效预测的生物标志物。不仅仅是肺癌，其他癌种的相关研究中也显示出多种免疫细胞亚群与免疫治疗疗效相关。因此，利用mIHC/IF对肿瘤TIME分析，精准指导抗PD-1治疗具有迫切的临床需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了预测抗PD1抗体药物治疗非小细胞肺癌疗效的模型和方法。本发明涉及的mIHC/IF技术是利用辣根过氧化酶对靶蛋白进行高密度原位标记并进行酪酰胺信号放大(TSA)，从而结合了免疫荧光和传统IHC技术，使得对TIME中复杂的免疫细胞亚群进行定量检测成为了可能。与传统IHC技术通常只能检测一个目标分子相比，mIHC/IF技术可以在同一张组织样本上确定多个靶蛋白的表达、丰度和空间位置，提供了更全面和详细的免疫组织学图像，帮助全面理解TIME在肿瘤发展和治疗反应中的作用。
本发明首先提供了一种用于免疫治疗疗效预测的标志物组合筛选自以下标志物：
免疫细胞亚型标志物，包括：CD3，CD4，CD8，Foxp3，CD68，CD103，CD45RO，CD20，CD138，Granzyme B（颗粒酶B）/Perforin（穿孔素）；
免疫检查点/治疗靶点，包括PD-L1，PD-1，LAG-3，TIM-3，TIGIT。
优选地，所述的标志物组合按以下5个面板进行预测：
面板1：CD8、CD103、Granzyme B、Perforin、PANCK（细胞角蛋白）；
面板2：CD8、LAG-3、TIM-3、TIGIT、PANCK；
面板3：CD8、PD-L1、PD-1、CD68、PANCK；
面板4：CD4、CD8、CD45RO、Foxp3、PANCK；
面板5：CD3、CD8、CD20、CD138、PANCK。
本发明最终筛选到的标志物组合由以下标志物组成：Granzyme B、CD68、CD8、PD-L1、PANCK、Foxp3和CD45RO。
本发明还提供了前述的标志物组合在构建免疫治疗疗效预测模型中的应用。
基于以上，本发明还提供了一种通过前述的标志物组合构建的用于免疫治疗疗效预测模型。
具体地，采用整体PD-L1+PANCK+细胞阳性率、整体CD45RO+细胞阳性率、间质区CD8+细胞阳性率、间质区Granzyme B+细胞阳性率、肿瘤区CD68+PD-L1+细胞阳性率和100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离进行构建。
所述的模型用于计算免疫评分，免疫评分计算方式为：
（0.20-0.45）×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+（0.40-0.80）×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+（0.10-0.20）×（间质区CD8+细胞阳性率）+（0.05-0.15）×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+（0.05-0.15）×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+（0.70-0.90）×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）。
所述的免疫评分的预测临界值为0.5。
作为优选，所述的免疫评分计算方式为：
0.42×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+ 0.63×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+0.20×（间质区CD8+细胞阳性率）+0.10×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+0.10×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+0.81×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）。
本发明还提供了前述的标志物组合构建免疫治疗疗效预测模型的方法，包括：
步骤（1）：FFPE标本mIHC染色；
