CN117701634A - 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 - Google Patents
一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117701634A CN117701634A CN202311708280.7A CN202311708280A CN117701634A CN 117701634 A CN117701634 A CN 117701634A CN 202311708280 A CN202311708280 A CN 202311708280A CN 117701634 A CN117701634 A CN 117701634A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mice
- seq
- itgb5
- mouse model
- knockout mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001015059 Homo sapiens Integrin beta-5 Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 102100033010 Integrin beta-5 Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 89
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 claims description 5
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 4
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 claims description 2
- 101150031268 Itgb5 gene Proteins 0.000 abstract description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 abstract description 9
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 abstract description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 abstract 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 206010004016 Bacterial diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000012639 Balance disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100073087 Mus musculus Itgb5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 210000004358 rod cell outer segment Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用,属于基因工程技术领域。本发明通过将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,并将该受精卵移植至假孕小鼠,获得F0代小鼠;将含有打靶序列的F0代小鼠与野生型小鼠杂交,得到含有打靶序列的杂合性小鼠;将得到的含有打靶序列的杂合性小鼠与Vil‑Cre阳性小鼠杂交,得到肠道ITGB5基因敲除动物模型。本发明获得条件性基因敲除(Conditional Knockout,CKO)小鼠,为研究ITGB5基因影响肠道对ETEC F4ac型细菌的抗性提供了便捷、可靠、经济的动物模型。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用。
背景技术
F4ac菌毛的产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是引起新生仔猪细菌性腹泻的主要病原微生物,研究报告表明ETEC需要通过菌毛黏附至宿主细胞,附着后通过分泌的蛋白质来破坏宿主细胞,操纵宿主细胞的信号传导途径,避免宿主细胞产生免疫反应并成功定植,释放毒素,导致肠道内电解质平衡紊乱,最终导致腹泻。
仔猪对ETEC F4ac的易感性由小肠上皮表面的特异性受体决定。本课题组前期选取4对ETEC F4ac抗性和易感的全同胞仔猪为试验对象,采用iTRAQ蛋白质组定量技术鉴定其小肠蛋白表达差异,结果富集到唯一的整合素信号通路(Integrin signallingpatinway:PO0034),说明该通路对ETEC F4acR感染仔猪小肠黏膜进而引起仔猪腹泻具有重要作用,从基因位于染色体上的位置、基因的分子功能、基因的蛋白质分子量大小角度对候选基因进行分化,发现ITGB5最有可能为ETEC F4acR的候选基因。ITGB5属于整合素家族成员,整合蛋白是参与细胞黏附的细胞表面受体,是通过细胞表面介导细菌黏附的粘连蛋白。ITGB5编码整合蛋白的β亚基,编码细胞表面糖蛋白,其主要功能为参与免疫细胞的黏附作用,它的作用机制是调节邻近细胞或胞外基质的黏附分子。经过搜寻鉴别ITGB5基因单核苷酸多样性,并分析ITGB5基因多态性与黏附表型的关联性,我们发现这些位点与黏附的关联性较强,ITGB5基因的缺失会显著降低黏附到IPEC-J2细胞上的ETEC数目,而该基因的过表达会导致细菌黏附于IPEC-J2的数量增加,这些结论支持ITGB5基因是ETEC F4ac的受体基因的假设,但是依然需要更加深入的研究来验证这一推论,例如进行动物模型实验。论文“Diurnal,localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tipsin wild-type but not Itgb5-/-or Mfge8-/-mouse retina.”