CN117651717A - 共刺激多特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种Fab‑scFv融合白，其(i)通过Fab支架，特异性结合肿瘤细胞或自体反应性免疫细胞的表面上表达的抗原，和(ii)通过scFv片段，特异性结合白细胞，优选细胞毒性淋巴细胞的表面上表达的抗原。

Description

共刺激多特异性抗体

技术领域

本发明涉及一种多特异性抗体，其特异性结合(i)肿瘤细胞或自身反应性免疫细胞表面上表达的抗原，和(ii)白细胞，优选细胞毒性淋巴细胞表面上表达的抗原。

背景技术

在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开，虽然被认为与本发明的可专利性无关，但在此整体援引加入本文。更具体地，所有引用的文件都以同样的程度援引加入，如同每个单独的文件都被明确地单独地援引加入一样。

自1997年利妥昔单抗获批以来，基于抗体的免疫疗法迅速成为继手术、放疗和化疗之后的第四大癌症治疗支柱。然而，尽管取得了成功，但并不是所有患者都能受益，疾病复发仍然是一个严重的问题[1]。因此，进一步开发和优化抗体疗法是当前转化研究的主要目标。小鼠肿瘤模型和患者观察结果表明，效应细胞的募集对治疗性抗体的效力起着重要作用[2-4]。

因此，改善这种效应细胞功能的方法特别有吸引力。这种机制基于抗体可结晶片段(Fc)结构域与效应细胞上表达的活化Fcγ-受体的相互作用，导致抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。特别是在治疗微小残留疾病(MRD)方面，抗体疗法可能很有前景，因为在这种情况下，高效应细胞与靶细胞比(E:T比)是可得的。然而，患者中通过治疗性抗体的效应细胞招募不足[5]。为了克服这一局限性，开发了各种策略来优化效应细胞结合，例如通过优化免疫球蛋白G(IgG)抗体的Fc结构域(Fc工程化)[6]，将单克隆抗体(mAb)与免疫刺激分子结合[7]或尝试使用双特异性抗体[8]。

用于效应细胞募集的双特异性抗体(bsAb)代表一类有前途的免疫疗法治疗剂，特别是在癌症免疫疗法中。

这些分子结合具有不同特异性的两种结合部分，第一种靶向肿瘤细胞上的抗原，第二种引发效应细胞上的活化受体。特别地，当分别靶向FcγRIIIa(CD16a)、CD3或γδT细胞受体时，这些药剂可以有效地激活自然杀伤(NK)细胞和T细胞[8,9]。除了嵌合抗原受体(CAR)T细胞，CD3 bsAb是诱导针对癌症的主要组织相容性复合物(MHC)非依赖性T细胞应答的最强大的药剂。目前，双特异性T细胞衔接子(engager)(BiTE)博纳吐单抗(blinatumomab)，一种[CD19×CD3]双特异性单链可变片段(bsscFv)，该类产品中的一种，已获得美国和欧盟的上市批准，用于治疗复发或难治性B细胞前体急性淋巴母细胞白血病，并显示出良好的结果[11,12]。

然而，仍然需要适用于免疫疗法，特别是癌症免疫疗法的新的双特异性抗体。本发明解决了这一需求。本发明的策略是刺激效应细胞群体以选择性杀伤癌症或自身免疫细胞，并通过共刺激方法提高细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性潜力。

发明内容

因此，在第一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其特异性结合：(i)肿瘤细胞或自体反应性免疫细胞的表面上表达的抗原，和(ii)白细胞，优选细胞毒性淋巴细胞的表面上表达的抗原。

根据本发明使用的术语“多特异性抗体”包含，例如，对上述项目(i)和(ii)中定义的靶标表现出结合特异性的至少两种不同单克隆抗体的结合基序。多特异性抗体还可以通过与肿瘤或效应细胞上的靶标结合的第三特异性来扩展。至少两种不同单克隆抗体的结合基序可以以全长抗体的形式包含在多特异性抗体中，也可以作为其衍生物或片段包含在术语“抗体”中，其仍然保留对靶标的结合特异性，例如肿瘤细胞的表面表达的抗原。抗体片段或衍生物又包括Fab或Fab’片段、Fd、F(ab’)2、Fv或scFv片段、单结构域VH或V样结构域，如VhH或V-NAR结构域。

术语“多特异性抗体”还包括诸如嵌合(人恒定结构域，非人可变结构域)、单链和人源化(人抗体，只是具有非人CDR)多特异性抗体的实施方案。

可以用于制备多特异性抗体的各种抗体制备技术在本领域中是众所周知的，例如Harlow and Lane(1988)and(1999)and Altshuler et al.,2010,loc.cit。因此，多克隆抗体可以用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫动物后从血液获得，并且单克隆抗体可以通过任何提供连续细胞系培养产生的抗体的技术制备。这样的技术的实例描述于，例如HarlowE and Lane D,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988；Harlow E and Lane D,Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999，并且包括最初由and Milstein,1975,the trioma technique,the human B-cellhybridoma technique(see e.g.Kozbor D,1983,Immunology Today,vol.4,7；Li J,etal.2006,PNAS,vol.103(10),3557)描述的杂交瘤技术以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术。此外，重组抗体可以从单克隆抗体获得，也可以使用各种展示方法(如噬菌体、核糖体、mRNA或细胞展示)从头制备。用于表达重组(人源化)抗体的合适***可选自，例如，细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或者转基因动物或植物(参见，例如US专利6,080,560；Holliger P,Hudson PJ.2005,Nat Biotechnol.,vol.23(9),11265)。此外，用于生产单链抗体的技术(除其他外，参见美国专利4,946,778)可以用于生产对GSK-3表位特异性的单链抗体。BIAcore***中使用的表面等离子共振可用于提高噬菌体抗体的效率。