步骤（2）：扫描和阅片；
步骤（3）：数据分析；
步骤（4）：免疫治疗疗效预测模型的构建。
具体地，所述的步骤（1）包括：烤片；脱蜡；水合；抗原修复；封闭；一抗孵育；二抗孵育；荧光染色放大信号；每轮抗体染色后，重复抗原修复，进行下一轮抗体染色；封片；读片。
具体地，所述的步骤（2）包括：扫描后清楚完整的图像进行分析区域划分，划分规则为：
1）无/少DAPI核染色的区域：无DAPI染色，无论其他通道是否有染色，全部剔除；少量/零星DAPI染色，若为血液和肌肉组织，全部剔除；
2）有DAPI染色的非细胞成分剔除；
3）折叠区域：染色扫描图像中出现部分因组织脱片导致的折叠区域剔除；
4）游离于整体样本外的散落区域剔除；
5）正常上皮组织剔除。
具体地，所述的步骤（3）中包括：
A.组织拆分：肿瘤组织和肿瘤间质拆分；
B.细胞拆分：细胞核和细胞质拆分；
C.计算细胞阳性率特征；
D.阳性细胞定位，计算阳性细胞间距离，分析细胞空间组织分布特征。
进一步具体地，所述的A中，通过DAPI着色和PANCK着色进行拆分；
进一步具体地，所述的B中，通过DAPI的表达强度进行拆分；
进一步具体地，所述的C中，不同亚型阳性细胞分别计算，细胞阳性率为视野下阳性细胞数和视野下总细胞数的比值；
进一步具体地，所述的D中，阳性细胞定位为二维笛卡尔坐标系数据，默认数据为基于矩形图像视野的像素坐标，依放大倍率转为长度坐标数据后进行阳性细胞间距离计算，距离的计算使用如下欧氏距离计算方式：
；
其中，d（x，y）表示细胞x与细胞y的欧氏距离，x 1、x 2表示细胞x的横坐标和纵坐标，y 1、y 2表示细胞y的横坐标和纵坐标。
作为优选，所述的免疫治疗疗效预测模型中的免疫治疗为抗体治疗，进一步优选为抗PD-1抗体治疗；所述的免疫治疗疗效预测模型针对的疾病为肿瘤。
在一些具体的实施例中，所述的免疫治疗疗效预测模型为预测抗PD1抗体药物治疗非小细胞肺癌疗效的模型。
本领域技术人员可以理解：本发明具体实施例是以针对非小细胞肺癌晚期一线免疫联合化疗治疗样本的疗效预测模型为示例，但整个检测方法与模型一定程度上也适用于非小细胞肺癌围手术期、二线或后线治疗的疗效预测。
本领域技术人员可以理解：本发明具体实施例是非小细胞肺癌作为示例，但检测方法一定程度上也适用于其他肿瘤类型。所述的肿瘤可以是良性肿瘤或恶性肿瘤（癌症），包括但不限于实体瘤或非实体瘤。
本领域技术人员可以理解：本发明使用的技术方法是mIHC/IF，本质上是对肿瘤组织进行原位的蛋白质检测，但在组织原位进行蛋白质检测的其他方法，根据本发明的标志物也可以实现检测，因此也在本发明保护范围内。
本领域技术人员可以理解：本发明本质上是对肿瘤组织进行原位的蛋白质检测，根据生物学中的中心法则，蛋白质来源于mRNA的翻译，因此存在在组织原位进行RNA检测的方法结合本发明的标志物进行检测，该类方法也在本发明所保护的范围内。
本发明的有益效果：
与mIHC/IF技术在NSCLC免疫治疗领域的应用研究以及现有报道相比，本发明的有益效果主要体现在以下三点：
（1）本发明所涉及的生物标志物源于近期大量相关领域文献报道的总结与汇总，它涵盖的TIME免疫细胞亚群更加全面；
（2）本发明在全面分析免疫细胞亚群特征基础上，还充分利用了mIHC/IF技术可以对空间信息进行检测这一优势，建立了新的空间关系算法，并将免疫细胞之间以及与肿瘤与免疫细胞之间的空间分布特征纳入了本发明的模型之中；
（3）本发明不仅利用了机器学习的方法对靶蛋白表达、丰度和空间分布特征进行了特征筛选以及模型构建，还从临床应用端出发对模型进行了简化以提高模型在真实应用场景下使用的便利性。
综上，本发明利用mIHC/IF相较于传统PD-L1 IHC技术的优势，全面分析NSCLC患者的TIME，获得了更加准确的针对NSCLC免疫治疗的疗效预测模型。
附图说明
图1为本发明的流程及技术路线。
图2为面板1 mIHC染色图。
图3为面板2 mIHC染色图。
图4为面板3 mIHC染色图。
图5为面板4 mIHC染色图。
图6为面板5 mIHC染色图。
图7为组织拆分示意图。
图8为细胞拆分示意图。
图9为空间分析示意图-半径范围计数。
图10为空间分析示意图-最邻近细胞。
图11-图14为阳性率特征效果生存曲线。
图15-图16为空间特征生存曲线。
图17为Lasso Cox进行特征惩罚过程。
