CN117660268B - 一种提高海洋微生物代谢活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高海洋微生物代谢活性的方法，具体涉及通过提高海洋假交替单胞菌代谢活性生产抗腐蚀细菌液的方法、海洋抗腐蚀细菌液及其应用，属于海洋微生物防腐技术领域。通过对菌种培养条件的优化，先后使用活化培养、刺激培养和与乳酸菌共育培养的方式最大限度促进微生物中活性成分的快速分泌代谢，尤其是促进胞外多糖的大量分泌，形成的代谢物丰富的细菌培养液，在金属材料表面形成均匀致密的生物膜，能够在金属表面形成保护性屏障，从而有效抑制金属材料的海洋腐蚀。本发明处理方式简单，对金属类型无限制，生产制备成本低且对环境友好，能够为装备材料抗海洋环境腐蚀提供一种简单高效、绿色环保的新方法。
Description
技术领域
本申请涉及海洋防腐技术领域，具体涉及一种通过提高海洋假交替单胞菌代谢活性生产抗腐蚀细菌液的方法。
背景技术
海洋腐蚀是海洋工程面临的重大难题，海洋环境的腐蚀不仅会造成大量经济损失，还会引起严重的人员安全，因此，海洋腐蚀成为我国海洋经济发展中必须要解决的关键问题。海洋腐蚀包括电化学腐蚀和生物腐蚀，参与微生物腐蚀的海洋中的真菌、藻类以及细菌等。
微生物腐蚀是指金属或非金属表面因微生物的生命活动而受到的腐蚀破坏。海洋环境中的微生物种类较多，根据细菌种类和代谢特点，可以将腐蚀性细菌分为硫酸盐还原菌、铁氧化还原菌与产粘液菌，其中硫酸盐还原菌被认为是最主要的腐蚀菌种。此外还包括诸多能够抑制腐蚀的微生物，其中包括大肠杆菌、芽孢杆菌、假交替单胞菌等。抑制海洋腐蚀的机理可能在于海洋微生物分泌抗生素类物质，抑制腐蚀性有害细菌的生长和繁殖，间接达到抑制金属腐蚀的作用；或者是细菌在海洋环境中，形成生物膜，当金属材料表面形成均匀的生物膜时，能够阻隔氧气和腐蚀性介质与金属（低合金钢、不锈钢、碳钢、铜、铝等物质）接触，从而抑制海水中的微生物腐蚀金属。研究证实，海洋细菌形成的生物膜中主要成分为细菌分泌的胞外多糖和蛋白纤维等成分，上述成分抑制金属腐蚀的主要机理在于胞外多糖能够吸附在金属表面，降低了氧还原，同时胞外多糖中的部分基团能够结合在金属表面，隔绝了腐蚀因子，因此，细菌分泌的胞外多糖是提高海洋微生物腐蚀的重要成分。
海洋假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于各个海域中，在近海环境、深远海和极地环境中均有分布。假交替单胞菌能够大量分泌如胞外多糖生物活性物质，能在金属表面形成生物被膜，在海洋微生物尤其是海洋防腐领域占据重要位置，得到科研工作者的广泛关注。且该属的不同种细菌菌株在遗传种系和生物特性等方面极为相似，大部分代谢产物和代谢片段完全一致，从该属菌种研究有助于寻找抑制微生物腐蚀的通用手段。
海洋解脂假交替单胞菌（Pseudoalteromonas lipolytica）是一种分离自是海水沉积物中的有机污染物降解菌，代谢过程中能够产胞外多糖（Exopoly Saccharides），对于该菌种的抗腐蚀研究不够深入，尤其是在对于代谢活性与细菌海洋腐蚀性能研究不足。
因此，目前现有技术尚未报道如何提高海洋微生物代谢活性，具体通过提高海洋微生物尤其是海洋假交替单胞菌代谢活性，促进胞外多糖的有效分泌提高生物膜的防腐性能。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种提高海洋微生物代谢活性的方法，具体通过提高海洋假交替单胞菌代谢活性生产抗腐蚀细菌液，通过对菌种培养条件的优化，先后使用活化培养、刺激培养和与乳酸菌共育培养的方式最大限度促进微生物中活性成分的快速分泌代谢，尤其是促进胞外多糖的大量分泌，形成代谢物丰富的细菌培养液，能够在金属材料表面形成均匀致密的生物膜，从而有效抑制金属材料的海洋腐蚀。
一方面，本发明提供一种提高海洋微生物代谢活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）基础培养基活化培养：将海洋假交替单胞菌接种至斜面培养基上在25-35℃下活化培养；接着将斜面培养基菌种转接至液体培养基中进行摇瓶培养，培养温度为25-35℃，转速120-180rpm，培养时间24h-48h，得活化培养液；摇瓶培养添加液体培养基总量0.3-0.5%的甘氨酸；
