CN117683119A - 一种抗iii型鲤疱疹病毒的多克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体，该多克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体能够识别III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白，且效价高、特异性好，解决了现有技术中针对III型鲤疱疹病毒缺少特异性抗体的问题，具有广泛的开发应用前景。

Description

一种抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体及其应用。

背景技术

锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus，KHV)为疱疹病毒科(Herpesviridae)，鲤疱疹病毒属(Cyprinidherpesvirus)，又称鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)，与鲤痘疮病毒(鲤疱疹病毒1型，CyHV-1)和金鱼造血器官坏死病毒(鲤疱疹病毒2型，CyHV-2)同属。锦鲤疱疹病毒(KHV)主要感染鲤鱼，如锦鲤以及其他变异鲤科鱼类，其致死率高达80～100％。首次发现于1998年，由德国和以色列学者从患病的鲤鱼和锦鲤中分离鉴定。许多国家的也先后发生过疱疹病毒感染的事例。由于其高致病性和致死率，在2006年，世界动物卫生组织(OIE)将其列为二类动物疫病。

KHV的295kbp基因组大小编码至少156个ORF，是已知的疱疹病毒目所有疱疹病毒中最大的一个。其直径达100～110nm，表面结构为二十面体球状，在细胞核中有不对称的电子致密区域，该区域的表面结构为螺纹状，成熟后呈球形，直径在170～230nm，细胞核结构匀称，核外部有囊状结构包围。KHV结构复杂，经过学者多年的研究，也仅仅只完成了一小部分，可见报道主要有确定了KHV的主要基因型并且其具有确定功能的ORF已经被成功克隆，但是大部分的编码蛋白的功能目前没有明确的研究结果。目前为止发现其含有46种蛋白，其中包含3种衣壳蛋白，15种囊膜蛋白，2种皮层蛋白和26种未知蛋白。

发明内容

本发明提供一种抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体，该多克隆抗体能够识别III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白，且效价高、特异性好，具有广泛的开发应用前景。

根据本发明的第一个方面，提供一种抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体，该多克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体能够识别III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白，且效价高、特异性好，解决了现有技术中针对III型鲤疱疹病毒缺少特异性抗体的问题，经结构解析，III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白属于衣壳蛋白，具有广泛的开发应用前景。

优选地，上述多克隆抗体由保藏号为GDMCC60225的大肠杆菌菌株BL21制备。

根据本发明的另一个方面，提供一种III型鲤疱疹病毒ORF92基因，III型鲤疱疹病毒ORF92基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的另一个方面，提供一种重组质粒载体，重组质粒载体含有上述III型鲤疱疹病毒ORF92基因。

根据本发明的另一个方面，提供上述抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体在制备检测III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白的试剂盒或芯片中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供一种检测III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白的试剂盒或芯片，包括上述抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体。

附图说明

图1为实施例1III型鲤鱼疱疹病毒ORF92基因的琼脂糖凝胶电泳图；M为标记物(marker)；1为目的基因。

图2为实施例1重组质粒载体的琼脂糖凝胶电泳图；M为marker；1为重组质粒载体pET-B2M-KHV-ORF92。

图3为实施例1重组蛋白的小量表达与鉴定中重组蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果图；M为marker；1～5为不同条件下得到的重组蛋白pET-B2M-KHV-ORF92。

图4为实施例1重组蛋白的大量表达与破菌鉴定中重组蛋白的SDS-PAGE结果图；M为marker；1、3为为重组蛋白上清，2、4为重组蛋白沉淀。

图5为实施例1纯化的包涵体的SDS-PAGE结果图；M为marker；1为纯化的包涵体。

图6为实施例1亲和纯化的重组蛋白的SDS-PAGE结果图；M为marker；1为亲和纯化的重组蛋白。

图7为实施例2利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测多克隆抗体的效价。

图8为实施例3利用免疫印迹(Western Blot)检测多克隆抗体的特异性；M为免疫前抗体；1为免疫前抗体；2为血清抗体(多克隆抗体)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体的制备

