CN117677376A - 重组蛋白、其组合物及其稳定化方法 - Google Patents

重组蛋白、其组合物及其稳定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组蛋白、其组合物及其稳定化方法。本发明具体涉及稳定的SEQ ID NO:1的重组蛋白和包括SEQ ID NO:1的重组蛋白的组合物。本发明还涉及制备、储存和稳定SEQ ID NO:1的重组蛋白的方法以及用于延长保质期的其组合物。

Description

重组蛋白、其组合物及其稳定化方法
技术领域
本发明涉及来源于齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)凝集素的重组凝集素蛋白、其组合物以及用于改善其稳定性的方法。
背景技术
凝集素是一种高度特异性碳水化合物结合蛋白，是对其他分子的糖部分具有高度特异性的大分子。许多凝集素被用作指示早期检测恶性生长的生物标记物或用作自噬诱导剂，而其他凝集素也示出通过细胞凋亡抑制癌生长的能力。凝集素调节癌症相关的路径，并且它们具有成为癌症诊断和治疗的试剂的潜力。目前，大多数商业上可获得的凝集素来自植物和其他真核生物。
齐整小核菌凝集素(Sclerotium rolfsii lectin或“SRL”)是从土传植物病原真菌齐整小核菌的菌核体中分离的凝集素。SRL对Thomsen-Friedenreich(TF)抗原和Tn抗原具有特异性。TF抗原是一种在不同的人类癌细胞的细胞表面过度表达的二糖(Galβ1→3GalNAc-α-Ser/Thr)。Tn抗原是一种单糖(GalNAc-α-Ser/Thr)。已知，TF和Tn经由募集Galectin-3和MUC-1的机制参与肿瘤细胞与内皮的黏附，这是转移形成的第一步。此外，很明显，这一路径可以被越来越多的分子阻断，从而创造出治疗干预的方法。由于其对TF和Tn抗原的特异性，SRL已被证明与人类癌细胞结合。
WO/2010/095143、WO/2014/203261和WO/2020/044296公开了SRL的几种重组变体，其内容以引用的方式整体并入本文。与天然SRL相比，除了对TF和Tn抗原表现出改善的特异性外，新变异体还表现出高溶解度和稳定性。这些变异体用于癌症的治疗用途已在上面列出的申请中公开。WO/2020/074984还公开了这种变异体用于治疗或预防炎症性疾病的治疗用途，其内容以引用的方式整体并入本文。
药用蛋白质和多肽，以及其他生物药物，由于稳定性问题，对制剂构成了挑战。传统溶液中的蛋白质通常是不稳定的。它们容易从化学和物理过程中降解，诸如氧化脱酰胺、聚集和沉淀。对于大多数蛋白质来说，聚集、沉淀、凝聚和粘性尤其成问题，特别是在高蛋白质浓度的情况下。蛋白质在冻干时通常比在溶液中更稳定。然而，储存和运输期间的不稳定性限制了各种蛋白质制剂的成功营销。
药用蛋白质制剂的基本原理是必须克服某些不稳定性。蛋白质水解路径可分为两种不同的种类，包括化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性导致蛋白质通过键的形成或断裂进行修改。化学不稳定问题的示例包括脱酰胺基作用、外消旋作用、水解作用、氧化作用、β-消除和二硫化物交换。另一方面，物理不稳定性不会导致蛋白质中的共价变化；相反，物理不稳定性与蛋白质的高阶结构(二级和更高级)的变化有关。这些包括变性、表面吸附、聚集和沉淀(Manning et al.,Pharma.Res.6,903(1989))。此外，某些蛋白质在生产、配制和储存期间暴露在环境大气条件和/或UV光下时是敏感的，这能够导致蛋白质降解，并可能影响制剂的效力。例如，蛋白质的光致辐照能够导致聚集、氧化、破碎和降低的生物活性。
虽然WO/2010/095143和WO/2014/203261通过修改序列解决了与天然SRL相关的稳定性问题，但修改后的重组凝集素没有表现出处理和配制药品所需的稳定性。在WO/2021/005500中公开的制剂中使用稳定剂进一步稳定重组凝集素，其内容以引用的方式整体并入本文。然而，这些蛋白质在配制、储存或运输期间仍然存在关于稳定性的挑战，蛋白质在这些过程中经常会聚集或氧化。
药物制剂在室温下必须是稳定的、应易于处理、并应具有较长的保质期，以便于运输、储存和处理。在药物组合物的储存和处理期间，蛋白质形成聚集体、氧化、凝聚和/或沉淀能够不利地影响蛋白质的生物活性，导致药物组合物的治疗效果丧失。
发明目的
因此，本发明的目的是提供在室温下表现出长期稳定性和在低于室温的温度下表现出长期稳定性的重组凝集素蛋白。这种重组凝集素蛋白具有更长的保质期。
本发明的另一个目的是开发一种用于改善重组凝集素蛋白、特别是来自SRL的重组凝集素蛋白的长期稳定性的方法。
本发明的另一个目的是开发一种稳定的、药学上可接受的、治疗上有效的重组凝集素制剂。具体地说，目的是提供一种在室温下长期稳定并且在低于室温的温度下长期稳定的凝集素制剂。
进一步的目的是提供一种具有改善的稳定性的稳定冻干凝集素制剂，该凝集素在其保质期期间易于处理、储存和输送。
本发明的另一目的是提供一种制备稳定的、药学上可接受的、治疗上有效的重组凝集素制剂的方法。
本发明的另一目的是开发一种用于改善包括重组凝集素蛋白的制剂的长期稳定性的方法。
发明内容
根据第一方面，本发明提供了稳定的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，当凝集素蛋白在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下储存至少约6个月的时间段时，凝集素蛋白单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质；其中所述凝集素蛋白存储在阻挡/抵抗波长范围在约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中容器中的顶部空间包括惰性气氛或真空。
根据第二方面，本发明提供了SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，当凝集素蛋白在约2℃至约8℃的温度下储存至少约1年的时间段时，凝集素蛋白单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质；其中凝集素蛋白存储在阻挡/抵抗波长范围在约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛。
根据本发明的第三方面，提供了一种改善SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的稳定性的方法，其中，方法包括将SEQ ID NO:1的凝集素蛋白存储在阻挡/抵抗波长范围在约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛，进一步其中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白在所述容器中在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下储存至少约6个月的时间段后单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质。
根据本发明的第四方面，提供了一种改善SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的稳定性的方法，其中，方法包括将SEQ ID NO:1的凝集素蛋白存储在阻挡/抵抗波长范围在约100nm至约500nm的光波的气密容器中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛，并且其中，SEQ IDNO:1的凝集素蛋白在所述容器中在约2℃至约8℃的温度下储存至少约1年的时间段后单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质。
根据本发明的第五方面，提供了一种包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白和稳定剂的组合物，其中，该组合物在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下储存至少约6个月的时间段后，组合物单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质；其中，组合物存储在阻挡/抵抗波长范围在约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛。
根据本发明的第六方面，提供了一种包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白和稳定剂的组合物，其中，当该组合物在约2℃至约8℃的温度下储存至少约1年的时间段时，组合物单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质，组合物存储在阻挡/抵抗波长范围在约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛。
根据本发明的第七方面，提供了一种冻干组合物(lyophilized composition)，该冻干组合物包括：
a)一种SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，以及
b)稳定剂，该稳定剂主要包括：氨基酸或其盐、表面活性剂、糖或碳水化合物、或它们的组合，
