CN117716234A - 用于从样本中分离阴电性低密度脂蛋白的生物试剂套组、试剂溶液以及从样本中分离阴电性低密度脂蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于分离阴电性低密度脂蛋白的生物试剂套组。该生物试剂套组包括第一试剂、第二试剂、第三试剂与第四试剂。第一试剂包括水。第二试剂包括第一缓冲液、第二缓冲液和盐类。第三试剂包括第一缓冲液、第二缓冲液、有机化合物及盐类。第四试剂包括第一缓冲液和第二缓冲。
Description
技术领域
本发明大致上涉及用于从样本中分离阴电性低密度脂蛋白(electronegativelow density lipoproteins,LDL-)的生物试剂套组以及从样本中分离阴电性低密度脂蛋白的方法。特定言之，本发明关于一种生物试剂套组的用途，在试剂的存在下从样本中分离出阴电性低密度脂蛋白，以大大减少操作时间。
背景技术
先前的研究表明，自然存在的阴电性低密度脂蛋白可能是心血管疾病的重要危险因子。因此，需要从血浆中分离自然存在的阴电性低密度脂蛋白，以用于进一步研究或进一步调查。
由于阴电性低密度脂蛋白是血浆中的次要成分，因此现有从血浆中分离阴电性低密度脂蛋白的方法会需要耗费大量时间，且品质也不理想。例如，现有从血浆中分离不同成分的方法可能需要几个步骤，每个步骤可能需要至少24小时才能分离特定的脂蛋白。具体而言，利用现有方法，可能需要至少96小时才能从生物液体中依序来分离所有的脂蛋白部分。此外，虽然可以藉由例如碘克沙醇(iodixanol)的密度梯度介质来达成血浆脂蛋白的快速分离，但所得脂蛋白部分的品质不理想，因此不能用于分离阴电性低密度脂蛋白。例如，由于碘克沙醇的特性，例如大分子量和存在有机碘，它无法藉由透析来将其有效去除以产生纯的、无碘克沙醇的脂蛋白部分。由于无法从脂蛋白的样本中完全去除碘克沙醇，因此无法对阴电性低密度脂蛋白进行分离、进一步分析和定量。有鉴于这些耗时的分离步骤和不理想的品质，迫切需要一种新的解决方案来提供更好的分离品质和一种从血浆中分离出阴电性低密度脂蛋白的更快方法，以打破长操作时间的障碍，加速科学化进程、研究或医学检验。
发明内容
综上所述，本发明能够提出一种从样本中分离出无碘克沙醇的阴电性低密度脂蛋白的新方法，以大大减少操作时间，从而克服现有技术中的问题。本发明也提出了一种从样本中分离高密度脂蛋白的新方法，用于进一步科学研究、医学检验或代谢相关疾病的筛检。本发明也提出了一种用于方便从样本中分离阴电性低密度脂蛋白部分的生物试剂套组(kit)。本发明进一步提出使用方便的生物试剂套组，在不使用有机碘添加剂的情况下，从样本中分离阴电性低密度脂蛋白部分。
本发明在第一方面提出了一种含有甘油的生物试剂套组，用于从样本中分离出带负电的低密度脂蛋白。生物试剂套组可包括试剂，例如视情况需要的第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂，但不存在有机碘添加剂，例如碘克沙醇。视情况需要的第一试剂可以包括水，并且可以具有至少18MΩ.cm的电阻率。第二试剂B的密度为1.090g/cm3至1.093g/cm3并可以包含第一缓冲液、第二缓冲液和盐类。第三试剂的密度为1.060g/cm3至1.063g/cm3并可以包含第一缓冲液、第二缓冲液、有机化合物和盐类。第四试剂的密度为0.98g/cm3至1.001g/cm3并可以包含第一缓冲液和第二缓冲液。
在本发明的一实施方式中，第一试剂可以包括三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液，其浓度为0.01M至0.05M，pH值为7.0至9.0。
在本发明的另一实施方式中，第二缓冲液可以包括乙二胺四乙酸的碱性缓冲液，其浓度为0.1mM至1mM且pH值为7.0至9.0。
在本发明的另一实施方式中，有机化合物可以选自由浓度为0.5％(体积/体积)至10％(体积/体积)的甘油、三醇、蔗糖和二甲基亚砜(DMSO)所组成的群组。
在本发明的另一实施方式中，盐类可以选自由氯化钠、氯化钾、溴化钾和碘化铯所组成的群组。
本发明在第二方面提出了一种用于从样本中分离带负电的低密度脂蛋白的方法。可以采用上述生物试剂套组，其包括多种试剂而不需要有机碘添加剂，例如碘克沙醇，来执行本方法。
本发明的方法可以包括以下步骤。首先，提供样本。样本包含脂蛋白的混合物。其次，在样本中加入试剂B、试剂C和试剂D。试剂B的密度为1.090g/cm3至1.093g/cm3并可以包含第一缓冲液、第二缓冲液和盐类。试剂C的密度为1.060g/cm3至1.063g/cm3并可以包含第一缓冲液、第二缓冲液、有机化合物和盐类。试剂D的密度为0.98g/cm3至1.001g/cm3并可以包含第一缓冲液和第二缓冲液。然后，将样本以至少6小时的第一速度进行单工序的第一离心，而得到样品。离心后，可以在不存在有机碘添加剂，例如碘克沙醇的情况下，但本发明不以此为限，将脂蛋白部分根据其密度加以分离和移除。例如，从样品中取出密度为0.960g/cm3至1.006g/cm3的样品的第一部分。从样品中取出密度为1.006g/cm3至1.019g/cm3的样品的第二部分。从样品中取出密度为1.019g/cm3至1.031g/cm3的样品的第三部分。从样品中取出密度为1.031g/cm3至1.036g/cm3的样品的第四部分。从样品中取出密度为1.036g/cm3至1.063g/cm3的样品的第五部分。接着，在不存在有机碘添加剂，例如碘克沙醇的情况下，对第一部分、第二部分、第三部分、第四部分和第五部分中的至少一者进行透析，以获得对应于第一部分、第二部分、第三部分、第四部分和第五部分的至少一纯化过的脂蛋白混合物。第三部分、第四部分和第五部分中的至少一者包含阴电性低密度脂蛋白。