根据本发明，抗体为具有多链或单链形式的多特异性抗体。多链或单链抗体形式例如为微型抗体(minibody)、二抗体(diabody)、双抗体(bibody)、三抗体(tribody)或三体(triplebody)、四抗体(tetrabody)或化学缀合的Fab’-多聚体(参见，例如Harlow andLane"Antibodies,ALaboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988；Harlow and Lane“Using Antibodies:ALaboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,1999；Altshuler EP,Serebryanaya DV,Katrukha AG.2010,Biochemistry(Mosc).,vol.75(13),1584；Holliger P,Hudson PJ.2005,NatBiotechnol.,vol.23(9),1126)。在这些形式中，双抗体形式是优选的，因为双抗体通过实施例进行阐述。双抗体，一种Fab-scFv融合蛋白，通过将scFv片段添加到Fab支架的C末端而产生。在这类多特异性抗体中，双特异性片段利用Fd片段(Fab片段的HC区)和轻链的天然体内异二聚化。异二聚体支架可以进一步与额外的功能组合，如scFv、支架蛋白、细胞因子等，以形成二价、双特异性分子或者三价、双或三特异性分子。双抗体分子，Fab-L-scFv和Fab-H-scFv，是双特异性和二价的。研究表明，这种形式可以保持双特异性结合，低聚集倾向并且在生理条件下稳定。多链格式特别包括双特异性抗体，其可以同时结合两种不同类型的抗原。双特异性抗体形式的非限制性实例是Biclonics(双特异性全长人IgG抗体)、DART(双亲和力再靶向抗体)和BiTE(由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)组成)分子(Kontermann and Brinkmann(2015),Drug Discovery Today,20(7):838-847)。下文将讨论其他双特异性抗体形式。

本文使用的术语“多特异性抗体”是指具有至少两个不同结合结构域的抗体，因此能够特异性结合两个不同的表位。如果抗体具有两个结合域，其可以称为“双特异性结合抗体”。根据本发明，第一表位是肿瘤细胞或自身反应性免疫细胞的表面上表达的抗原的一部分，第二表位是白细胞、优选细胞毒性淋巴的细胞的表面上表达的抗原的一部分。

本文使用的抗原是指存在于细胞外部的分子或分子结构，其可被本发明的多特异性结合抗体特异性结合。抗原包含表位(也称为抗原决定簇)，其为本发明的多特异性结合抗体识别的抗原的一部分。

肿瘤细胞是异常细胞，其在许多方面与正常体细胞不同。当一系列突变导致细胞继续生长和***失控时，正常细胞会变成肿瘤细胞。此外，与正常细胞不同，肿瘤细胞可能具有侵入附近组织和/或扩散到身体远处区域的能力。一系列突变通常导致肿瘤细胞的表面表达抗原，而正常细胞不表达。此外，肿瘤细胞表达在健康组织上发现的各种抗原。然而，这些抗原也可以用作靶结构，因为它们的表达模式有限，和/或它们的表达仅限于健康组织中的某些组织或细胞类型。此类抗原在本文中称为在肿瘤细胞的表面上表达的抗原。所述抗原优选不在正常细胞上表达。因此，“双特异性结合抗体”可以特异性或至少高度优先地与肿瘤细胞结合。

本文所指的肿瘤可以是恶性肿瘤或良性肿瘤。肿瘤优选为恶性肿瘤，其在本文中也称为癌症。

自身反应性免疫细胞也是异常细胞。它们与正常免疫细胞不同，因为它们不针对外来抗原，而是针对产生这些细胞的受试者体内可以发现的抗原。因此，这些细胞会引发机体对自身健康细胞、组织和其他正常成分的免疫应答。因此，自身反应性免疫细胞可能变得有害，并导致自身免疫性疾病，如多发性硬化症、关节炎或红斑狼疮。

白细胞(leukocyte)也称为白细胞(white blood cell)。白细胞可以分为五种主要类型：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。白细胞优选为细胞毒性淋巴细胞。细胞毒性淋巴细胞优选为细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)或自然杀伤细胞(NK细胞)。NKT细胞是一群异质T细胞，其具有T细胞和NK细胞的特性。在这方面，术语“细胞毒性”是指细胞特异性杀伤细胞的能力，例如通过与细胞上表达的抗原结合和/或通过介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，在肿瘤特异性细胞毒性T细胞的情况下，细胞毒性T细胞表面上的T细胞受体对肿瘤抗原具有特异性。TCR与抗原结合，并且细胞毒性T细胞破坏细胞。

因此，本发明的多特异性抗体一方面结合异常细胞(肿瘤细胞或自身免疫细胞)，并且另一方面结合细胞毒性白细胞(如NK细胞、NTK细胞和/或细胞毒性T细胞)。在这种情况下，多特异性抗体刺激免疫***(免疫调节功能)，并且使异常细胞对细胞毒性白细胞的耗竭敏感。免疫调节功能对异常细胞具有高度选择性，并且能够刺激细胞毒性白细胞，使其杀伤异常细胞。然而，仅这种功能不足以有效杀伤异常细胞。出人意料的是，免疫调节剂在本发明的多特异性抗体中作为共激活剂，能够显著增强由第二抗体或抗体衍生物(免疫激活剂)介导的细胞毒性作用，所述抗体或抗体衍生物与相同细胞毒性白细胞上的独立抗原和肿瘤细胞上的不同抗原结合。在CD20×NKG2D抗体的情况下，细胞毒性效应增加约10倍；参见实施例6和7。HER2×NKG2D、CD138×NKG2D和CD319CS1×NKG2D抗体的情况基本相同；参见实施例8和9。实施例6-9证明了细胞毒性效应增加的广泛适用性，值得注意的是所有测试的多特异性抗体都是以Fab-scFv融合蛋白的形式产生的。Fab-scFv融合蛋白被认为在实现细胞毒性效应增加方面特别有利。