其中，当组合物放置在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中并且容器中的顶部空间为真空或惰性气氛时，组合物在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下，在至少约6个月的时间段内是稳定的，并且其中，在这段时间之后，组合物单独地或组合地表现出小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质。
根据本发明的第八方面，提供了一种冻干组合物，该冻干组合物包括：
a)一种SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，以及
b)稳定剂，该稳定剂主要包括：氨基酸或其盐、表面活性剂、糖或碳水化合物、或它们的组合，
其中，当组合物放置在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中并且容器中的顶部空间为真空或惰性气氛时，组合物在约2℃至约8℃的温度下，在至少约1年的时间段内，组合物单独地或组合地表现出小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质。
根据本发明的其中一个方面，提供了一种稳定的药物组合物，该药物组合物包括：
a)约0.0001％(w/v)至约10％(w/v)的来自齐整小核菌凝集素的重组凝集素蛋白；以及
b)约0.01％(w/v)至约10％(w/v)的一种或多种氨基酸或其药学上可接受的盐；
c)约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的一种或多种表面活性剂；或
d)约0.1％(w/v)至约15％(w/v)的一种或多种碳水化合物或糖。
本文使用的百分比指的是在最终制剂中以准备好给药的体积计的组分的量(重量)。该百分比可以通过现有技术中已知的方法来确定。
根据本发明的第九方面，提供了一种稳定的冻干注射用组合物，该组合物包括：
约0.01％w/v至约2％w/v的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，
约0.04％w/v至约0.8％w/v的聚山梨醇酯(聚山梨酯，polysorbate)80，
约0.08％w/v至约1.6％w/v的L-精氨酸盐酸盐(L-arginine hydrochloricacid)，
约0.09％w/v至约19.2％w/v的蔗糖，以及
约0.09％w/v至约20％w/v的甘露醇，
其中，当组合物放置在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中并且容器中的顶部空间为真空或惰性气氛时，组合物在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下，在至少约6个月的时间段内是稳定的，
其中，在这段时间之后，组合物单独地或组合地表现出小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质。
根据本发明的第十方面，提供了一种稳定的冻干注射用组合物，该组合物包括：
a)约0.01％w/v至约2％w/v的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，
b)约0.04％w/v至约0.8％w/v的聚山梨醇酯80，
c)约0.08％w/v至约1.6％w/v的L-精氨酸盐酸盐，
d)约0.09％w/v至约19.2％w/v的蔗糖，以及
e)约0.09％w/v至约20％w/v的甘露醇，
其中，当组合物放置在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中并且容器中的顶部空间为真空或惰性气氛时，组合物在约2℃至约8℃的温度下在至少约1年的时间段内是稳定的，
其中，在这段时间之后，组合物单独地或组合地表现出小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质。
根据本发明的第十一方面，提供了一种气密容器，该气密容器阻挡/抵抗波长范围在约100nm至约500nm的光波，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其组合物和顶部空间，其中，顶部空间为真空或惰性气氛。
根据本发明第十二方面，提供了一种封装SEQ ID NO 1的凝集素蛋白或其药物组合物的方法，其中该方法包括：
a)将SEQ ID NO 1的凝集素蛋白或组合物放置在阻挡/抵抗100nm至500nm波长的光波的容器中，以及
b)密封容器，使得SEQ ID NO 1的凝集素蛋白或组合物与真空或惰性气氛保持接触。
根据本发明的第十三方面，提供了一种制备稳定的冻干组合物的方法，该冻干组合物包括：
a)SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，以及
b)稳定剂，该稳定剂主要包括：氨基酸或其盐、表面活性剂、糖或碳水化合物、或它们的组合，
其中，该方法包括在波长大于约500nm的光下配制组合物。
根据本发明的第十四方面，提供了一种SEQ ID NO:1的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白基本上不含式I的杂质蛋白质。
根据本发明的第十五方面，提供了一种包括SEQ ID NO:1的重组凝集素蛋白的组合物，其中，该组合物基本上不含式I的杂质蛋白质。
附图说明
图1：在25℃/60％RH下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的组合物的测定结果
图2：在25℃/60％RH下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的组合物的HMWP
图3：在25℃/60％RH下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的组合物的单个最大杂质
图4：在25℃/60％RH下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的组合物的总杂质
图5：在2-8℃下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的组合物的测定结果
图6：在2-8℃下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的组合物的HMWP
图7：在2-8℃下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的单个最大杂质
图8：在2-8℃下储存在透明小瓶相对于琥珀色小瓶中的总杂质。
定义
如本文所使用的，术语“室温”指的是20℃至30℃范围内的温度、优选为22℃至27℃范围内的温度、更优选为23℃至26℃范围内的温度。
保质期是指药品自生产的日期起，在推荐的储存条件下储存时，预计将药品保持在其批准的产品规格内的时间。保质期通常以月为单位来表达，即24个月、36个月至最多60个月。为了本发明的目的，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的保质期为至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月。
本文使用的术语“凝集素”指的是碳水化合物结合蛋白，其中，本文使用的术语“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。
术语‘制剂’、‘组合物’、‘药物制剂’和‘药物组合物’可交换地使用，并且指的是以允许活性成分的生物活性有效的形式存在的制剂，并且因此可以施用至受试者用于治疗用途，其中受试者优选为人。本文使用的‘活性成分’，指的是具有所需生物学活性或治疗活性，以使受试者免于疾病或疾病症状，或减缓或延缓疾病的进展的重组凝集素或重组蛋白。本发明的制剂以液体制剂或固体制剂制备。液体制剂是适合口服或注射的溶液、乳剂或混悬剂的形式。本领域技术人员将理解，液体制剂在诸如注射用水(water for Injection，WFI)的介质中作为液体载体。固体制剂是通过混合固体成分或通过蒸发溶剂介质来制备的。固体制剂也可以通过液体制剂的冷冻干燥来制备，其中，在冷冻干燥过程中，首先冻结待干燥的材料，然后通过在真空或惰性气氛下升华来移除冰或冷冻的溶剂。出于稳定性的原因，在冻干之前可以在制剂中添加赋形剂。在冷冻干燥期间，可能需要确定和使用适当的贮存温度、产品温度、真空水平、冷冻、一次干燥参数和二次干燥参数，这在本领域技术人员的知识范围内。固体制剂也可以称为冻干制剂。
术语“药品”指的是包含药物物质的成品剂型，通常但不必须与一种或多种其他赋形剂结合。在本发明的上下文中，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白和赋形剂的组合物是药品。
术语“药物物质”指的是在诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病中提供药理活性或其他直接效果或影响人体的结构或任何功能的活性成分，但不包括用于合成此类成分的中间体。为了本发明的目的，药物物质是SEQ ID NO:1的凝集素蛋白。
术语“容器”指的是保存药物或组合物的内容物的物体。容器，诸如小瓶(vial)、注射器(syringe)、药筒(cartridge)或安瓿(ampule)，其中，这种容器抵抗/阻挡波长为100-500nm的光波或是不透明的。在本发明的上下文中，容器是气密容器，并且是深色的，诸如黑色、蓝色、红色或琥珀色，并且阻挡/抵抗具有约100nm至约500nm范围波长的光波。为了本发明的目的，容器是耐光的琥珀色容器，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其具有稳定剂的组合物，该稳定剂阻挡/抵抗波长为约100nm至约500