在本发明的一实施方式中，此方法还可以包括以下步骤。可以在试剂A的存在下，使第一血浆以第二血浆速度进行1小时至2小时的第二离心来获得第二血浆。试剂A可以包含水并且可以具有至少18MΩ.cm的电阻率。可以从第二血浆去除水和乳糜微粒来获得样本。
在本发明的另一实施方式中，此方法还可以包括以下步骤。例如，可以在第一试剂的存在下，以生物物质速度对生物物质进行第三离心5分钟至15分钟来获得生物上清液，并得到是生物物质的生物上清液的第一血浆。
在本发明的另一实施方式中，此方法还可以包括以下步骤。可以对至少一纯化过的脂蛋白部分进行过滤，然后在不存在有机碘添加剂(例如碘克沙醇)的情况下将其进行储存。
在本发明的另一实施方式中，此方法还可以包括以下步骤。可以对至少一纯化过的脂蛋白部分进行电泳，以在不存在有机碘添加剂，例如碘克沙醇的情况下，分析或验证此至少一纯化过的脂蛋白部分。
在本发明的另一实施方式中，第一缓冲液可包括浓度为0.01M至0.05M且pH值为7.0至9.0的三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液。三羟甲基氨基甲烷，又简称Tris，分子量＝121.14g/mol。
在本发明的另一实施方式中，第二缓冲液可以包括浓度为0.1mM至1mM且pH值为7.0至9.0的乙二胺四乙酸的碱性缓冲液。乙二胺四乙酸，又简称EDTA，分子量＝292.24g/mol。
在本发明的另一实施方式中，盐类可以是卤化物，例如选自由氯化钠、氯化钾、溴化钾和碘化铯所组成的群组。本发明试剂中的卤化物选自无机卤化物，例如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物。本发明试剂中的碘化物选自无机碘化物，可为碘化物盐，例如碘化铯，但本发明不以此为限。
在本发明的另一实施方式中，有机化合物可以选自由甘油、三醇、蔗糖和二甲基亚砜所组成的群组。有机化合物可以是不含氮的有机化合物或不含碘的有机化合物。
在本发明的另一实施方式中，有机化合物可以具有0.5％(体积/体积)至10％(体积/体积)的浓度。
在本发明的另一实施方式中，此方法还可以包括以下步骤。可以从样品中去除密度为1.063g/cm3至1.210g/cm3的样品的第六部分。第六部分可包括高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)。
在本发明的另一实施方式中，第二血浆速度可在40000rpm至60000rpm的范围内。
在本发明的另一实施方式中，生物物质速度可以在3000rpm至3600rpm的范围内。
在本发明的另一实施方式中，第一试剂可以选自由乙二胺四乙酸、酸-柠檬酸盐-葡萄糖和肝素所组成的群组。
在本发明的另一实施方式中，相对离心力可以在200g至300g的范围内。
在本发明的另一实施方式中，使样本以第一速度进行第一次离心的时间可以不超过24小时。
在本发明的另一实施方式中，第一速度可以在60000rpm至100000rpm的范围内。
本发明的这些和其他目的对于本领域的普通技术人员，在阅读了以下在各种附图中示出的优选实施例的详细描述之后无疑将变得显而易见。
附图说明
图1显示出管中样品的影像，管中包含对应于来自给定样品的不同脂蛋白，在根据本发明的方法将样品离心6小时后的密度分布中的多个部分。
图2显示出管中样品的影像，管中包含对应于来自给定样品的不同脂蛋白，在根据本发明的方法将样品离心24小时之后的密度分布中的多个部分。
图3显示了不同部分的蛋白质对应于图1所示的结果依照样品透析处理和过滤处理后的SDS-PAGE图谱的图像。
图4显示了不同部分的蛋白质对应于图2所示的结果依照样品透析处理和过滤处理后的SDS-PAGE图谱的图像。
图5显示出管中样品的影像，管中包含对应于来自给定样品的不同脂蛋白，在根据本发明的方法将样品离心之后的密度分布的多个部分。
图6显示出不同部分的蛋白质的SDS-PAGE图谱的影像。
具体实施方式
如本领域技术人员将所理解的，厂商可以用不同的名称来称呼元件。本文中无意区分名称不同但功能没有不同的元件。在下面的描述和权利要求中，术语“包括”、“包含”和“具有”以开放式方式使用，因此应被解释为意味着“包括但不限于”。当元件或层称为在另一个元件或层“上”或“连接到”另一元件或层时，它可以直接在另一个元件或层上或直接连接到另一个元件或层，或者可以呈现中间元件或层。尽管诸如第一、第二、第三等的术语可以用来描述不同的组成元件，但是这样的组成元件不限于这些术语。这些术语仅用于将说明书中的构成元件与其他构成元件区分开。权利要求可以不使用相同的术语，而是可以相对于要求保护的元素的顺序使用术语第一、第二、第三等。因此，在下面的描述中，第一构成要素可以是权利要求中的第二构成要素。
