CN117683667A - 一株东湖假单胞菌及其在防治白菜细菌性软腐病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株东湖假单胞菌及其在防治白菜细菌性软腐病中的应用。本发明涉及微生物领域，具体涉及一株东湖假单胞菌及其在防治白菜细菌性软腐病中的应用。本发明的东湖假单胞菌为东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)ZF510，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.27639。菌株ZF510在代谢过程中可产生蛋白酶、合成IAA能力、溶磷能力以及嗜铁能力，并具有广谱拮抗作用，能够有效抑制病原细菌和真菌的生长，另外ZF510对白菜软腐病的活体盆栽防效可达63.06％。综上所述，菌株ZF510具有良好的生防潜力和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于是生物技术领域，具体涉及一株东湖假单胞菌及其在防治白菜细菌性软腐病中的应用。
背景技术
假单胞菌属(Pseudomonas spp.)细菌是典型的根际促生细菌，适生范围广。以荧光假单胞菌(P.fluorescens)为代表的一些生防菌株可产生多种抑菌活性物质，大量产生抗生素是假单胞生防菌的一个重要特点，因此，不少假单胞菌已被商业化用于植物防病。目前，假单胞菌多用于防治根茎病害以及促生作用，已有学者用假单胞菌成功防治了番茄、辣椒、黄瓜、甜瓜等多种植物的侵染性病害。关于假单胞菌的溶磷能力、耐盐碱能力也有不少学者报道，研究发现东湖假单胞菌能产生铁载体、氰化氢、抗生素抑制病原真菌、细菌及线虫对作物的侵染。然而，关于东湖假单胞菌在生物防治上的研究报道较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何增强植物抗病能力、抑制或防治植物病害。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株东湖假单胞菌。
本发明提供的东湖假单胞菌为东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)CGMCCNo.27639，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.27639。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有前文所述的东湖假单胞菌和/或所述东湖假单胞菌的代谢物。
上述菌剂可为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌可为病原真菌或病原细菌。
本发明中，所述病原真菌可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)和茄匍柄霉(Stemphylium solani)。
本发明中，所述病原细菌可为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.campestris)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis)、西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibacter michiganense subsp.sepedonicum)、巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)和丁香假单胞菌流泪致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)。
本发明中，所述病害为白菜软腐病。
本发明还提供了一种生物有机肥，所述生物有机肥含有前文所述东湖假单胞菌或所述东湖假单胞菌的代谢物的菌剂。
本发明还提供了前文所述的东湖假单胞菌在制备下述中任一的产品中的应用：
1)用于防治植物病害的菌剂，所述病害为白菜软腐病；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochytacitrullina)和茄匍柄霉(Stemphylium solani)；所述病原细菌可为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis)、西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibacter michiganense subsp.sepedonicum)、巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)和丁香假单胞菌流泪致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)。
