CN1177062C - 中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法 - Google Patents
中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法Info
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Abstract
本发明属于中药鉴定技术领域，是一种用于鉴定中药浙贝母的引物及其鉴定方法。本发明设计的浙贝母聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为：引物1：5’-CTAAATAGGC GGGCGAGCTA ATC-3’；引物2：5’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’。鉴定方法为：提取药材的总DNA；用一对引物AS、AS-1进行扩增以检查总DNA的质量，若有阳性扩增则模板DNA质量合格；用本发明的一对鉴定引物进行扩增；电泳检查扩增结果，若用鉴定引物得到阳性扩增，则供试品为浙贝母，若无阳性扩增则供试品不为浙贝母。本发明能够实现浙贝母的快速、准确地鉴别。
Description
一、技术领域：
本发明是一种用于鉴定中药浙贝母的引物及其鉴定方法，涉及中药材鉴定的
技术领域。
二、背景技术：
贝母是一类重要的止咳祛痰药，其有效成分为贝母生物碱。2000年版中国药典收载贝母9种，不同种的贝母其生物碱的种类及含量各不相同，其毒性及药效也存在差异。浙贝母是目前市场上使用较多的一种，但其毒性也较大，使用时应控制其用量，因而对浙贝母进行准确鉴别就极为重要。然而，利用形态及理化方法对其鉴定需要丰富的经验，且结果不够可靠，尤其是破碎或粉未状态的药材则更难鉴别。而基于植物DNA序列的分子遗传标记技术适合于物种的鉴别，因此，急需建立一种分子遗传标记技术对浙贝母进行鉴定的方法。目前，分子遗传标记在动植物品种鉴别方面得到广泛的应用。在药材鉴定方面，已建立了鉴别性聚合酶链反应(PCR)技术，并已成功地用于龟甲、鹿类等中药的鉴别。但这种方法不是对所有的中药都有统一的方法和引物，对于不同的中药材，其鉴定的方法，引物都不相同。
三、发明内容：
本发明的目的是提供一种对浙贝母药材能准确鉴别其真伪的中药材浙贝母鉴别性聚合酶链反应的鉴定引物及其鉴定方法。
本发明设计的浙贝母聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为：
引物1：5’-CTAAATAGGCGG GCGAGCTAATC-3’
引物2：5’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’
用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。
中药材浙贝母聚合酶链反应鉴定的方法为：
(1)药材DNA提取：按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA质量的鉴定：用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物可扩增各种植物的5S rRNA间区序列。引物的DNA序列为：AS：5’-GGATCC GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-1：5’-GGA TCC TTA GTG CTGGTA TGA TCG CA-3’(Cai ZH，Li P，Dong TX et，al.The molecular diversity of5S-rRNA spacer domain in Fritillaria species revealed by PCR analysis.PlantaMedica，1999，65：360-364.)；引物浓度为30pmol/μl，除将反应体系中引物1、引物2改为AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除复性温度改为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。
(3)鉴别性PCR：引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均为30μL为参考点，各物品的用量为：
10×Taq DNA聚合酶缓冲液 3μl
MgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(10mM) 0.6μl
引物1、引物2各 0.5μl
Taq DNA聚合酶 1.0～2.0单位
供试品DNA模板 1.0～2.0μl
无离子水 加到30μl
(4)PCR循环：在PCR仪上，95℃予变性4min，然后按下列参数进入30循环：
变性95℃ 10～50秒
复性60～65℃ 20～50秒
延伸72℃ 20～60秒
循环结束后在72℃保持2～10分钟补齐。
(5)电泳观察：取出PCR反应液4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。
如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应剂量的比例为参考点，相应地增加或减少。
若有阳性扩增，则供试品为浙贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为浙贝母。
本发明的效果是：
本发明解决贝母类药材浙贝母的鉴别问题。我们在对浙贝母的鉴别中，设计了鉴别浙贝母的一对高特异性引物，该鉴定引物在给定的PCR条件下，只能特异地鉴别浙贝母，而对于任何其他种类的贝母或生物材料提取的总DNA均不能扩增出该基因片段。当供试样品用本鉴定引物进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳观察有无扩增条带的出现，即可准确地判定药材的真伪。用此对引物可以制造用于浙贝母鉴别的试剂盒。本发明对于中药生产、销售部门快速、准确地鉴别浙贝母药材，搞好药材的质量控制，是十分必要的，对于各地市药检部门打击假冒伪劣，净化药材市场具有十分重要的价值。
四、具体实施方式：
首先从贝母类药材不同种的原植物中提取总DNA，用PCR方法扩增多个基因片段并分别纯化，对各纯化片段进行DNA序列分析，建立浙贝母及其近缘种、混淆种的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，选择合适的DNA片段，针对药材伪、混品出现的情况，设计一对鉴别性PCR引物：