本发明在第一方面提供了一种生物试剂套组。此生物试剂套组可用于从样本或生物物质中分离出阴电性低密度脂蛋白。生物物质可以从动物中取得，例如人、小鼠、仓鼠、兔子或猪，但本发明不以此为限。生物物质可以是动物的体液，例如全血、脑脊髓液(cerebrospinal fluid,CSF)、来自胞器或来自组织的体液，但本发明不以此为限。
生物试剂套组可以包括试剂，例如第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂。视情况需要的第一试剂可以包括水，或基本上由水所组成，例如纯化水。纯化水可以是0.22μm-过滤过的水、去离子水、蒸馏水、去离子蒸馏水(DD水)或其组合，但本发明不以此为限。第一试剂可以有至少18MΩ.cm的较大电阻率，例如18MΩ.cm或更大。第一试剂的体积是视情况需要来决定的，取决于本发明的实施情况。
第二试剂可以具有在1.090g/cm3至1.093g/cm3范围内的密度。第二试剂可以包括第一缓冲剂、第二缓冲剂和盐类。可以选择性地混合第一缓冲液、第二缓冲液和盐类以获得第一缓冲液为0.01M至0.05M、第二缓冲液为0.1mM至1mM的终浓度、以及密度在1.090g/cm3至1.093g/cm3的范围内的溶液来用于实施本发明。第二试剂可具有7.0至9.0范围内的pH值，优选约8.0。第二试剂的体积是视情况需要来决定的，取决于本发明的实施情况。
第三试剂可以具有在1.060g/cm3至1.063g/cm3范围内的密度。第三试剂可包含第一缓冲剂、第二缓冲剂、有机化合物和盐类。可以选择性地混合第一缓冲液、第二缓冲液、有机化合物和盐类以获得第一缓冲液为0.01M至0.05M、第二缓冲液为0.1mM至1mM的终浓度、以及密度范围为1.060g/cm3至1.063g/cm3的溶液来用于实施本发明。在一些实施例中，有机化合物可以选自由甘油、三醇、蔗糖和二甲基亚砜所组成的群体。三醇可以是具有3个羟基的有机化合物。在一些实施例中，有机化合物可具有基于总试剂的0.5％(体积/体积)至10％(体积/体积)的浓度。第三试剂可具有7.0至9.0范围内的pH值，优选约8.0。
第四试剂的密度可以在0.98g/cm3至1.001g/cm3的范围内。第四试剂可以包含第一缓冲液和第二缓冲液。可选择性地混合第一缓冲液和第二缓冲液，得到第一缓冲液为0.01M至0.05M、第二缓冲液为0.1mM至1mM的终浓度，密度的范围为0.98g/cm3至1.001g/cm3的第四试剂来用于实施本发明。第四试剂可具有7.0至9.0范围内的pH值，优选约8.0。
第一缓冲液可以是碱性的缓冲液***，例如含氮缓冲液。在一些实施例中，第一缓冲液可以包括三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液。第一缓冲液的浓度可以为0.01M至0.05M，优选约0.02M，但本发明不以此为限。第一缓冲液的pH值可在7.0至9.0的范围内，优选约8，但本发明不以此为限。配制三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液对于本领域技术人员来说是公知的，故在此不多赘述。
第二缓冲液可以是螯合缓冲液***，例如含羧基缓冲液。在一些实施例中，第二缓冲液可以包括基于乙二胺四乙酸的碱性缓冲液。第二缓冲液的浓度可以为0.1mM至1mM，优选约0.5mM，但本发明不以此为限。第二缓冲液的pH值可在7.0至9.0的范围内，优选约8，但本发明不以此为限。配制基于乙二胺四乙酸的缓冲液对于本领域普通技术人员来说是公知的，故在此不多赘述。
在一些实施例中，盐类可以包括M+X-的组合，阳离子或阴离子例如可以是一价离子。例如，盐类可以包括卤化物盐，例如氯化钠、氯化钾、溴化钾和碘化铯，优选溴化钾，但本发明不以此为限。
在生物试剂套组中，每种试剂都可以单独地装在一个容器中。例如，视情况需要的第一试剂装在第一容器中，第二试剂装在第二容器中，第三试剂装在第三容器中，而第四试剂装在第四容器中。此外，生物试剂套组可以视情况需要包括用于说明如何使用生物试剂套组的指南或手册。
本发明在第二方面提供了从生物流体中分离出阴电性低密度脂蛋白的方法。此方法可以涉及使用生物试剂套组，而不需要使用有机碘添加剂，例如碘克沙醇，从生物液体中分离出阴电性低密度脂蛋白。例如，本方法可以关于使用上述生物试剂套组在较短的时间内，从生物液体中分离出阴电性低密度脂蛋白。
本发明的方法可以涉及三个工序，例如预处理工序、分离工序和分析工序，但本发明不以此为限。生物流体可以是原液或预处理过的液体。如果生物流体是原液，则本方法可以从预处理工序开始，然后是分离工序。或者，如果生物流体是预处理过的液体，则本方法可以直接从分离工序开始，然后是分析工序。以下的说明，是从在未进行过预处理的原液的存在下开始进行预处理工序，但本发明不以此为限。
预处理工序
首先，提供生物物质。生物物质可以是未经预处理过的生物体原液。生物物质可以包括混合物形式的不同脂蛋白，例如极低密度脂蛋白(VLDL)、阴电性低密度脂蛋白(LDL-)、低密度脂蛋白(LDL)、中密度脂蛋白(IDL)、或高密度脂蛋白(HDL)，但本发明不以此为限。
例如，生物物质可得自动物，例如人、小鼠、仓鼠、兔或猪，但本发明不以此为限。生物物质可以是动物的体液，例如全血、脑脊髓液、来自胞器或来自组织的体液，但本发明不以此为限。生物物质可以视情况需要先被预处理过，例如是经培养的细胞或血清。生物原物质也可包括固体或血球，因此需要先以预处理产生血清而排除固体或血球。