nm范围内的紫外线(uv)和近可见光波。可以设想，容器可以由玻璃材料制成，特别是I型、II型、III型或IV型玻璃。
术语“耐光”指的是一种容器封闭***，该***通过构成容器的材料的特定性质，包括对其施加的任何涂层，来保护内容物不受光的影响。在本发明的上下文中，耐光容器是琥珀色小瓶，其阻挡/抵抗波长为约100nm至约500nm的紫外线(uv)和近可见光两者。
术语“不透明的”指的是材料阻挡光穿过的能力或性质。为了本发明的目的，术语不透明的指的是半不透明或部分不透明的材料。这种材料是不透光的或部分不透光的。
术语惰性气氛意指‘化学上不活泼的’气氛。惰性气氛可以包括真空或非反应性气体气氛，诸如氮气、二氧化碳、氩气、氦气等；用于覆盖储存中的组合物，以清除工艺管线和容器中的反应性气体和液体，以及用于覆盖部分填充的容器中的混合物。在本发明的上下文中，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其组合物的容器具有包括真空或惰性气氛的顶部空间。
术语‘测定’涉及通过本领域已知的合适的分析方法对药品中存在的药物物质进行定量评估。在本发明的上下文中，‘测定’是通过高效液相色谱(High PerformanceLiquid chromatography，HPLC)方法确定组合物中SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的定量评估的分析。
术语“稀释剂”是一种用于稀释药品的稀释剂。稀释剂可以是用于溶解待注射、待摄入或待吸入的药物的液体。稀释剂可以是生理盐水(normal saline，NS)、无菌注射用水(sterile water for injection，SWFI)、5％右旋糖水(Dextrose 5％in water，D5W)。在本发明的上下文中，冻干制剂可以与适当的药学上可接受的稀释剂或其混合物进行重建(reconstituted)，以获得本领域技术人员已知的所需浓度。更优选地，稀释剂是用于注射的无菌水。
术语“稳定剂”或“稳定试剂”涉及本发明的组合物的赋形剂。在本发明的上下文中被理解为在WO2021/005500中公开。
具体实施方式
序列表：
SEQ ID NO:1：代表齐整小核菌凝集素的变体的氨基酸序列
TYKIT VRVYQ TNPDA FFHPV EKTVW KYANG GTWTI TDDQH VLTMG GSGTS GTLRFHADNG ESFTATFGVH NYKRW CDIVT NLAAD ETGMV INQQY YSQKN REEAR ERQLS NYQVK NAKGRNFQIV YTEAE GNDLH ANLII G
SEQ ID NO:2：代表SEQ ID NO:1的变体(Met-凝集素)的氨基酸序列：
MTYKI TVRVY QTNPD AFFHP VEKTV WKYAN GGTWT ITDDQ HVLTM GGSGT SGTLRFHADN GESFT ATFGV HNYKR WCDIV TNLAADETGM VINQQ YYSQK NREEA RERQL SNYQV KNAKGRNFQI VYTEAEGNDL HANLI IG
根据一方面，本发明提供了一种稳定的凝集素蛋白。
SEQ ID NO:1的凝集素蛋白首先在印度专利申请350/MUM/2009中被公开为Rec 2，其源自齐整小核菌凝集素(SRL)。
在实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO:1的稳定的重组凝集素蛋白。
术语“重组”意指已经被人工地或合成地(即非自然地)通过人为干预改变的核酸或多肽。可以在其自然环境或状态内对材料执行改变，或从其自然环境或状态中移除对材料执行的改变。例如，“重组核酸”是指在克隆、DNA改组或其他众所周知的分子生物学程序中，通过重新组合核酸而形成的核酸。“重组DNA分子”是由通过这种分子生物学技术连接在一起的DNA的片段构成的。本文中使用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”指的是使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。本发明的蛋白质可以在细菌或酵母中表达。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的重组凝集素蛋白旨在涵盖与SEQ ID NO:1同源性超过85％的凝集素蛋白。本文使用的术语“同源性”指的是在给定的序列区域或部分上与SEQID NO：1具有至少85％同一性的凝集素蛋白。SEQ ID NO:1和其他序列之间的同源性百分比使用具有默认参数的BLASTP算法来确定(Altschul et al.Nucleic Acids Res.1997Sep1；25(17):3389-402)。特别地，BLAST算法可以使用以下URL在互联网上访问：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。在可选择的实施方案中，对于整体序列比对，使用默认参数使用EMBOSS Needle算法来确定两个序列之间的同源性百分比。特别地，EMBOSSNeedle算法可以使用以下URL在互联网上访问：https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/。
除非另有说明，否则在本说明书中，术语“同源”可与术语“同一”可交换地使用。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白可以包括其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或任何其他药学上可接受的形式。SEQ ID NO:1的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或任何其他药学上可接受的形式指的是具有与SEQ ID NO:1相同的生物效力的物质并且不具有任何不期望的性质。盐、溶剂化物、水合物和前药的制备能够通过本领域已知的方法进行。
SEQ ID NO:1能够通过350/MUM/2009或WO/2020/074977中公开的方法制备。为了本发明的目的，通过WO/2020/074977中公开的方法制备和纯化凝集素蛋白，其内容以引用的方式整体并入本文。
根据另一方面，本发明提供了一种包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包括SEQ ID NO:1的重组凝集素蛋白的组合物。
在实施方案中，本发明提供了一种包括重组凝集素蛋白SEQ ID NO:1和稳定剂的组合物。
根据本发明的方面，稳定剂可以选自表面活性剂、洗涤剂、氨基酸、药学上可接受的氨基酸的盐、碳水化合物或糖稳定剂、胺、多元醇、或它们的组合。
根据本实施方案，表面活性剂的非限制性示例是20(聚山梨醇酯20)、/>40(聚山梨醇酯40)、/>60(聚山梨醇酯60)、/>80(聚山梨醇酯80)、山梨醇单月桂酸酯、山梨醇单棕榈酸酯、山梨醇单硬脂酸酯、山梨醇三硬酯酸酯、山梨醇单油酸酯、TritonTMX-100、/>F-68、/>F-88、/>F-127(poloxamer，泊洛沙姆)、山梨醇单月桂酸酯、山梨醇单硬脂酸酯、山梨醇三硬脂酸酯、泊洛沙姆188和Brij 35(聚氧乙烯烷基醚)、或它们的组合。
在一些实施方案中，表面活性剂可以在0.001mg/ml至10mg/ml或0.0001％(w/v)至1.0％(w/v)的范围内。
在一些实施方案中，稳定组合物包括源自齐整小核菌凝集素的重组凝集素和一种或多种表面活性物质，其中蛋白质与表面活性物质的比率在1：0.0002至1：10的范围内。
此外，根据实施方案，氨基酸可以选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、l、精氨酸、或它们的组合。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸，优选L-氨基酸。氨基酸可以直接使用也可以作为其盐使用。盐可以是碱金属盐或碱土金属盐；铵盐；有机胺盐，诸如三乙胺盐或三乙醇胺盐；精氨酸盐诸如碱性氨基酸盐或酸式盐，例如氢氯酸盐(hydrochloride salt)、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、无机酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐或本领域技术人员公知的任何其他氨基酸的盐。在实施方案中，氨基酸选自L-组氨酸、L-精氨酸、谷氨酸或甲硫氨酸。在另一实施方案中，氨基酸是选自L-组氨酸、L-精氨酸、谷氨酸或甲硫氨酸的氨基酸的氢氯酸盐。在优选实施方案中，氨基酸选自L-组氨酸或L-精氨酸的氢氯酸盐。
在一些实施方案中，氨基酸或其药学上可接受的盐的浓度在0.01％(w/v)至10％(w/v)或0.1mg/ml至100mg/ml的范围内。
在另一实施方案中，稳定的组合物包括源自齐整小核菌凝集素的重组凝集素和一种或多种氨基酸或其药学上可接受的盐。蛋白质与氨基酸或其药学上可接受的盐的比率在1：0.1至1：10的范围内。
根据又一实施方案，碳水化合物或糖稳定剂可以选自以下非限制性示例：蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘油、甘露醇、乳糖、木糖醇、阿糖醇、赤藓糖醇、糖醇、麦芽糖醇、葡萄糖、棉子糖、麦芽糖、右旋糖酐、肌糖或其组合。在一些实施方案中，碳水化合物是蔗糖或甘露醇。在另一实施方案中，碳水化合物的浓度在0.1％(w/v)至15％(w/v)或1.0mg/ml至150.0mg/ml的范围内。