双特异性抗体如博纳吐单抗的特征在于具有强免疫激活功能，并且通过与CD3阳性淋巴细胞结合，单独引发免疫应答，导致强健(robust)的激活。作为单一药剂的这种强自身活性和NK细胞缺乏CD3的表达，使其不能用作NK细胞共激活的免疫调节剂，也不适合用作T细胞的免疫调节剂。此外，NKG2D配体与抗CD20单链抗体片段的融合在单独施用时产生相当高的自身细胞毒性活性，因此其免疫激活剂而非免疫调节剂。在这种情况下，免疫激活剂视为一种分子，作为单一药剂，其可以在没有共刺激的情况下有效地引发免疫细胞(例如，在标准化的4小时铬释放实验中单独施用时诱导细胞毒性)，而免疫调节剂可以发挥微弱的单一药剂活性，但可以调节免疫激活剂诱导的作用。优选地，免疫调节剂作为增强剂发挥作用，使靶细胞对免疫激活剂引发的效应敏感(例如增强其细胞毒性活性)，而在没有免疫激活剂的情况下几乎无效。

根据本发明第一方面的优选实施方案，(ii)的抗原在自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和/或细胞毒性胸腺细胞(T细胞)和/或其遗传工程化的细胞上表达。

在这方面，优选(ii)的抗原在自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性胸腺细胞(T细胞)上表达，因为这导致由这两种细胞类型自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性胸腺细胞(T细胞)介导的细胞毒性效应。此类抗原的实例将在下文中提供。

生产遗传工程化细胞毒性淋巴细胞的手段和方法在本领域中是已知的，例如，来自Bonini et al.,Biol Blood Marrow Transplant.2011Jan；17(1Suppl):S15–S20。例如，细胞毒性特异性T淋巴细胞(CTL)可以从受试者分离，离体扩增，然后引发(primed)以识别特定的抗原，或者经过遗传修饰以表达特定的TCR或识别靶抗原的CAR。然后，这样的修饰的T细胞可以通过自体T淋巴细胞疗法来治疗受试者。

根据本发明第一方面的另一个优选实施方案，(ii)的抗原选自NKG2D、CD137、NKp30、NKp46、NKp44、2B4、DNAM-1、CD2、CD4、CD8和CD28，其中所述抗原优选为NKG2D。

多特异性抗体可包含针对这些抗原中的对于一种的结合结构域。多特异性抗体可以相应地结合选自以下的两种或更多种抗原：NKG2D、CD137、NKp30、NKp46、NKp44、2B4、DNAM-1、CD2、CD4、CD8和CD28，其中所述两种或更多种抗原优选包括NKG2D。

NKG2D是一种跨膜蛋白，属于NKG2家族的C型凝集素样受体。NKG2D在肿瘤和病原体的免疫监视中起着关键作用[13,14]。在人中，NKG2D由NK细胞和细胞毒性胸腺细胞表达，并识别“诱导的自身蛋白”，其在病毒感染或恶性转化后经常在细胞表面表达[15,16]。人NKG2D配体包括MHC I类相关链(MIC)A和B以及UL16结合蛋白(ULBP)1-6。对这些危险信号传导抗原的识别通过NKG2D相关适配(adapter)蛋白10kDa的DNAX激活蛋白(DAP10)的细胞内激活途径导致细胞内活化[17]。在NK细胞中，这种信号促进天然细胞毒性[18]。与NK细胞相反，NKG2D在T细胞中的作用更为复杂。在人中，其由CD8⁺αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞以及CD4 T细胞的亚群表达。先前的研究表明，NKG2D的共刺激调节细胞毒性T细胞的引发、增殖和功能[24,25]。然而，在用IL-2或IL-15长时间刺激后，T细胞也能够通过NKG2D激活，以TCR非依赖性方式杀伤靶细胞[26,27]。据证实，NKG2D配体在肿瘤细胞上的表达导致同基因小鼠肿瘤模型中T细胞介导的适应性免疫应答[28]。在癌症进展过程中，许多肿瘤通过NKG2D配体的下调或蛋白水解去除而逃避这种免疫监视机制(Salih et al.,J Immunol.2002Oct15；169(8):4098-102)。因此，采用不同的策略来恢复NKG2D介导的恶性细胞识别。例如，据证实，与NKG2D结合的双特异性免疫配体触发NK细胞细胞毒性，并通过治疗性抗体协同增强NK细胞介导的ADCC[19,20]。在异种移植物小鼠模型中，一种类似地构建的靶向多发性骨髓瘤(MM)细胞的分子在体外和体内也显示出有希望的结果[21]。此外，最近据证实，对NKG2D和CS-1具有特异性的bsAb在MM的临床前模型中表现出治疗效果[22]。最近另一项研究使用抗MICA和抗MICB抗体抑制这些配体的去除，通过NKG2D和额外的FcγRIIIa激活导致增强的NK细胞细胞毒性[23]。由于NKG2D在NK细胞和T细胞上表达，因此其是抗原在细胞毒性白细胞的表面上表达的一个实例，特别是在NK细胞和T细胞上。

CD137(ILA/4-1BB)是肿瘤坏死因子受体家族的成员，在活化的T淋巴细胞和NK细胞上表达。

NKp30(CD337)是人NK细胞上的刺激受体，与肿瘤免疫有关，并且能够促进或终止树突状细胞的成熟。

NKp46是主要的NK细胞活化受体，其参与被NK细胞杀伤的靶细胞的消除。

NKp44(CD336)是天然细胞毒性受体(NCR)的成员。其是一种激活受体，在活化的NK细胞和其他NKp44+免疫细胞发挥的大多数功能中起着重要作用。

2B4(CD244)是自然杀伤细胞受体，其介导非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀伤。

DNAM-1(CD226)是约65kDa的糖蛋白，在自然杀伤细胞、血小板、单核细胞和T细胞亚群的表面上表达。其是免疫球蛋白超家族的成员，含有V-set的2个Ig样结构域。