提到Itgb5-/-小鼠,文章中所使用的Itgb5-/-小鼠为非特异性基因敲除的小鼠或者说是全身性基因敲除的小鼠,由于有些基因对小鼠个体很重要,敲除后会导致小鼠不能存活、不能正常发育、繁殖能力异常,因此,研究某个基因仅在某个器官、某个时期缺失后有什么功能,不能用全身性基因敲除方法。对于针对后续进行肠道研究实验建立的敲除鼠,需要使用条件性基因敲除的方法进行处理,而用于该方面研究的小鼠模型存在空白,针对以上现状,为深入了解ITGB5基因对ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用,迫切需要开发ITGB5基因敲除小鼠模型的构建方法,以克服当前实际应用中的不足。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用。本发明是通过利用ITGB5基因flox小鼠与组织特异性表达Cre重组酶(Vil-Cre)的小鼠交配后,其后代flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除,导致ITGB5基因在肠道组织类型中功能性缺失,获得条件性基因敲除(Conditional Knockout,CKO)小鼠,为有目的地研究ITGB5基因对ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制提供理想的动物模型。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,包括以下步骤:
(1)确定小鼠待敲除基因的靶位点,设计针对ITGB5基因的gRNA,所述gRNA的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示;
(2)构建同源重组载体,所述同源重组载体包括:5’同源臂、flox区域和3’同源臂;
(3)将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体注射到小鼠的受精卵中,取存活的受精卵移植到假孕母鼠体内,产出F0代小鼠,对F0代小鼠进行鉴定;
(4)将阳性的F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,对F1代小鼠进行鉴定;
(5)将步骤(4)得到的含有打靶序列的杂合性F1代小鼠与Vil-Cre重组酶阳性小鼠杂交获得F2代小鼠,对F2代小鼠进行鉴定,得到ITGB5条件性基因敲除小鼠模型。
进一步的,步骤(2)中,flox区域序列如SEQ ID No.3所示。
进一步的,步骤(2)中,5’同源臂序列和3’同源臂序列分别如SEQ ID No.4和SEQID No.5所示。
进一步的,步骤(3)中,对产出F0代小鼠进行PCR鉴定,其中,
5’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7;
3’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
进一步的,步骤(4)中,对F1代小鼠进行flox位点PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。
进一步的,步骤(5)中,对F2代小鼠进行flox位点PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。
进一步的,步骤(5)中,对F2代小鼠进行Cre作用效果PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。
进一步的,步骤(5)中,对F2代小鼠进行肠道基因型qRT-PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.14和SEQ ID No.15。
本发明的第二方面,提供一种条件性基因敲除小鼠模型,所述条件性基因敲除小鼠模型由所述的构建方法构建得到。
本发明的第三方面,提供所述的条件性基因敲除小鼠模型在ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制研究中的应用
本发明的有益效果:
(1)本发明是通过利用ITGB5基因flox小鼠与组织特异性表达Cre重组酶(Vil-Cre)的小鼠交配后,其后代flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除,导致ITGB5基因在肠道组织类型中功能性缺失,获得条件性基因敲除(Conditional Knockout,CKO)小鼠,为有目的地研究ITGB5基因对ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制提供理想的动物模型。
(2)本发明构建得到的ITGB条件性基因敲除小鼠模型为进一步研究ITGB5基因的生物学功能奠定了基础,为特异性针对ITGB5基因的研究提供了理想模型,减少了全身敲除引起的其他机制的变化。本发明用小鼠模型模拟仔猪腹泻,为仔猪腹泻的致病机理研究和通过转基因技术对仔猪腹泻抗性基因进行功能验证奠定基础。
附图说明
图1为ITGB5条件性基因敲除小鼠策略图。
图2为同源重组载体质粒图谱。
图3为同源重组载体酶切鉴定电泳图。(BglII酶切鉴定结果,理论条带大小为6967bp、3329bp、2410bp;M:1kb;DNA ladder 10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图4为F0代小鼠鉴定策略示意图。
图5为同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图。(数字为F0代小鼠编号;WT为野生型对照;M为1kb DNA marker)。
图6为F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂PCR鉴定电泳图。PCR鉴定阳性小鼠为:3、4、15、16、17号;经测序确认均为阳性。(数字为F1代小鼠编号;WT为野生型对照;M为1kb DNAladder)。