图18为Lasso Cox进行模型构建加权系数计算过程。
图19为免疫特征评分Panoscore训练集生存曲线。
图20为免疫特征评分Panoscore验证集生存曲线。
图21为免疫特征评分Panoscore总集生存曲线。
图22为临床使用PD-L1 IHC检测获得的TPS及对应截断值cutoff（TPS 1%）对生存曲线的区分效果。
图23为临床使用PD-L1 IHC检测获得的TPS及对应截断值cutoff（TPS 50%）对生存曲线的区分效果。
图24为实施例2获得的免疫特征评分对PFS生存曲线的区分效果。
图25为实施例3获得的免疫特征评分对PFS生存曲线的区分效果。
图26为间质区Granzyme B+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果。
图27为100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离对PFS生存曲线的区分效果。
图28为整体CD20+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所采用的名词“面板”，如本领域技术人员知晓，也被称为“panel”。
本发明具体实施例中采用的部分试剂的品牌，以中文和英文形式进行描述，当存在歧义时，以英文品牌名称为准。
实施例1
参照图1所示的技术路线，具体包括：
1.标本采集
本实验使用***固定石蜡包埋（FFPE）的穿刺样本。
样本采集标准：10%中性***固定样本，制片技术人员在接收检材后，按照行业规范(中华医学会:临床技术操作规范，病理学分册)，在2个工作日内完成组织脱水、浸蜡、包埋、制片。切片要求完整，无污染皱褶，厚度3-5μm。
标本来源：3000+例NSCLC患者中严格挑选出110例。诊断标准参照《中国临床肿瘤学会（CSCO）非小细胞肺癌诊疗指南2023》。
初诊时间从2020年1月至2021年12月。
筛选标准：接受抗PD-1抗体K药（可瑞达，默沙东）为基础的一线免疫治疗。
该步骤的优点与好处：
通过对临床队列临床信息细致筛选，使得本发明使用的临床队列基线背景清晰，从而获得更稳定可靠的模型。
2.多重免疫荧光面板设计和染色
2.1 靶标选择和面板设计
2.1.1 靶标选择
可能影响抗PD-1治疗的NSCLC患者肿瘤免疫微环境中的生物标志物：
免疫细胞亚型标志物，包括CD3 (T cell, T细胞)，CD4 (Helper T cell，辅助性T细胞)，CD8 (Cytotoxic T cell，细胞毒性T细胞)，Foxp3 (Regulatory T cell，调节性T细胞)，CD68 (Macrophages，巨噬细胞)，CD103 (Tissue Resident Memory T cell，组织驻留记忆性T细胞)，CD45RO (Memory T cell， 记忆性T细胞)，CD20 (B cell，B细胞)，CD138(Plasma cell，浆细胞)，Granzyme B/Perforin (Effector T cell，效应T细胞)；免疫检查点/治疗靶点，包括PD-L1，PD-1，LAG-3，TIM-3，TIGIT。
2.1.2 面板设计
表1 面板1
表2 面板2
表3 面板3
表4 面板4
表5 面板5
2.2 mIHC染色
对前述110例FFPE标本中进行5个面板的免疫细胞亚型和免疫检查表达进行检测。具体步骤如下：
烤片：FFPE样本65℃烤20分钟；
脱蜡：二甲苯脱蜡（5分钟，重复3次）；
水合：梯度乙醇浸片（100% 5分钟，95% 5分钟，70% 2分钟）；
抗原修复：将脱蜡水合后的玻片置于碱性抗原修复液浸没(PANOVUE；Cat.0019020500)，微波炉内高火煮沸，低火维持15分钟，取出自然冷却至室温；
封闭：一抗封闭液(PANOVUE；Cat. 0018001120)，室温震荡10分钟；
一抗孵育：以PD-1为例，PD-1 (CST43248，1:100) ，室温孵育30分钟；
二抗孵育：滴加HRP二抗工作液(PANOVUE；Cat. 0013001010)，室温孵育10分钟；
荧光染色放大信号：加入TSA染料PPD520TSA (1:100)，室温震荡孵育10分钟。1×TBST 缓冲液浸洗，重复3次。