CD2是T细胞和自然杀伤(NK)细胞的表面上发现的细胞粘附分子。其称为T细胞表面抗原T11/Leu-5、LFA-2、LFA-3受体、红细胞受体和玫瑰花环(rosette)受体。

CD4是免疫细胞例如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的表面上发现的糖蛋白。CD4是T细胞受体(TCR)的共受体，并且协助后者与抗原呈递细胞通信。

CD8是跨膜糖蛋白，其充当T细胞受体(TCR)的共受体。与TCR一起，CD8共受体在T细胞信号传导中发挥作用，并且参与细胞毒性T细胞抗原相互作用。

CD28在T细胞上表达，其提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体，T细胞刺激通过CD28可以以为各种白细胞介素(特别是IL-6)的产生提供强信号。

根据本发明第一方面的另一优选实施方案，(i)的抗原选自CD20、CD19、CD22、CD37、CD38、CD7、CD33、CD44、CD54、CD64、CD75s、CD79b、CD96、CD138、CD123、CD317、CD319、BCMA、FCRL5、EGFR、HER2、EpCAM CEA、GD2和Claudin6/18.2，其中所述抗原优选为CD20。

多特异性抗体可以包含这些抗原中多于一个的结合结构域。因此，多特异性抗体可以结合选自以下的两个或更多个抗原：CD20、CD19、CD22、CD37、CD38、CD7、CD33、CD44、CD54、CD64、CD75s、CD79b、CD96、CD123、CD138、CD317、CD319、BCMA、FCRL5、EGFR、HER2、EpCAMCEA和Claudin 6/18，其中所述两个或更多个抗原优选包括CD20。

CD20 B-淋巴细胞抗原CD20或CD20在所有B细胞的表面表达，从pro-B期开始(CD45R+,CD117+)，并逐渐增加浓度，直至成熟。CD20已在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞急性淋巴母细胞白血病(ALL)和黑色素瘤癌症干细胞中发现。

CD19是在B细胞中表达的跨膜蛋白。由于CD19是B细胞的标志物，所述蛋白已用于诊断和靶向由这种类型的细胞引起的癌症，特别是B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

CD22是属于凝集素SIGLEC家族的分子，并且在成熟B细胞表面上发现，并且在某些未成熟B细胞表面也有少量存在。此外，CD22已用于诊断和靶向B细胞引起的癌症，如急性淋巴母细胞白血病(ALL)。

CD37是跨膜4超家族的成员。CD37的表达限于免疫***的细胞，在成熟的B细胞上丰度最高，在T细胞和髓样细胞上表达较低。细胞s和髓样细胞。在癌症中，CD37在各种B细胞淋巴瘤和白血病的恶性B细胞上高度表达，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)和CLL。

CD38是在许多免疫细胞(白细胞)的表面上发现的糖蛋白，包括CD4+、CD8+、B淋巴细胞和自然杀伤细胞。CD38也在各种血液恶性肿瘤中表达，包括NHL、MM、CLL和ALL。

CD7编码跨膜蛋白，其是免疫球蛋白超家族的成员。CD7在胸腺细胞和成熟T细胞中发现。CD7由T谱系白血病和淋巴瘤表达，并且是白血病预后标志物。

CD33是在髓样谱系细胞上表达的跨膜受体。其是治疗急性髓系白血病患者的靶点。

CD44是细胞表面糖蛋白，其参与细胞间相互作用、细胞粘附和迁移。CD44在许多哺乳动物细胞类型中表达。据报道，CD44的变化是一些乳腺癌和***癌症干细胞的细胞表面标志物。

CD54是细胞表面糖蛋白，其通常在内皮细胞和免疫***的细胞上表达。CD54在眼部过敏中起着重要作用，其募集促炎性淋巴细胞和肥大细胞，促进I型超敏反应。

CD64是称为Fc受体的一类整合膜糖蛋白，其以高亲和力结合单体IgG型抗体。CD64在巨噬细胞和单核细胞上发现。在炎性自身免疫性疾病中，中性粒细胞CD64表达增加。

CD75s是α-2,6-唾液酸化的碳水化合物表位，其由成熟B细胞(特别是生发中心B细胞)、红细胞和一些上皮细胞表达。CD75s已鉴定为成熟B细胞恶性肿瘤的免疫疗法的有前景的靶标。

CD79b是B细胞抗原受体复合物相关蛋白β链。与CD79b相关的疾病包括无丙种球蛋白血症6、常染色体隐性遗传和非布鲁顿(Non-Bruton)型无丙种球蛋白血症。

CD96是跨膜糖蛋白，其具有三个细胞外免疫球蛋白样结构域，并且由静息NK细胞表达。据报道，CD96与胶质瘤的免疫特征和临床结果相关。

CD123是在细胞上发现的分子，其有助于传递白细胞介素-3的信号，这是在免疫***中重要的可溶性细胞因子，如造血细胞的多能祖细胞。CD123在急性髓系白血病(AML)亚型中均有表达，包括白血病干细胞。

CD138(或黏结蛋白聚糖1)是由人中的SDC1基因编码的蛋白。该蛋白是跨膜(I型)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。CD138作为完整的膜蛋白发挥功能，并通过其细胞外基质蛋白受体参与细胞增殖、细胞迁移和细胞基质相互作用。CD138附着(is a sponge for)生长因子和趋化因子，主要通过硫酸乙酰肝素链结合。

CD317是脂筏(lipid raft)相关蛋白，其在成熟B细胞、浆细胞和浆细胞样树突状细胞以及许多其他细胞中表达。其仅表达为对IFN途径的刺激的应答。一些报道描述了CD137在各种恶性肿瘤中的表达，包括肺癌、白血病和淋巴瘤。