在又一实施方案中，稳定的组合物包括源自齐整小核菌凝集素的重组凝集素和一种或多种碳水化合物或糖稳定剂，其中，蛋白质与碳水化合物的比率在1：0.1至1：150的范围内。
根据本发明的方面，稳定剂还可以选自胺类碱性蛋白质诸如鱼精蛋白或药学上可接受的鱼精蛋白的盐，或带有胺残基的天然或合成聚合物诸如聚赖氨酸。鱼精蛋白可以从例如人或鱼中获得或衍生。稳定剂可以选自多元醇，诸如PEG 400至PEG 20,000、甘油或木糖醇。
在具体优选实施方案中，稳定剂是表面活性剂、氨基酸、氨基酸的药学上可接受的盐和/或碳水化合物中的一种或多种的组合。例如，稳定剂可以是表面活性剂和氨基酸的组合，或者可以是氨基酸或其盐和碳水化合物的组合。
在具体实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括：
a)一种SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，以及
b)稳定剂，该稳定剂主要包括：氨基酸或其盐、表面活性剂、糖或碳水化合物、或它们的组合。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括：
a)约0.01％w/v至约2％w/v的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，
b)约0.04％w/v至约0.8％w/v的聚山梨醇酯80，
c)约0.08％w/v至约1.6％w/v的L-精氨酸盐酸盐，
d)约0.09％w/v至约19.2％w/v的蔗糖，以及
e)约0.09％w/v至约20％w/v的甘露醇，
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物可以储存在玻璃容器中，诸如小瓶、注射器、安瓿，其中这种容器抵抗波长在100nm-500nm之间的光，或者容器是不透明的。众所周知，玻璃容器分为I型、II型、III型和IV型。I型玻璃容器包含10％的氧化硼，80％的二氧化硅，以及少量的氧化铝和氧化钠。其中的氧化硼使其具有高度的耐水解性和化学惰性。更具体地说，I型玻璃容器非常适合用于肠胃外和非肠胃外制剂的包装材料。II型容器具有较高的耐水解性。II型玻璃容器是其内表面经过硫磺处理的III型容器。这种处理有助于防止容器的老化。II型玻璃的熔点一般比I型玻璃低，因此更容易成型。II型玻璃容器适用于储存中性含水制剂和酸性制剂，无论它们是肠胃外用还是非肠胃外用。III型玻璃容器由10％的氧化钙、15％的氧化钠和75％的二氧化硅制成。它们还包括忽略不计的量的氧化铝、氧化钾和氧化镁。虽然氧化镁降低了模制玻璃所需的温度，但氧化铝提高了其化学耐久性，并用于包装非肠胃外制剂和用于包装某些肠胃外产品。IV型玻璃容器包含通用的碱石灰，并且它们具有较低的耐水性。这类玻璃容器最适合用于高压灭菌的产品，因为玻璃容器的腐蚀反应速率将会增加。IV型玻璃容器用于储存口服剂型和外用产品。特别地，在本发明中，容器是I型容器。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物可以储存在容器中，诸如小瓶、注射器、药筒或安瓿，其中，这种容器抵抗波长在100nm至500nm之间的光，或者容器是不透明的。特别地，容器是深色的容器，诸如黑色、蓝色、红色或琥珀色，该容器阻挡波长为约100nm至约500nm的光波。由于光从一级容器传播，导致许多药品变质。随着光波长的减小，光的影响会增加，危害也会更大。光敏产品必须包装在耐光的琥珀色玻璃瓶和塑料瓶中，因为这些产品的制造是为了吸收UV区域的光，以保护药品。测量玻璃瓶和塑料瓶的透光特性是评估包装材料以防止药品变质的重要考虑因素。改变玻璃瓶的化学组成会影响光的透射，因此并不是所有的琥珀色瓶都能提供足够的抗UV光保护。UV光可以引起光化学反应的程度取决于其对***的穿透。来自UV或可见光的人工来源的辐射能量显著影响光敏产品的稳定性，因为它加速了具有产品劣化效应的光化学降解反应。UV射线比可见光携带更多的能量，并且造成更大的损害。由于这个原因，有机化合物被用作各种塑料树脂的光稳定剂，以防止阳光和人造UV光引起的光降解。包装顶部空间中的残氧量足以催化影响药品的某些组分的光氧化反应。在本发明中，小瓶的顶部空间包括惰性气氛，其中惰性气氛选自真空或一种或多种惰性气体，如氩气、氮气等。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物储存在阻挡/抵抗光线的容器中时是稳定的。特别地，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白储存在阻挡/抵抗紫外线(uv)和近可见光的容器中时是稳定的。根据更具体的实施方案，本发明的凝集素蛋白在存储在阻挡/抵抗波长为约100nm至约500nm的光波的容器中时是稳定的。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物可以储存在耐光容器中，诸如小瓶、注射器、药筒或安瓿，或者其中这种容器是不透明的。特别地，容器是深色的容器，诸如黑色、蓝色、红色或琥珀色，该容器阻挡/抵抗波长为约100nm至约500nm的光波。容器可以是玻璃容器，或由诸如例如环烯烃共聚物(cyclicolefin copolymer，COC)或环烯烃聚合物(cyclic olefin polymer，COP)或多层塑料容器(夹在两个COP层之间的聚酰胺)的塑料材料制成的容器。
根据另一实施方案，SEQ ID NO：1或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物可以储存在容器中，诸如小瓶、注射器、药筒或安瓿，其中这样的容器是不透明的。容器可以储存在远离光的地方，优选放在由纸、纸板、木材、塑料或阻挡/抵抗光的玻璃制成的二级容器中。更优选地，二级容器可以是纸箱、塑料盒或铝袋。
在实施方案中，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其组合物的容器为气密容器。气密容器是具有气密密封件的容器，不允许空气或气体进出容器。这种密封件例如可以是橡胶塞。因此，容器中的状态从密封时间、整个存储、处理以及直到打开使用都保持不变。密封前的容器可以填充SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其组合物，其形式为缓冲液中的溶液或冷冻干燥固体的形式。
在另一实施方案中，容器的顶部空间包括真空或惰性气氛。顶部空间是容器中,SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物与密封件之间的空间。容器可以经受约0.05mbar至0.2mbar的真空。SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其组合物可以以固体形式或溶解在缓冲液中的溶液形式填充在容器中。在冷冻干燥(冻干，lyophilisation)过程中，组合物可以在适合的温度下在真空或惰性气氛中经受足够的时间，以将顶部空间转变为真空或惰性气氛。然而，溶液中的蛋白质可以经受包括冷冻、升华和干燥的冷冻干燥过程，其中将溶液冷冻至低于-20℃约20h至40h，然后在约0.05毫巴至0.2毫巴的真空下升华至多60h，以及最后在约0.05毫巴至0.2毫巴的真空下干燥至多20h。
根据本发明的实施方案，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的密封容器可以保存或储存在室温下。特别地，密封容器保持或储存在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度。
根据实施方案，包括具有SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的本发明的组合物的密封容器可以保存或储存在室温下。特别地，密封容器保持或储存在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度。
根据另一实施方案，所述包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的密封容器可以保存或储存在低于室温的温度。在具体实施方案中，温度可以在约0℃至约15℃之间。在更具体的实施方案中，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的密封容器保持或储存在约2℃至约8℃的温度下。
根据另一实施方案，包括具有SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的本发明的组合物的密封容器可以保存或储存在低于室温的温度。在具体实施方案中，温度可以在约0℃至约15℃之间。在更具体的实施方案中，包括所述组合物的密封容器保持或储存在约2℃至约8℃的温度。
在具体实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白在室温或低于室温和/或相对湿度约60％的条件下储存在本发明的密封容器中时是稳定的，其中该凝集素蛋白稳定至少约1个月的时间段。在所述条件下，所述密封容器中的凝集素蛋白可以保持稳定至少约3个月、约6个月、约9个月或约12个月。特别地，凝集素蛋白稳定至少在约6个月或12个月的时间段。
在更具体的实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白在室温和/或相对湿度约60％的条件下储存在本发明的密封容器中时是稳定的，其中凝集素蛋白稳定至少约6个月的时间段。