2）发酵培养基刺激培养：将活化培养液按照4-6%的接种量转接至2216E发酵培养基中，在25-35℃、120-180 rpm下刺激培养48-72h得到发酵培养液；
所述刺激培养的过程中分批添加刺激剂，其中培养开始0-12h，向发酵培养基中加入0.5-1.0%的壳聚糖适应性发酵；培养进行到24h-36h时，向发酵培养基中继续添加刺激剂，所述刺激剂的组成和配比为：壳聚糖：酪蛋白的质量比为2:3，添加量为1.5%-2.0%；
3）植物乳杆菌共育培养：将活化培养后的植物乳杆菌P8以5-8%的添加量加入到步骤2）的发酵培养液中共育培养，其中植物乳杆菌活菌数大于1×109 CFU/ml，共育培养时间为24h，温度30-35℃，每隔6h搅拌20S，即得代谢活性提高的抗腐蚀细菌液。
甘氨酸又名氨基乙酸，是一种结构最简单的氨基酸，人体非必需的一种氨基酸。在微生物培养基中添加甘氨酸，氨基酸中的氨基可以为菌种生长提供生长所需氮源，而且氨基酸在生物体内产生葡萄糖可以作为多糖产生的前体，同时假单胞菌属的微生物能够产生转化生成甘氨酸，二者相互促进转化代谢。
壳聚糖属于一种天然多糖类物质，应用于微生物培养基中可以作为生物骨架材料，提供细胞间的交流以及细胞黏附的交互作用，起到均匀分布和稳定细胞，降低细胞病毒感染风险的作用；在培养生长过程中促进微生物细胞的生长、增殖和分化，促成代谢产物的快速分泌。
酪蛋白是一种含磷钙的结合蛋白，作为一种蛋白质，能够为微生物生长提供氮源和碳源，满足微生物生长转化需要。在海洋假交替单胞菌生长中添加酪蛋白与壳聚糖配合具有突出的促代谢效果。
植物乳杆菌P8为现有技术研究深入的乳酸菌菌株，已做了***的评价和研究，具有优异的带代谢产胞外多糖的能力，并且研究证实该菌株具有优异的耐受胃酸、肠液和胆盐的能力，在中性偏甚至碱性环境下具有较高的存活率。
作为优选的方案，所述海洋假交替单胞菌为解脂假交替单胞菌（Pseudoalteromonas lipolytica）。
步骤1）中斜面培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，琼脂20.0g，人工海水1000ml，调pH至7.4～7.8。
步骤1）中液体培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，人工海水1000ml，调pH至7.4～7.8。
步骤2）中2216E发酵培养基的具体组成为蛋白胨5.0g，酵母粉1.0 g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45 g，氯化镁5.98 g，硫酸钠3.24 g，氯化钙1.8 g，氯化钾0.55 g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08 g，氯化锶0.034 g，硼酸0.022 g，硅酸钠0.004 g，氟化钠0.0024 g，硝酸铵0.0016 g，磷酸氢二钠0.008 g，蒸馏水1000ml，调pH值至7.4～7.8。
步骤3）中植物乳杆菌活化培养的方式为将植物乳杆菌P8菌粉经MRS培养基，在32℃～38℃下培养12～24h制备得到。
另一方面，本发明还提供了一种通过提高海洋假交替单胞菌代谢活性生产抗腐蚀细菌液的方法制备得到的海洋抗腐蚀细菌液。
作为优选的方案，细菌液中胞外多糖的含量为14-17g/L。
第三方面，本发明还提供了一种海洋抗腐蚀细菌液在抑制海洋环境中金属腐蚀中的应用。
海洋环境中的金属包括碳钢、低合金钢、不锈钢、铝合金中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明采用的上述至少一个技术方案能够达到的有益效果至少包括：
（1）胞外多糖是菌体生长过程中分泌到细胞壁外的天然高分子化合物，能够促进形成细菌生物膜，提升抗海洋环境腐蚀性能。本发明在研究中基于海洋假交替单胞菌代谢的特点，从基础培养、发酵培养再到后续的共育培养提高菌株优化培养发酵条件，所得细菌液产品具有优异的胞外多糖含量，代谢产品中形成的菌膜致密，应用于海洋环境金属腐蚀效果突出。