CD319(也称为CS1(CD2亚群-1)、CRACC和SLAMF7)是单跨膜l型跨膜糖蛋白，在NK细胞、成熟树突状细胞亚群、活化的B细胞和细胞毒性淋巴细胞上表达，但在早幼粒细胞、B细胞或T细胞系中不表达。CD319是多发性骨髓瘤中正常浆细胞和恶性浆细胞的强效标志物。

BCMA(B细胞成熟抗原)是TNF受体超家族的细胞表面受体，其识别B细胞活化因子(BAFF)。BCMA与白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤有关。

FCRL5(Fc受体样蛋白5，也称为CD307)是识别完整IgG的受体，可能使B细胞能够感知Ig的量。与FCRL5相关的疾病包括毛细胞白血病和淋巴瘤。

EGFR(表皮生长因子受体)是跨膜蛋白，其是细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族(EGF家族)成员的受体。在许多癌症类型中，影响EGFR表达或活性的突变可能导致癌症。

HER2(受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，也称为CD340)是在正常细胞生长和分化中起重要作用的受体。已知HER2过表达发生在例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺腺癌和子宫癌中。

EpCAM(表皮细胞粘附分子)是跨膜糖蛋白，其介导表皮细胞中Ca2+非依赖性同型细胞间粘附。EpCAM在许多癌症和癌症干细胞中过表达，使EpCAM成为免疫疗法的有吸引力的靶标。

CEA(癌胚抗原)描述了一组与细胞粘附高度相关的糖蛋白。CEA通常在胎儿发育期间在胃肠道组织中产生，但在出生前停止产生。在成人中，CEA主要在(恶性和良性)肿瘤细胞中表达。

GD2是在健康组织中有限表达的双唾液酸神经节苷脂(disialogangliside)。在某些肿瘤中，GD2广泛表达，并与癌症的发展有关。抗原是神经母细胞瘤治疗中的靶标。

CLDN(密蛋白(claudin))是指蛋白家族的成员，其与闭合蛋白(occludin)一起，是紧密连接(闭锁小带(zonulae occludentes))最重要的组分。几种密蛋白(特别是密蛋白-1、密蛋白-3、密蛋白-4和密蛋白-7)表达的改变与各种癌症的发展有关。此外，CLDN6和CLDN18.2是免疫治疗有吸引力的靶标。

根据本发明第一方面的一优选实施方案，(ii)的抗原是NKG2D，并且抗体与天然配体ULPB2竞争结合NKG2D。

如上所述，NKG2D在NK细胞和细胞毒性T细胞上表达，因此是本发明的(ii)的最优选抗原。NKG2D也在CD4^-NKT细胞上表达，而大多数CD4⁺NKT细胞缺乏这种受体(Kuylenstierna el al.,Eur J Immunol.2011Jul；41(7):1913–1923)。因此，本文所指的NKT细胞优选为CD4^-NKT细胞。

通过上调“应激诱导配体”，受损或转化的细胞可以被免疫细胞识别并清除。人基因组编码八种功能性“应激诱导配体”：MICA、MICB和ULBP1-6。它们都被单个受体NKG2D识别。

NKG2D的天然配体ULBP3、UBP6、MICA以及其他可能的已知配体在NKG2D受体上共享结合区，这是抗体触发NK/T细胞活化的优选结合位点。精细的表位和亲和力可能会显著影响激活/共刺激的强度。

根据本发明第一方面的又一优选实施方案，多特异性抗体包含Fab、scFv、Fv、VHH和/或dAb scFv片段作为组分，并且优选是IgG scFv或Fab scFv融合蛋白。

虽然本发明的多特异性抗体的特定形式不受特别限制，但根据本优选实施方案的多特异性抗体包含Fab、scFv、Fv、VHH或dAb作为组分。

Fab(抗原结合片段)、scFv(单链可变片段)、Fv(可变片段)、VHH(仅重链抗体的可变结构域)和dAb(结构域抗体)是完整(或完全)抗体的众所周知的片段。完整(或完全)抗体由整个免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的各两个拷贝组成。在抗体片段的这个列表中，scFv片段特别优选地包含在本发明的多特异性抗体中。

与全长抗体相比，抗体片段的区别特性是，例如，较小的尺寸，单价抗原结合，缺乏FcR结合，普遍缺乏复杂的糖基化和/或稳健的生物物理特性。

本发明的多特异性抗体的形式优选为IgG scFv或Fab scFv融合蛋白。在第一种情况下，IgG(即全IgG抗体)与scFv片段融合，在第二种情况下，Fab片段与scFv片段融合。

在本发明的多特异性抗体包含scFv片段的优选情况下，所述scFv片段优选通过肽接头，更优选通过GS接头，与Fab、IgG或Fc支架的C末端融合。

Fc支架包含抗体的恒定区或由其组成。肽接头是短氨基酸序列，优选在5-50个氨基酸的范围内。GS接头仅由甘氨酸和丝氨酸氨基酸组成。

在这方面，应该理解的是，Fc支架不包含抗原结合位点，而是多特异性抗体的另一组分。例如，Fc支架可以增加多特异性抗体的体内血清稳定性和保留时间。

根据本发明第一方面的更优选的实施方案，Fab支架特异性结合(i)的抗原，并且scFv片段特异性结合(ii)的抗原。

本发明的多特异性抗体的这种特定Fab-scFv形式在所提交的申请的实例中示出，因此是特别优选的。与串联的scFv形式不同，具有约75kDa中等分子量的Fab-scFv形式不会通过肾清除而被消除，从而延长其体内半衰期。与IgG样形式相比，较小的尺寸在介导靶细胞和效应细胞之间的突触(synapse)形成方面显示出有利的特征。避免使用多个scFv片段，这样的Fab-scFv分子显示出更低的形成多聚体或聚集体的趋势。