在具体实施方案中，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在室温或低于室温和/或相对湿度约60％的条件下储存在本发明的密封容器中时是稳定的，其中该组合物稳定至少约1个月的时间段。在所述条件下，所述密封容器中的组合物可以保持稳定至少约3个月、约6个月、约9个月或约12个月。特别地，该组合物稳定至少约6个月或12个月的时间段。
在更具体的实施方案中，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在室温和/或相对湿度约60％的条件下储存在本文所公开的本发明的密封容器中时是稳定的，其中凝集素蛋白稳定至少约6个月的时间段。
在另一更具体的实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白在2℃至8℃下储存在本发明的密封容器中时是稳定的，其中凝集素蛋白稳定至少约12个月的时间段。
在另一更具体的实施方案中，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在2℃至8℃储存在本发明的密封容器中时是稳定的，其中所述组合物稳定至少约12个月的时间段。
在一方面中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在室温或低于室温和/或相对湿度为60％的条件下在储存在本发明的密封容器中至少不少于1个月的时间段，如果在这样的储存时间段后，该组合物单独地或组合地包括低于10％、低于7％或低于5％的高分子量蛋白杂质或相关物质杂质，则该组合物是稳定的。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的不期望形式可能是由于蛋白质的自结合、无序形式，其中蛋白质经受与自身的结合以形成二聚体或更高阶的低聚物或聚集体。这些蛋白质被称为高分子量蛋白质(High Molecular Weight Protein，HMWP)。这些杂质使用诸如以下的技术检测：液相色谱-质谱仪(Liquid Chromatography–Mass Spectrophotometer，LCMS)、具有紫外或多角度光散射检测器的尺寸排阻色谱法(Size exclusionchromatography with UV or Multi-Angle Light Scattering detector，SEC-UV/MALS)、成分梯度多角度静态光散射法(Composition-Gradient Multi-Angle static LightScattering，CG-MALS或CG-SLS)、动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)、沉降等效分析超速离心(Sedimentation equivalent analytical ultra-centrifugation，SE-AUC)、沉降速度分析超速离心(Sedimentation velocity analytical ultra-centrifugation，SV-AUC)、凝胶电泳、非对称流场-流动分馏(Asymmetrical flow field-flow fractionation，AF4)、微流成像或其他技术人员已知的方法。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在室温或低于室温和/或相对湿度为60％的条件下储存在本发明的密封容器中至少不少于1个月的时间，如果在这样的储存时间段后、该组合物包括低于10％、低于7％或低于5％的高分子量蛋白杂质，则该组合物是稳定的。特别是高分子量的蛋白质杂质低于3％。
SEQ ID NO:1的其他不期望的形式是通过蛋白质的聚集、变性、降解或凝结形成的。这些现象大多是由于蛋白质的错误折叠而发生的，这也是不期望的。这种形式的蛋白质被称为相关物质杂质。每次在不利条件下准备、处理或储存新一批蛋白质时，这些杂质可能都不同。
SEQ ID NO:1的凝集素蛋白通过WO/2020/074977中公开的方法制备和纯化，特别是使用WO/2020/074977第34页表1中给出的批次5的条件。WO/2020/074977中公开的Met-凝集素(SEQ ID NO:1的变体)以约2％至20％存在于SEQ ID NO:1的凝集素蛋白中。Met-凝集素的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1中SEQ ID NO:2的Met-凝集素的存在特别不利，因为引发剂甲硫氨酸极易氧化。甲硫氨酸中存在的硫经历氧化以形成相关物质杂质，诸如式Ia-Ie(SEQ ID NO:3-7)的杂质蛋白质。
本领域技术人员将理解，根据ICHQ6B指南，由于生物体用于生产蛋白质的生物合成过程，蛋白质中确实存在固有程度的结构异质性；因此，所需的产物可以是预期的翻译后修饰形式(例如糖形式)的混合物。这些形式可以是活性的，并且它们的存在可能不会对产物的安全性和有效性产生有害影响。在药物物质或药品的制造和/或储存期间也可能出现异质性。因为这些产品的异质性决定了它们的质量，所以应该表征这种异质性的程度和特征，以确保批次间的一致性。当所需产品的这些变体在活性、有效性和安全性方面具有与所需产品相似的性质时，它们被视为与产品相关的物质。由于生物技术和生物产品独特的生物合成生产工艺和分子特性，药物物质可以包括多个分子实体或变体。当这些分子实体衍生自预期的翻译后修饰时，它们被认为是所需产品的一部分。当在制造工艺和/或储存期间形成所需产品的变体并具有与所需产品相当的性能时，它们被认为是与产品相关的物质，而不是杂质。已经发现具有如SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列的Met-凝集素变体以SEQ IDNO:1的凝集素蛋白的约2％至约20％重量的量存在于SEQ ID NO:1的凝集素蛋白中。因此，在整个本公开中，本文参考SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物和包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的成品/包装应被解释为包括具有SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的Met-凝集素变体，其量为SEQ ID NO:1的凝集素蛋白重量的约2％至约20％。
当SEQ ID NO:1的凝集素蛋白在室温下用3％过氧化氢经受氧化仅约10min时，与对照相比，该蛋白质降解超过14％，暗示甲硫氨酸在SEQ ID NO:1中44和89位置的部分氧化。类似地，当具有约12％Met-凝集素变体的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白暴露于120万勒克斯小时的白光和200瓦时/平方米的近紫外线能量达120h时，蛋白质降解11.74％。另一方面，观察到包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物，当暴露于提供不小于120万勒克斯小时的总照明和不小于200瓦时/平方米的综合近紫外线能量的光达120h的时间段时，示出约7-8％的相关物质杂质的形成。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白在非调节条件(unregulatedcondition)下可经受氧化以形成式I的杂质蛋白质，其中式I的杂质蛋白质是式Ia、式Ib、式Ic、式Id和/或式Ie中的一种或多种的组合。这种杂质是由于SEQ ID NO:2的Met-凝集素蛋白变体的存在而形成的。
式Ia：
(O)MTYKI TVRVY QTNPD AFFHP VEKTV WKYAN GGTWT ITDDQ HVLTM GGSGT SGTLRFHADN GESFT ATFGV HNYKR WCDIV TNLAADETGM VINQQ YYSQK NREEA RERQL SNYQV KNAKGRNFQI VYTEAEGNDL HANLI IG
式Ib
(O)(O)MTYKI TVRVY QTNPD AFFHP VEKTV WKYAN GGTWT ITDDQ HVLTM GGSGTSGTLR FHADN GESFT ATFGV HNYKR WCDIV TNLAADETGM VINQQ YYSQK NREEA RERQL SNYQVKNAKG RNFQI VYTEA EGNDL HANLI IG
式Ic
(O)MTYKI TVRVY QTNPD AFFHP VEKTV WKYAN GGTWT ITDDQ HVLTM(O)GGSGTSGTLR FHADN GESFT ATFGV HNYKR WCDIV TNLAADETGM VINQQ YYSQK NREEA RERQL SNYQVKNAKG RNFQI VYTEA EGNDL HANLI IG
式Id
(O)(O)MTYKI TVRVY QTNPD AFFHP VEKTV WKYAN GGTWT ITDDQ HVLTM(O)GGSGTSGTLR FHADN GESFT ATFGV HNYKR WCDIV TNLAADETGM VINQQ YYSQK NREEA RERQL SNYQVKNAKG RNFQI VYTEA EGNDL HANLI IG
式Ie
(O)(O)MTYKI TVRVY QTNPD AFFHP VEKTV WKYAN GGTWT ITDDQ HVLTM(O)GGSGTSGTLR FHADN GESFT ATFGV HNYKR WCDIV TNLAADETGM(O)VINQQ YYSQK NREEA RERQLSNYQV KNAKG RNFQI VYTEAEGNDL HANLI IG
