CN117679493B - 一种通过免疫调控来治疗或预防肌腱病的药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过免疫调控来治疗或预防肌腱病的药物及其应用，所述药物的活性成分含有中脑星形胶质细胞源性神经营养因子或者能够表达中脑星形胶质细胞源性神经营养因子的病毒。与现有肌腱病治疗药物相比，本发明的药物除了缓解症状，还可实现针对病因的有效治疗，并有效避免造成全身性毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过免疫调控来治疗或预防肌腱病的药物及其应用。
背景技术
肌腱病（tendinopathy）通常是指由于肌肉被过度使用、反复强烈牵拉而引起的肌腱组织退行性病变，是一种以疼痛、功能下降和运动耐受性降低为主要临床特征的疾病，好发部位包括肩袖肌腱、肘关节内侧和外侧上髁、髌骨肌腱、臀肌肌腱和跟腱等。近年来随着运动人口不断增长，肌腱病的发病率持续上升，严重影响患者运动能力与生活质量。目前肌腱病治疗方式主要是对症治疗，缺乏针对病因的有效治疗方式，无法延缓肌腱组织退变进程。
免疫反应在肌腱病的发生发展过程中发挥重要作用，而巨噬细胞在其中扮演了关键角色。巨噬细胞能够浸润至受损的肌腱，调节局部炎症及愈合过程，因而发挥重要作用。巨噬细胞分为M1和M2表型，其中M1型巨噬细胞释放各种促炎性细胞因子，而M2型巨噬细胞能够参与后期的愈合过程，具有清除损伤细胞与组织碎片以及促进肌腱再生的能力。基于巨噬细胞的独特性质，调节巨噬细胞的异质性可能是改善肌腱病变的一种有效途径。
中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derivedneurotrophic factor, MANF）是一种进化保守的神经营养因子，存在于脊椎动物和无脊椎动物物种中，在细胞内定位于内质网（endoplasmic reticulum, ER）和高尔基体，人类和鼠的脑、肝、心脏、脾、肺以及骨骼肌等组织中均有不同程度的表达，其中，脑组织中主要见于大脑皮质、海马、小脑浦肯野细胞以及丘脑和下丘脑。MANF是一种分泌蛋白，由于其具有独特的三维结构，除了与传统的神经营养因子（Neurotrophic Factors，NTF）一样可激活细胞内信号通路，调控神经元结构、功能和生存，在神经元的生长、存活和成熟中发挥关键作用外，还参与内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）以及调控炎症反应等病理生理过程，具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡等活性，因而在非神经元疾病的动物模型中也能发挥细胞保护作用，包括视网膜损伤、糖尿病、肝损伤、心肌梗死、肾病综合征等。最新研究还显示，MANF可通过促进巨噬细胞由M1型向M2型转换，从而在免疫调控中发挥重要作用，但在肌腱病进程中，MANF是否可通过免疫调控来改善肌腱损伤退变尚未有相关研究。
腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）在基因治疗领域发展势头日益强劲，越来越多临床试验将其用于特定疾病的治疗。AAV由于其较低的免疫原性和位点特异性整合能力，被认为具有较好的安全性。截至目前，FDA批准的基于AAV的基因疗法包括Sparktherapeutics的Luxturna，Avexis的Zolgensma以及欧盟批准的PTC的Upstaza和BioMarin的ROCTAVIAN，分别用于治疗遗传性视网膜疾病、脊髓性肌肉萎缩、AADC缺乏症和血友病。但在肌腱病治疗中暂时无AAV相关应用。
随着体育强国建设的持续推进,运动人口不断增长，导致肌腱病的发病率也在逐年攀升，且在运动员群体中尤为高发。目前针对肌腱病的治疗方式多为局部治疗，主要侧重于减轻疼痛和改善功能，无法实现损伤退变肌腱组织的有效修复，因此存在治疗效果不佳、副作用较大等局限性。常用药物如非甾体类抗炎药长期使用可引发严重的胃肠道不良反应和心血管疾病；新型生物制剂如富血小板血浆（Platelet-rich plasma,PRP）目前仍缺乏高水平的研究证据来证明其治疗的有效性；干细胞疗法，由于其供体特异性（如年龄、性别）显著影响干细胞的增殖、分化能力，以及细胞培养技术也受到安全性、质控等不稳定因素影响，广泛应用亦被极大限制；手术缝合是唯一有效的肌腱断裂治疗方法，但手术对患者造成巨大的创伤，且复发率高，给患者带来了严重的身体和心理痛苦。因此，迫切需要研发用于肌腱病的新型治疗药物。
发明内容
基于上述原因，本发明旨在提供一种通过免疫调控来治疗肌腱病的药物及其应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：