生物物质可以经过处理后获得血浆。例如，可以对生物物质进行第一次血浆离心以获得第一血浆，因此第一血浆可以是生物物质的上清液。第一次血浆离心可以以生物物质速度进行5分钟至15分钟的时间，但本发明不以此为限。生物物质速度可以在3000rpm至3600rpm的范围内，但本发明不以此为限。
可以在第一试剂的存在下进行第一血浆离心以产生生物上清液。换言之，可以将第一试剂添加到生物物质中以促进第一血浆离心的操作。第一试剂可以是抗凝血剂以防止生物物质凝固。例如，第一试剂可以选自由乙二胺四乙酸、酸-柠檬酸盐-葡萄糖和肝素所组成的群组。
接下来，可以进一步处理第一血浆以获得第二血浆。例如，可以对第一血浆进行第二血浆离心以获得第二血浆，其为血浆的不含乳糜微粒的部分。例如，第二血浆离心可以将第一血浆分离成两个部分，例如顶部部分和底部部分。由于过量的水及/或乳糜微粒的浓度的缘故，顶部部分可能是透明的及/或乳白色的。由于得自生物物质的多种脂蛋白的浓度，底部部分可能是富含脂蛋白且缺乏乳糜微粒的部分，因此底部部分可以藉由视觉识别而呈现金黄色。因此，可以藉由从第二血浆去除水和乳糜微粒来获得样本。例如，样本可以是底部部分。
第二血浆离心可以在试剂A存在下，以设定速度进行1小时至2小时的时间，但本发明不以此为限。设定速度可以在40000rpm至60000rpm的范围内。试剂A可以包含水，或基本上由水所组成，例如纯化水。纯化水可以是0.22μm-过滤过的水、去离子水、蒸馏水、去离子蒸馏水或其组合，但本发明不以此为限。试剂A可具有至少18MΩ.cm，例如18MΩ.cm或更大的电阻率。试剂A的体积是视情况需要来决定的，取决于本发明的实施情况。
经过预处理工序后，生物物质中的各种脂蛋白会被浓缩分离，形成富含脂蛋白而缺乏乳糜微粒的部分，例如经过第二血浆离心处理后呈金黄色外观的底部部分。金黄色底部部分可包含混合物形式的不同脂蛋白，例如极低密度脂蛋白、阴电性低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、中密度脂蛋白或高密度脂蛋白，但本发明不以此为限，作为后续分离过程中所使用的样本。
分离工序
不同脂蛋白的混合物，例如极低密度脂蛋白、带阴电性的低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、中密度脂蛋白或高密度脂蛋白，可以作为样本使用。在分离工序中，样本可以是来自生物原物质的富含脂蛋白且缺乏乳糜微粒的血浆，并经过预处理以促进分离工序的作业。
首先，提供样本。样本可以是包括脂蛋白的水性混合物。例如，样本可包含极低密度脂蛋白、阴电性低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、中密度脂蛋白或高密度脂蛋白中的至少一种，而具有金黄色。
其次，可以在样本中添加试剂B、试剂C和试剂D，以利于后续的分离，优选地，依序添加试剂。例如，先加入试剂B，再加入试剂C，最后加入试剂D。
试剂B、试剂C和试剂D相对于样本体积的用量可以取决于样本的体积。例如，样本的体积可以为2mL至3mL，但本发明不以此为限。试剂B的体积可以为2mL至4mL，但本发明不以此为限。试剂C的体积可以为2mL至4mL，但本发明不以此为限。试剂D的体积可以为0.2mL至1mL，但本发明不以此为限。优选地，样本、试剂B、试剂C、试剂D的体积比可以为6：6：6：1，但本发明不以此为限。
试剂B可以有相对较高的密度。例如，试剂B可以具有在1.090g/cm3至1.093g/cm3范围内的密度。试剂B可以包含第一缓冲液、第二缓冲液和盐类。可以添加盐类来将试剂B的密度调整至适当的范围。
试剂C可具有1.060g/cm3至1.063g/cm3范围内的密度。试剂C可以包含第一缓冲剂、第二缓冲剂、盐类和有机化合物。在随后的离心操作中，有机化合物的存在可以有利于在较短的时间内将脂蛋白分离出来。可以添加盐类来将试剂C的密度调整至适当的范围。
试剂D可以具有相对较低的密度。例如，试剂D可以具有在0.98g/cm3至1.001g/cm3范围内的密度。试剂D可以包含第一缓冲液和第二缓冲液。
第一缓冲液可以是碱性缓冲液***，例如含氮缓冲液。在一些实施例中，第一缓冲液可以包括三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液。第一缓冲液的浓度可以为0.01M至0.05M，优选约0.02M，但本发明不以此为限。第一缓冲液的pH值可在7.0至9.0的范围内，优选约8，但本发明不以此为限。
第二缓冲液可以是螯合缓冲液***，例如含羧基缓冲液。在一些实施例中，第二缓冲液可以包括基于乙二胺四乙酸的碱性缓冲液。第二缓冲液的浓度可以为0.1mM至1mM，优选约0.5mM，但本发明不以此为限。第二缓冲液的pH值可在7.0至9.0的范围内，优选约8，但本发明不以此为限。
盐类可以包含M+X-的组合，例如阳离子或阴离子可以是一价离子。例如，盐类可以包括氯化钠、氯化钾、溴化钾和碘化铯，优选是溴化钾，用于构建密度梯度以微调最佳分离结果，但本发明不以此为限。