本发明还提供了培养前文所述东湖假单胞菌的方法，包括将所述东湖假单胞菌在用于培养假单胞菌的培养基中培养的步骤。
本发明还提供了前文所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将前文所述的东湖假单胞菌作为活性成分，得到所述菌剂。
上述菌剂的活性成分可为上述东湖假单胞菌和/或上述东湖假单胞菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
上述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，上述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述代谢物可从所述东湖假单胞菌的发酵液中获得。所述代谢物可为所述东湖假单胞菌的无菌代谢物或所述东湖假单胞菌的含菌代谢物。所述东湖假单胞菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述东湖假单胞菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述东湖假单胞菌即得到所述东湖假单胞菌的无菌代谢物。所述东湖假单胞菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述东湖假单胞菌，收集发酵液，该发酵液即为所述东湖假单胞菌的含菌代谢物。
本发明还提供了前文所述的东湖假单胞菌或所述东湖假单胞菌的菌剂在防治白菜软腐病和/或提高白菜产量中的应用。
本发明还提供了前文所述的东湖假单胞菌或所述的菌剂在栽培白菜中的应用。
本研究采用稀释涂布法，从贵州白菜根际土壤分离筛选到一株对细菌性软腐病巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)具有显著抑制效果的生防菌株ZF510。经过形态学特征观察、生理生化特征、Biolog测定和多基因***发育树分析，鉴定其为东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)。生防机理初步研究发现，菌株ZF510在代谢过程中可产生蛋白酶、合成IAA能力、溶磷能力以及嗜铁能力。菌株ZF510具有广谱拮抗作用，能够有效抑制7种病原细菌的生长，且挥发性物质对立枯丝核菌、西瓜壳二孢和茄匍柄霉具有明显抑制作用。活体盆栽条件下，接种菌株ZF510的白菜发病率和病情指数均显著降低，活体盆栽防效可达63.06％。综上所述，菌株ZF510具有良好的生防潜力和应用前景。
附图说明
图1为菌株ZF510在KB平板形态特征观察。其中A：菌落正面；B：菌落反面。
图2为菌株ZF510扫描电镜照片。其中左图为10000倍镜下多个菌体的结构，右图为30000倍镜下单个菌体的结构。
图3为菌株ZF510基于16S rDNA、gyrB和rpoB基因序列的***进化树。
图4为菌株ZF510生长曲线变化图。
图5为ZF510对病原细菌抑菌效果。其中A1—G1：ZF510处理；A2—G2：空白对照。A：丁香假单胞菌番茄致病变种；B：西瓜嗜酸菌；C：野油菜黄单胞野油菜致病变种；D：密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种；E：丁香假单胞菌流泪致病变种；F：巴西果胶杆菌；G：密执安棒杆菌密执安亚种。
图6为ZF510挥发性物质对立枯丝核菌、西瓜壳二孢和茄匍柄霉抑制效果图。其中A：立枯丝核菌，B：西瓜壳二孢，C：茄匍柄霉；A1-C1：ZF510接菌处理，A2-C2：空白对照。
图7为ZF510蛋白酶、IAA合成、溶磷以及嗜铁能力效果。其中A：ZF510产蛋白酶能力；B：ZF510溶磷能力；C：ZF510嗜铁能力；D：ZF510IAA合成能力；E：IAA标准曲线。
图8为菌株ZF510安全性测定效果。其中A为平板正面；B为平板背面。
图9为菌株ZF510抗生素耐受性水平效果。其中A为菌株ZF510对氨苄青霉素耐受水平；B为菌株ZF510对壮观霉素耐受水平；C为菌株ZF510对利福平耐受水平；D为菌株ZF510对四环素耐受水平；E为菌株ZF510对氯霉素耐受水平；F为菌株ZF510对链霉素耐受水平；G为菌株ZF510对卡那霉素耐受水平；H为菌株ZF510对庆大霉素耐受水平。
图10为菌株ZF510不同稀释倍液对活体盆栽防效测定。其中A：菌株ZF510稀释100倍液；B：菌株ZF510稀释200倍液；C：菌株ZF510稀释300倍液；D：5％中生菌素药剂对照；E：病原菌液对照；F：健康对照。
保藏说明
分类命名：东湖假单胞菌
拉丁名：Pseudomonas donghuensis
菌株编号：ZF510
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2023年6月15日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.27639。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的白菜品种速生秀绿购于中蔬种业科技(北京)有限公司。