步骤一、提取III型鲤疱疹病毒的cDNA

用III型鲤疱疹病毒(KHV)感染鲤鱼脑细胞(CCB)，使用FOREGENE Cell RNAIsolation Kit试剂盒抽提感染后的鲤鱼脑细胞的总RNA，并用微量分光光度计检测RNA纯度和浓度；然后采用TAKARA反转录试剂盒对总RNA进行反转录，得到III型鲤鱼疱疹病毒ORF92基因的cDNA，该cDNA序列如SE Q ID NO.5所示。

步骤二、构建重组质粒载体

以III型鲤疱疹病毒(KHV)感染鲤鱼脑细胞(CCB)的cDNA为模板，利用序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的特异性引物进行PCR扩增得到目的基因，其中，PCR扩增体系50μl为：PrimeSTAR Max Premix(2x)25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA 2μl，ddH2O 21μl；PCR扩增条件为：98℃5min；98℃10s，57℃5s，72℃1min，30cycles；72℃10min。对目的基因进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)并使用Omega胶回收经试剂盒进行切胶纯化，该目的基因(III型鲤疱疹病毒ORF92基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在37℃的条件下用BamHI和SaI I对目的基因和空的pET-B2M质粒进行双酶切、纯化；然后用T4连接酶按3:1的体积比将酶切目的基因与酶切pET-B2M质粒连接，于16℃反应12小时过夜，得到连接产物；取全部连接产物转化至Ecoli.DH5α感受态细胞，涂布至含有100mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，在37℃下倒置培养过夜，得到重组质粒载体。挑选阳性克隆进行测序，将测序正确的阳性克隆进行扩大培养。通过Omega质粒抽提试剂盒抽提重组质粒载体，得到重组质粒载体pET-B2M-KHV-ORF92，对上述重组质粒载体进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)。

步骤三、将重组质粒载体转化至感受态细胞中，得到重组工程菌：

将测序正确的重组质粒载体pET-B2M-KHV-ORF92转化至Ecoli.BL21感受态细胞中，并将细胞涂布于含有100mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，在37℃的条件下倒置培养过夜，筛选到的阳性克隆即为含有重组质粒载体的重组工程菌；将该重组工程菌在含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养后，用甘油保存菌种。

步骤四、诱导重组工程菌的表达，得到重组蛋白pET-B2M-KHV-ORF92

重组蛋白的少量表达与鉴定：将保存的重组工程菌按1:100接种到5ml LA液体培养基中，在37℃下培养过夜，进行活化；取活化后的重组工程菌按1:100的比例接种至新鲜的3mL LB液体培养基(含100mg/l氨苄青霉素)中，在37℃下培养约4小时，至OD₆₀₀值为0.6左右；取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG至体系中IPTG的浓度为0.5mM，在37℃下培养4h诱导重组工程菌的蛋白表达，分别取两组菌液0.15mL，12000×g离心2min，菌体沉淀以40μL1×loading buffer重悬裂解，处理后的菌体蛋白样品进行SDS-PAGE检测，检测结果如图3所示。由图3可知，重组质粒载体pET-B2M-KHV-ORF92在大肠杆菌BL21中得到了表达，表达了分子量约为52kDa的蛋白条带，与预期大小一致。

重组蛋白的大量表达及破菌检测：取保存于-20℃的菌种100μL接种于100mL LB液体培养基(含抗生素)中震荡培养过夜；取100mL菌液接种于2000mL LB液体培养基中，37℃扩大培养至OD600约0.6，降低培养温度到30℃；加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM，30℃继续震荡培养4h；8000rpm离心3min收集菌体，重悬于50mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30min；超声破碎菌体，参数设置为功率200W、工作3s、暂停4s、时间30min；16000rpm 4℃离心50min，收集上清以及沉淀；分别取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，剩余上清及沉淀至于4℃备用。SDS-PAGE检测结果如图4所示。由图4可知，重组质粒载体pET-B2M-KHV-ORF92在大肠杆菌BL21中得到了表达，表达了分子量约为52kDa的蛋白条带，与预期大小一致，主要以包涵体的形式存在。