有机化合物可以是：1)可溶于水，使得其可与水混溶或与水完全混溶；2)液体，例如有黏性、吸湿性的液体；3)无氮的有机化合物或无碘的有机化合物，以利于随后的离心，并在较短的操作时间内产生优质的密度梯度。所得的优质密度梯度可促进混合物中不同脂蛋白的分离，以根据沿着给定方向的密度分布形成品质较佳的各部分。有机化合物可以选自由甘油、三醇、蔗糖和二甲基亚砜所组成的群组，优选为甘油，其即为一种三醇。三醇可以是具有3个羟基的有机化合物。有机化合物可具有0.5％(体积/体积)至10％(体积/体积)范围内的浓度。
具有缓冲剂和盐类的试剂溶液用于从样本藉由离心分离出脂蛋白，本发明的试剂溶液中包含与水混溶的有机化合物，例如可提出用以产生在较短的操作时间内形成优质的密度梯度的改良。有机化合物可以是与水完全混溶的液体，例如黏性吸湿性液体、无氮的有机化合物或无碘的有机化合物。
第一缓冲剂、第二缓冲剂、盐类和有机化合物的组合可以调整或较佳优化用于分离混合物中脂蛋白的离心条件。例如，第一缓冲剂、第二缓冲剂、盐类和有机化合物的层状组合可以形成更佳的密度分布、或优质的密度梯度、或较佳为最佳密度梯度，以促进借助离心的分离作用并可以缩短操作时间。
其次，可以在试剂B、试剂C和试剂D的存在下对样本进行样本离心。在样本离心过程中，试剂B、试剂C和试剂D的存在可以促进样本离心。在与现有技术所需的操作时间相比之下要短得多的操作时间内形成优质的密度梯度。操作时间例如至少6小时，优选在6小时至24小时的范围内。样本离心可以以第三血浆离心速度进行，例如60000rpm至100000rpm。在样本离心分离后，可以处理样本以获得样品。样品可以包含多个部分，这些部分根据沿着所得到的优质密度梯度的密度分布而对应于混合物中的不同脂蛋白。
多个部分中的每一部分可具有不同的密度范围。不同的部分可能存在不同的脂蛋白。例如，在经过一段适当的操作时间之后，作为样本离心的结果，样品的第一部分可以具有在0.960g/cm3至1.006g/cm3范围内的密度，但是本发明不以此为限。第一部分可以对应极低密度脂蛋白。第一部分可以是无色或浅黄色的。第一部分富含三酸甘油酯，还可以含有载脂蛋白B100(apolipoprotein B100)、载脂蛋白CI(apolipoprotein CI)、载脂蛋白CII(apolipoprotein CII)、载脂蛋白CIII(apolipoprotein CIII)、载脂蛋白E(apolipoprotein E)和阴电性极低密度脂蛋白。值得注意的是，研究表明，在某些疾病状态下，例如在代谢症候群中，阴电性极低密度脂蛋白的量会显著升高。
在经过一段适当的操作时间之后，作为样本离心的结果，样品的第二部分可具有在1.006g/cm3至1.019g/cm3范围内的密度，但本发明不以此为限。第二部分可以对应到中密度脂蛋白。第二部分可以是无色的。第二部分可含有三酸甘油酯、胆固醇、载脂蛋白B100和载脂蛋白E。
在经过一段适当的操作时间段之后，作为样本离心的结果，样品的第三部分可具有在1.019g/cm3至1.031g/cm3范围内的密度，但本发明不以此为限。第三部分可以对应低密度脂蛋白。第三部分可以是无色或浅黄色的。第三部分富含胆固醇，可能含有载脂蛋白A、载脂蛋白B-100和阴电性低密度脂蛋白。研究表明，阴电性低密度脂蛋白可能比正常的低密度脂蛋白含有更高量的载脂蛋白CIII、载脂蛋白AI、载脂蛋白E、载脂蛋白J(apolipoproteinJ)、对氧磷酶1(paraoxonase 1)和血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activatingfactor acetylhydrolase)。值得注意的是，研究表明，在某些疾病状态下，例如II型糖尿病、代谢症候群和急性缺血事件期间，阴电性低密度脂蛋白的量会显著升高。
在经过一段适当的操作时间段之后，作为样本离心的结果，样品的第四部分可具有在1.031g/cm3至1.036g/cm3范围内的密度，但本发明不以此为限。第四部分可以对应低密度脂蛋白。例如，第四部分可以是金黄色的。第四部分富含胆固醇，可能含有载脂蛋白A、载脂蛋白B-100和阴电性的低密度脂蛋白。研究表明，阴电性低密度脂蛋白可能比正常的低密度脂蛋白含有更高量的载脂蛋白CIII、载脂蛋白AI、载脂蛋白E、载脂蛋白J、对氧磷酶1和血小板活化因子乙酰水解酶。值得注意的是，研究表明，在某些疾病状态下，例如II型糖尿病、代谢症候群和急性缺血事件期间，阴电性低密度脂蛋白的量会显著升高。
在经过一段适当的操作时间段之后，作为样本离心的结果，样品的第五部分可具有在1.036g/cm3至1.063g/cm3范围内的密度，但本发明不以此为限。第五部分可以对应低密度脂蛋白。例如，第五部分可以是浅黄色的。第五部分富含胆固醇，但缺乏载脂蛋白A，并且可能含有载脂蛋白B-100和阴电性低密度脂蛋白。研究表明，阴电性低密度脂蛋白可能比正常低密度脂蛋白含有更高水平的载脂蛋白CIII、载脂蛋白AI、载脂蛋白E、载脂蛋白J、对氧磷酶1和血小板活化因子乙酰水解酶。值得注意的是，研究表明，在某些疾病状态下，例如II型糖尿病、代谢症候群和急性缺血事件期间，阴电性低密度脂蛋白的量会显著升高。
在经过一段适当的操作时间段之后，作为样本离心的结果，样品的第六部分可具有在1.063g/cm3至1.210g/cm3范围内的密度，但本发明不以此为限。第六部分可以对应高密度脂蛋白。例如，第六部分可能看起来呈现红棕色。第六部分富含胆固醇、富含磷脂，并且可以含有载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、载脂蛋白AIV、载脂蛋白CI、载脂蛋白CII、载脂蛋白E和阴电性高密度脂蛋白。具体来说，阴电性高密度脂蛋白富含载脂蛋白CIII。值得注意的是，研究表明，在某些疾病状态下，例如阿兹海默症，阴电性高密度脂蛋白的量会升高。