下述实施例中野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestrispv.campestris)已记载于:张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜，2011，17：23-25.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已记载于:柴阿丽、帕提古丽、郭威涛、石延霞、谢学文、席先梅、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.园艺学报，2019，46(01)：182-192.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis)已记载于:康华军,柴阿丽,石延霞,谢学文,袁军海,李宝聚.番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法.园艺学报2018，45(11):2254-2264.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)已记载于:田惠、谢学文、李焕玲、魏松红、李宝聚.李宝聚博士诊病手记(七十)砧木南瓜种传细菌性果斑病的发生及防治.中国蔬菜2014，(05)：65-66.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibacter michiganensesubsp.sepedonicum)已记载于:马海艳、张家森、王丽、高中强、余宏军、蒋卫杰.蒋卫杰博士:聚焦生产一线(十四)滕州市早春拱棚马铃薯高效栽培技术.中国蔬菜2015，(08):70-73.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)已记载于:李磊、赵昱榕、郑斐、石延霞、柴阿丽、谢学文、李宝聚.芹菜软腐病拮抗芽孢杆菌筛选及防治效果.中国生物防治学报，2020，36(03)：388-395.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的丁香假单胞菌流泪致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)已记载于:柴阿丽、帕提古丽、郭威涛、石延霞、谢学文、席先梅、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.园艺学报，2019，46(01)：182-192.，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已记载于:高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜，2008，(6)：9-12.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)已记载于:赵彦杰,李宝聚,石延霞等.瓜类蔓枯病的发生与防治[J].中国蔬菜,2008(02):56-57+70.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中茄匍柄霉(Stemphylium solani)已记载于:李新宇、李磊、陈利达、石延霞、柴阿丽、谢学文、李宝聚.番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定.园艺学报，2020，47(04)：741-748.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的培养基信息如下：
King′s B培养基(KB培养基)：蛋白胨20.0g，甘油10.0mL，MgSO4·7H2O 1.5g，K2HPO4 1.5g，蒸馏水补足至1000mL，pH 7.0±0.2。
Nutrient Broth培养基(NB培养基)：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水补足至1000mL，pH 7.0±0.2。
WA培养基：5.0g琼脂，补足至蒸馏水1000mL。
NBRIP无机磷培养基：Ca3(PO4)2 5g，葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.15，KCl2·6H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g；蒸馏水补足至1000mL。
CAS培养基：琼脂15.0g，葡萄糖9.0g，蛋白胨4.5g，牛肉膏2.7g，NaCl 4.5g，铬天青121mg，溴代十六烷基三甲铵145.8mg，FeCl3 0.054g，HCl 0.167mL，蒸馏水补足至1000mL。