（2）海洋菌株生长代谢过程中，碳源和氮源是培养基中最基础的营养物质，能够促进微生物代谢，例如碳源或氮源浓度过高或过低都不利于多糖的生长和积累，传统促进代谢活性的研究中多集中在对于培养条件的优化改进，本发明进行创新和改进，在活化培养阶段添加甘氨酸，作为多糖合成前体物质，促进生物体内多糖转化，发酵培养阶段，分批添加刺激剂，促进多糖持续积累释放；发酵培养开始阶段，壳聚糖的少量添加使得菌株快速适应，提高菌株代谢活性，后期壳聚糖与酪蛋白配伍使用，在持续补充碳源和氮源的同时，刺激代谢物质尤其是胞外多糖的加速分泌，快速积累。乳酸菌与产胞外多糖的菌种共育时，由于氧气在解脂假交替单胞菌生长过程中得到消耗，利于厌氧的乳酸菌进一步在该环境中分泌多糖，两种菌相互作用，共同形成了致密的抗腐蚀生物膜，实验研究证实生物膜的抗腐蚀性能得到显著提升。
（3）经过实验研究证实，本发明所采用的方案所得细菌分泌物中代谢产物丰富，胞外多糖含量最高可达16.7 g/L，高于对照组；菌膜致密性较强，厚度最高可达86.3μm，且通过模拟海洋防腐研究发现，在海水环境中最高缓蚀率高达98.1%，腐蚀速率较低，最低仅为9.5μm/Y，低于对照组，且显著优于对比例各组。因此，本发明所述方法制备得到的海洋防腐细菌液能够应用于海洋防腐蚀方面，且效果显著。
（4）本发明所制备得到的海洋抗腐蚀细菌液能够应用于海洋环境中金属的抗腐蚀领域，处理方式简单，对金属类型无限制，生产制备成本低且对环境友好，能够为海洋环境抗腐蚀提供一种简单高效、绿色环保的新方法。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所使用的解脂假交替单胞菌（Pseudoalteromonas lipolytica）采购自上海保藏生物技术中心, 菌种编号:SHBCC D80739（SCSIO04301）。
植物乳杆菌P8，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，该菌种保藏编号为CGMCCNo.6312。
本发明实施例中海洋假交替单胞菌培养时所使用的斜面培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，琼脂20.0g，人工海水1000ml，调pH至7.4～7.8。
液体培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，人工海水1000ml，调pH至7.4～7.8。
2216E发酵培养基的具体组成为蛋白胨5.0g，酵母粉1.0 g，柠檬酸铁0.1 g，氯化钠19.45 g，氯化镁5.98 g，硫酸钠3.24 g，氯化钙1.8 g，氯化钾0.55 g，碳酸钠0.16 g，溴化钾0.08 g，氯化锶0.034 g，硼酸0.022 g，硅酸钠0.004 g，氟化钠0.0024 g，硝酸铵0.0016 g，磷酸氢二钠0.008 g，蒸馏水1000ml，调pH值至7.4～7.8。
实施例1
一种提高海洋微生物代谢活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）基础培养基活化培养：将解脂假交替单胞菌（Pseudoalteromonas lipolytica）接种至斜面培养基上在32℃下活化培养；接着将斜面培养基菌种转接至液体培养基中进行摇瓶培养，培养温度为32℃，转速150rpm，培养时间36h，得活化培养液；摇瓶培养添加液体培养基总量0.4%的甘氨酸；
2）发酵培养基刺激培养：将活化培养液按照5%的接种量转接至2216E发酵培养基中，在32℃、150 rpm下刺激培养60h得到发酵培养液；
所述刺激培养的过程中分批添加刺激剂，其中培养开始6h，向发酵培养基中加入0.7%的壳聚糖适应性发酵；培养进行到30h时，向发酵培养基中继续添加刺激剂，所述刺激剂的组成和配比为壳聚糖：酪蛋白的质量比为2:3，添加量为1.7%；
3）植物乳杆菌共育培养：将植物乳杆菌P8菌粉经MRS培养基，在36℃下培养18h制备得到活化培养后的植物乳杆菌，活化培养后的植物乳杆菌P8以6%的添加量加入到步骤2）的发酵培养液中共育培养，其中植物乳杆菌活菌数大于1×109 CFU/ml，共育培养时间为24h，温度32℃，每隔6h搅拌20S，即得代谢活性提高的抗腐蚀细菌液。
实施例2