强酸性或碱性pH对SEQ ID NO:1的凝集素蛋白也有显著影响。这种极端环境可能会破坏侧链之间形成的盐桥和氢键，导致变性。强碱性的pH可以将质子化的NH3+离子转化为中性的-NH2基团，并通过裂解氨基酸和分子的侧链立即启动水解和降解。即使在浓度小于10％的情况下，这种形式也会影响产品的性质和功效，使其在药学上是不期望的。其中一些形式可能会对受试者产生负面影响，造成伤害和长期不可逆的损害。因此，SEQ ID NO:1的药典级凝集素蛋白是期望的，没有任何其不受欢迎的形式。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在室温或低于室温和/或相对湿度为60％的条件下储存在本发明的密封容器中至少在不少于1个月的时间内，如果在这样的储存时间段后其包括量低于10％、低于7％、低于5％、低于3％或低于2％的相关物质杂质，则是稳定的。特别是相关物质杂质低于2％。
在实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在其保质期期间基本上不含式I的杂质蛋白质。在具体实施方案中，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在其保质期期间包括小于10％、小于7％、小于5％、小于3％或小于2％的式I的杂质蛋白质。在非常具体的实施方案中，SEQ IDNO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在其保质期期间包括小于2％的式I的杂质蛋白质，其中式I单独地或组合地包括式Ia、式Ib、式Ic、式Id或式Ie的蛋白质。
因此，保护SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物免受氧化剂(诸如空气)氧化性化学品或光是必要的。还需要保护蛋白质及其组合物不受更高的温度、湿度和/或极端酸性或碱性条件的影响。为了延长SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物的稳定期和增加其保质期，在制备、储存和处理时，有必要保持温度、湿度、pH值和/或暴露在光波下，使得产品的纯度在整个保质期内一致并且药学上可接受。关键属性(诸如测定、相关物质和HMWP)对于组合物的安全性和有效性是重要的，并且必须在组合物的整个保质期内保持。
在具体实施方案中，本发明提供了一种稳定的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，当该凝集素蛋白在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下储存至少约6个月的时间段时，该凝集素蛋白单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质；其中，凝集素蛋白被储存在阻挡/抵抗波长为约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛。
在具体实施方案中，本发明提供了一种包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白和稳定剂的组合物，其中，组合物在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下储存至少约6个月的时间段时，组合物单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质；其中，组合物存储在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛。
在另一具体实施方案中，本发明提供了一种SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，该组合物在约2℃至约8℃的温度下储存至少约1年的时间段时，单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质；其中，凝集素蛋白存储在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括至少90％v/v的惰性气氛或真空。惰性气体可以选自氦气、氮气、氩气或本领域中已知的任何其他合适的气体。
在另一具体实施方案中，本发明提供了一种包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白和稳定剂的组合物，其中，该组合物在约2℃至约8℃的温度下储存至少约1年的时间段时，单独地或组合地包括小于5％的高分子量杂质或相关物质杂质；其中，组合物存储在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中；并且其中，容器中的顶部空间包括真空或惰性气氛。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种冻干组合物，该包括：
a)一种SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，以及
b)稳定剂，该稳定剂主要包括：氨基酸或其盐、表面活性剂、糖或碳水化合物、或它们的组合，
其中，当组合物放置在阻挡/抵抗波长为约250nm约500nm围内的光波的气密容器并且容器中的顶部空间包括至少90％v/v的惰性气体或真空时，组合物在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下稳定至少约6个月的时间段，
以及其中，在这段时间之后，组合物单独地或组合地表现出小于3％的高分子量杂质或相关物质杂质。
在本发明提供的另一更具体的实施方案中，冻干组合物包括：
a)一种SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，以及
b)稳定剂，该稳定剂主要包括：氨基酸或其盐、表面活性剂、糖或碳水化合物、或它们的组合，
其中，当放置在阻挡/抵抗波长为约250nm约500nm围内的光波的气密容器并且容器中的顶部空间包括至少90％v/v的惰性气体或真空时，组合物在约2℃至约8℃的温度下稳定至少约1年的时间段，
其中，在这段时间之后，组合物单独地或组合地包括小于3％的高分子量杂质或相关物质杂质。
在本发明的最优选的实施方案中，提供了一种稳定的冻干肠胃外组合物，该组合物包括：
a)约0.01％w/v至约2％w/v的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，
b)约0.04％w/v至约0.8％w/v的聚山梨醇酯80，
c)约0.08％w/v至约1.6％w/v的L-精氨酸盐酸盐，
d)约0.09％w/v至约19.2％w/v的蔗糖，以及
e)约0.09％w/v至约20％w/v的甘露醇，
其中，当该组合物放置在阻挡/抵抗波长为约250nm约500nm围内的光波的气密容器并且容器中的顶部空间包括至少90％v/v的惰性气体或真空时，组合物在约20℃至约25℃的温度和约60％的相对湿度下稳定至少约6个月的时间段，
其中，在这段时间之后，组合物单独地或组合地包括小于3％的高分子量杂质或相关物质杂质。在本发明的另一最优选的实施方案中，提供了一种稳定的冻干肠胃外组合物，该组合物包括：
a)约0.01％w/v至约2％w/v的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，
b)约0.04％w/v至约0.8％w/v的聚山梨醇酯80，
c)约0.08％w/v至约1.6％w/v的L-精氨酸盐酸盐，
d)约0.09％w/v至约19.2％w/v的蔗糖，以及
e)约0.09％w/v至约20％w/v的甘露醇，
其中，当组合物放置在阻挡/抵抗波长为约250nm至约500nm范围内的光波的气密容器并且容器中的顶部空间包括至少90％v/v的惰性气体或真空时，组合物在约2℃至约8℃的温度下稳定至少约1年的时间段，
其中，在这段时间之后，组合物单独地或组合地包括小于3％的高分子量杂质或相关物质杂质。
本发明的组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂。这种赋形剂可以包括聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、羟基乙基淀粉(hydroxyl ethyl starch,HETA)或PEG-4000、或它们的组合；以及蛋白质，诸如人血清白蛋白或明胶、或它们的组合。
本发明的组合物还可以可选择地包括防腐剂，诸如苯甲醇、间甲酚、甲基对羟基苯甲酸甲酯、苯酚、或它们的组合；张力调节剂，诸如氯化钠、右旋糖、氯化钾、氯化钙、蔗糖、甘露醇、或它们的组合；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；和/或冷冻保护剂，诸如甘露醇、乙二醇、甘油、蔗糖、海藻糖和/或右旋糖。
应当理解，本文提到的赋形剂的示例是为了清晰易懂和理解本发明，并且不以任何方式限制本发明。
本发明的组合物可以配制为水性液体或固体。在一些实施方案中，组合物可以是液体、混悬剂、粉末、无菌粉末或冻干制剂。冻干制剂可与无菌注射用水(Water forInjection，WFI)和/或任何合适的药学上可接受的稀释剂或其混合物重新组成(重建)，以获得本领域技术人员已知的所需浓度。组合物适用于单剂或多剂。本领域的技术人员知道，剂量的类型取决于各种因素，诸如患者的身高和体重、身体表面积、年龄、性别或一般健康状况，特别是取决于待施用的制剂、施用的持续时间和类型、以及可以平行施用的其他药物。
本发明的组合物可以以合适的剂量施用至个人。施用可在局部、肠内或非肠道进行，例如静脉内、腹腔内、皮下、肌内、局部、鼻内、支气管内或皮内，或经由动脉中一点的导管。在具体实施方案中，本发明的组合物可以非肠道施用。