5％中生菌素可湿性粉剂购买于福建凯立生物制品有限公司，登记证号：PD20170764。
氨苄青霉素Ampicillin[Amp]100mg/ml(索莱宝，A8180)、卡那霉素Kanamycine[Kan]50mg/ml(索莱宝，K8020)、氯霉素Chloramphenicol[Cm]25mg/ml(索莱宝，C8050)、硫酸链霉素Streptomycin sulfate[Str]50mg/ml(酷来搏，CS10481)、四环素Tetracyyline[Tet]10mg/ml(麦克林，T829835)、硫酸庆大霉素Gentamicin sulfate[Gm]50mg/ml(酷来搏，CG5551)、利福平Rifampicin[Rif]50mg/ml(酷来搏，CR9551)、盐酸壮观霉素Spectinomycin sulfate[Spec]50mg/ml(Sigma，G1914)。
下述实施例采用Excel 2019软件对数据进行统计分析和绘图，采用SPSS20软件对数据进行差异性分析。实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
实施例1、菌株分离、筛选、鉴定与保藏
1、菌株分离、筛选
土壤样品2022年采集自贵州健康白菜植株根际土壤，采用稀释涂布平板法，将土壤样品进行梯度稀释，取100μL稀释浓度为10-4、10-5、10-6的悬浮液涂布于KB固体培养基，28℃培养24h。对单菌落进行划线纯化3～5次，待菌落形态稳定后保存备用，共分离获得341株菌株。
2、拮抗菌株的筛选
采用混菌法对上述341株菌株的病原细菌抑菌谱进行测定，用微量移液枪吸取1×108cfu/mL巴西果胶杆菌菌悬液150μL，加入到装有150mL已灭好菌，温度50℃左右King′s B培养基的250mL三角瓶中，摇匀倒入无菌培养皿中，冷却成平板。
在平板中央贴上灭菌滤纸片，用微量移液器向滤纸片滴入5μL生防菌液，以滴加空白培养基进行空白对照，28℃恒温培养24h，观察并测量抑菌圈大小,每个菌株重复3次，十字交叉法测量抑菌圈直径。
利用混菌法测定获得24株具有较好抑制效果的拮抗细菌，对其编号为ZF490～ZF513。试验结果表明(表1)，有7株拮抗细菌对巴西果胶杆菌具有一定的抑制效果，其中菌株ZF510抑制效果最好，抑菌率达到57.26％(表1)。
表1、24株假单胞菌对病原细菌拮抗效果测定
| 编号 | 初步鉴定结果 | 抑制率(％) | 编号 | 初步鉴定结果 | 抑制率(％) |
| ZF490 | 铜绿假单胞菌 | 52.16±2.10 | ZF502 | 绿针假单胞菌 | 49.62±2.34 |
| ZF491 | 荧光假单胞菌 | 43.29±1.62 | ZF503 | 韩国假单胞菌 | 45.34±1.65 |
| ZF492 | 绿针假单胞菌 | 41.56±2.16 | ZF504 | 韩国假单胞菌 | 34.69±2.15 |
| ZF493 | 韩国假单胞菌 | 35.46±3.65 | ZF505 | 绿针假单胞菌 | 50.64±1.68 |
| ZF494 | 铜绿假单胞菌 | 53.16±2.11 | ZF506 | 荧光假单胞菌 | 52.39±1.25 |
| ZF495 | 绿针假单胞菌 | 46.34±1.65 | ZF507 | 铜绿假单胞菌 | 49.52±2.14 |
| ZF496 | 荧光假单胞菌 | 50.26±3.21 | ZF508 | 绿针假单胞菌 | 47.89±2.91 |
| ZF497 | 绿针假单胞菌 | 47.39±1.39 | ZF509 | 荧光假单胞菌 | 53.29±1.64 |
| ZF498 | 荧光假单胞菌 | 50.96±1.65 | ZF510 | 东湖假单胞菌 | 57.26±1.33 |
| ZF499 | 荧光假单胞菌 | 49.68±2.31 | ZF511 | 韩国假单胞菌 | 39.49±2.51 |
| ZF500 | 绿针假单胞菌 | 48.26±2.61 | ZF512 | 荧光假单胞菌 | 38.46±3.65 |
| ZF501 | 荧光假单胞菌 | 54.23±1.65 | ZF513 | 绿针假单胞菌 | 40.39±1.39 |
3、菌株ZF510的鉴定
1)菌株形态特征观察及生理生化指标测定
使用灭菌牙签挑取菌株ZF510单菌落接种于KB固体培养基上，28℃培养24h。菌株形态特征观察和生理生化指标测定参考《常见细菌***鉴定书册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》。
结果如下：菌株ZF510在KB培养基平板中正面呈现淡黄色，背面为黄色(图1中A和B)，有特殊气味；扫描电镜下观察，菌株ZF510呈短杆状，长度约为1.05μm(图2)。
2)Biolog测定
挑取ZF510单菌落接种至KB培养基试管斜面上，28℃恒温培养24h，使用BIOLOGGENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对其进行唯一碳源利用的测定。