一种提高海洋微生物代谢活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）基础培养基活化培养：将解脂假交替单胞菌（Pseudoalteromonas lipolytica）接种至斜面培养基上在25℃下活化培养；接着将斜面培养基菌种转接至液体培养基中进行摇瓶培养，培养温度为25℃，转速120rpm，培养时间24h，得活化培养液；摇瓶培养添加液体培养基总量0.3%的甘氨酸；
2）发酵培养基刺激培养：将活化培养液按照4%的接种量转接至2216E发酵培养基中，在25℃、120 rpm下刺激培养48h得到发酵培养液；
所述刺激培养的过程中分批添加刺激剂，其中培养开始0h，向发酵培养基中加入0.5%的壳聚糖适应性发酵；培养进行到24hh时，向发酵培养基中继续添加刺激剂，所述刺激剂的组成和配比为壳聚糖：酪蛋白的质量比为2:3，添加量为1.5%；
3）植物乳杆菌共育培养：将植物乳杆菌P8菌粉经MRS培养基，在32℃下培养12h制备得到活化培养后的植物乳杆菌，将活化培养后的植物乳杆菌P8以5%的添加量加入到步骤2）的发酵培养液中共育培养，其中植物乳杆菌活菌数大于1×109 CFU/ml，共育培养时间为24h，温度30℃，每隔6h搅拌20S，即得代谢活性提高的抗腐蚀细菌液。
实施例3
一种提高海洋微生物代谢活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）基础培养基活化培养：将解脂假交替单胞菌（Pseudoalteromonas lipolytica）接种至斜面培养基上在35℃下活化培养；接着将斜面培养基菌种转接至液体培养基中进行摇瓶培养，培养温度为35℃，转速180rpm，培养时间48h，得活化培养液；摇瓶培养添加液体培养基总量0.5%的甘氨酸；
2）发酵培养基刺激培养：将活化培养液按照6%的接种量转接至2216E发酵培养基中，在35℃、180 rpm下刺激培养72h得到发酵培养液；
所述刺激培养的过程中分批添加刺激剂，其中培养开始12h，向发酵培养基中加入1.0%的壳聚糖适应性发酵；培养进行到36h时，向发酵培养基中继续添加刺激剂，所述刺激剂的组成和配比为壳聚糖：酪蛋白的质量比为2:3，添加量为2.0%；
3）植物乳杆菌共育培养：将植物乳杆菌P8菌粉经MRS培养基，在38℃下培养24h制备得到活化培养后的植物乳杆菌，将活化培养后的植物乳杆菌P8以8%的添加量加入到步骤2）的发酵培养液中共育培养，其中植物乳杆菌活菌数大于1×109 CFU/ml，共育培养时间为24h，温度35℃，每隔6h搅拌20S，即得代谢活性提高的抗腐蚀细菌液。
对比例1-甘氨酸
与实施例1的区别在于在活化培养阶段不在液体培养基中添加总量0.4%的甘氨酸，其余同实施例1。
对比例2-刺激培养阶段刺激剂的添加
与实施例1的区别在于刺激培养阶段不添加壳聚糖和酪蛋白，其余同实施例1。
对比例3-刺激培养阶段添加时机
与实施例1的区别在于刺激培养阶段在培养开始6h不添加壳聚糖，一次性在培养进行到30h时与后续的壳聚糖和酪蛋白一起添加，添加总量为2.4%，其余同实施例1。
对比例4-刺激培养阶段不添加酪蛋白
与实施例1的区别在于刺激培养阶段，刺激剂中不添加酪蛋白，在30h时只添加1.7%的壳聚糖，其余同实施例1。
对比例5-刺激培养二批次添加时不添加壳聚糖
与实施例1的区别在于刺激培养阶段，刺激剂中不添加壳聚糖，在30h时只添加1.7%的酪蛋白，其余同实施例1。
对比例6-刺激培养时刺激剂的比例
与实施例1的区别在于刺激培养阶段，刺激剂的配比调整为壳聚糖：酪蛋白的质量比为1:1，其余同实施例1。
对比例7-不进行温育培养
与实施例1的区别在于不包括步骤3）植物乳杆菌温育培养步骤，其余同实施例1。
实验例1-胞外多糖产率测定
采用苯酚-硫酸显色法测定多糖含量。测试结果见表1。
表1 不同实验组胞外多糖产率测定结果
| 实验组别 | 胞外多糖含量/（g/L） |
| 实施例1 | 16.7±0.1 |
| 实施例2 | 14.8±0.5 |
| 实施例3 | 15.2±0.4 |
| 对比例1 | 13.1±0.2 |
| 对比例2 | 9.8±0.6 |
| 对比例3 | 13.8±0.7 |
| 对比例4 | 12.5±1.2 |
| 对比例5 | 11.7±0.8 |
