CN117660286A - 重组乳酸乳球菌、制剂、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于重组微生物技术领域，具体涉及一种重组乳酸乳球菌、制剂、构建方法及其应用。本发明通过以益生菌乳酸球菌(乳酸乳球菌NZ9000)为载体，利用双酶切NcoI和XbaI双酶切位点可以形成具有特殊功能的重组菌(LL‑miR‑146b)，可通过口服给药或灌肠的方式定植于肠道，一方面可通过改变肠道菌群；另一方面可通过分泌miR‑146b抑制肠道M1型巨噬细胞分化，从而抑制肠道炎症并促进肠道粘膜上皮修复，从而应用于包括炎症性肠病在内的多种肠道炎症，达到促进肠炎修复的目的。
Description
技术领域
本发明属于重组微生物技术领域，具体涉及一种重组乳酸乳球菌、制剂、构建方法及其应用。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一种终生的反复发作的肠道慢性炎症。它是一种病因不明的复杂的多因素所致疾病。研究认为肠道菌群失调与宿主肠道粘膜免疫***异常的相互作用能导致过度的免疫激活和持续的慢性炎症。
目前研究证实miR-146b(miRNA 146b)可通过重塑肠道巨噬细胞进而抑制肠道炎症。在此基础上，本发明进一步提出设想，以益生菌为载体构建携带分泌miR-146b的重组菌LL-miR-146b，从而不仅可重塑肠道菌群，还可抑制M1巨噬细胞分化以及炎症因子分泌。
发明内容
本发明提供了一种重组乳酸乳球菌、制剂、构建方法及其应用，通过构建重组菌LL-miR-146b不仅可以通过乳酸球菌重塑肠道菌群，发挥益生菌的作用。
一种重组乳酸乳球菌，所述重组乳酸乳球菌为转化了带有pre-miR-146b质粒的重组乳酸乳球菌；
所述pre-miR-146b的基因序列如SEQ ID No.1所示。
特别的，所述重组乳酸乳球菌的载体为pNZ-8148。
所述重组乳酸乳球菌的原始乳酸乳球菌为乳酸乳球菌NZ9000。
前述重组乳酸乳球菌的构件方法，包括以下步骤：
(1)将构建的USP45-pre-miR-146b cDNA和pNZ-8148载体进行Ncol和XbaI双酶切；回收目的条带、连接，转化至MC1061大肠杆菌中，筛选阳性克隆子，提取质粒；
(2)制备乳酸乳球菌NZ9000感受态，用电穿孔方法将pNZ-pre-miR-146b转入NZ9000，构建表达miR-146b的重组乳酸乳球菌LL-miR-146b。
前述重组乳酸乳球菌在制备治疗或改善肠道炎症的药品中的应用。
一种制剂，包含前述的重组乳酸乳球菌。
本发明的有益效果：
本发明通过以益生菌乳酸球菌(乳酸乳球菌NZ9000)为载体，利用双酶切NcoI和XbaI双酶切位点可以形成具有特殊功能的重组菌(LL-miR-146b)，可通过口服给药或灌肠的方式定植于肠道，一方面可通过改变肠道菌群；另一方面可通过分泌miR-146b抑制肠道M1型巨噬细胞分化，从而抑制肠道炎症并促进肠道粘膜上皮修复，从而应用于包括炎症性肠病在内的多种肠道炎症，达到促进肠炎修复的目的。
本发明通过成功构建重组菌LL-miR-146b不仅可以通过乳酸球菌重塑肠道菌群，发挥益生菌的作用；另一方面重组菌LL-miR-146b可自身分泌miR-146b，增加肠道内miR-146b的浓度，从而抑制M1型巨噬细胞的活化，从多方面达到改善肠道炎症的目的。同时以乳酸球菌为载体，可以形成具有特殊功能的重组菌，其具有良好的生物相容性、生物可降解性，对人体无毒害，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1：A：载体构建模式图；B-C：miR-146b***位点；D：PCR证实成功构建LL-miR-146b和对照菌LL-Scramble；E：qPCR证实LL-miR-146b表达miR-146b。
图2：一代测序证实成功构建LL-miR-146b。
图3：一代测序证实成功构建对照菌LL-Scramble。
图4：A：电镜检测提取的外泌体；B：Western blot检测外泌体标志物ALIX、CD9和CD63表达；C：马尔文激光粒度仪检测外泌体粒径约100-500nm；D：用qPCR的方法检测EV中的miR-146b表达。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，其中实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，不构成对本发明保护范围的限制。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所使用原料来源：
乳酸乳球菌NZ9000(VS-ELS09000-01)购自德国MoBiTec公司。
大肠杆菌MC1061(VS-ELS10610-01)购自德国MoBiTec公司。