每轮抗体染色后，重复抗原修复，进行下一轮抗体染色至单个面板所有标志物染色完成。
封片：滴加DAPI工作液，室温孵育；1×TBST 缓冲液浸洗玻片，室温浸片3分钟。
用灭菌水洗片2分钟，待玻片微干，用移液器在玻片上滴加超强抗淬灭封片剂，浸没样本区域。
加盖玻片，封片。读片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并进行判读。
染色结果示例如图2-图6所示。
该步骤的优点与好处：
（1）通过文献总结与内部数据挖掘，提炼了与NSCLC免疫治疗相关的重要生物标志物。
（2）通过对检测面板的严谨设计，使得面板有独创性，也使得多个生物标志物共定位以及面板内部的空间特征分析成为可能，充分涵盖了能预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物。
3.扫描和阅片
3.1 扫描
使用高通量全景扫描仪PanoVIEW VS200扫描染色完成的FFPE组织切片，以获得整个载玻片的明场和荧光图像。
3.2 阅片
3.2.1确认图像扫描质量
确认聚焦清楚，出现扫描模糊无法进行正常分析的样本需要重新进行扫描；确认扫描完整，未能将全部组织纳入扫描范围的样本需要重新进行扫描。
3.2.2分析区域圈画
由病理专家预先制定NSCLC穿刺样本分析区域划分规则。在确认图像扫描质量没有问题后，进行分析区域圈画。规则内容如下：
（1）无/少DAPI核染色的区域：无DAPI染色，无论其他通道是否有染色，全部剔除。少量/零星DAPI染色，若为血液和肌肉组织，全部剔除；
（2）有DAPI染色的非细胞成分剔除；
（3）折叠区域：染色扫描图像中出现部分因组织脱片导致的折叠区域剔除；
（4）游离于整体样本外的散落区域剔除；
（5）正常上皮组织剔除。
该步骤的优点与好处：
（1）通过扫描与阅片，保证了图像质量。
（2）通过分析区域划分规则制定与标准化，能使得整体的分析区域更统一，使得每个样本结果之间的可比性更强，最终保证结果更可靠。
4.数据分析
4.1组织类型划分
肿瘤区（肿瘤组织）、间质区（肿瘤间质）通过人工神经网络-多层感知机算法进行组织拆分，并生成对应的分析区域，用于后续分析。使用的机器学习方法为人工神经网络-多层感知机(Artificial Neural Network-Multi-Layer Perceptron, ANN-MLP)。具体参考文献如下：M. Jabarouti and H. Soltanian-Zadeh, ‘Medical Image SegmentationUsing Artificial Neural Networks’, Artificial Neural Networks -Methodological Advances and Biomedical Applications. InTech, Apr. 11, 2011.doi: 10.5772/16103.
肿瘤组织：有DAPI和PANCK（前述标志物之一）着色的区域，细胞体积较大，组织杂乱分散。
肿瘤间质：有DAPI着色，没有PANCK着色的区域，细胞体积较小，组织整齐。
拆分后的效果如图7所示，右图为DAPI（荧光通道A）和PANCK（荧光通道B）荧光通道，左图中区域类型A为识别出的肿瘤区域，区域类型B为间质区域，区域类型C为非组织区域。
4.2 细胞拆分
指定核通道：通常为DAPI通道，用于识别细胞核。
设定阈值：根据DAPI的表达强度，设定阈值，避免将DAPI表达低的区域识别成细胞核。
拆分程度：使用分水岭算法精确地进行细胞拆分，拆分后的效果如附图8所示，细胞拆分类型A为细胞核，细胞拆分类型B为拆分出的细胞，每个细胞含两个圈，内圈为细胞核区域，外圈为细胞质区域。具体算法参考文献：Ali S, Madabhushi A. An integratedregion-, boundary-, shape-based active contour for multiple object overlapresolution in histological imagery. IEEE Trans Med Imaging. 2012 Jul;31(7):1448-60. doi: 10.1109/TMI.2012.2190089. Epub 2012 Apr 5. PMID: 22498689.