如果甚至期望进一步延长体内半衰期，则还可以给Fab-scFv形式另外配备Fc结构域。这种分子量为约125kDa的分子仍然比常规IgG抗体小，因此在组织穿透方面可以表现出有利的特征。

根据本发明第一方面的更优选的实施方案，多特异性抗体，在(i)的情况下，包含SEQ ID NO 22-26和CDR2 VL ATS的6个CDR；和/或，在(ii)的情况下，包含SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VLGKN、或者SEQ ID NO 11-15和CDR2 VLGKN的6个CDR。

从下面的实施例可以看出，发明人产生了38种抗NKG2D抗体(克隆1-38)，并将其中36种加工成Fab-scFv融合蛋白(双抗体)，其中Fab片段针对CD20，并且scFv片段针对NKG2D。

虽然36种Fab-scFv融合蛋白都能够诱导NK细胞活化，但在36种Fab-scFv融合蛋白中，如实施例中所述，具有抗NKG2D抗体3、32和35的三个克隆能够诱导最强效的NK细胞活化。在克隆3、32和35中，克隆3和32比克隆35诱导甚至更好的NK细胞活化，并且克隆3提供与人和鼠NKG2D结合的额外优势(参见实施例10)。具有抗NKG2D抗体3和32的Fab-scFv融合蛋白能够潜在地裂解淋巴瘤细胞。人和鼠NKG2D对于小鼠模型中的临床前测试是有利的。因此，在克隆3、32和35中，克隆3和32是优选的，克隆3是最优选的。

SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VL GKN、或者SEQ IDNO 11-15和CDR2 VL GKN分别是3种新的抗NKG2D抗体克隆3、32和35的6个CDR序列的组。

在SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VL GKN、或者SEQID NO 11-15和CDR2 VL GKN中，SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VL GKN是优选的，并且SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN是最优选的。

SEQ ID NO 22-26和CDR VL ATS的6个CDR是可商购CD20抗体利妥昔单抗的6个CDR。利妥昔单抗(Rituximab)用于治疗自身免疫性疾病和癌症类型。例如，其用于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎、特发性血小板减少性紫癜、寻常性天疱疮、重症肌无力和Epstein–Barr病毒阳性的粘膜皮肤溃疡。

虽然利妥昔单抗(Fab形式)已用作特异性结合肿瘤细胞或自身反应性免疫细胞的表面上表达的抗原的抗体的实例，但克隆3、32和35讨论的优势并不限于增强多特异性抗体形式的利妥昔单抗的效力。至少非常合理的是，克隆3、32和35可以增强特异性结合肿瘤细胞或自身反应性免疫细胞的表面上表达的抗原的任何治疗性抗体的效力。

因此，在第一方面的上述优选实施方案中，多特异性抗体优选包含(i)抗体，优选scFv片段，其包含SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VL GKN、或者SEQ ID NO 11-15和CDR2 VL GKN的6个CDR；以及(ii)抗体，优选Fab片段，其特异性结合肿瘤细胞或自体反应性免疫细胞的表面上表达的抗原。

本发明还涉及一种抗NKG2D抗体，其包含SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQID NO 6-10和CDR2 VL GKN、或者SEQ ID NO 11-15和CDR2 VL GKN的6个CDR。

结合第一方面公开的上述定义和优选实施方案经适当修改后适用于本发明的抗NKG2D抗体。

根据本发明第一方面的另一优选实施方案，多特异性抗体，在(i)的情况下，包含SEQ ID NO 27和28的可变重链区和可变轻链区；和/或在(ii)的情况下，包含SEQ ID NO 16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21的可变重链区和可变轻链区。

SEQ ID NO 16和17、SEQ ID NO 18和19和SEQ ID NO 20和21的可变重链区和可变轻链区分别为克隆3、32和35的可变重链区和可变轻链区。

本文还描述多特异性抗体，其包含(i)可变重链区和可变轻链区，其与SEQ ID NO16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21，按递增的优选，至少90％、至少95％、至少98％、以及至少99％相同；和/或(ii)SEQ ID NO 27和28的可变重链区和可变轻链区。对此，优选地，这样的多特异性抗体包含(i)SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQID NO 6-10和CDR2 VL GKN、或者SEQ ID NO 11-15和CDR2 VL GKN的6个CDR；和/或(ii)SEQID NO 22-26和CDR2 VL ATS的6个CDR。

根据本发明，术语“序列相同性百分比(％)”描述与构成模板核酸或氨基酸序列总长度的核苷酸或氨基酸残基的数目相比的两个或更多个比对的核酸或氨基酸序列相同核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)数目。换句话说，使用两个或更多个序列或子序列的比对，当(子)序列在比较窗口上进行比较和比对以获得最大对应时，或者使用本领域已知的序列比较算法测量的指定区域上，或者当手动比对和目视检查时，可以确定相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如90％或95％相同性)。这个定义也适用于要比对的任何序列的互补物。

核苷酸和氨基酸序列优选使用NCBI BLAST算法(Stephen F.Altschul,ThomasL.Madden,Alejandro A.Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and DavidJ.Lipman(1997),Nucleic Acids Res.25:3389-3402)进行与本发明相关的分析和比对。BLAST可用于核苷酸序列(核苷酸BLAST)和氨基酸序列(蛋白BLAST)。本领域技术人员知道用于比对核酸序列的其他合适程序。

SEQ ID NO 27和28的可变重链区和可变轻链区是利妥昔单抗的可变重链区和可变轻链区。

在第一方面的上述优选实施方案中，多特异性抗体优选包含(i)抗体，优选scFv片段，其包含SEQ ID NO 16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21的可变重链区和可变轻链区；以及(ii)抗体，优选Fab片段，其特异性结合肿瘤细胞或自体反应性免疫细胞的表面上表达的抗原。