本发明一方面涉及一种通过免疫调控来治疗或预防肌腱病的药物，所述药物的活性成分含有中脑星形胶质细胞源性神经营养因子或者能够表达中脑星形胶质细胞源性神经营养因子的病毒。
在本发明的一个优选实施方式中，所述能够表达中脑星形胶质细胞源性神经营养因子的病毒为腺病毒。本发明将利用AAV安全性高、特异性强的优势，将其作为递送载体来实现在损伤退变肌腱组织局部高效表达神经营养因子MANF，促进损伤部位浸润的巨噬细胞由M1促炎表型向M2修复表型转化，从而显著减轻炎症反应、促进肌腱组织修复再生。
在本发明的一个优选实施方式中，所述腺病毒中具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物为注射液。
本发明还涉及上述药物在制备预防或治疗肌腱病的药剂中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药剂用于缓解疼痛、提高平衡能力、减轻炎性反应、恢复腱组织纤维排列和/或抑制胶原纤维排列紊乱。
有益效果
本发明利用可过表达中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalicastrocyte-derived neurotrophic factor, MANF）的腺相关病毒（Adeno-associatedvirus, AAV）对肌腱病大鼠模型进行局部注射治疗，并通过行为学表现、肌腱组织大体观、以及组织病理学等多方面检测证实了AAV-MANF对肌腱病具有良好的治疗效果，为肌腱病的临床治疗新策略研发提供理论依据。与现有肌腱病治疗药物相比，本发明的药物除了缓解症状，还可实现针对病因的有效治疗，并有效避免造成全身性毒副作用。
附图说明
图1：载体GV411的结构图谱示意图；
图2：组1-4大鼠的Von frey测试结果；
图3：组1-4大鼠的热板实验结果；
图4：组1-4大鼠的平衡转棒测试结果；
图5 ：组1-4大鼠跟腱部位的大体观；
图6：组1-4大鼠跟腱组织扫描电镜检测结果；
图7：组1-4大鼠跟腱组织H&E染色结果；
图8：组1-4大鼠跟腱组织Masson染色结果；
图9：Western blot试验结果可以进一步证实AAV-MANF病毒可成功转染细胞并表达MANF蛋白。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例
1 过表达腺相关病毒载体AAV-MANF的构建
1.1 将编码MANF的基因克隆至病毒载体GV411
①基因信息
基因名称：MANF(NM_006010)
物种：Human
②载体信息
载体名称：GV411，其结构图谱如图1所示。
元件顺序：CMV-betaGlobin-MCS-3Flag-SV40 PolyA
克隆位点：BamHI / NheI
③目的基因片段的获取
表1：PCR扩增引物序列（含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因）：
PCR产物大小：593bp
④重组质粒构建
产物交换入线性化表达载体
表2：PCR鉴定引物序列：
PCR鉴定：阳性转化子PCR产物大小为730bp。
阳性克隆测序结果对比，测序结果里加粗部分与目的基因MANF序列一致，说明转化成功：
aactggaggtggaggtagtggaatggatcccgccaccatgaggaggatgtgggccacgcaggggctggcggtggcgctggctctgagcgtgctgccgggcagccgggcgctgcggccgggcgactgcgaagtttgtatttcttatctgggaagattttaccaggacctcaaagacagagatgtcacattctcaccagccactattgaaaacgaacttataaagttctgccgggaagcaagaggcaaagagaatcggttgtgctactatatcggggccacagatgatgcagccaccaaaatcatcaatgaggtatcaaagcctctggcccaccacatccctgtggagaagatctgtgagaagcttaagaagaaggacagccagatatgtgagcttaagtatgacaagcagatcgacctgagcacagtggacctgaagaagctccgagttaaagagctgaagaagattctggatgactggggggagacatgcaaaggctgtgcagaaaagtctgactacatccggaagataaatgaactgatgcctaaatatgcccccaaggcagccagtgcacggaccgatttggctagcgactacaaggatgacgatgacaaggattacaaagacgacgatgataaggactataaggatgatgacgacaaaaagctttaaa