图7为肠道组织flox位点***情况的PCR鉴定结果,根据专利中的flox位点PCR鉴定方法,单独鉴定flox位点***情况,纯合子:313bp;杂合子:251bp和313bp;野生型:251bp。M:2000bp DNA ladder(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图8为肠道组织Cre作用效果基因型鉴定结果,根据专利中的Cre作用效果PCR鉴定方法,含有Cre的样本:657bp;不含Cre的样本:1399bp;野生型:1273bp。M:2000bp DNAladder(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图9为小鼠模型ITGB5条件性基因条件性敲除效果,图9中A为实时荧光定量PCR结果;图9中B为western blot实验结果;图9中C为免疫荧光实验结果。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。本发明所用C57BL/6J小鼠、Vil-Cre重组酶的阳性小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司,实验全程保证动物福利。
实施例1:ITGB5基因定点突变小鼠模型的构建
(1)小鼠ITGB5基因的gRNA设计、构建和纯化
CAS9是一种核酸酶,可通过crRNA和tracrRNA(或反式激活crRNA)的介导实现特异DNA序列的剪切。考虑到CRISPR/Cas9技术周期短、效率高的优点,设计ITGB5条件性基因敲除小鼠策略,见图1。根据策略,确定flox区域为ITGB5基因的exont2,exon2翻译起始于ITGB5基因编码区的2.9%,敲除该区域会引起读码框移码突变,使翻译提前终止。具体来看,选择敲除ITGB5基因部分intron 1,exon 2及部分intron 2,敲除区域共486bp,包含ITGB5基因整个编码区的2.9%;序列表中序列1的第1-284位为intron1;第285-370位为exon 2,共86bp(序列中灰色标记部分);第371-731位为intron 2;intron 1,exon 2及intron 2核苷酸序列如下:
从Ensembl(https://asia.ensembl.org/index.html)网站上获得小鼠基因组中ITGB5(ENSMUSG00000022817)基因的序列和结构信息,在基因的编码区域设计gRNA。本发明中针对的转录本(Ensembl号):Itgb5-201(ENSMUST00000069345.6),利用crispr.mit.edu(http://crispr.mit.edu/)来设计gRNA序列;向导RNA(gRNA)是一个短的合成RNA,由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列(靶位点)组成,合成gRNA1和gRNA2均由各自靶序列转录的RNA与gRNA的骨架序列连接而成,序列如下:
gRNA1,Sequence(5’-3’):TGCCCCGGTGAGGACCAGCATGG;(SEQ ID No.1);
gRNA2,Sequence(5’-3’):ACCCAGAAAAGAAACCCTTGAGG;(SEQ ID No.2)。
(2)对ITGB5基因进行flox修饰
同源定向修复(HDR)可以将特定的外源突变引入到目标基因DNA中,将含有flox序列的DNA修复模板(即包含3.0kb 5’同源臂、0.7kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂的序列)与gRNA和Cas9一起,通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector),骨架载体是PBR322,该载体包含3.0kb 5’同源臂(SEQ ID No.4,具体核苷酸序列请见序列表)、0.7kb的flox区域(SEQ ID No.3,具体核苷酸序列请见序列表)和3.0kb3’同源臂(SEQ IDNo.5,具体核苷酸序列请见序列表),同源重组载体图质粒图谱见图2,酶切鉴定电泳图见图3。
(3)F0代小鼠获得及基因型鉴定
运用体外转录的方式,将Cas9 mRNA、gRNA(gRNA1和gRNA2)和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中。对于4-6周龄C57BL/6J小鼠,向雌小鼠腹腔内注射5个国际单位(IU)的孕马血清***(PMSG),约46-48h后再注射5IU的人绒毛膜***(hCG),12h后即可诱发***,供体雌鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼,交配后第四天收集供体雌鼠子宫中的囊胚,在显微镜下选择状态好的胚胎缓慢吹入受体雌鼠子宫中,子宫和肠系膜送回腹腔,移植手术成功后,20天左右出生的小鼠为F0代小鼠,通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定,鉴定策略示意图见图4,其中:
5’同源臂重组PCR鉴定所用引物:
Forward,Sequence(5’-3’):AATGGCCTGTGGAGGCTAAC(SEQ ID No.6);
Reverse,Sequence(5’-3’):TTCCACTCCCAATGACGGTG(SEQ ID No.7);
目的片段为:4.6kb WT:7.7kb。
3’同源臂重组PCR鉴定所用引物:
Forward,Sequence(5’-3’):GCCCTAAAAGGCTAGGGAGC(SEQ ID No.8);
Reverse,Sequence(5’-3’):AGCCTTGATTCAGACAGCCT(SEQ ID No.9);
目的片段为:4.0kb WT:7.3kb。
5’同源臂和3’同源臂的PCR反应条件相同,反应体系的区别仅在于所用的的引物不同(使用各自的引物),具体的PCR反应体系为:
表1反应体系
PCR反应条件为:94℃3min,98℃15sec,61℃15sec,68℃4min(98-68℃循环35次),68℃5min,12℃维持。
结果见图5,由于受精卵早期卵裂速度很快,因此得到的F0代小鼠为嵌合体,不一定具备稳定遗传的能力,需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠。
(4)F1代小鼠繁育及基因型鉴定