由于上述解释的原因，本发明还涉及一种抗NKG2D抗体，其包含SEQ ID NO 16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21的可变重链区和可变轻链区。在scFv片段中，SEQ ID NO 16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21优选通过肽接头连接，并且更优选通过SEQ ID NO:29的肽接头连接。

本发明第二方面涉及一种核酸序列或核酸序列组，其编码本发明的多特异性抗体。

本发明的术语“核酸分子”包括DNA，例如cDNA或者双链或单链基因组DNA，以及RNA。在这方面，“DNA”(脱氧核糖核酸)是指称为核苷酸碱基的化学结构单元腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的任何链或序列，它们在脱氧核糖糖骨架上连接在一起。DNA可以具有一条核苷酸碱基链，或者两条互补链，其形成双螺旋结构。它还包括RNA。“RNA”(核糖核酸)是指称为核苷酸碱基的化学结构单元腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的任何链或序列，它们在核糖骨架上连接在一起。RNA通常具有一条核苷酸碱基链，例如mRNA。其还包括单链和双链杂交分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA。核酸分子也可以通过本领域已知的许多手段进行修饰。这样的修饰的非限制性实例包括甲基化，“加帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及核苷酸间修饰，例如，具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些。核酸分子在下文中也称为多核苷酸，可以含有一个或多个额外的共价连接的部分，例如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素(psoralen)等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷化剂。多核苷酸可以通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基磷酰胺键而衍生化。进一步包括本领域已知的核酸模拟分子，例如DNA或RNA的合成或半合成衍生物以及混合聚合物。根据本发明的这种核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸酯核酸、磷酰胺核酸、2’-O-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)(参见Braaschand Corey,Chem Biol 2001,8:1)。LNA是RNA衍生物，其中核糖环受到2’-氧和4’-碳之间的亚甲基键的限制。还包括含有修饰的碱基的核酸，例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶。核酸分子通常携带遗传信息，包括用于制造蛋白和/或多肽的细胞机制所用的信息。本发明的核酸分子可包含启动子、增强子、应答元件、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5'-和3'-非编码区等。

本发明的核酸分子编码本发明的多特异性抗体。本发明的多特异性抗体也可以由一组核酸分子编码，优选由一组两个核酸分子编码。这是因为抗体(全长抗体、scFv或Fab)包含重链和轻链序列，例如，在细胞中表达时，其自组装成抗体。重链和轻链序列可以由一组不同的核酸分子编码，优选由两个核酸分子编码。

本发明第三方面涉及一种载体或载体组，其以可表达形式编码的本发明多特异性抗体。

本发明的术语“载体”优选是指质粒、粘粒、病毒、噬菌体或例如常规用于基因工程的其他载体，其以可表达形式编码本发明的多特异性抗体。出于与关于本发明的核酸分子组所讨论的相同原因，本发明的多特异性抗体也可以由一组载体编码，优选由一组两个载体编码。

例如，可以将编码本发明多特异性抗体的核酸分子***几种可商购载体中。非限制性实例包括原核质粒载体，例如，pUC系列，pBluescript(Stratagene)，pET系列的表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)，以及与哺乳动物细胞中表达相容的载体，如pREP(Invitrogen)、pSec Tag2(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(Edge Biosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适用于毕赤酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(均来自Invitrogen)。

***载体中的核酸分子可以例如通过标准方法合成，或者从天然来源分离。编码序列与转录调控元件和/或其他氨基酸编码序列的连接也可以使用已建立的方法进行。本领域技术人员熟知确保在原核或真核细胞中表达的转录调控元件(表达盒的部分)。这些元件包括确保转录起始的调控序列(例如，翻译起始密码子、启动子，例如天然相关或异源启动子和/或绝缘子(insulator)；见上文)、内部核糖体进入位点(IRES)(Owens,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(2001),1471-1476)以及任选存在的poly-A信号，其确保转录终止和转录物的稳定。其他调控元件可以包括转录以及翻译增强子。优选地，编码本发明多特异性抗体的多核苷酸与这样的表达控制序列可以操作地连接，从而允许在原核或真核细胞中表达。载体可以进一步包含编码分泌信号的核酸序列作为进一步的调控元件。这样的序列对于本领域技术人员是众所周知的。此外，取决于所用的表达***，可以将能够将表达的多肽导向细胞区室的先导序列添加到本发明多核苷酸的编码序列中。这样的先导序列在本领域是众所周知的。

此外，载体优选包含选择标记物。选择标记物的实例包括编码对新霉素、氨苄青霉素、潮霉素和卡那霉素的抗性的基因。专门设计的载体允许DNA在不同宿主之间穿梭，例如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞(例如看获得自Invitrogen的Gateway***)。本发明的表达载体能够指导本发明的多核苷酸和编码的肽或融合蛋白的复制和表达。除了通过诸如噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)的载体引入之外，如上所述的核酸分子可以设计为用于直接引入或通过脂质体引入细胞。另外，杆状病毒***或基于痘苗病毒或塞姆利基森林(Semliki Forest)病毒的***可用作本发明的核酸分子的真核表达***。

本发明的第四方面涉及一种宿主细胞，优选非人宿主细胞，其包含本发明的载体。

术语“宿主细胞”是指任何生物体的任何细胞，其经选择、修饰、转化、生长或以任何方式使用或操作，以通过细胞产生本发明的蛋白或肽或融合蛋白。因此，宿主细胞通常是离体或体外细胞和/或分离的细胞。

本发明的宿主细胞通常通过将本发明的核酸分子或载体引入宿主细胞来产生，所述宿主细胞在其存在时介导编码本发明多特异性抗体的本发明核酸分子的表达。宿主细胞来源或分离的宿主可以是任何原核或真核细胞或生物体，优选地，通过破坏人类胚胎直接衍生的人胚胎干细胞除外。