| 对比例6 | 14.2±0.7 |
| 对比例7 | 10.4±0.3 |
通过实施例和不同条件下的对比例对比研究可知，在本发明制备步骤和方法参数条件下，所得细菌液中产物中胞外多糖含量丰富，实施例1胞外多糖最高含量高达16.7 g/L，胞外多糖产率得到极大提升。对比例1在未添加多糖形成前体时产率仅为13.1 g/L，未进行刺激培养的对比例2产率最低，其次为不进行植物乳杆菌共育培养的对比例7，含量为10.4 g/L；在刺激培养阶段刺激剂的添加与否、添加时机、刺激剂组成和配比的改变均会极大影响防腐抗菌核心物质胞外多糖的形成，能够证实本发明的方法和参数能够加快海洋假交替单胞菌代谢活性，提高细菌胞外多糖的分泌代谢，为海洋环境中金属的防腐蚀提供了支撑。
实验例2-细菌生物膜测定研究
向培养基所用海水中分别加入实施例和对比例的细菌液，添加量为每1L海水中加入细菌液50mL，将所得含有细菌液的海水放入生物膜形成测定的反应器中进行反映，反应36h测量生物膜的厚度，每个实验组平行测定3次，不同实施例和对比例的测定结果如表2所示。
表2 不同实验组细菌生物膜厚度测定结果
| 实验组别 | 生物膜厚度/（μm） |
| 实施例1 | 86.2±3.5 |
| 实施例2 | 86.3±5.2 |
| 实施例3 | 78.5±3.4 |
| 对比例1 | 72.1±2.9 |
| 对比例2 | 43.5±4.1 |
| 对比例3 | 63.7±3.3 |
| 对比例4 | 66.8±4.8 |
| 对比例5 | 52.7±1.2 |
| 对比例6 | 77.1±4.4 |
| 对比例7 | 45.6±3.5 |
在细菌生物膜厚度的研究过程中，通过实施例和不同条件下的对比例对比研究可知，在本发明制备步骤和方法参数条件下，所得细菌液在生物膜形成方面具有较好的效果。实施例各组中生物膜厚度普遍高于对比例，其中实施例1和实施例2生物膜厚度较高，最高可达86.3μm，与其它对比例各组相比显著提升。在培养方式改变，操作处理条件变化的情况下，生物膜厚度降低，对比例2和对比例7生物膜厚度不佳，仅为43.5μm，因此，通过对生物膜厚度的测量对比研究，能够证实本发明实施例条件下的方法和参数能够加快海洋假交替单胞菌代谢活性，提高胞外多糖代谢的同时促使形成较为致密的生物膜，有助于海洋防腐蚀效果发挥。
实验例3-海洋腐蚀性实验研究
选用低合金钢为金属材料，将其经过切割、打磨、清洗和灭菌等预处理。以实施例和对比例所得细菌液为材料，实验组和对照组均选择将金属样品置于盛装有无菌海水的三角瓶中，实验组中分别加入不同组细菌液，对照组中不添加任何成分，确保含菌海水中活菌浓度大于4000CFU/mL，各组置于相同条件下摇床培养。
分别从实验组和对照组中，取出经过21d处理的样品，采用交流阻抗评估样品腐蚀速率，腐蚀电阻通过交流阻抗测量得到，缓蚀率可以表征缓蚀效果。测定结果见表3。
表3 不同实验组腐蚀电阻、缓蚀率和腐蚀速率比较
| 实验组别 | 腐蚀电阻（Ω·cm2） | 缓蚀率（%） | 腐蚀速率（μm/Y） |
| 对照组 | 1600 | 51.3% | 35.2±1.5 |
| 实施例1 | 39100 | 98.1% | 9.5±1.1 |
| 实施例2 | 32600 | 97.6% | 10.7±1.5 |
| 实施例3 | 35100 | 97.8% | 10.1±1.2 |
| 对比例1 | 13400 | 94.2% | 13.5±0.9 |
| 对比例2 | 8500 | 90.8% | 15.3±1.4 |
| 对比例3 | 26900 | 97.1% | 11.2±1.3 |
| 对比例4 | 25300 | 96.9% | 12.8±1.5 |
| 对比例5 | 17800 | 95.6% | 13.6±0.7 |
| 对比例6 | 23600 | 96.7% | 11.9±0.8 |
| 对比例7 | 9500 | 91.8% | 17.5±1.6 |
表3的结果显示了不同组别的抗腐蚀性能相关指标，本发明实施例各组在抗腐蚀方面效果显著由于对照组，添加细菌液的防腐蚀性能较佳。实施例由于对比例，从实验数据反映，对照组的缓蚀率较好，腐蚀速率在不同操作条件下不同，本发明实施例1中最高缓蚀率高达98.1%，腐蚀速率较低，腐蚀率交流阻抗评估值最低仅为9.5μm/Y，低于对照组，且显著优于对比例各组。结果证实，本发明所述方法制备得到的海洋防腐细菌液能够应用于海洋防腐蚀方面，且效果显著。