F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠。通过PCR方法及测序对其进行基因型鉴定:取1-2周F1代小鼠进行基因型鉴定,取需要鉴定的1~3mm小鼠尾尖组织于1.5ml的EP管中,用眼科钳剪碎所取组织。将剪碎的组织浸泡在预添加了200μl 1×Proteinase K的裂解液中,各组分添加完成后涡旋震荡,充分混匀后再使用,55℃孵育40-90min,孵育完成后,将样品置于95℃或者沸水浴中加热5min灭活Proteinase K,将裂解产物涡旋震荡充分混匀后,12,000rpm离心5min,取上清即可进行PCR反应,鉴定方式同步骤(3),F1代阳性小鼠基本信息见下表:
表3 F1代阳性小鼠基本信息
结果见图6,通过PCR鉴定,编号为3、4、15、16、17的小鼠为阳性小鼠。
单独鉴定flox位点***情况,纯合子:313bp条带;杂合子:251bp和313bp条带;野生型:251bp条带。
flox位点PCR鉴定时引物对序列分别为:
Forward,Sequence(5’-3’):GCAGGAGCAGGAGTTGCTAA(SEQ ID No.10);
Reverse,Sequence(5’-3’):AGCTCCAAGGAACAGGATGC(SEQ ID No.11)。
PCR反应体系:
表2 PCR反应体系
PCR反应条件为:94℃5min,94℃30sec,59℃30sec,72℃1min(94-72℃循环35次),72℃5min,12℃维持。
通过PCR鉴定,这些经测序确认均为阳性的小鼠即F1代flox杂合小鼠。
(5)F2代小鼠繁育及基因型鉴定
取步骤(4)中获取的F1代小鼠flox杂合小鼠与Vil-Cre重组酶的阳性小鼠杂交,获得F2代小鼠。
单独鉴定F2代小鼠flox位点***情况,纯合子:313bp条带;杂合子:251bp和313bp条带;野生型:251bp条带,鉴定方式同步骤(4)。
在F2代小鼠1-2周时取一小块表达Cre的组织,抽提基因组DNA,通过PCR的方法对flox区域进行扩增,直接鉴定肠道组织Cre作用效果。
Cre作用效果PCR鉴定时引物对序列分别为:
Forward,Sequence(5’-3’):TTCTCCACTAAGGGTGTGCG(SEQ ID No.12);
Reverse,Sequence(5’-3’):GGGAGTGCAGCTCAGTGTAG(SEQ ID No.13)。
含有Cre的样本:657bp条带;不含Cre的样本:1399bp条带;野生型:1273bp条带。
PCR反应体系为:
表4 PCR反应体系
PCR反应条件为:95℃3min,98℃15sec,61℃15sec,68℃1min(98-68℃循环35次),68℃5 min,12℃维持。
PCR鉴定结果如图7、图8所示,通过PCR鉴定,编号为19、51、81、83、84、86的小鼠为敲除ITGB5鼠;编号为61、64、85、87、88、101、103、105、107的小鼠为未敲除ITGB5鼠。
通过qRT-PCR、western blot、免疫荧光实验对肠道进行基因型鉴定。
qRT-PCR引物序列
Forward,Sequence(5’-3’):TTCCGCCATCTGCTGCCTCT(SEQ ID No.14);
Reverse,Sequence(5’-3’):CCTTCCGCCAACCAATCTTCTCC(SEQ ID No.15)。
表5 qRT-PCR反应体系
PCR反应条件为:预变性95℃30sec;循环反应:95℃10sec,60℃30 sec(95-60℃循环40次);溶解曲线95℃15sec,60℃60 sec,95℃15sec。
结果见图9,图9中A、图9中B和图9中C分别为小鼠空肠组织通过qRT-PCR、westernblot、免疫荧光进行的实验,目的是为了在mRNA、蛋白水平对特异性敲除组织肠道进行ITGB5基因敲除效果鉴定。control(itgb5+/+)为ITGB5基因未敲除,experimental(itgb5-/-)为ITGB5基因敲除组,图9中A可以看出experimental组的ITGB5的RNA表达明显低于control组;图9中B和C可以看出experimental组的ITGB5的蛋白表达明显低于control组。可以说明ITGB5在RNA、蛋白水平表达均显著降低,说明ITGB5在肠道组织敲除成功。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)确定小鼠待敲除基因的靶位点,设计针对ITGB5基因的gRNA,所述gRNA的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示;
(2)构建同源重组载体,所述同源重组载体包括:5’同源臂、flox区域和3’同源臂;
(3)将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体注射到小鼠的受精卵中,取存活的受精卵移植到假孕母鼠体内,产出F0代小鼠,对F0代小鼠进行鉴定;
(4)将阳性的F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,对F1代小鼠进行鉴定;
(5)将步骤(4)得到的含有打靶序列的杂合性F1代小鼠与Vil-Cre重组酶阳性小鼠杂交获得F2代小鼠,对F2代小鼠进行鉴定,得到ITGB5条件性基因敲除小鼠模型。
2.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,flox区域序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,5’同源臂序列和3’同源臂序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。
4.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(3)中,对产出F0代小鼠进行PCR鉴定,其中,
5’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7;
3’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
5.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(4)中,对F1代小鼠进行flox位点PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11。
6.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(5)中,对F2代小鼠进行flox位点PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11。