根据一方面，本发明提供了一种提高SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ IDNO:1的凝集素蛋白的组合物的稳定性的方法，其中，方法包括：将SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物存储在气密容器中，该气密容器阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波，并且容器中的顶部空间为真空或惰性气氛。
根据实施方案，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的稳定性在至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月的时间段内得到改善。凝集素蛋白稳定性的改善意味着蛋白在更长的时间段内保持药学上可接受的等级，其保质期显著增加，并且在这种更长的稳定性期间，杂质形成小于可接受的限度。
根据实施方案，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物的稳定性在至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月的时间段内得到改善。组合物的稳定性的提高意味着组合物在更长的时间段内保持药学上可接受，其保质期显著增加，并且在这种更长的稳定性期间，杂质形成小于不可接受的限度。
SEQ ID NO:1的凝集素蛋白中形成的杂质优选为HMWP或相关物质杂质。在实施方案中，如果在时间段结束时，SEQ ID NO:1的凝集素蛋白单地独或组合地包含不超过5％的HMWP或相关物质杂质，则在这样的时间段内是稳定的。
所述包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物中形成的杂质优选为HMWP或相关物质杂质。在实施方案中，如果在时间段结束时，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物单地独或组合地包含不超过5％的HMWP或相关物质杂质，则在这样的时间段内是稳定的。
在具体实施方案中，通过将包括SEQ ID NO:1或其组合物的气密容器放置在室温和约60％的相对湿度下，可以改善SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其组合物的稳定性至少约6个月的时间段。在更具体的实施方案中，通过将这种气密容器放置在约20℃至约25℃和约60％的相对湿度下，可以改善凝集素蛋白或其组合物的稳定性约6个月。
在另一具体实施方案中，通过将包括SEQ ID NO:1或其组合物的气密容器放置于低于室温下，可以改善SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或其组合物的稳定性至少约12个月的时间段。在更具体的实施方案中，通过将这种密闭容器放置在约2℃至约8℃，可以改善凝集素蛋白或其组合物的稳定性至少约12个月。
本发明的发明人可以通过将SEQ ID NO:1的凝集素蛋白在真空下或在惰性气氛中储存在气密、不透明的容器中显著改善其稳定性。将SEQ ID NO:1暴露于UV光导致形成至多11.74的杂质以及测定从98.61％降低至86.87％。而当储存在用铝箔包裹的不透明容器中时，SEQ ID NO:1暴露于UV光形成至多1.55％的杂质，并且测定仅从98.61％降低至97.06％。类似地，本发明的发明人可以通过将包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在真空或惰性气氛下储存在气密、不透明、琥珀色容器中而显著改善其稳定性。将所述组合物直接暴露于UV光下导致形成至多7.56％的杂质，而在带有标签的小瓶中间接暴露导致形成至多5％的杂质。直接和间接暴露的组合物也示出组合物的测定分别从99％降低至89.9％和93.4％。当储存在琥珀色容器中时，将包括SEQ ID NO:1的组合物暴露于UV光不会形成杂质或降低含量测定。
通过在真空下或在惰性气氛中储存在气密、不透明、琥珀色的容器中，显著地改善了本发明的包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物的长期稳定性。与储存在琥珀色小瓶中的组合物导致形成至多1.48％的总杂质相比，在透明小瓶中在25℃/60％RH下储存6个月的包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物导致形成至多3.60％的总杂质。(与透明小瓶相比，减少2.12％)。
当储存在透明小瓶中时，包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物的测定值在六个月内从100.2％降低至96.7％。然而，储存在抵抗100nm至500nm之间的波长的光的琥珀小瓶中的组合物在6个月的时间段内表现出测定值的极小的变化，从101.1％(初始)到98.6％(6个月)。
类似地，本发明的发明人可以通过将包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物在真空或惰性气氛下储存在气密、不透明的、琥珀色容器中而显著改善其稳定性。对所述组合物进行光稳定性研究，没有标签的透明小瓶中导致形成至多1.69％的杂质以及有标签的透明小瓶中导致形成至多1.09％的杂质。对所述组合物的光稳定性研究在没有标签的琥珀色小瓶中导致形成至多0.20％的杂质，以及在有标签的琥珀色小瓶中导致形成至多0.20％的杂质。
在实施方案中，对SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的光稳定性研究在没有标签的透明小瓶中导致形成至多10.21％的杂质，并且在有标签的透明小瓶中导致形成至多10.91％的杂质。对储存在琥珀色小瓶中的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白进行的所述研究示出0杂质，这表明SEQ ID NO:1的凝集素蛋白及其组合物是光敏的，并且将产品封装在琥珀色小瓶中有助于控制对组合物的安全性和有效性很重要的关键属性，诸如测定、相关物质、HMWP。
在另一实施方案中，本发明提供了一种阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器，该气密容器包括SEQ ID NO:1的凝集素蛋白和顶部空间，其中顶部空间包括真空或惰性气氛。
在另一实施方案中，本发明提供了一种阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器，其中该容器包括具有SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的组合物和顶部空间，其中顶部空间包括真空或惰性气氛。
在另一实施方案中，提供了一种封装SEQ ID NO:1的凝集素蛋白或包括SEQ IDNO:1的凝集素蛋白的药物组合物的方法，其中，该方法包括：
a)将凝集素蛋白或其组合物放置在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中，以及
b)密封容器，使得SEQ ID NO 1的凝集素蛋白或组合物与惰性气氛或真空保持接触。
在实施方案中，包括凝集素蛋白或其组合物的容器是气密容器。气密容器是具有气密密封的容器，不允许空气或气体进出容器。因此，容器中的状态从密封时间、整个存储、处理以及直到打开使用都保持不变。在具体实施方案中，该封装方法包括将凝集素蛋白质或其组合物放置在阻挡/抵抗波长范围为约100nm至约500nm的光波的气密容器中。
在另一实施方案中，气密容器中的凝集素蛋白或其组合物与真空接触。通过本领域技术人员已知的方法对这种容器施加真空；或者将容器中的蛋白质或其组合物在真空或惰性气氛下冷冻干燥并使其免受湿气，其中将作为溶液的凝集素蛋白或其组合物冷冻至低于-20℃持续约20h至40h，然后在约0.05毫巴至0.2毫巴的真空下升华至多60h，并且最后在约0.05毫巴至0.2毫巴的真空下干燥至多20h。
在实施方案中，封装方法还可以包括二级容器，其中将包括SEQ ID NO:1的气密容器放置在二级容器中。二级容器可以是纸、纸板、木材、塑料或光阻挡/抵抗玻璃。更优选地，二级容器可以是纸箱、塑料盒或铝袋。
根据一方面，提供了一种制备稳定的冻干组合物的方法，该组合物包括：
a)一种SEQ ID NO:1的凝集素蛋白，以及
b)稳定剂，该稳定剂主要包括：氨基酸或其盐、表面活性剂、糖或碳水化合物、或它们的组合，
其中，该方法包括在波长大于约500nm的光下配制组合物。
在本发明的实施方案中，提供了一种制备稳定的冻干组合物的方法，其中该方法包括：将SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的缓冲溶液与一种或多种稳定剂的缓冲溶液在波长大于约500nm或大于约589nm的光下或特别是在钠蒸气灯下组合。该工艺在室温下进行。溶液形式的组合物可选择地被冷冻干燥。冷冻干燥可在托盘或本发明的气密容器中进行。
实施例
实施例仅用于演示和说明发明模式。它们不以任何方式限制本发明的范围。
使用HPLC方法对样品进行分析。使用带UV检测器的HPLC***，柱C4，3.5μ，150x4.6mm(制造商：Kromasil或同等)。使用的流动相为：1mL三氟乙酸与1000mL纯净水的混合物，或1mL三氟乙酸与1000mL乙腈的混合物。本领域技术人员非常了解分析蛋白质样本的其他方法、仪器和技术。基于实验的必要性和技术人员的理解，可以改变HPLC方法。本文使用的机械、设备和仪器以及分析方法不以任何方式限制本发明的范围。