图1显示出管中样品的影像，管中包含对应于来自给定样品的不同脂蛋白，在根据本发明的方法将样品离心6小时后，这些部分在沿着所得到的优质密度梯度的密度分布中的多个部分。管1中的样品4的总体积约为9.5mL，并且从盖子2到底部3包含三个主要层，即例如层10、层20和层30。
作为样本离心的结果，层10可具有在1.000g/cm3至1.0125g/cm3范围内的密度。层10可以包括2个部分。层10的顶部部分11的体积可以为约200μL。层10的底部部分12可以是层10的其余部分，其密度可以为约1.0125g/cm3。层20可以是无色部分，并在样本离心后的密度可以为约1.025g/cm3。作为样本离心的结果，层30的密度可在1.05g/cm3至1.0625g/cm3范围内。层30可以包括2个部分。层30的顶部部分31的体积可以为约1mL并为金黄色。层30的底部部分32可以是层30的其余部分，密度可以是约1.0625g/cm3并为黄色。
图2显示出管中样品的影像，管中包含对应于来自给定样品的不同脂蛋白，在根据本发明的方法将样品离心24小时之后，在沿着所得到的优质密度梯度的密度分布中的多个部分。图2显示了更清晰的分离结果。
样本在经过一段适当操作时间的离心后，可以单独移除以下部分，优选地依照下列顺序。例如，可以从样品中去除密度在0.960g/cm3至1.006g/cm3范围内的样品的第一部分；可从样品中移除密度在1.006g/cm3至1.019g/cm3范围内的样品的第二部分；可从样品中移除密度在1.019g/cm3至1.031g/cm3范围内的样品的第三部分；可从样品中移除密度在1.031g/cm3至1.036g/cm3范围内的样品的第四部分；可从样品中移除密度在1.036g/cm3至1.063g/cm3范围内的样品的第五部分；可以从样品中移除密度在1.063g/cm3至1.210g/cm3范围内的样品的第六部分，但本发明不以此为限。
可以在分离目标部分之后进行透析处理。接下来，可以对第一部分、第二部分、第三部分、第四部分、第五部分和第六部分中的一者或多者进行透析处理。透析处理可以从某部分中去除过量的盐分以浓缩或纯化此部分中的脂蛋白，而不改变此部分中脂蛋白的基本组成。透析处理可以获得对应于第一部分、第二部分、第三部分、第四部分、第五部分或第六部分中具有最少盐含量的纯化脂蛋白混合物。
透析处理可以将各部分的盐含量降到最低的限度。例如，可以在试剂D存在的情况下使用透析装置来降低某个部分的盐含量并降低某个部分的电导率，例如将某个部分的电导率降低至小于10ms/au。此部分与试剂的体积比可在1：100至1：500的范围内，优选1：500。可以进行30分钟至60分钟的透析处理。
在经过透析处理后，可进一步进行过滤处理。在一些实施例中，在至少一纯化过的脂蛋白部分进行储存之前，可以对包含至少一纯化过的脂蛋白混合物的一个或多个部分进行过滤处理。过滤处理可以从纯化过的脂蛋白的一部分中去除细菌，以防止此部分的污染。
可以使用亲水性注射式过滤器来进行过滤处理。例如，可以使用具有滤膜的亲水性注射器过滤器，例如合适材料的0.22μm滤膜，但本发明不以此为限。用于过滤处理的合适材料可以包括聚偏二氟乙烯、尼龙、聚苯醚砜、混合纤维(mixed cellulose ester,MCE)、醋酸纤维素(cellulose acetate,CA)、聚四氟乙烯、玻璃纤维(glass fibre,GF)和多羟基苯(polyphenol,PPhe)，但本发明不以此为限。
在经过过滤处理后，可储存过滤后的部分以备后用。可以在较低温度的条件下储存过滤后的部分，以利于此部分在储存时的稳定品质。较低温度条件可在4℃至10℃的范围内，优选约4℃。
特别地，密度在1.019g/cm3至1.063g/cm3范围内的脂蛋白可包括阴电性低密度脂蛋白。例如，第三部分、第四部分和第五部分中的一者或多者可以包括具有适当密度梯度的阴电性低密度脂蛋白混合物。或者，不含脱辅基蛋白(apoprotein)或载脂蛋白(apolipoprotein)的低密度脂蛋白群可对应于1.019g/cm3至1.030g/cm3密度范围内的第三部分。
分析工序
为了验证分离工序后的脂蛋白的品质、研究或调查脂蛋白、或预测人体的状况，可以在分离工序之后进行分析工序。有建议指出，载脂蛋白E阳性结果或载脂蛋白CIII阳性结果与较高的阴电性低密度脂蛋白水平相关。例如，可以对一种或多种纯化过的脂蛋白混合物进行电泳，以分析或验证一个或多个部分的品质。用于品质验证的电泳可以是常规的凝胶电泳。常规的凝胶电泳可以是聚丙烯酰胺凝胶电泳，例如4％至12％SDS-PAGE，优选10％SDS-PAGE。SDS-PAGE是一种电泳方法，可以根据质量，优选在标记的辅助下，来分离蛋白质。由于SDS-PAGE电泳方法对于本领域技术人员来说是公知的，故在此不多赘述。