包涵体的纯化：沉淀以50mL STET缓冲液重悬，加入DTT至终浓度1mM；超声促进杂蛋白溶解，参数设置为功率200W、工作3s、暂停3s、时间10min；10000rpm 4℃离心10min，去上清；重复以上三步至上清透明；沉淀以1XPBS重悬，超声，参数设置为功率200W、工作3s、暂停3s、时间5min；16000rpm 4℃离心10min，去上清；以4mL 6M盐酸胍重悬包涵体，加DTT至终浓度5mM；220rpm 37℃震荡3h至包涵体全部溶解；10000rp m 4℃离心10min，取10ul上清蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图5所示。由图5可知，扩增出了单一明亮的条带，说明经纯化后得到了高纯度的包涵体。

亲和纯化：将包涵体溶液用0.22μm过滤器过滤备用；准备Ni-NTA柱，以1mL/min的流速上样包涵体溶液；以6M盐酸胍缓冲液(pH8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)；分别以含20mM、60mM、200mM和500mM咪唑的洗脱液洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20％乙醇洗层析柱，4℃封存，收集流出液。4℃超滤浓缩产物，取10ul进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图6所示。由图6可知，扩增出了单一明亮的条带，说明经纯化后得到了高纯度的重组蛋白。

步骤五、多克隆抗体的制备

对重组蛋白pET-B2M-KHV-ORF92进行蛋白浓度测定，取2只新西兰兔(标号为G1512、G1513)进行皮下免疫，每2周免疫一次，第一次使用完全弗氏佐剂包裹的重组蛋白pET-B2M-KHV-ORF92，免疫量为500μg，后续用不完全弗氏佐剂包裹的重组蛋白pET-B2M-KHV-ORF92进行免疫，免疫量为300μg，共计免疫4次。提取兔血制备血清抗体，该血清抗体即为抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体。该多克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体的效价检测

1.检测方法

取2μg/ml重组蛋白液pET-KHV-ORF92作为包被抗原，100μL/孔加入96孔酶标反应板中，4℃过夜包被；次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次。随后200μL/孔加入封闭液，37℃温育2h，用洗涤液洗3次。加入实施例1获得的抗ORF 92血清抗体(取血，4℃4000rmp离心10min取上清)，用稀释液将抗ORF92血清抗体(多克隆抗体)按1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000......进行倍比稀释(免疫前兔血清同比稀释做阴性对照)，每孔100ul，37℃孵育1h，用洗涤液洗3次。加入HRP标记IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育40min(羊抗小鼠-HRP 1：5000-1：10000，羊抗兔-HRP 1：5000-1：10000)，用洗涤液洗5次后拍干。加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，37℃遮光放置5～20min。加50μL/孔终止液，颜色变黄终止反应。用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，通过读数确定稀释后的抗体血清在450nm吸光度大于免疫前血清2.1倍时的最高稀释倍数，即，效价＝OD_血清抗体/OD_{免疫前血清}≥2.1的最高稀释度。

2.检测结果

表1.G1512、G1513新西兰兔的ELISA检测结果

检测结果如表1和图7所示。由表1和图7可知，在G1512兔子中，多克隆抗体(血清抗体)的效价约为512k；在G1513兔子中，多克隆抗体(血清抗体)的效价约为128k。由此说明，实施例1成功制备了抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体，且该多克隆抗体效价高，在浓度被大量稀释的情况下仍能与III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白快速结合。

实施例3抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体的特异性检测

1.检测方法

Western Blot检测。

2.检测结果

检测结果如图8所示。由图8可知，在52kDa处有一条明显的特异条带。由此说明，本发明所提供的抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体能够特异性结合III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体由保藏号为GDMCC60225的大肠杆菌菌株BL21制备。

3.一种III型鲤疱疹病毒ORF92基因，其特征在于，所述III型鲤疱疹病毒ORF92基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体含有如权利要求2所述III型鲤疱疹病毒ORF92基因。

5.如权利要求1所述抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体在制备检测III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白的试剂盒或芯片中的应用。

6.一种检测III型鲤疱疹病毒ORF92蛋白的试剂盒或芯片，其特征在于，包括如权利要求1所述抗III型鲤疱疹病毒的多克隆抗体。