用WO/2020/074977公开的工艺制备SEQ ID NO 1的凝集素蛋白。
实施例1重组蛋白制剂
上述制剂通过以下工艺制备，每个步骤在钠蒸汽灯下进行：
a)在WFI中制备了聚山梨醇酯80(10％w/v)的原液。从该原液中取出所需量的聚山梨醇酯80并将其添加到WFI中。
b)在TBS(Tris缓冲盐水)中制备SEQ ID NO.1的蛋白质原液并且将其放入玻璃烧杯中；
c)在22℃-25℃的温度下，将所需量的步骤b)的SEQ ID NO.1的蛋白质溶液添加到所需量的步骤a)的溶液中，并充分混合以获得出现的透明的无色溶液；
d)向步骤c)的溶液中添加所需量的L-精氨酸HCl，并且充分混合以均匀溶解；
e)向步骤d)的溶液中添加所需量的蔗糖，并且充分混合以均匀溶解；
f)向步骤e)的溶液中添加所需量的甘露醇，并且混合以得到透明的无色溶液；
g)使用注射用水(WFI)将批次的体积构成为批次大小的80％；
h)使用0.05N HCl将步骤g)中的溶液的pH调节至7.4-8.5之间(如果步骤g)中的溶液是酸性的，则使用0.05N NaOH将pH调节至7.4至8.5)；
i)将WFI添加至步骤h)中的溶液以构成批次大小，并通过0.2微米聚醚砜(polyether sulphone，PES)过滤器过滤；
j)将批次装入小瓶(气密容器)并经受冷冻干燥。冷冻干燥本身上涉及在一次干燥和二次干燥步骤中应用真空。在二次干燥完成后，在真空下进行小瓶的密封，并且因此，小瓶中的顶部空间包括真空。
k)冻干小瓶在室温或2℃-8℃的温度下保存。
实施例2实施例1的制剂的光稳定性研究
光稳定性研究按照ICH Q1B进行，其中产品被封装在两种类型的容器(透明和琥珀色玻璃小瓶)中，四种不同的规格如下：
1.用铝箔包裹的小瓶作为对照
2.没有标签的小瓶
3.有标签的小瓶
4.二级纸箱(secondary carton)内的有标签的小瓶。
将所有上述包装暴露于提供不小于120万勒克斯小时的总照明和不小于200瓦时/平方米的综合近紫外线能量的光下持续120hrs。120h后用HPLC方法对样品进行分析。所得结果示出于表1和表2。
结论：将组合物直接暴露于UV光下导致形成至多7.56％的杂质，而在带有标签的小瓶中间接暴露导致形成至多5％的杂质。直接和间接暴露的组合物也示出组合物的测定分别从99％降低至89.9％和93.4％。包括SEQ ID NO:1的组合物在储存在琥珀色容器(其抵抗100nm至500nm之间的波长的光)中时暴露于UV光，未形成杂质或示出降低的测定。
实施例3实施例1的制剂的稳定性研究
将实施例1的冻干制剂在25℃±2℃以及相对湿度(RH)为60±5％以及温度为2℃至8℃的条件下，储存在透明小瓶(USPI型的5ml 20mm透明的冻干小瓶，来自Schott)和琥珀小瓶(USPI型的5ml 20mm琥珀色的冻干小瓶，来自Schott)中。6个月后，用HPLC方法对两瓶样品进行分析，以评价其稳定性。
结论：
[参考：图1、图2、图3和图4]
在25℃/60％RH条件下，在透明和琥珀色小瓶中储存6个月的SEQ ID NO:1凝集素蛋白组合物的长期和加速稳定性研究导致分别形成至多为3.60％和1.48％的总杂质。琥珀瓶中的测定值在整个6个月内都是一致的。另一方面，透明小瓶中的测定值在6个月内从100.2％降低至96.7％。琥珀色小瓶中的HMWP比透明小瓶中的HMWP低得多。
实施例4实施例1的制剂的稳定性研究
结论：
[参考：图5、图6、图7和图8]
在长期和加速稳定性研究数据中，在二级纸箱中透明小瓶和带有标签的琥珀色小瓶都保持稳定。SEQ ID NO 1的凝集素蛋白在两种容器中都稳定。关键属性(如测定、相关物质和HMWP)在琥珀色小瓶中比在透明小瓶中更受控，从数据中可以明显看出SEQ ID NO 1的凝集素蛋白及其冻干组合物是光敏的。将产品储存在琥珀色小瓶中有助于防止SEQ ID NO1的凝集素蛋白暴露于光，并改善药品的稳定性。这有助于控制在组合物的安全性和有效性方面很重要的关键属性，如测定、相关物质、HMWP。
实施例5SEQ ID NO 1的凝集素蛋白的强制降解研究
实施例5a：光降解：
用包括Tris 25mM pH 8.0缓冲液的稀释液稀释的SEQ ID NO 1的凝集素蛋白在25±2℃下，暴露于120万勒克斯小时的白光和200瓦时/平方米的近紫外线能量持续120h。在另一实验中，在暴露前样品用铝箔包裹。作为对照，样品在没有暴露于光的情况下进行了分析。暴露120h后对样品的分析得出以下结果：
结论：将SEQ ID NO:1暴露于UV光导致形成至多11.74的杂质以及测定从98.61％降低至86.87％。而当储存在用铝箔包裹的不透明容器中时，SEQ ID NO:1暴露于UV光形成至多1.55％的杂质，并且测定仅从98.61％降低至97.06％。
具有约12％的Met-凝集素变体的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白暴露于120万勒克斯小时的白光和200瓦时/平方米的近紫外线能量持续120h，蛋白质降解11.74％，暗示引发剂甲硫氨酸的光催化氧化。
实施例5b.氧化降解：
向400μL包含10mg/mL SEQ ID NO:1的稀释液的样品溶液中添加800μL 3％的过氧化氢溶液，该稀释液包括tris 25mM pH 8.0缓冲液。样品在室温下温育10min，用30.1mg甲硫氨酸在800μL稀释剂中的溶液进行中和。用于分析的对照溶液包含400μL的样品溶液，包含10mg/mL的SEQ ID NO:1和1600μL的稀释液。对比对照的结果如下：
结论：
使用3％的过氧化氢在室温下使SEQ ID NO:1的凝集素蛋白经受氧化约10min，与对照相比，该蛋白降解超过14％，暗示在SEQ ID NO:1的44和89位置的甲硫氨酸部分氧化。
实施例6：药物物质和药品的光稳定性研究
对封装在透明、耐光的琥珀色玻璃小瓶的药物物质和药品进行了光稳定性研究。
结论：储存在无标签的透明小瓶中的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的光稳定性研究形成至多10.21％的杂质，以及储存在有标签的透明小瓶中形成至多10.91％的杂质。储存在耐光的琥珀色小瓶中的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白的光稳定性研究形成0％的杂质，无论有没有标签。
结论：对没有标签的透明小瓶中的组合物的光稳定性研究形成至多1.69％的杂质，以及在有标签的小瓶形成至多1.09％的杂质。对没有标签的耐光琥珀色小瓶中的所述组合物的光稳定性研究形成至多0.20％的杂质，以及在有标签的小瓶中形成至多0.20％的杂质，这表明SEQ ID NO:1的凝集素蛋白对光敏感，并且将产品储存在耐光的琥珀色小瓶中有助于控制在组合物的安全性和有效性方面很重要的关键属性，诸如含量测定、相关物质、HMWP。

Claims (13)

1.一种包括药物组合物的耐光容器，其中，所述药物组合物包括凝集素蛋白和稳定剂。
2.根据权利要求1所述的容器，其中，所述容器抵抗波长在100nm至500nm之间的光波。
3.根据权利要求1所述的容器，其中，所述容器的顶部空间包括惰性气氛或真空。
4.根据权利要求1所述的容器，其中，所述容器选自小瓶、注射器、药筒、安瓿。
5.根据权利要求1所述的容器，其中，当所述组合物在20℃-25℃的温度范围内和60％相对湿度下储存6个月的时间段时，所述组合物单独或组合表现出小于5％的高分子量杂质或相对物质杂质。
6.根据权利要求1所述的容器，其中，当所述组合物在2℃-8℃下储存1年的时间段时，所述组合物单独或组合显示小于5％的高分子量杂质或相对物质杂质。
7.根据权利要求1所述的容器，其中，
a.所述药物组合物包括凝集素蛋白和稳定剂；
b.所述容器抵抗波长在100nm至500nm之间的光波，所述容器的所述顶部空间为惰性气氛或真空；
c.所述容器选自小瓶、注射器、药筒、安瓿；
d.以及当所述组合物储存6个月的时间段时，所述组合物单独或组合表现出小于5％的高分子量杂质或相对物质杂质。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述凝集素蛋白为SEQ ID NO.1的重组凝集素蛋白。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述稳定剂包括：氨基酸或其盐；表面活性剂；糖或碳水化合物；或它们的组合。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括
a.0.01％w/v至2％w/v的SEQ ID NO:1的凝集素蛋白；
b.0.04％w/v至0.8％w/v的聚山梨醇酯80；
c.0.08％w/v至1.6％w/v的L精氨酸盐酸盐，
d.0.09％w/v至19.2％w/v的蔗糖，以及
e.0.09％w/v至20％w/v的甘露醇。
11.一种用于稳定凝集素蛋白质组合物的方法，所述方法包括将包括凝集素蛋白质和稳定剂的组合物引入容器中，其中，所述容器抵抗波长在100nm至500nm之间的光波；并且所述容器的顶部空间包括惰性气氛或真空。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，
a.所述凝集素蛋白为SEQ ID NO 1的重组凝集素蛋白。
b.所述稳定剂包括：氨基酸或其盐；表面活性剂；糖或碳水化合物；或它们的组合。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，当所述组合物储存6个月的时间段时，所述组合物单独或组合表现出小于5％的高分子量杂质或相对物质杂质。
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