1.2 将上述重组表达质粒同pHelper（携带腺病毒来源的基因）和pAAV-RC（携带AAV复制和衣壳基因）共转染进AAV-293细胞（提供AAV复制和包装所需的反式作用因子）。转染2到3天后重组AAV-MANF在包装细胞中组装完成。
1.3 从被感染AAV-293细胞中收集AAV-MANF病毒颗粒，一般AAV颗粒会富集在包装细胞中，所以收集细胞而后裂解释放AAV颗粒到上清中可以回收大部分的AAV颗粒。这一步得到的病毒上清液随后用于感染各种哺乳动物类细胞系的感染实验。同时上清中的病毒也可以浓缩保留。
1.4 浓缩并纯化上一步的病毒上清液，原上清液里面包含了许多细胞蛋白分子和碎片，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤可以去除绝大部分的细胞蛋白和残留的CsCl离子。
1.5 用定量PCR法测定所得到病毒的滴度，这种方法可以得到被包装到颗粒中的AAV基因组的物理滴度值。本实验中，用质粒作为标准品设立标准曲线，待测AAV样品与标准曲线比较后，得到待测样品的滴度。
表3
表4：标准曲线拷贝数
表5
标准曲线:Y=-3451LOG(X)+41.47，其中，R2=1.000，Eff=94.9%
滴度计算
将目的样品的Ct值代入公式，得到待测样品滴度，并乘以稀释倍数得到原始样品滴度，将四个组的滴度数值加以平均，得到滴度均值，即为样品最终滴度（7.62E+13 v.g./mL）。
表6
图9所示的Western blot试验结果可以进一步证实AAV-MANF病毒可成功转染细胞并表达MANF蛋白。
表7：图9样品说明：
结果说明：实验组在26KD附近检测到特异性蛋白条带，证实MANF在细胞中成功过表达。
2 肌腱病大鼠模型建立与AAV-MANF注射操作
动物选择：250g雄性SD大鼠，随机分为4组，每组8只。
①AAV注射
组1（空白对照）：后肢跟腱注射30 µL生理盐水
组2（肌腱病造模）：后肢跟腱注射30 µL生理盐水
组3（对照AAV治疗）：后肢跟腱注射1E+11 vg AAV对照病毒（溶于30 µL生理盐水）
组4（AAV-MANF治疗）：后肢跟腱注射1E+11 vg AAV-MANF（溶于30 µL生理盐水）
7天后进行I型胶原酶注射。
②I型胶原酶注射
组1（空白对照）：后肢跟腱注射30 µL PBS
组2（肌腱病造模）：后肢跟腱注射0.3 mg I型胶原酶（溶于30 µL PBS）
组3（对照AAV治疗）：后肢跟腱注射0.3 mg I型胶原酶（溶于30 µL PBS）
组4（AAV-MANF治疗）：后肢跟腱注射0.3 mg I型胶原酶（溶于30 µL PBS）
28天后进行行为学测试并取材，完成后续病理学检测。
3 行为学测试
对各组大鼠进行纤毛机械刺激针（von Frey）测试、热板实验、以及平衡转棒实验，检测其后肢疼痛程度与肢体平衡情况。Von frey与热板实验结果显示，较之正常对照组大鼠（NC），肌腱病模型组大鼠（Model）肢体疼痛敏感性明显增加，而AAV-MANF治疗显著改善了这一症状（图2、图3）。平衡转棒结果显示，较之正常对照组大鼠，肌腱病模型组大鼠肢体平衡能力明显下降，而AAV-MANF治疗显著增强了大鼠的肢体平衡能力（图4）。
4 大体观评估
对各组大鼠后肢进行解剖，并拍摄跟腱部位大体观。结果显示，较之正常对照组大鼠，肌腱病模型组大鼠跟腱部位出现明显出血、肿胀与组织退变现象，炎性反应明显，而AAV-MANF治疗显著延缓了这一病变（图5）。
5 组织病理学检测
取各组大鼠跟腱组织，做扫描电镜检测，结果显示较之正常对照组大鼠，肌腱病模型组大鼠跟腱组织纤维排列出现明显紊乱，AAV-MANF治疗则使得大鼠跟腱组织纤维排列在一定程度上恢复正常（图6）。
H&E与Masson染色结果显示，肌腱病大鼠跟腱组织中存在严重的胶原纤维排列紊乱与炎性浸润，而AAV-MANF治疗组大鼠跟腱组织中胶原排列明显更整齐，纤维体积增粗，炎性反应程度也得到显著改善，整体接近正常大鼠(图7、图8)。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (4)
1.一种治疗肌腱病的药物在制备治疗肌腱病的药剂中的应用，所述药物的活性成分含有能够表达中脑星形胶质细胞源性神经营养因子的病毒，所述能够表达中脑星形胶质细胞源性神经营养因子的病毒为腺病毒。
2.根据权利要求1所述的应用，所述腺病毒中具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，所述药物为注射液。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，所述药剂用于缓解疼痛、提高平衡能力、减轻炎性反应、恢复腱组织纤维排列和/或抑制胶原纤维排列紊乱。
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