pNZ-8148载体为质粒载体，购自德国MoBiTec公司。
pre-miR-146b cDNA，购自德国MoBiTec公司。
Scramble cDNA，购自德国MoBiTec公司。
本发明中：
Nisin是指乳酸链球菌素。
PBS是指PBS缓冲液。
Trizol是指总RNA抽提试剂。
pre-miR-146b的基因序列如SEQ ID No.1所示。
Scramble的基因序列如SEQ ID No.2所示。
构建重组菌的构建
(1)构建重组菌LL-miR-146b：将构建的pre-miR-146b cDNA以及对照ScramblecDNA分别和pNZ-8148载体进行Ncol和XbaI双酶切，电泳回收相应的目的条带、连接，转化至MC1061大肠杆菌中，筛选阳性克隆子，提取质粒送测序验证；
制备乳酸乳球菌NZ9000感受态，用电穿孔方法将pNZ-pre-miR-146b和pNZ-Scramble转入NZ9000，构建表达miR-146b的重组乳酸乳球菌LL-miR-146b和对照菌LL-Scramble，采用PCR方法对阳性克隆子进行筛选及提质粒双酶切验证筛选阳性菌株(如附图1、附图2、附图3所示)；
(2)检测重组菌LL-miR-146b中miR-146b的表达：在30℃条件培养箱中，待LL-miR-146b和LL-Scramble生长至光密度(OD)为0.4左右，用Nisin(10ng/ml)处理两种菌4小时，离心去上清(8000rpm，10min)，用PBS洗涤两次，用溶菌酶(25mg/ml)37℃裂解LL-miR-146b和LL-Scramble 30min，再用Trizol提取细菌RNA进行qPCR验证miR-146b表达，以验证miR-146b在LL-miR-146b中的表达；
(3)收集两种菌上清中的EV:同上用nisin处理LL-miR-146b和LL-Scramble4小时，离心去除细菌沉淀(8000rpm，10min)，细菌培养基首先用0.45um的真空滤器进行第一次过滤，再用Quix Stand Benchtop System进行浓缩，浓缩过后的液体再用0.22um的真空滤器进行第二次过滤，最后将获得的液体进行超高速离心(150000g/min)，所收集的产物进行下一步的EV特征检测；
(4)EV鉴定以及miR-146b在EV中的表达：马尔文激光粒度仪和电镜检测EV形态和直径，用qPCR的方法检测EV中的miR-146b表达。
如图4中可知，A部分为电镜检测提取的外泌体，B部分为Western blot检测外泌体标志物ALIX、CD9和CD63表达；C部分为马尔文激光粒度仪检测外泌体粒径约100-500nm；D部分为用qPCR的方法检测EV中的miR-146b表达；可以得出结论：重组菌LL-miR-146b可分泌大量的miR-146b。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌为转化了带有pre-miR-146b质粒的重组乳酸乳球菌；
所述pre-miR-146b的基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌的载体为pNZ-8148。
3.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌的原始乳酸乳球菌为乳酸乳球菌NZ9000。
4.权利要求1-3任意一种重组乳酸乳球菌的构件方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将构建的USP45-pre-miR-146b cDNA和pNZ-8148载体进行Ncol和XbaI双酶切；回收目的条带、连接，转化至MC1061大肠杆菌中，筛选阳性克隆子，提取质粒；
(2)制备乳酸乳球菌NZ9000感受态，用电穿孔方法将pNZ-pre-miR-146b转入NZ9000，构建表达miR-146b的重组乳酸乳球菌LL-miR-146b。
5.权利要求1-3任一所述的重组乳酸乳球菌在制备治疗或改善肠道炎症的药品中的应用。
6.一种制剂，其特征在于，含有权利要求1-3任一所述的重组乳酸乳球菌。
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| 胡晶晶;李开学;刘若丹;熊鹰;: "微小RNA146b通过靶向调节干扰素调节因子5控制M1型巨噬细胞极化", 中国实验诊断学, no. 06, 25 June 2017 (2017-06-25), pages 1076 - 1082 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117660286B (zh) | 2024-05-10 |
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