引物1：5’-CTAAATAGGCGG GCGAGCTAATC-3’
引物2：5’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’
用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。
采用上述引物对浙贝母的真伪进行鉴别，以反应体系30μl为例，采用以下步骤进行浙贝母的鉴别性聚合酶链反应：
(1)药材DNA提取：按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA质量的鉴定：用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物可扩增各种植物的5S rRNA基因间区序列。引物的DNA序列为：AS：5’-GGA TCC GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’：AS-1：5’-GGA TCC TTAGTG CTG GTA TGA TCG CA-3’；引物浓度为30pmol/l，除将反应体系中引物1、引物2改为AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除复性温度为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。
(3)鉴别性PCR：引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均为30μL为参考点，各物品的用量为：
10×Taq DNA聚合酶缓冲液 3μl
MgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(10mM) 0.6μl
引物1、引物2各 0.5μl
Taq DNA聚合酶 1.0～2.0单位
供试品DNA模板 1.0～2.0μl
无离子水 加到30μl
(4)PCR循环：在PCR仪上，95℃予变性4min，然后按下列参数进入30循环：
变性95℃ 10～50秒
复性60～65℃ 20～50秒
延伸72℃ 20～60秒
循环结束后在72℃保持2～10分钟补齐。
(5)电泳观察：取出PCR反应4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。
若有阳性扩增，则供试品为浙贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为浙贝母。
中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法
<110>中国药科大学
<120>中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法
<160>2
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<212>DNA
<213>浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)
<400>1
ctaaataggc gggcgagcta atc
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)
<400>1
tattagcatt aatcgatcga attc
Claims (3)
1、一种中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于：鉴定引物DNA序列为：引物1：5’-CTAAATAGGC GGGCGAGCTA ATC-3’；引物2：5’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉未结晶。
2、一种使用权利要求1所述鉴定引物对中药浙贝母进行鉴定的方法，其特征在于鉴定步骤为：
(1)药材DNA提取：提取供试品DNA作为聚合酶链反应的模板，并用无离子水将DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μL；
(2)模板DNA质量的鉴定：用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物扩增各种植物的5S rRNA间区序列；引物的DNA序列为：AS：5’-GGATCCGTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-1：5’-GGA TCC TTA GTG CTG GTATGATCG CA-3’；引物浓度为30pmol/μL，除将反应体系中引物1、引物2改为AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除复性温度改为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)，若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验；
(3)鉴别性PCR：引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/L；以反应体系均为30μl为参考点，各物品的用量为：
10×TaqDNA聚合酶缓冲液 3μl
25mM的MgCl2 2.4μl
10mM的dNTP 0.6μl
引物1、引物2各 0.5μl
Taq DNA聚合酶 1.0～2.0单位
供试品DNA模板 1.0～2.0μl
无离子水 加到30μl
(4)PCR循环：在PCR仪上，95℃预变性4min，然后按下列参数进入30循环：
变性95℃ 10～50秒
复性60～65℃ 20～50秒
延伸72℃ 20～60秒
循环结束后在72℃保持2～10分钟补齐；
(5)电泳观察：取出PCR反应液4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳，用含0.5％溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应剂量的比例为参考点，相应地增加或减少；
若有阳性扩增，则供试品为浙贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为浙贝母。
3、权利要求1所述鉴定引物在制备中药浙贝母聚合酶链反应试剂盒中的应用。
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