7.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(5)中,对F2代小鼠进行Cre作用效果PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.12和SEQID No.13。
8.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于,步骤(5)中,对F2代小鼠进行肠道基因型qRT-PCR鉴定,鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.14和SEQ ID No.15。
9.一种条件性基因敲除小鼠模型,其特征在于,所述条件性基因敲除小鼠模型由权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到。
10.权利要求9所述的条件性基因敲除小鼠模型在ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制研究中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311708280.7A CN117701634A (zh) | 2023-12-12 | 2023-12-12 | 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311708280.7A CN117701634A (zh) | 2023-12-12 | 2023-12-12 | 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117701634A true CN117701634A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90149136
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311708280.7A Pending CN117701634A (zh) | 2023-12-12 | 2023-12-12 | 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117701634A (zh) |
-
2023
- 2023-12-12 CN CN202311708280.7A patent/CN117701634A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107858373B (zh) | 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法 | |
CN108660161B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
CN106470545B (zh) | 人源化IL-4和IL-4Rα动物 | |
CN110551759B (zh) | 一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法 | |
CN109197781B (zh) | Aurka-cko1-n条件性基因敲除小鼠模型的构建方法 | |
CN110771573B (zh) | PirB基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法 | |
CN110257435B (zh) | 一种prom1-ko小鼠模型的构建方法及其应用 | |
CN110438160B (zh) | 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用 | |
JP2023104002A (ja) | エクソンヒト化マウス | |
CN112899311A (zh) | 一种rs1-ko小鼠模型的构建方法及其应用 | |
CN113897369A (zh) | KRT10定点基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的构建及应用 | |
CN111979241B (zh) | 制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法 | |
CN114591957B (zh) | 一种重症a型血友病动物模型的构建方法及其应用 | |
CN116716345A (zh) | 一种用于制备人源化rho和或rho突变体小鼠的方法及其应用 | |
CN114457114B (zh) | 一种Fars2基因条件性敲除动物模型的构建方法 | |
CN114574526B (zh) | 一种rpsa基因猪源化小鼠模型的构建方法 | |
CN117701634A (zh) | 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 | |
CN110218743B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法 | |
CN109694885B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒 | |
CN113862266A (zh) | 靶向小鼠BBS5基因的gRNA及构建Bardet–Biedl小鼠模型的方法 | |
CN111979272A (zh) | 制备视网膜病变的非人哺乳动物模型的方法及其应用 | |
CN117363660B (zh) | 一种构建sma小鼠模型的方法 | |
CN117660527B (zh) | 一种ABCA7-Floxp小鼠模型的构建方法和应用 | |
CN109090040B (zh) | 一种Wnt10aflox/flox小鼠模型的构建方法 | |
CN116144709A (zh) | 一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型及其构建方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |