CN117683877A - 一种诊断或治疗免疫***疾病的生物标志物或靶点 - Google Patents

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CN117683877A CN202311751900.5A CN202311751900A CN117683877A CN 117683877 A CN117683877 A CN 117683877A CN 202311751900 A CN202311751900 A CN 202311751900A CN 117683877 A CN117683877 A CN 117683877A
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王�锋
李晓雪
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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种诊断或治疗免疫***疾病的生物标志物或靶点。所述的生物标志物或靶点包括Dock2和/或Sub1。所述的Dock2和/或Sub1在多种免疫***疾病中高表达，下调Dock2和/或Sub1能用于治疗多种免疫***疾病(特别是多发性硬化症)。

Description

一种诊断或治疗免疫***疾病的生物标志物或靶点
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种诊断或治疗免疫***疾病的生物标志物或靶点。
背景技术
免疫***的一个基本特征是其独特的能力，充分区分自我和非自我，以防止异常感染和定植。免疫平衡状态的维持需要对免疫细胞的活性和功能进行精确的控制，以避免针对自身的不必要反应。中枢和外周淋巴器官维持机体免疫耐受，使得机体产生的自身反应性T、B淋巴细胞在正常情况下能够被清除或沉默。免疫***进化出了多种控制自身反应的机制，其中一种或多种机制的缺陷可能导致耐受性的破坏，使得自身反应性淋巴细胞能够逃避免疫***监视，导致自身免疫性疾病。广泛的自身免疫性疾病被描述为具有可变的发病年龄、组织分布、临床和功能影响。这些疾病大多无法治愈，需要终生治疗。自身免疫性疾病影响大约十分之一的个体，其病因复杂，症状体征多变，发病机制未完全明了。
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种典型的中枢神经***(centralnervous system，CNS)白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫病，由T细胞介导的免疫耐受紊乱进而导致神经髓鞘和轴索发生炎性损害。因为其发病率较高，慢性病程并倾向于年轻人罹患，所以已经成为最重要的神经***疾病之一。尽管多发性硬化症的确切病因尚不清楚，但人们普遍认为髓磷脂特异性CD4+T细胞的激活是神经炎症开始的核心步骤。多发性硬化最强的遗传危险因素是HLA-DRA、白细胞介素(IL)-2R和IL-7R基因，这强调了CD4+T细胞的重要性。骨髓特异性T细胞过继性转移可诱导EAE的发生进一步强化了MS是T细胞介导的自身免疫性疾病的观点。此外，仅CD4+T细胞转移就足以引发EAE，这一观察结果使大多数致病机制的研究集中在CD4+T细胞的致病作用上。
中枢神经***有几个独特的屏障来维持体内平衡和限制白细胞的浸润。为了启动中枢神经***自身免疫，自身抗原特异性T细胞在外周被激活并进入中枢神经***，在那里它们被呈递自身抗原的APC重新激活，这会触发细胞因子的释放，从而激活和招募其他炎症细胞，从而引起炎症。然而，中枢神经***使用各种障碍，如血脑屏障(BBB)和血脑脊液屏障(BCSFB)来限制T细胞的进入。为了突破这些障碍，需要协调使用选择素、整合素和趋化因子才能有效地向中枢神经***迁移。在免疫失调的情况下，阻断免疫细胞向中枢神经***的迁移已被证明是治疗MS的有效方法。最近的一项研究发现，DICAM(dual immunoglobulindomain containing cell adhesion molecule)通过促进TH17淋巴细胞在血脑屏障内皮上的迁移来促进神经炎症，通过药物中和DICAM可减少小鼠和人类TH17细胞通过血脑屏障的运输，并缓解小鼠自身免疫性脑脊髓炎模型的疾病症状，这些结果表明用单克隆抗体阻断DICAM可能是一种很有前途的治疗方法。Natalizumab是一种经批准的单克隆抗体，旨在通过靶向几乎所有免疫细胞亚群上表达的整合素VLA4特异性地阻碍这一过程。尽管natalizumab对治疗MS患者有一定的疗效，但natalizumab被发现与停药后MS活性的严重反弹有关，也与危及生命的中枢神经***感染有关，这是由于保护性和致病性白细胞普遍表达VLA4导致中枢神经***免疫监测受损所致。因此寻求有效性与低副作用性的新靶点至关重要。
趋化因子信号是淋巴细胞运输、激活和存活的重要组成部分，动态的细胞骨架变化发生在T细胞跨内皮迁移(TEM)的整个过程中。Rac是GTPase Rho家族的成员，是大多数趋化因子受体下游肌动蛋白细胞骨架动力学的主要驱动因素。Rac在无活性(GDP结合)和活性(GTP结合)状态之间循环，这种切换主要是由于鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的作用。GEFs由两个家族成员组成:经典的含Dbl-homology(DH)结构域的蛋白家族和非经典的Dock蛋白家族。Dock蛋白家族包括高度保守的Dock同源结构域DHR-1和DHR-2，在细胞增殖、迁移和活化中起关键作用。基于序列同源性和底物特异性，Dock蛋白家族包括4种类型:Dock-a、Dock-b、Dock-c和Dock-d。Dock-A亚家族包括Dock1、Dock2和Dock5，它们都能激活小G蛋白Rac，但不能激活Cdc42。在这些亚家族成员中，Dock2在免疫细胞上特异性表达，包括骨髓细胞和T/B淋巴细胞，而其他Dock蛋白的表达并不局限于免疫细胞。Dock2通过激活Rac影响细胞膜极化和细胞骨架动力学，调控淋巴细胞和先天免疫细胞的迁移、增殖和活化。通过使用Dock2-/-小鼠，已经确定Dock2对于多种趋化因子受体下游淋巴细胞(包括CCR7和CXCR4)的Rac激活和趋化至关重要。越来越多的证据表明，Dock2调节各种炎症性疾病的发展，如利什曼原虫大感染、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、T和B细胞联合免疫缺陷引起的过敏性疾病等。
转录激活因子(SUB1,也被称为PC4)被鉴定为RNA聚合酶Ⅱ依赖性转录的辅助激活因子，其包含一个独特的保守的非特异性DNA结合域，并参与不同的DNA依赖过程，包括复制，DNA修复和转录。在小鼠中，完全敲除SUB1会导致胚胎致死，这反映了它的多种功能。作为转录调节因子，多项研究已经证明SUB1可以直接启动多个基因的转录起始，例如PLK1、BUB1B和C-MYC等。此外，SUB1与VP16、GAL4、AP2、HIV-TAT、P53和SMYD3等激活因子的不同结构域相互作用，以调节其功能。目前，关于SUB1功能的研究大部分还是聚焦在肿瘤细胞上，例如非专利文献：MicroRNA-101regulated transcriptional modulator SUB1 plays arole in prostate cancer(Chakravarthi BV,Goswami MT,et al.,Oncogene.2016Dec 8；35(49):6330-6340)公开了SUB1在***癌细胞中表达升高；再如非专利文献：SUB1在肝癌患者中的预后价值(黄勇平，唐德钧，刘冬等，岭南现代临床外科，2020,20(04)中公开了SUB1在肝癌织中高表达，SUB1可以作为肝癌患者总体生存和无病生存的预后因素，但是现有技术中还未公开SUB1与免疫***疾病之间的关系。
发明内容
本申请发现Sub1在多种免疫***疾病患者的CD4+T细胞中高表达。通过缺失Sub1下调了Dock2的表达，抑制GTPase活性和F肌动蛋白聚合，从而抑制CD4+T细胞向中枢神经***的迁移而阻断免疫***疾病(特别是多发性硬化症)的发生。明确Sub1作为CD4+T细胞迁移的关键调节因子，是阻断CD4+T细胞向中枢神经***迁移的潜在治疗靶点，对于遏制免疫***疾病(特别是多发性硬化)的发生发展具有重要的意义。具体的：
本发明的第一方面，提供了一种Dock2和/或Sub1作为生物标志物或靶点在制备诊断、监测、严重程度评估、疗效评估或预后评估，和/或，预防或治疗免疫***疾病的产品中的应用。
优选的，所述的Dock2和/或Sub1为基因和/或蛋白。
其中，Dock2为胞质***蛋白2或其编码基因；Sub1为RNA聚合酶Ⅱ依赖性转录的辅助激活因子或其编码基因。
优选的，所述的诊断、监测、严重程度评估、疗效评估和/或预后评估免疫***疾病包括检测Dock2和/或Sub1的有无或其mRNA和/或蛋白的表达量。
优选的，所述的检测Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量包括使用试剂。
进一步优选的，所述的试剂可以包括但不限于PCR所需试剂、RPA所需试剂、LAMP所需试剂、ERA所需试剂、RCA所需试剂、Western blot所需试剂、免疫组化所需试剂、测序所需试剂、液相所需试剂或者质谱所需试剂等等。
优选的，当Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量显著高于阈值，则表示个体患免疫***疾病，其中，所述的阈值为通过实验在前期获得。
优选的，所述的预防或治疗免疫***疾病包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量。
优选的，所述的调节包括上调或下调。
进一步优选的，所述的预防或治疗免疫***疾病包括敲除或敲低Sub1，更优选的，所述的敲除或敲低Sub1包括但不限于使用CRISPR/Cas***、组织特异性敲除***或导入靶向Sub1的干扰RNA或microRNA(例如microRNA-101)。
优选的，所述的敲除或敲低Sub1包括使用试剂。
优选的，所述的试剂包括但不限于敲除或敲低所需的试剂(例如组织特异性敲除***所需的材料，CRISPR/Cas***所需的材料、干扰RNA或microRNA等)，或者，抑制基因转录和/或翻译所需的试剂等等。
优选的，所述的干扰RNA包括但不限于siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA或miRNA中一种或两种以上。
优选的，CRISPR/Cas***中使用的Cas蛋白选自Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csy4、Csel、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Cscl、Csc2、Csa5、Csnl、Csn2、Csml、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、CsxlO、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、CsxlS、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Csdl、Csd2、Cstl、Cst2、Cshl、Csh2、Csal、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、C2cl、C2c2、C2c3、Cpfl、CARF、DinG、其同源物或其修饰形式。
所述的组织特异性敲除技术包括但不限于Cre/loxp重组酶***，Cre/loxp重组酶***是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、***、易位及倒位，用该***可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激，对细胞中DNA进行修改。Cre重组酶识别loxP位点两端的反向重复序列并结合形成二聚体，然后此二聚体与另一个loxP位点上的二聚体结合形成一个四聚体。LoxP位点是有方向性的，四聚体连接的两个位点在方向上是平行的。然后两个loxP位点间的DNA序列被Cre重组酶切断。接着，DNA连接酶快速高效地将这些链连接起来。如果两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶介导loxP间的序列切除；如果两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶介导loxP间的序列反转；如果两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶介导两条DNA链发生交换或染色体易位。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的Cre/loxp重组酶***中两个loxp位点设置在目标基因两端，同向排列(flox/flox)，然后再导入Cre重组酶，介导loxP间的序列切除。
优选的，所述的敲除或敲低Sub1使得Sub1无法转录或转录后的蛋白不表达或活性降低，优选包括敲除Sub1基因的1号至5号外显子的全部或部分，例如1号、2号、3号、4号或5号外显子中的任一个或两个以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的敲除或敲低Sub1包括敲除Sub1基因的外显子3和外显子4，优选3-4内含子被敲除。优选的，敲除包括使用组织特异性敲除，例如将外显子3的5’端和外显子4的3’端***LoxP位点，然后再引入Cre重组酶。
优选的，所述的敲除或敲低Sub1包括敲除T细胞中的Sub1基因。所述的T细胞可以为CD4+T细胞或CD8+T细胞，进一步优选CD4+CD8+T细胞。优选的，所述的敲除或敲低包括联合使用组织特异性敲除***和CRISPR/Cas***，进一步优选的，所述的敲除或敲低Sub1包括使用CRISPR/Cas***在Sub1基因的外显子3的5’端和外显子4的3’端***LoxP位点，然后再导入Cre重组酶(例如T细胞特异性Cre重组酶，包括但不限于CD4-Cre和/或CD8-Cre)。优选的，所述的Dock2和/或Sub1来源于中枢神经***、体液、细胞、组织或器官中的一种或两种以上；
优选的，所述的体液包括血液或脑脊液。
优选的，所述的组织包括脑组织、脊髓、脾脏或淋巴组织中的一种或两种以上；
优选的，所述的细胞包括免疫细胞，进一步优选的，所述的免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞中的一种或两种以上。
优选的，所述的淋巴细胞包括T细胞，优选的，所述的T细胞包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD4+CD8+T细胞、Treg细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、CD127+)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+CD8+T细胞。
优选的，所述的产品包括检测Dock2和/或Sub1的有无或其mRNA和/或蛋白的表达量的试剂，或者，所述的产品包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量的试剂(优选为上调或下调，进一步优选为下调)。
在本发明的一个具体实施方式中，Sub1增强染色质的组蛋白修饰(例如甲基化修饰或乙酰化修饰)使染色质的开放程度增加从而招募AP-1转录因子结合到Dock2的启动子上驱动转录，同时Sub1通过与AP-1的相互作用进一步稳定AP-1在Dock2的启动子上的占据从而促进AP-1介导的转录激活。
其中，AP-1为转录因子，是一种二聚体复合物，由碱性亮氨酸拉链结构的Jun蛋白质、Fos蛋白质、激活转录因子ATF(activating transcription factor)或肌肉腱膜纤维肉瘤MAF(musculoaponeurotic fibrosarcoma)家族形成高度保守的同源二聚体或异源二聚体,可激活下游靶基因的转录。
优选的，所述的Jun蛋白家族包括v-Jun、c-Jun、JunB或JunD中的一种或两种以上；
优选的，所述的Fos蛋白家族包括v-Fos、c-Fos,FosB,Fra-1,Fra-2中的一种或两种以上；
优选的，所述的ATF蛋白家族包括ATF2、ATF3/LRF1、B-ATF、JDP1或JDP2中的一种或两种以上；
优选的，所述的MAF蛋白家族包括c-Maf、MafB、MafA、MafG、MafF、MafK或Nrl中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的AP-1为由Jun(c-Jun、JunB或JunD中的一种或两种以上)和/和Fos(c-Fos、FosB、Fra-1或Fra-2中的一种或两种以上)多基因家族成员组成的二聚体。
所述的组蛋白甲基化修饰包括H3K4me1(表示在H3组蛋白的第4位赖氨酸的单甲基化)。
所述的组蛋白乙酰化修饰包括H3K27ac(表示在H3组蛋白的第14位赖氨酸的乙酰化)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的产品包括药物，或，用于免疫***疾病诊断、监测、严重程度评估、疗效评估和/或预后评估的试剂盒、试纸、质谱或生物芯片。
优选的，所述的药物包括调节Dock2和/或Sub1的试剂，进一步优选的，所述的调节包括上调和/或下调。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的药物下调Dock2和/或Sub1，所述的药物可以为抗体或小分子抑制剂等等，例如，所述的药物可以为抗Dock2抗体、抗Sub1抗体、microRNA(例如microRNA-101)或IRF4转录因子抗体中的一种或两种以上。
下调Sub1可以下调Dock2的表达。
下调Sub1可以阻断或减缓Dock2介导的CD4+T细胞(包含CD4+CD8+T细胞)迁移，从而预防或治疗免疫***疾病。
所述的CD4+T细胞迁移包括CD4+T细胞向中枢神经***的迁移。
下调Sub1通过下调Dock2的表达抑制GTPase活性和F-actin的聚合，从而抑制CD4+T细胞向中枢神经***的迁移而阻断免疫***疾病的发生。
优选的，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述的药学上可接受的辅料选自稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、pH调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、金属离子螯合剂、抑菌剂或等渗调节剂中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述药物的制剂形式可以为悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、水溶液、霜剂、凝胶剂或乳剂。所述药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
优选的，药物制剂优选为单位剂量制剂。
优选的，所述的药物中包含的活性成分(调节Dock2和/或Sub1的试剂)按照体积或质量比计算包括0.001％-99.9％中的任一数值，例如0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.1、99.5、99.9％等。
根据具体实施方式的需要，所述的药物中还可以包含其它适合的治疗剂。
所述的药物适于非肠胃给药诸如例如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径给药的制剂包括含水和非水的等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，和使制剂与接受者的血液等渗的溶质，以及含水和非水的无菌悬浮剂，其可包含助悬剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂或防腐剂。制剂可存在于单位剂量或者多剂量密封容器诸如安瓿和小瓶中。注射用溶液和悬浮液可从先前所述类型的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。
优选的，药物的给药方式包括但不限于静脉输注，局部给药，腹膜内给药或鞘内给药等等。
优选的，所述的试剂盒、试纸、质谱或生物芯片特异性检测Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量，优选包含检测Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的试剂。
优选的，所述的试剂盒选自免疫磁珠检测试剂盒、凝集检测试剂盒、液相芯片检测试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或质谱检测试剂盒。
所述的试剂盒还包括稀释液、清洗溶液、缓冲液、底物和/或终止溶液。
优选的，所述的免疫***疾病为抑制T细胞(例如CD4+T细胞)迁移有益于预防或治疗的免疫***疾病。
进一步优选的，所述的T细胞迁移为Dock2介导T细胞迁移。所述的T细胞迁移包括T细胞向中枢神经***的迁移。
优选的，免疫***疾病包括感染性疾病、超敏反应性疾病、自身免疫疾病、免疫增殖病或免疫缺陷病中的一种或两种以上。
优选的，所述的免疫***疾病为中枢神经***白质脱髓鞘病变的自身免疫疾病。
优选的，所述的自身免疫疾病包括不限于免疫介导的炎症性疾病。
进一步优选的，所述的免疫***疾病包括***性红斑狼疮、类风湿关节炎、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎、史提芬强生症候群、干燥综合征、***性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性***病、桥本氏甲状腺炎、原发性黏液性水肿、强制性脊柱炎、成人斯蒂尔病、贝赫切特综合征、***性硬化症、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、结节性多动脉炎或溃疡性结肠炎中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的免疫***疾病为多发性硬化。
本发明的第二方面，提供了一种免疫***疾病的生物标志物，所述的生物标志物包括Dock2和/或Sub1。
本发明的第三方面，提供了一种筛选预防或治疗免疫***疾病药物的方法，所述的方法包括将待测药物处理样本后检测Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白表达量。
优选的，所述的样本包括但不限于体液、细胞、组织或器官。
优选的，所述的体液包括血液或脑脊液。
优选的，所述的组织包括脑组织、脊髓、脾脏或淋巴组织中的一种或两种以上；
优选的，所述的细胞包括免疫细胞，进一步优选的，所述的免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞中的一种或两种以上。
优选的，所述的淋巴细胞包括T细胞，优选的，所述的T细胞包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD4+CD8+T细胞、Treg细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、CD127+)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+CD8+T细胞。
优选的，可以下调样本中Dock2和/或Sub1的待测药物具有预防或治疗作用。
本发明的第四方面，提供了一种诊断、监测、严重程度评估、疗效评估和/或预后评估免疫***疾病的方法。
优选的，所述的方法包括检测Dock2和/或Sub1的有无或其mRNA和/或蛋白的表达量。
当Dock2和/或Sub1的表达量高于阈值，指示患病或风险较高。
本发明的第五方面，提供了一种预防和/或治疗免疫***疾病的方法。
优选的，所述的方法包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量。
优选的，所述的调节包括下调。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的下调Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量的试剂。
优选的，下调Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量的试剂可以为敲除或敲低Sub1所需试剂。
本发明的第六方面，提供了一种抑制免疫细胞迁移的方法，所述的方法包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA或蛋白的表达量。
优选的，所述的调节包括下调。
优选的，所述的免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞中的一种或两种以上。优选的，所述淋巴细胞包括T细胞。
进一步优选的，所述的T细胞包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、Treg细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、CD127+)。
优选的，所述迁移包括向中枢神经***迁移。
优选的，所述的免疫细胞迁移为Dock2介导的T细胞迁移。
优选的，通过抑制Dock2介导的T细胞迁移预防或治疗免疫***疾病。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括下调Sub1的表达，优选通过Cre/loxp重组酶***下调Sub1的表达。
本发明的第七方面，提供了一种免疫***疾病动物模型的构建方法，所述的构建方法包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达。
优选的，所述的构建方法包括调节免疫细胞中的Dock2和/或Sub1的表达。所述的免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞中的一种或两种以上，优选为T细胞，例如CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD4+CD8+T细胞、Treg细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、CD127+)。
优选的，所述的调节为上调。
优选的，所述的上调Sub1为过表达Sub1和/或过表达Dock2。
优选的，所述的上调Dock2为过表达Dock2或其DHR-2结构域。
上调Sub1可以上调Dock2的表达。
上调Sub1可以促进Dock2介导的CD4+T细胞(包含CD4+CD8+T细胞)迁移促进免疫***疾病的发生或发展。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在动物模型体内过表达Dock2或其DHR-2结构域，以促进CD4+T细胞的GTPase活性和F-肌动蛋白聚合能力，促进Dock2介导的CD4+T细胞(包含CD4+CD8+T细胞)迁移。
所述的动物模型为非人哺乳动物或人，例如大鼠、小鼠、猴、猪、牛、马、羊、狗、猫等等。
本发明的第八方面，提供了一种抑制细胞因子分泌的方法，所述的方法包括调节Sub1的表达量。优选包括调节Sub1的mRNA或蛋白的表达量。
优选的，所述的调节包括上调或下调。
优选的，所述的细胞因子包括IL-17A或IFN-γ中的一种或两种。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“预后评估”指预测疾病的可能病程和结局，包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失，以及死亡)。
本发明所述的“疗效评估”指评估患者对治疗的反应。
本发明所述的“监测”指观察疾病的发生、发展动态。
本发明所述的“预防”指个体在疾病未确诊或未发病前，采取特定措施，防止疾病的发生。
本发明术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。
本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：Sub1在自身免疫疾病患者的CD4+T细胞中表达量分析；
图2：Sub1在MS患者的CD4+T细胞中表达量分析；
图3：WT和Sub1-KO小鼠Sub1 mRNA的表达量；
图4：WT和Sub1-KO小鼠T细胞发育的流式细胞图和定量检测，其中，DN表示双阴性细胞CD4-CD8-，DP表示双阳性细胞CD4+CD8+；
图5：利用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)肽免疫引发自身免疫性脑脊髓炎EAE的流程图；
图6：WT和Sub1-KO小鼠在免疫不同天数后的EAE临床评分；
图7：HE染色结果；
图8：LFB染色结果；
图9：WT和Sub1-KO小鼠中枢神经***和外周CD4+T细胞分析；
图10：CD4+T细胞过继回输诱导EAE发生的实验流程；
图11CD4+T细胞过继回输不同天数后的EAE临床评分；
图12：小鼠脑部的流式分析结果；
图13：小鼠脊髓的流式分析结果；
图14：RNA-seq差异基因火山图和KEGG通路分析；
图15：Sub1缺失抑制CD4+T细胞体外趋化和体内归巢能力；
图16：Sub1缺失下调Dock2表达，抑制Rac的活化和F-actin聚合；
图17：过表达Dock2挽救Sub1缺失的CD4+T细胞功能；
图18：Sub1增强染色质可及性，协同JUNB促进Dock2的表达；
图19：Sub1增加组蛋白H3K27ac和H3K4me1修饰，促进染色质开放。
各附图中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001，NS表示无显著差异。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请中涉及的部分材料来源及实验方法如下：
1、小鼠来源
Sub1fl/fl(Sub1位于小鼠第15染色体上，NCBI参考序列:NM_011294。外显子3-4作为条件敲除区,该区域的缺失将导致小鼠Sub1基因功能的丧失。Sub1fl/fl小鼠为利用CRISPR/Cas介导的基因组工程技术，在外显子3-4两端***LoxP位点)和CD4-Cre小鼠购自赛业生物科技有限公司。Sub1fl/fl小鼠与CD4-Cre小鼠杂交产生Sub1-KO小鼠。所有小鼠均饲养在无特定病原体(SPF)设施中。
2、EAE模型诱导
用含有髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽MOG35-55(100μg/只)和结核分枝杆菌H37Ra提取物(5mg/mL)的乳剂(完全弗氏佐剂，200ul/只)在四肢均衡比例免疫8-10周龄小鼠(WT和Sub1-KO)。免疫后第0天和第2天，腹腔注射200ng百日咳毒素(PTX)。每日根据以下评分评估EAE的临床症状:0分，无临床症状；1分，软尾；2分，后肢软弱无力；3分，后肢瘫痪；4分，四肢瘫痪；5分，濒死状态。
3、T效应细胞过继回输诱导EAE
WT,Sub1-KO小鼠EAE造模第七天时分离脾脏细胞，制备浓度为107个细胞/mL的细胞悬液，将细胞悬液置于T75培养瓶中。细胞在37℃，5％ CO2,50μg/mL MOG下培养3天，Th17极化条件为:20ng/mL mIL-23，20ng/ml mIL6,mTGFβ2ng/ml。收集再刺激的细胞并用PBS洗涤。向C57BL/6受体小鼠静脉注射1×107个细胞。受体小鼠在T细胞转移后第0天和第2天腹腔注射200ng百日咳毒素(PTX)，每天监测动物EAE的发展情况。
4、中枢神经***(CNS)中T细胞分离
小鼠心脏灌注冷PBS。在静水压力下，用PBS冲洗前脑和小脑，将脊髓从椎管中冲洗出来。将组织通过70μm过滤器研磨，收集研磨液然后进行70％/30％percoll梯度离心，分离单个核细胞。从中间层吸取出单个核细胞，洗涤后重悬在PBS中进行后续的流式分析。
5、流式分析
对于表面标记物，使用指定的抗体在4℃下对细胞进行30分钟的染色。为了检测T淋巴细胞细胞因子的表达，在Brefeldin A和Monenin溶液存在下，用500ng/ml离子霉素和50ng/ml PMA 37℃下激活细胞4h。然后，使用Violet LIVE/DEAD固定染色试剂进行活细胞鉴定，并用固定和渗透试剂盒固定和渗透细胞。在BD LSR Fortessa流式机器上采集细胞，使用Flowjo version 10软件进行分析。
6、RNA提取和实时荧光定量PCR(RT-PCR)
使用RNA提取试剂盒(RNAfast200，上海飞捷)按照制造商的方案从培养细胞或组织中提取总RNA。RNA逆转录使用RT试剂盒(Yeasen)。cDNA随后进行SYBR-based real-timePCR分析。采用GAPDH对结果进行归一化处理，数据以均数±标准差表示。p值采用Student’st检验计算。
7、蛋白免疫印记(western blot)
细胞样品在RIPA缓冲液(Beyotime,P0013B)中裂解，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂(MCE)。使用BCA蛋白测定法(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白质浓度。用12.5％的SDS-PAGE凝胶(雅酶)分离蛋白质，然后转移到0.22μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5％BSA室温下封闭1.5小时，随后与一抗在4℃下孵育过夜，然后与二抗孵育1小时。
8、趋化检测
趋化性实验采用Transwell 24孔板(孔径为5μm；CoStar)。细胞在无血清培养基中饥饿4-6h。用完全培养基重悬细胞(浓度为1×106个细胞/ml)，100μl细胞悬液加入到上室，在下室加入500μl含趋化因子的完全培养基。在37℃,5％ CO2下静置2小时后，收取下室全部细胞通过流式细胞术计数并计算迁移细胞的百分比。CCL21，CCL19和CXCL12趋化因子购自R&D公司。
9、T细胞归巢检测
提取WT和Sub1-KO小鼠脾脏细胞，分别用不同颜色的Cell Tracker染料进行标记，1：1混合静脉注射到C57/B6受体小鼠(每只小鼠1×107个细胞)。4和24小时后，从受体小鼠血液和次级淋巴器官中分离淋巴细胞进行流式检测。
10、Rac活性检测
细胞在CCL21(1μg/ml)刺激后，立即加入1×Mg2+裂解缓冲液[MLB；25mM Hepes(pH7.5)，150mM NaCl,1％ Igepal CA-630,10mM MgCl2,1mM EDTA,10％甘油；Millipore]，然后在4℃下，20000g离心1分钟。保留等量的细胞总裂解物作为对照，剩余裂解物与含有PAK1的GST融合Rac结合结构域的琼脂糖珠在4℃下孵育1小时。用1×MLB缓冲液洗涤2次，悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中[62.5mM三盐酸(pH 6.8)，2％ SDS,10％甘油，0.005％溴酚蓝，2.5％2-巯基乙醇]。结合蛋白和细胞总裂解物在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上用SDS-PAGE分离，用单克隆抗体Rac1检测。
11、F-肌动蛋白聚合检测
细胞在RPMI/1％ FCS/10mM HEPES(pH 7.5)中重悬至5×106个细胞/ml，并保存在37℃。在加入趋化因子之前，从每个样品中取出等分以确定基线F-肌动蛋白水平。将CCL21加入细胞悬液中，37℃刺激，按规定刺激时间取等分，立即用4％多聚甲醛固定10分钟。PBS洗涤后，样品用FITC-Phalloidin(Molecular Probes)作为F-actin的探针对样品进行染色，并用流式细胞术进行分析。
12、原代T细胞提取，培养
取小鼠***，使用70μm过滤器研磨，重悬于T细胞原代培养基中，37℃，5％ CO2条件下培养。T细胞原代培养基配方：RPMI 1640(500ml)+10％FBS+1％NEAA+1％sodiumpyruvate+1％P/S+1.74μlβ-mercaptoethanol。
13、双荧光素酶报告实验
通过克隆鼠Dock2启动子的全长-2000～+200区域，并将其***pGL3-Basic载体的NheⅠ和XhoI酶切位点之间，生成用于实验的启动子构建体。采用PEI转染试剂，按照转录因子：luc报告质粒：pRL-TK(renilla内参质粒)＝9：1：0.1的比例共转染293T细胞。六孔板每孔转染质粒总量3μg，PEI 12μl。转染48小时后，对细胞进行洗涤、裂解，使用多功能酶标仪依次评估萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。
14、RNA-seq分析
WT和Sub-KO EAE小鼠脾脏细胞中分选出CD4+T细胞，细胞沉淀裂解于Trizol。测序由联川生物有限公司完成。采用DESeq2包分析差异基因表达。通过将错误发现率(FDR)阈值设置为小于0.05来确定显著性列表，并且|log2FC|＞1.随后对所有差异表达基因进行GO功能和KEGG通路分析。
15、ATAC-seq分析
分选WT和Sub1-KO小鼠脾脏CD4+T细胞，冻存。测序由派诺森生物科技有限公司完成。ATAC-seq测序后获得原始数据(raw reads)，经过过滤去接头，去污染，比对参考基因组(GRCm38)，使用Unique mapped reads进行后续的信息分析。
16、ChIP-seq分析
小鼠原代CD4+T细胞在室温下与1％甲醛交联10分钟，用0.125mol/L甘氨酸终止交联。文库构建与测序由联川生物有限公司完成。使用Bowtie2(v2.2.6)软件将clean reads映射到小鼠基因组(GRCm38)。使用MACS(v2.1.1)寻峰算法进行峰值检测，使用ChIPseekerR包对基因特征的峰位点进行注释。
实施例1SUB1在多种自身免疫疾病患者CD4+T细胞中高表达
通过对来自337名被诊断患有10种免疫***疾病的患者和79名健康志愿者进行了大规模的免疫细胞基因表达分析，以及全基因组序列分析，发现SUB1在多种自身免疫疾病(例如史提芬强生症候群(SjS)、类风湿关节炎(RA)、***性红斑狼疮(SLE)、***性硬化症(SSc)、成人斯蒂尔病(AOSD)、贝赫切特综合征(BD))患者的CD4+T中高表达，如图1所示，这指示SUB1可能是导致自身免疫疾病的一个关键的致病因子，同时也是CD4+T细胞功能的一个重要调控因子。
进一步的，对多发性硬化症(MS)患者和健康志愿者的血液和脑脊液进行了单细胞数据分析。同样发现SUB1在多发性硬化症患者的CD4+T细胞中也有明显的高表达，如图2所示。
实施例2Sub1缺失可显著抑制CNS中CD4+T细胞的浸润，阻止EAE发生
为了探究Sub1在MS中的功能，构建了T细胞特异性敲除Sub1(Sub1-KO)的小鼠模型。首先，通过q-PCR检测了Sub1的敲除效率，确定Sub1-KO中Sub1被敲除(参见图3)，接着对敲除小鼠的T细胞发育情况进行检测，发现Sub1缺失并不影响T细胞的正常发育，如图4所示。
接下来用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)肽免疫WT和Sub1-KO小鼠，以此引发实验性***反应性脑脊髓炎EAE(experimental allergic encephalomyelitis，引发过程流程图参见图5，EAE是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经***内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，其病理变化与多发性硬化症类似。因此EAE动物模型是研究MS病理过程、发病机制的重要途经，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义)。研究发现Sub1基因的缺失完全抑制了EAE的发病，在实验期间完全未出现EAE症状(临床评分参见图6)。EAE小鼠发病过程中伴随着中枢神经***特别是脊髓白质炎症细胞浸润和髓鞘损伤，取WT和Sub1-KO EAE小鼠高峰期时的脊髓进行病理切片分析，HE结果显示WT组EAE小鼠脊髓白质区域紫蓝色颗粒密集，出现紫蓝色颗粒聚集成团现象，Sub1缺失EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润程度明显减少，说明Sub1缺失能够减轻炎症细胞向CNS的浸润(图7)。Luxol fast blue(LFB)可与髓鞘(myelin)结合染上蓝色，LFB不仅用于检测脊髓脱髓鞘现象，还可以显示病理情况下髓鞘是否完整、变性以及坏死程度和修复情况，实验结果显示相较于WT小鼠，Sub1-KO小鼠脊髓LFB染色显示蓝色部分明显增加，脊髓结构完整性较好，无空泡(图8)。
进一步又检测了中枢神经***(CNS)和外周中的T细胞情况。在EAE造模后的发病高峰期采集了WT或Sub1-KO小鼠脑，脊髓，脾脏和***进行流式检测分析。发现在脑和脊髓中，Sub1-KO小鼠CD4+T细胞总的浸润数量显著减少，产生IL-17A、IFN-γ的CD4+T细胞均显著减少。在脾脏和***中，CD4+T细胞的数量以及IL-17A和IFN-γ的产生在WT和Sub1-KO小鼠中无显著差异(参见图9)，这表明Sub1的缺失并未损害CD4+T细胞的活力。
为了进一步验证Sub1缺失可抑制EAE发病，又通过T细胞过继性转移诱导EAE发生，实验流程如示意图10所示。实验结果显示，接受Sub1-KO CD4+T细胞回输的受体小鼠始终未出现EAE症状(图11)。在发病高峰期取小鼠脑和脊髓进行流式分析，Sub1缺失的CD4+T细胞几乎没有浸润到CNS中(图12和图13)。以上结果表明Sub1缺失通过抑制CD4+T细胞向CNS的浸润来阻止EAE发生。
实施例3Sub1缺失抑制CD4+T细胞的迁移。
为了进一步探究Sub1调节CD4+T细胞功能的机制，在EAE造模后的第7天，取WT和Sub1-KO小鼠的脾脏CD4+T细胞进行了RNA-seq分析。火山图结果显示与WT CD4+T细胞相比，Sub1-KO CD4+T细胞上调52个基因，下调84个基因(图14中a)，KEGG结果显示Sub1缺失导致下调基因相关的信号通路主要为细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路等(图14中b)。
接下来在体外进行transwell实验来验证Sub1是否会影响CD4+T细胞的迁移能力。分别使用CCL21、CCL19和CXCL12三种不同的趋化因子来趋化CD4+T的迁移，结果显示Sub1缺失可显著抑制CD4+T细胞的体外迁移能力(图15中a)，这与前面EAE模型中CNS中CD4+T细胞浸润减少的结果一致。原始淋巴细胞不断地从血液中迁移或归巢到次级淋巴器官(SLO)，如脾脏、外周***(pLN)和肠系膜***(mLN)，以及肠道相关淋巴组织。为了进一步证明Sub1影响CD4+T细胞的迁移能力，进行了体内T细胞归巢实验(示意图如图15中b所示)。结果表明Sub1缺失会减弱CD4+T细胞向次级淋巴器官归巢的能力(参见图15中c)。
实施例4Sub1缺失通过下调Dock2的表达抑制Rac活性和F-肌动蛋白聚合
进一步分析Sub1缺失影响最为显著的基因，如热图所示(图16中a)，发现Sub1、Dock2、IL-17、IFN-γ等基因在Sub1-KO组显著下调。已有的研究表明，Dock2可通过激活Rac影响细胞膜极化和细胞骨架动力学，从而调控淋巴细胞和先天免疫细胞的迁移、增殖和活化等能力。首先通过RT-PCR和western blot分别在RNA和蛋白水平上检测了Dock2的表达，与RNA-seq的结果一致，Sub1缺失后显著下调的Dcok2的表达(图16中b和c)。
小G蛋白(small GTPase)Rac是F-肌动蛋白聚合的关键调节剂，是细胞迁移的先决条件。在淋巴细胞中，趋化因子介导的Rac激活强烈依赖于CDM蛋白家族成员Dock2。因此，进一步检测了Dock2的下调是否会导致Rac激活的受损。Western blot结果显示，Sub1缺失使活性Rac(Rac-GTP)的表达显著下降(图16中d)。由于鬼笔环肽能够选择性结合丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)而不是肌动蛋白单体(G-肌动蛋白)，通过鬼笔环肽染色强度来衡量F-肌动蛋白的聚合程度。结果表明Sub1缺失可明显减弱F-肌动蛋白的聚合能力(图16中e)。
实施例5过表达Dock2恢复Sub1缺失CD4+T细胞的迁移能力
为了验证Sub1调控的CD4+T细胞迁移是由Dock2介导的，进行了Dock2回补实验。已知DocK2含有四个结构域:SH3,DHR-1,DHR-2和PAA(图17中a)。其中DHR-2结构域中的V1538位点被证明可以直接与Rac结合并激活Rac，当该位点突变(V1538A)后，Rac GEF活性几乎完全丧失。由于Dock2全长无法表达，因此分别构建了Dock2-DHR2功能截短体和Dock2-DHR2V1538A突变体进行实验。结果表明过表达Dock2-DHR2可明显恢复Sub1-KO CD4+T细胞的Rac活化和F-肌动蛋白聚合能力(图17中b和c)。进一步的，体外transwell实验也表明过表达Dock2-DHR2可恢复Sub1-KO CD4+T细胞的体外迁移能力，而过表达突变体Dock2-DHR2V1538A无法恢复CD4+T细胞的迁移能力(图17中d)。
实施例6Sub1协同JUNB促进Dock2的表达
接下来进一步探究Sub1如何调控Dock2的表达。在EAE造模后的第7天，取WT和Sub1-KO小鼠的脾脏CD4+T细胞进行了ATAC-seq以描述染色质的可及性。图18中a结果显示，Sub1缺失后整体染色质开放程度明显减弱，这说明Sub1可增强染色质可及性进而调控基因的转录。ATAC(ATAC-seq：染色质开放性测序技术)所捕获染色质开放区一般是正在转录的那部分DNA序列的上下游，得到这些序列后可以对富集到的序列结合motif分析，以此来识别哪种转录因子参与了基因表达调控。使用HOMER软件对WT组特异性开放的染色质区域进行motif分析发现，AP-1可结合于这些开放的染色质区域(图18中b)，这指示Sub1可能与AP-1协同调控这些基因的表达。转录因子AP-1(激活蛋白1)是一个普遍存在的二聚体转录复合物家族，参与了大量的细胞和生理功能。AP-1二聚体由各种多基因蛋白家族组成，这些蛋白家族拥有高度保守的碱性亮氨酸拉链结构域(bZip)，其中亮氨酸拉链结构域(LZ)用于二聚化，碱性区域(BR)用于结合特定的DNA基元。AP-1通常被定义为由Jun(c-Jun,JunB,JunD)和Fos(c-Fos,FosB,Fra-1,Fra-2)多基因家族成员组成的二聚体集合。
为了验证Sub1是否与AP-1协同调控Dock2的表达，首先进行了免疫共沉淀(co-IP)实验以检测Sub1是否与AP-1存在相互作用。图18中c结果显示，Sub1与Jun家族蛋白c-Jun,JunB,JunD均有一定程度的互作，其中以与JunB的互作最为显著。为了验证Sub1与JunB能否直接结合Dock2的启动子来调控表达，构建了含Dock2启动子全长的荧光素酶报告质粒，使用双荧光素酶报告***对Sub1与JunB是否结合Dock2启动子序列进行检测。结果显示Sub1并未直接结合在Dock2启动子上，而JunB可明显结合于Dock2启动子上并增强Dock2的转录(图18中d)
实施例7Sub1通过增强组蛋白修饰促进染色质开放
开放染色质允许调控因子结合的特性称为染色质的可及性，染色体组蛋白修饰是调节染色质可及性的一个关键因素。已知组蛋白H3K27乙酰化(H3K27ac)和H3K4一甲基化(H3K4me1)是基因转录激活的标志，因此对WT和Sub1-KO CD4+T细胞进行组蛋白H3K27ac和H3K4me1的ChIP-seq分析。图19中a结果显示，Sub1缺失使组蛋白H3K27ac和H3K4me1修饰区域明显减少。ChIP-seq联合ATAC-seq峰图注释显示，Dock2上H3K27ac和H3K4me1修饰的位置基本一致，且修饰部位染色质开放程度明显增加，这说明Sub1可增加Dock2附近的组蛋白H3K27ac和H3K4me1修饰水平从而使其位置染色质开放程度增加，进而招募AP-1转录因子结合以驱动Dock2转录表达(图19中b)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.Dock2和/或Sub1作为生物标志物或靶点在制备诊断、监测、严重程度评估、疗效评估、预后评估、预防和/或治疗免疫***疾病的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Dock2和/或Sub1为基因和/或蛋白。
3.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述的诊断、监测、严重程度评估、疗效评估或预后评估免疫***疾病包括检测Dock2和/或Sub1的有无或其mRNA和/或蛋白的表达量。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的预防或治疗免疫***疾病包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量；
优选的，所述的调节包括上调或下调。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的预防或治疗免疫***疾病包括敲除或敲低Sub1；
优选的，所述的敲除或敲低Sub1包括使用CRISPR/Cas***、组织特异性敲除、导入靶向Sub1的干扰RNA或microRNA(例如microRNA-101)。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Dock2和/或Sub1来源于中枢神经***、体液、细胞、组织或器官中的一种或两种以上；
优选的，所述的体液包括血液或脑脊液；
优选的，所述的Dock2和/或Sub1来源于免疫细胞，例如T细胞，优选CD4+T细胞或CD8+T细胞，进一步优选CD4+CD8+T细胞。
7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述的产品包括检测Dock2和/或Sub1的有无或其mRNA和/或蛋白的表达量的试剂，或者，所述的产品包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达量的试剂。
8.根据权利要求1-7任一所述的应用，其特征在于，免疫***疾病包括感染性疾病、超敏反应性疾病、自身免疫疾病、免疫增殖病或免疫缺陷病中的一种或两种以上；
优选的，所述的自身免疫疾病包括免疫介导的炎症性疾病；
进一步优选的，所述的免疫***疾病包括***性红斑狼疮、类风湿关节炎、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎、史提芬强生症候群、干燥综合征、***性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性***病、桥本氏甲状腺炎、原发性黏液性水肿、强制性脊柱炎、成人斯蒂尔病、贝赫切特综合征、***性硬化症、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、结节性多动脉炎或溃疡性结肠炎中的一种或两种以上。
9.一种免疫***疾病动物模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括调节Dock2和/或Sub1的mRNA和/或蛋白的表达；
优选的，所述的调节为上调。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括过表达Dock2或其DHR-2结构域。
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