图3显示了不同部分的蛋白质对应于图1所示的结果依照样品透析处理和过滤处理进行离心操作6小时后的SDS-PAGE图谱的影像。泳道1为顶部部分11，泳道2为底部部分12，泳道3为层20，泳道4为顶部部分31，泳道5为底部部分32以及载脂蛋白标记5。例如，泳道1可以对应于极低密度脂蛋白，泳道2可以对应于中密度脂蛋白，泳道3可以对应低密度脂蛋白-1，泳道4可以对应低密度脂蛋白-2，泳道5可以对应低密度脂蛋白-3。
图4显示了不同部分的蛋白质对应于图2所示的结果依照样品透析处理和过滤处理进行离心操作24小时后的SDS-PAGE图谱的影像。泳道1为顶部部分11，泳道2为底部部分12，泳道3为层20，泳道4为顶部部分31，泳道5为底部部分32以及载脂蛋白标记物5。例如，泳道1可以对应于极低密度脂蛋白，泳道2可以对应于中密度脂蛋白，泳道3可以对应低密度脂蛋白-1，泳道4可以对应低密度脂蛋白-2，泳道5可以对应低密度脂蛋白-3。图4中显示出顶部部分11和底部部分12之间有更好的分离结果。
实施例
1.将5mL全血置于装有抗凝血剂乙二胺四乙酸的采血管中，进行第一血浆离心(3000rpm、4℃、10分钟)，得到第一上清液(2mL、全血血浆)。
2.将7mL试剂A缓慢加入装有步骤1血浆的超速离心管(带盖的聚碳酸酯材质、16×76mm、容量10.4mL)中，管子再进行第二血浆离心(90Ti转子和Beckman L-100k、45000rpm、2小时)，除去乳糜微粒和水，得到贫乳糜微粒血浆(3mL、金黄色)。
3.3mL的试剂B(0.02M三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液、0.5mM乙二胺四乙酸的缓冲液、溴化钾、pH 8.0、d＝1.090g/cm3)、3mL的试剂C(0.02M三羟甲基氨基甲烷的碱缓冲液、0.5mM乙二胺四乙酸的缓冲液、1％甘油(体积/体积)、溴化钾、pH 8.0、d＝1.063g/cm3)、3mL的贫乳糜微粒血浆和0.5mL的试剂D(0.02M三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液、0.5mM乙二胺四乙酸的缓冲液、pH 8.0、d＝1.001g/cm3)依序加入新的超速离心管(带盖的聚碳酸酯材质、16×76mm、容量10.4mL)中。接下来，将管进行第三血浆离心(90Ti转子和Beckman L-100k、65000rpm、4℃、分别进行6小时或24小时)，得到样品(2.5mL、浅黄色、淡黄色至金黄色)。结果影像如图1(6小时)中及图2中(24小时)所示。
4.单独取出样品中密度在1.019g/cm3至1.063g/cm3的各部分进行透析处理。将这些部分在试剂A存在下注射到透析装置中(1X、样品：试剂＝1：500、持续30分钟、直到电导率小于10ms/au)以获得脱盐部分(2.5mL，浅黄色，淡黄色至金黄色)。
5.用3mL无菌注射器小心取出脱盐部分，连接过滤器(0.22μm聚偏二氟乙烯亲水注射器过滤器)进行过滤。将脱盐部分收集于玻璃瓶中(带有未切割的lectra-bond盖和预裂缝的聚四氟乙烯/硅隔片的玻璃瓶、12×32mm、8mm螺纹颈、容量1.5mL)，得到脱盐过、过滤过和纯化过的脂蛋白部分，包括阴电性低密度脂蛋白部分。
6.视情况需要的10％SDS-PAGE用于验证上述工序的质量，或在载脂蛋白标记物存在的情况下预测人的状况。有建议显示，载脂蛋白E阳性结果或载脂蛋白CIII阳性结果与较高的L5低密度脂蛋白水平相关。结果的影像如图3(6小时)中及图4中(24小时)中所示。
图5显示出管中样品的影像，管中包含对应于来自给定样品的不同脂蛋白，在根据本发明的方法将样品离心之后，在沿着所得到的优质密度梯度的密度分布的多个部分。图6显示出不同部分的蛋白质的SDS-PAGE图案的影像。两图中的处理条件是相同的。
SDS-PAGE的结果可以更快暗示阳性结果或阴性结果。如图6所示，泳道1的样品1A来自阴电性低密度脂蛋白的量较高(3.1％)的患者。泳道2至泳道5来自阴电性低密度脂蛋白的量较低(<1.6％)的患者。先前已确定，健康成人阴电性低密度脂蛋白的量的参考范围可能低于1.6％。显然，泳道1中的条带显示阴电性低密度脂蛋白的量异常高。较高的阴电性低密度脂蛋白的量与许多疾病有关，例如动脉粥状硬化性心血管疾病。为了精确量化阴电性低密度脂蛋白的量，可能需要进一步分离，以确定阴电性低密度脂蛋白混合物的细节。泳道6对应于载脂蛋白标记。将本发明快速分离方法所得的低密度脂蛋白样本进一步进行SDS-PAGE分离，以分离出不同分子量的载脂蛋白。有建议显示，载脂蛋白E的阳性结果或载脂蛋白CIII的阳性结果，可能与较高的阴电性低密度脂蛋白的水平相关。
第一次血浆离心可以进行10分钟。第二次血浆离心可以进行1小时。样本离心可进行6小时。透析处理可以进行30分钟。换句话说，本发明提供了一种在大大缩短的7小时40分钟的操作时间内从生物物质，例如全血中，分离纯化脂蛋白部分的快速方法。此外，本发明提供了一种在6小时的缩短操作时间内从样本中分离纯化脂蛋白的部分(例如不含乳糜微粒和不含细胞的血清)的快速方法。因此，本发明的优点在于提供更快的方法来纯化或分离来自一源头(例如全血或血清)的纯化脂蛋白部分(包括阴电性低密度脂蛋白部分)，以大大减少操作时间。
可以选择性地选择实施例的参数的任意组合，以有利于本发明的实践。
本发明说明书中所揭露的参数的组合比例关系所得到的最大值和最小值内的数值范围均可以相应地实现。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (20)
1.一种用于从样本中分离阴电性低密度脂蛋白的含甘油的生物试剂套组，包括：
一第一试剂，其密度为1.090g/cm3至1.093g/cm3，并包括一第一缓冲液、一第二缓冲液和一盐类；
一第二试剂，其密度为1.060g/cm3至1.063g/cm3，并包括所述第一缓冲液、所述第二缓冲液、甘油及所述盐类；以及
一第三试剂，其密度为0.98g/cm3至1.001g/cm3，并包括所述第一缓冲液和所述第二缓冲液。
2.如权利要求1所述的含甘油的生物试剂套组，其中所述第二缓冲液为三羟甲基氨基甲烷的碱性缓冲液，其浓度为0.01M至0.05M，pH值为7.0至9.0。
3.如权利要求1所述的含甘油的生物试剂套组，其中所述第三缓冲液是乙二胺四乙酸的碱性缓冲液，其浓度为0.1mM至1mM且pH值为7.0至9.0。
4.如权利要求1所述的含甘油的生物试剂套组，其中基于所述第三试剂，所述甘油的浓度为0.5％(体积/体积)至10％(体积/体积)。
5.如权利要求1所述的含甘油的生物试剂套组，其中所述盐类选自由氯化钠、氯化钾、溴化钾和碘化铯所组成的一群组。
6.如权利要求1所述的含甘油的生物试剂套组，更包括：
一第四试剂，包含水并具有至少18MΩ.cm的电阻率。
7.一种从一样本中分离出一阴电性低密度脂蛋白的方法，包括：
提供包含一脂蛋白混合物的一样本；
将所述样本以一第一速度历经至少6小时进行一第一离心得到一样品前，在所述样本中加入一试剂B、一试剂C和一试剂D，其中所述试剂B的密度为1.090g/cm3至1.093g/cm3并包含一第一缓冲液、一第二缓冲液和一盐类，所述试剂C的密度为1.060g/cm3至1.063g/cm3并包含所述第一缓冲液、所述第二缓冲液、甘油和所述盐类，以及所述试剂D的密度为0.98g/cm3至1.001g/cm3并包含所述第一缓冲液和所述第二缓冲液；
从所述样品中取出密度为0.960g/cm3至1.006g/cm3的所述样品的一第一部分；
从所述样品中取出密度为1.006g/cm3至1.019g/cm3的所述样品的一第二部分；
从所述样品中取出密度为1.019g/cm3至1.031g/cm3的所述样品的一第三部分；
从所述样品中取出密度为1.031g/cm3至1.036g/cm3的所述样品的一第四部分；
从所述样品中取出密度为1.036g/cm3至1.063g/cm3的所述样品的一第五部分；以及对所述第一部分、所述第二部分、所述第三部分、所述第四部分和所述第五部分中的至少一者进行透析以获得对应于所述第一部分、所述第二部分、所述第三部分、所述第四部分和所述第五部分的至少一纯化过的脂蛋白混合物，其中所述第三部分、所述第四部分和所述第五部分中的至少一者包含一阴电性低密度脂蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，更包括：
在所述试剂A的存在下使一第一血浆以一第二血浆速度进行1小时至2小时的一第二离心来获得一第二血浆，其中所述试剂A包含水且具有至少18MΩ.cm的电阻率；以及藉由从所述第二血浆中去除水和一乳糜微粒来获得所述样本。
9.如权利要求8所述的方法，更包括：
获得一生物物质的一生物上清液的所述第一血浆，藉由在所述第一试剂的存在下以一生物物质速度对所述生物物质进行5分钟至15分钟的一第三离心而得。
10.如权利要求7所述的方法，更包括：
在将所述至少一纯化过的脂蛋白混合物进行储存之前，对所述至少一纯化过的脂蛋白混合物进行过滤。
11.如权利要求7所述的方法，更包括：
对所述至少一纯化过的脂蛋白混合物进行电泳以分析所述至少一纯化过的脂蛋白混合物。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述第一缓冲液是浓度为0.01M至0.05M且pH值为7.0至9.0的三羟甲基氨基甲烷的碱缓冲液。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述第二缓冲液是浓度为0.1mM至1mM且pH值为7.0至9.0的乙二胺四乙酸的碱缓冲液。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述盐类选自由氯化钠、氯化钾、溴化钾和碘化铯所组成的一群组。
15.如权利要求7所述的方法，其中基于所述第三试剂，所述甘油的浓度为0.5％(体积/体积)至10％(体积/体积)。
16.如权利要求7所述的方法，更包括：
从所述样品中取出密度为1.063g/cm3至1.210g/cm3的所述样本的一第六部分，其中所述第六部分包含一高密度脂蛋白。
17.如权利要求8所述的方法，其中所述第二血浆速度在40000rpm至60000rpm的范围内。
18.如权利要求9所述的方法，其中所述生物物质是全血，所述生物物质速度在3000rpm至3600rpm的范围内，并且所述第一试剂选自由乙二胺四乙酸、酸-柠檬酸盐-葡萄糖和肝素所组成的一群组。
19.如权利要求7所述的方法，其中以不超过24小时经所述第一离心的所述第一速度处理所述样品。
20.如权利要求7所述的方法，其中所述第一速度在60000rpm至100000rpm的范围内。
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