Biolog测定结果如下：菌株ZF510可利用α-D-葡萄糖、D-果糖、D-丝氨酸等碳源，不可利用D-蜜二糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖等碳源(表2)。
表2、利用BIOLOG GENⅢ试剂条测定菌株ZF510的唯一碳源利用
注：+，阳性；-，阴性；w，弱阳性。
3)菌株ZF510多基因***发育树构建
利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒，小量提取菌株ZF510基因组DNA为模板，选择16S rDNA、gyrB和rpoB等保守基因进行PCR扩增并测序，所得PCR产物由北京博迈德生物公司进行测序，测序结果见表3。
菌株ZF510具有核苷酸序列是序列表中序列1的16S rDNA基因、具有核苷酸序列是序列表中序列2的gyrB基因和具有核苷酸序列是序列表中序列3的rpoB。使用MEGA 6.0、Sequence Matrix、Seaview4等软件对测序结果进行分析，构建最大似然法***进化树，分析其分类地位。
表3、构建多基因***发育树引物信息
经PCR扩增后，得到菌株ZF510的16S rDNA、gyrB和rpoB基因序列，构建ZF510多基因***进化树，与东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)HYS位于同一分支上，综合上述分类学特征，确定菌株ZF510的分类地位为东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)(图3)。
4)菌株ZF510生长曲线测定
挑取纯化后的菌株ZF510单菌落，转入50mL KB(+kan)液体培养基中摇培备用。将待测菌种子液稀释至菌悬液浓度为1×108cfu/mL后，按照1％的接种量转接到盛有100mL待测培养基的无菌250mL三角瓶中，置于28℃摇床中，180rpm摇培48h，每4h测定一次OD600值和菌落数，同时补充发酵瓶中损耗的KB培养基，设计3个重复。转接后4h开始取样，每次取100μL菌液，涂板计数时在紫外灯下选择能发出荧光的菌落,整合数据得到ZF510菌株生长曲线。
OD600值：采用比浊法测定。以相应空白培养基为对照，测定发酵液在600nm处的吸光度。每个处理3次重复。
菌落数：采用梯度稀释法测定。用相应空白培养基将发酵液梯度稀释至10-6、10-7、10-8浓度，吸取100μL菌悬液均匀涂布于KB平板上，28℃培养1天后进行菌落计数。每个处理3次重复。
结果表明：菌株ZF510在接种后的0-4h为生长的延滞期；4-24h进入对数期，菌体数落呈对数增长；28h后菌株活性降低。因此，指数中期为菌株生长最旺盛的时期，确定种子液的最佳培养时间为12h(图4)。
4、菌株ZF510的保藏
东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)ZF510，已于2023年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.27639。以下简称东湖假单胞菌CGMCC No.27639或者菌株ZF510。
实施例2、菌株ZF510的抑菌能力研究
1、菌株ZF510细菌抑菌谱测定
采用双层培养法测定菌株ZF510对7种病原细菌抑制效果。将5μL浓度为1×108cfu/mL的菌株ZF510的菌悬液接种在KB平板中心，28℃培养48h后用3mL氯仿熏蒸灭活，使用5mL含有病原细菌的WA培养基作为上层。28℃培养48h后测量抑菌圈直径，计算抑菌率，每个处理3次重复。抑制率(％)＝抑菌圈直径/对照菌落直径×100。
结果表明：菌株ZF510可以有效抑制野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、丁香假单胞番茄致病变种、密执安棒杆菌密执安亚种、巴西果胶杆菌、西瓜噬酸菌、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种、丁香假单胞菌黄瓜角斑病致病变种，7种细菌抑制率均大于50％(表4、图5中A1-G1和A2-G2)。
表4、菌株ZF510对病原菌的抑菌效果
2、菌剂ZF510的挥发性物质抑菌活性测定
取菌株ZF510单菌落接种在液体KB培养基中，28℃摇培24h，调整其浓度为1×108cfu/mL，获得ZF510菌剂，备用。
在二分皿中分别加入KB培养基和PDA培养基，用灭菌牙签蘸取ZF510菌剂在含KB培养基一侧划线，含PDA培养基一侧加入6mm病原真菌菌饼，置于28℃培养箱中倒置培养，以未加ZF510菌剂的无菌水作为空白对照。当空白对照组的病原真菌生长至平板边缘处进行调查，测定病原真菌生长直径并计算抑制率，每个处理重复3次。抑制率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100。