4.3 特征计算与结果输出
4.3.1 通过对肿瘤不同区域中荧光团特征分别测量，计算出对应的细胞阳性率。
细胞阳性率=(ΣC_P)/(ΣC)
其中，细胞是指不同亚型的细胞（不同亚型分别计算比例），C为视野下的细胞计数；C_P为C中染色呈阳性的表型细胞计数。
单一靶标：CD3，CD4，CD8，Foxp3，CD68，CD103，CD45RO，CD20，CD138，Granzyme B，Perforin，PD-L1，PD-1，LAG-3，TIM-3，TIGIT。
靶标共定位：CD8+PD-L1+，CD68+PD-L1+，CD8+PD-1+，CD8+CD103+，CD8+Perforin+，CD8+Granzyme B+，CD4+Foxp3+，CD8+Foxp3+，CD8+CD45RO+，CD8+LAG-3+，CD8+TIM-3+，CD8+TIGIT+等。
其中一些生物标志物对样本临床生存数据的区分效果如附图：
阳性率特征区分效果举例（如图11-图14）：整体PD-L1+PANCK+细胞阳性率、整体CD45RO+细胞阳性率、间质区CD8+细胞阳性率和肿瘤区CD68+PD-L1+细胞阳性率等能区分患者PFS。
4.3.2 使用Inform软件分析以下细胞空间组织分布特征。
细胞间距离数据均为二维笛卡尔坐标系数据，默认数据为基于矩形图像视野的像素坐标，依放大倍率可转为相应的长度坐标数据后进行计算。简单图例如附图9-图10所示。
距离的计算使用如下欧氏距离计算方式：
；
其中，d（x，y）表示细胞x与细胞y的欧氏距离，x 1、x 2表示细胞x的横坐标和纵坐标，y 1、y 2表示细胞y的横坐标和纵坐标。
可由视野下的细胞分布情况自行确定。
（1）以CD8+细胞为中心，分别计算CD8+细胞到PANCK+肿瘤的最短距离以及到CD68+细胞的最短距离(两个数值配对，后续计算比值)。
（2）以PD-L1+细胞为中心，半径5/10/15/20 μm范围内PD-1+细胞的数量以及到PD-L1+细胞的距离。
（3）以CD8+细胞为中心，半径30 μm范围内PD-L1+和CD68+细胞的数量以及到CD8+细胞的距离。
（4）以CD4+细胞为中心，分别计算CD4+到PANCK+肿瘤的最短距离以及到Foxp3+细胞的最短距离(两个数值配对，后续计算比值)。
（5）以CD8+细胞为中心，分别计算CD8+和PANCK+肿瘤的最短距离以及到Foxp3+细胞的最短距离(两个数值配对，后续计算比值)。
空间特征区分效果举例（如图15-图16）：CD8+细胞30μm范围内PD-L1+细胞的数量以及CD4+到PANCK+肿瘤细胞的最短距离和到Foxp3+细胞的最短距离的比值等能区分患者PFS。
该步骤的优点与好处：
（1）通过利用人工智能与机器判读在分析流程中的应用，保证分析结果的稳定性，避免了人为判读的主观性。
（2）通过多个生物标志物共定位以及空间特征分析，获得了更丰富更精确的与NSCLC免疫治疗疗效相关的生物标志物，这是传统IHC方法无法获得的信息。
5.免疫治疗疗效预测模型的构建
本发明使用R语言，利用上述生物标志物或细胞类型阳性率、空间特征与样本对应临床生存信息无进展生存期(PFS)，探索免疫特征模型与临床指标之间的相关性。并通过机器学习算法为每个指标计算权重，并通过加权求和的方式计算免疫特征评分Panoscore。具体分为以下几个步骤：
5.1 样本质控
对进行检测的样本进行如下分析结果质控：
（1）切片内细胞总数是否大于1000。
（2）切片内肿瘤细胞占比是否大于10%。
（3）细胞表型判读结果为0的特征数是否小于总特征数的20%。
样本质控结果不满足上述任何一项，即认为样本存在问题，将剔除出后续分析，最终剩余102例样本。
5.2 数据预处理
对mIHC/IF图像分析所得结果进行以下预处理：缺失值处理、异常值处理、特征转换、归一化处理等。
5.3 特征筛选
特征筛选主要分为2步：（1）基于临床信息中的生存数据信息，将样本分成2组，根据统计假设筛选2组间存在显著差异的特征；（2）根据上述筛选出的特征的内在相关性，对特征进行进一步筛选。
5.4 模型构建
（1）将102例样本按照训练集：验证集为2：1的比例，进行随机分组。训练集68例，验证集34例。
（2）在训练集中使用Lasso Cox方法，对特征进行惩罚与筛选，最终构建基于样本特征与PFS生存信息的NSCLC免疫治疗疗效预测模型。特征惩罚过程与模型构建过程（即加权系数计算过程）如图17-图18。训练所得模型对训练集样本生存数据区分效果如图19。
（3）进行k折n次重复建模筛选模型，获得如下免疫评分的模型：Panoscore=0.42×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+ 0.63×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+0.20×（间质区CD8+细胞阳性率）+0.10×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+0.10×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+0.81×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）。
（4）将模型在验证集中进行验证，判读模型在验证集中是否能稳定。
将上述步骤中所得模型套用在验证集中，并使用同一截断值cutoff区分患者，所得的生存曲线如图20。训练集与验证集的集合（即总集）在上述截断值cutoff下的生存曲线如图21。
该步骤的优点与好处：
（1）通过对样本分析结果质控和数据预处理，降低真实世界异常样本异常检测结果对模型的影响，可使得模型的泛用性更好。
（2）通过多轮特征筛选，尽可能的筛选出与治疗效果真实密切相关的生物标志物；将经过筛选的特征放进模型进行建模，可以使所获得模型更加稳健并贴合真实情况
（3）通过样本的随机分组分为训练集验证集，使得训练集中训练的模型有验证，使得模型尽可能的稳定。
将纳入本发明的102例样本，按照临床现有的生物标志物（即PD-L1 IHC检测获得的TPS评分）以及对应截断值cutoff（1%与50%）所提供的生存曲线区分效果，如图22-图23。
综上：从Panoscore与TPS对总集的PFS区分效果可以明显看出，本发明所构建的Panoscore模型免疫评分的区分效果显著优于临床目前使用的TPS评分。
实施例2
与实施例1的区别在于：间质区Granzyme B+细胞的阳性率的系数选取了可行系数区间的最小值；肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率的系数选取了可行系数区间的最大值。
免疫评分的模型：Panoscore=0.20×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+ 0.80×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+0.20×（间质区CD8+细胞阳性率）+0.10×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+0.10×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+0.81×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）。
结果见图24。本发明所构建的Panoscore模型免疫评分的区分效果显著优于临床目前使用的TPS评分。
实施例3
与实施例1的区别在于：间质区Granzyme B+细胞的阳性率的系数选取了可行系数区间的最大值；肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率的系数选取了可行系数区间的最小值。
免疫评分的模型：Panoscore=0.45×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+ 0.40×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+0.30×（间质区CD8+细胞阳性率）+0.10×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+0.10×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+0.81×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）。
结果见图25。本发明所构建的Panoscore模型免疫评分的区分效果显著优于临床目前使用的TPS评分。
参照实施例1设置对比例如下：
对比例1
仅采用间质区Granzyme B+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果，如图26。
对比例2
仅采用间质区CD8+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果，如图14。
对比例3
肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果，如图12。
对比例4
整体CD45RO+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果，如图11。
对比例5
整体PANCK+PD-L1+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果，如图13。
对比例6
100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离对PFS生存曲线的区分效果，如图27。