本说明书中，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例侧重说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于后面说明的实施例而言，描述比较简单，相关之处参见前述实施例的部分说明即可。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种提高海洋微生物代谢活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）基础培养基活化培养：将海洋假交替单胞菌接种至斜面培养基上在25-35℃下活化培养；接着将斜面培养基菌种转接至液体培养基中进行摇瓶培养，培养温度为25-35℃，转速120-180rpm，培养时间24h-48h，得活化培养液；摇瓶培养添加液体培养基总量0.3-0.5%的甘氨酸；
2）发酵培养基刺激培养：将活化培养液按照4-6%的接种量转接至2216E发酵培养基中，在25-35℃、120-180 rpm下刺激培养48-72h得到发酵培养液；
所述刺激培养的过程中分批添加刺激剂，其中培养开始0-12h，向发酵培养基中加入0.5-1.0%的壳聚糖适应性发酵；培养进行到24h-36h时，向发酵培养基中继续添加刺激剂，所述刺激剂的组成和配比为：壳聚糖：酪蛋白的质量比为2:3，添加量为1.5%-2.0%；
3）植物乳杆菌共育培养：将活化培养后的植物乳杆菌P8以5-8%的添加量加入到步骤2）的发酵培养液中共育培养，其中植物乳杆菌活菌数大于1×109 CFU/ml，共育培养时间为24h，温度30-35℃，每隔6h搅拌20S，即得代谢活性提高的抗腐蚀细菌液；
所述海洋假交替单胞菌为解脂假交替单胞菌Pseudoalteromonas lipolytica，采购自上海保藏生物技术中心, 菌种编号:SHBCC D80739 SCSIO04301；
所述步骤1）中斜面培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，琼脂20.0g，人工海水1000ml，调pH至7.4～7.8；
所述步骤1）中液体培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，人工海水1000ml，调pH至7.4～7.8；
所述步骤3）中植物乳杆菌活化培养的方式为将植物乳杆菌P8菌粉经MRS培养基，在32℃～38℃下培养12～24h制备得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中2216E发酵培养基的具体组成为蛋白胨5.0g，酵母粉1.0 g，柠檬酸铁0.1 g，氯化钠19.45 g，氯化镁5.98 g，硫酸钠3.24 g，氯化钙1.8 g，氯化钾0.55 g，碳酸钠0.16 g，溴化钾0.08 g，氯化锶0.034 g，硼酸0.022 g，硅酸钠0.004 g，氟化钠0.0024 g，硝酸铵0.0016 g，磷酸氢二钠0.008 g，蒸馏水1000ml，调pH值至7.4～7.8。
3.一种采用权利要求1-2任一所述方法制备得到的海洋抗腐蚀细菌液。
4.根据权利要求3所述的海洋抗腐蚀细菌液，其特征在于细菌液中胞外多糖的含量为14-17g/L。
5.一种权利要求3或4所述海洋抗腐蚀细菌液在抑制海洋环境中金属腐蚀中的应用。
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| CN101037661A (zh) * | 2007-02-12 | 2007-09-19 | 浙江大学 | 假交替单胞菌及其用途 |
| CN103409345A (zh) * | 2013-07-23 | 2013-11-27 | 山东恩康药业有限公司 | 一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法 |
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