菌剂ZF510的挥发性物质对病原真菌抑制效果结果表明，菌剂ZF510的挥发性物质对立枯丝核菌、西瓜壳二孢和匍柄霉效果较好，抑制率分别为75.73％、61.96％和62.30％(表5、图6中A1、A2、B1、B2、C1和C2)。
表5、菌剂ZF510的挥发性物质抑制效果
实施例3、菌株ZF510生防机制研究
菌剂ZF510的制备：取东湖假单胞菌CGMCC No.27639单菌落接种在液体KB培养基中，28℃180r/min振荡24h，调整其菌悬液浓度为1×108cfu/mL(以液体KB培养基为空白对照)，得到ZF510菌剂。
1、蛋白酶活性测定
在脱脂牛奶培养基中心位置接种5μL浓度为1×108cfu/mL的菌剂ZF510，28℃培养24h后观察消解圈。每个处理3次重复。
2、溶磷能力测定
采用透明圈法，在NBRIP无机磷培养基中心位置接种5μL浓度为1×108cfu/mL的菌剂ZF510，每组3次重复，28℃培养7d，测量解磷透明圈的直径与菌落直径，计算透明圈直径与菌落直径比值HD/CD。
3、嗜铁能力测定
在CAS培养基中心位置接种5μL浓度为1×108cfu/mL的菌剂ZF510，每组3次重复28℃下倒置培养7d。如菌株在CAS平板产生明显的橙黄色透明圈，则说明该菌株具有分泌嗜铁素的能力，而透明圈的大小及其颜色，则表示菌株产嗜铁素能力，透明圈越大，产生的颜色越深说明菌株产嗜铁素的能力越强。测量解磷透明圈的直径与菌落直径，计算透明圈直径与菌落直径比值HD/CD。
结果表明：菌株ZF510在脱脂牛奶培养基中有透明圈产生，透明圈直径为2.35±0.05cm(图7中A)；在NBRIP无机磷培养基中有透明圈产生(图7中B)透明圈直径为1.15±0.08cm；在CAS培养基中有淡黄色晕圈产生(图7中C)，晕圈直径为0.66±0.04cm；；在DF+培养基中能产生微量IAA(图7中D)；根据IAA标准曲线y＝0.0396x-0.0381(R2＝0.9972)(图7中E)，计算得到菌株ZF510合成IAA浓度为11.94μg/mL。证明菌剂ZF510的代谢产物中含有蛋白酶以及具有合成IAA、溶磷、嗜铁能力。
4、安全性测定
将5μL菌剂ZF510接种于血平皿中央，晾干后于28℃培养1天，每处理3次重复。观察是否有透明圈生成，若无透明圈，则表示菌剂ZF510对生物体具有较好的安全性。
结果表明：菌剂ZF510在溶血培养基中无透明圈产生，说明菌剂ZF510具有一定安全性(图8中A和B)。
5、菌株ZF510的抗生素耐受性水平
选用8种抗生素：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、链霉素、四环素、庆大霉素、利福平、壮观霉素(表6)，制备50-600μg/mL 8种抗生素梯度溶液，接种菌剂ZF510观察生长情况，3次重复。
表6、抗生素种类及浓度
结果如表7和图9所示：菌株ZF510对氨苄霉素(Amp)(图9中A)耐受性超过600μg/mL，壮观霉素(Spec)(图9中B)、利福平(Rif)(图9中C)、四环素(Tet)(图9中D)耐受水平分别为350μg/mL、150μg/mL、100μg/mL，对氯霉素(Cm)(图9中E)、链霉素(Str)(图9中F)的耐受水平为50μg/mL，对卡那霉素(Kan)(图9中G)、庆大霉素(Gm)(图9中H)较敏感。
表7、菌株ZF510抗生素耐受性水平分析
注：“+”代表耐受，“-”代表不耐受。
实施例4、不同稀释倍数的菌剂ZF510在防病中的活体盆栽防治效果测定
1、菌剂ZF510的制备：将保存在-80℃冻存管中的东湖假单胞菌CGMCC No.27639用接种环以划线的方法接入KB平板上，28℃培养箱活化48h，将活化后的菌株挑取单菌落接种在液体KB培养基中，28℃，180r/min继续振荡24h，收集菌悬液，用无菌水调整其菌浓度为1×108cfu/mL(以无菌水为空白对照)，得到菌剂ZF510的菌悬液。用无菌水将该菌剂ZF510菌悬液稀释100倍，得到菌剂ZF510菌悬液稀释100倍液；用无菌水将该菌剂ZF510菌悬液稀释200倍，得到菌剂ZF510菌悬液稀释200倍液；用无菌水将该菌剂ZF510菌悬液稀释300倍，得到菌剂ZF510菌悬液稀释300倍液。
2、白菜软腐病病菌巴西果胶杆菌的制备：将保存在-80℃冻存管中的巴西果胶杆菌用接种环以划线的方法接入KB平板上，28℃培养箱活化48h，将活化后的病原菌菌株挑取单菌落接种在液体KB培养基中，28℃，180r/min继续振荡24h，收集菌悬液，用无菌水调整其菌浓度为1×108cfu/mL(以无菌水为空白对照)，获得1×108cfu/mL白菜软腐病巴西果胶杆菌菌悬液备用。
3、菌剂ZF510对白菜软腐病的活体盆栽防治效果测定
采用喷雾接种法，当白菜品种速生秀绿(中蔬种业科技(北京)有限公司)长到适当株高(两叶两心)后，将浓度为1×108cfu/mL的白菜软腐病病菌巴西果胶杆菌悬液喷施于两片真叶白菜叶部，每株喷施10mL，保湿培养。接种1天后，采用喷雾接种的方式按照表8接种不同稀释倍数的菌剂ZF510菌悬液10mL/株。每个处理重复三次，每个重复18株苗，将苗放于温室。待病原菌对照处理病情指数超过50时，计算病情指数和防治效果。以5％中生菌素可湿性粉剂为阳性对照，以仅病原菌液处理为阴性对照，以不添加菌剂和病原菌的白菜为健康对照。