对比例7
整体CD20+细胞的阳性率对PFS生存曲线的区分效果，如图28。
本发明各个标志物共同构建的模型显然具有更好的区分效果，具有更好的临床应用前景。
上述实施例仅用于说明本发明，不用于限制本发明，本领域技术人员根据本发明的记载进行常规手段的替代、优化，其所获得的技术方案也在本发明保护范围内。
Claims (8)
1.一种免疫治疗疗效预测模型在制备免疫治疗疗效预测产品中的应用，其特征在于，采用整体PD-L1+PANCK+细胞阳性率、整体CD45RO+细胞阳性率、间质区CD8+细胞阳性率、间质区Granzyme B+细胞阳性率、肿瘤区CD68+PD-L1+细胞阳性率和100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离进行构建；用于计算免疫评分，免疫评分计算方式为：（0.20-0.45）×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+（0.40-0.80）×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+（0.10-0.20）×（间质区CD8+细胞阳性率）+（0.05-0.15）×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+（0.05-0.15）×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+（0.70-0.90）×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）；
所述的免疫治疗疗效预测产品为预测抗PD-1抗体药物治疗非小细胞肺癌疗效的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的免疫治疗疗效预测模型预测临界值为0.5。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的免疫评分计算方式为：0.42×（间质区Granzyme B+细胞的阳性率）+ 0.63×（肿瘤区CD68+PD-L1+细胞的阳性率）+0.20×（间质区CD8+细胞阳性率）+0.10×（整体CD45RO+细胞的阳性率）+0.10×（整体区PANCK+PD-L1+细胞阳性率）+0.81×（100微米内Foxp3+细胞到PANCK+细胞的最短距离）。
4.一种免疫治疗疗效预测模型的构建方法在制备免疫治疗疗效预测产品中的应用，其特征在于，所述的构建方法包括：
步骤（1）：FFPE标本mIHC染色；
步骤（2）：扫描和阅片；
步骤（3）：数据分析；
步骤（4）：免疫评分计算；
所述的免疫治疗疗效预测产品为预测抗PD-1抗体药物治疗非小细胞肺癌疗效的产品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的步骤（1）包括：烤片；脱蜡；水合；抗原修复；封闭；一抗孵育；二抗孵育；荧光染色放大信号；每轮抗体染色后，重复抗原修复，进行下一轮抗体染色；封片；读片。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的步骤（2）包括：扫描后清楚完整的图像进行分析区域划分，划分规则为：
1）无或少DAPI核染色的区域：无DAPI染色，无论其他通道是否有染色，全部剔除；少量或零星DAPI染色，若为血液和肌肉组织，全部剔除；
2）有DAPI染色的非细胞成分剔除；
3）折叠区域：染色扫描图像中出现部分因组织脱片导致的折叠区域剔除；
4）游离于整体样本外的散落区域剔除；
5）正常上皮组织剔除。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的步骤（3）中包括：
A.组织拆分：肿瘤组织和肿瘤间质拆分；
B.细胞拆分：细胞核和细胞质拆分；
C.计算细胞阳性率特征；
D.阳性细胞定位，计算阳性细胞间距离，分析细胞空间组织分布特征。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的A中，通过DAPI着色和PANCK着色进行拆分；
所述的B中，通过DAPI的表达强度进行拆分；
所述的C中，不同亚型阳性细胞分别计算，细胞阳性率为视野下阳性细胞数和视野下总细胞数的比值；
所述的D中，阳性细胞定位为二维笛卡尔坐标系数据，默认数据为基于矩形图像视野的像素坐标，依放大倍率转为长度坐标数据后进行阳性细胞间距离计算，距离的计算使用如下欧氏距离计算方式：
；
其中，d（x，y）表示细胞x与细胞y的欧氏距离，x 1、x 2表示细胞x的横坐标和纵坐标，y 1、y 2表示细胞y的横坐标和纵坐标。
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