按照《农药田间药效试验准则》中的病害分级标准，病情按病斑面积占叶片比例分级：0级为0；1级为1％～5％；2级为6％～10％；3级为11％～25％；4级为26％～50％；5级为50％以上。病情指数＝∑(各级病叶数×病级数)/(调查总叶数×最高病级数)×100，防治效果(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照病情指数×100。
表8、菌剂ZF510在不同接种浓度下对白菜软腐病盆栽防效测定
结果如表9和图10所示：病原菌液对照处理接种巴西果胶杆菌3d后，叶片上出现明显的病斑；菌剂ZF510菌悬液稀释200倍液喷施后，对白菜细菌性软腐病的防效为63.06％，高于5％中生菌素药剂对照处理的防效62.87％(P＜0.05)(表9、图10中A-F)。
表9、菌剂ZF510对活体盆栽防效测定
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (8)
1.东湖假单胞菌，其特征在于：所述东湖假单胞菌为东湖假单胞菌(Pseudomonasdonghuensis)CGMCC No.27639，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.27639。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的东湖假单胞菌和/或所述东湖假单胞菌的代谢物；
所述菌剂为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochytacitrullina)和茄匍柄霉(Stemphylium solani)；
所述病原细菌为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis)、西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibacter michiganense subsp.sepedonicum)、巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)和丁香假单胞菌流泪致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)；
所述病害为白菜软腐病。
3.生物有机肥，其特征在于：所述生物有机肥含有权利要求1所述东湖假单胞菌或权利要求2所述的菌剂。
4.权利要求1所述的东湖假单胞菌在制备下述任一的产品中的应用：
1)用于防治植物病害的菌剂，所述病害为白菜软腐病；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochytacitrullina)和茄匍柄霉(Stemphylium solani)；
所述病原细菌为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis)、西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibacter michiganense subsp.sepedonicum)、巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)和丁香假单胞菌流泪致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)。
5.培养权利要求1所述东湖假单胞菌的方法，包括将所述东湖假单胞菌在用于培养假单胞菌的培养基中培养的步骤。
6.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的东湖假单胞菌作为活性成分，得到所述菌剂。
7.权利要求1所述的东湖假单胞菌在防治白菜软腐病和/或提高白菜产量中的应用。
8.权利要求1所述东湖假单胞菌或权利要求2所述的菌剂在栽培白菜中的应用。
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| CN202311648021.XA CN117683667A (zh) | 2023-12-04 | 2023-12-04 | 一株东湖假单胞菌及其在防治白菜细菌性软腐病中的应用 |
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| CN117965405A (zh) * | 2024-04-02 | 2024-05-03 | 西北农林科技大学深圳研究院 | 一株东湖假单胞菌及其在植物病害防治中的应用 |
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