用作本发明的宿主的合适原核生物(细菌)例如是通常用于克隆和/或表达的原核生物，如大肠杆菌(E.coli)(例如，大肠杆菌菌株BL21、HB101、DH5a、XL1-Blue、Y1090和JM101)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。上述宿主细胞的适当培养基和条件在本领域是众所周知的。

合适的真核宿主细胞可以是脊椎动物细胞、昆虫细胞、真菌/酵母细胞、线虫细胞或植物细胞。真菌/酵母细胞可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞或曲霉(Aspergillus)细胞。用本发明的核酸分子或载体基因工程化造的宿主细胞的优选实例是酵母、大肠杆菌和/或芽孢杆菌(Bacillus)属(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))的物种的细胞。在一优选实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))。

在不同的优选实施方案中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤淋巴母细胞、人胚胎肾细胞(HEK-293)、人胚胎视网膜细胞(Crucell'sPer.C6)或人羊水细胞(Glycotope和CEVEC)。细胞在本领域中经常用于生产重组蛋白。CHO细胞是工业生产用于人的重组蛋白治疗剂最常用的哺乳动物宿主细胞。

本发明还涉及一种转基因动物，优选非人转基因动物，其包含本发明的载体。

转基因动物可以用于生产抗体，例如Brüggemann(2015),Arch Immunol Ther Exp(Warsz)；63(2):101–108。转基因动物优选为除人以外的哺乳动物。还可以产生抗体，使得可以从转基因哺乳动物的乳汁获得抗体。因此，哺乳动物优选山羊、绵羊或奶牛。

本发明的第五方面涉及一种用于产生本发明的多特异性抗体的方法，其包括(a)在宿主细胞表达本发明的多特异性抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，和(b)分离(a)中表达的本发明的多特异性抗体。

术语“培养”说明宿主细胞在受控条件下生长的过程。这些条件可以因使用的宿主细胞而异。本领域技术人员非常了解建立优化培养条件的方法。此外，在现有技术中已经广泛描述了建立、维持和操作细胞培养物的方法。

本发明多特异性抗体的分离方法在本领域是众所周知的，并且包括但不限于例如以下的方法步骤：离子交换色谱、凝胶过滤色谱(尺寸排阻色谱法)、亲和色谱、高压液相色谱(HPLC)、反相HPLC、圆盘凝胶电泳或免疫沉淀，参见Antibody Purification Handbook,GE Healthcare,18-1037-46。

本发明的术语“(a)中表达的本发明的多特异性抗体”是指过程的产物，其意味着在宿主细胞中可以诱导这样的过程，通过该过程，来自编码本发明多特异性抗体的核酸分子的信息用于合成本发明的多特异性抗体。可以通过本领域已知的方法调节该过程中的几个步骤，包括本发明的多特异性抗体的转录、RNA剪接、翻译和翻译后修饰。因此，这种调节可以允许控制产生的多特异性抗体的时间、位置和量。

本发明的第六方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的多特异性抗体、本发明的核酸序列、本发明的载体或者本发明的宿主细胞，并且任选地包含(a)抗体，其特异性结合(i)的抗原以外的、肿瘤细胞的表面上表达的抗原，其中(a)的抗体优选特异性结合CD19或CD38，和/或(b)抗体，其特异性结合(ii)的抗原以外的、细胞毒性淋巴细胞的表面上表达的抗原，其中(b)的抗体优选特异性结合T细胞和NKT细胞的表面上表达的CD3，和/或NK细胞的表面上表达的CD16或CD32，和/或(c)细胞产物，优选嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体自然杀伤细胞，其中所述细胞产物表达(ii)的抗原，并且其中所述细胞产物优选包含细胞毒性淋巴细胞，所述细胞毒性淋巴细胞优选经遗传修饰以表达合成免疫受体，其含有对(i)以外的抗原的结合位点。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于向患者(优选人患者)给药的组合物。本发明的药物组合物包含上述化合物。其可以任选地包含能够改变本发明化合物特征的其他分子，从而例如稳定，调节和/或激活其功能。组合物可以是固体、液体或气体形式，尤其可以是(一或多种)粉末、(一或多种)片剂、(一或多种)溶液或(一或多种)气溶胶的形式。本发明的药物组合物可以任选且另外包含药学上可接受的载剂。合适的药物载剂的实例在本领域是众所周知的，并且包括磷酸缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液、有机溶剂(包括DMSO)等。包含这样的载剂的组合物可以通过众所周知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量向受试者给药。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。正如医学领域众所周知的那样，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况以及同时给药的其他药物。给定情况下的治疗有效量容易通过常规实验确定，并且在普通临床医生或医生的技能和判断范围内。通常，作为药物组合物的常规给药方案应在每天1μg-5g单位的范围内。然而，更优选的剂量可能在每天0.0001mg-100mg/kg体重，甚至更优选0.01mg-50mg/kg体重，最优选20mg-50mg/kg体重的范围内。观察变化所需的治疗长度以及治疗后发生反应的间隔取决于期望的效果而变化。特定量可以通过本领域技术人员众所周知的常规测试来确定。

任选地存在于本发明药物组合物中的抗体可以通过与肿瘤或自身反应性免疫细胞(抗体(a))表达的抗原结合和/或与免疫细胞(抗体(b))表达的活化受体结合而发挥免疫激活剂功能，并通过本发明多特异性抗体的免疫调节剂功能增强其功能。特别地，下文的实施例显示，抗CD38抗体与本发明的多特异性抗体(CD20xNKG2D克隆3或CD20xNKG2D克隆32)的组合在触发细胞介导的肿瘤细胞杀伤方面比单独的两种抗体之一明显更有效。

术语“细胞产物”优选地表示包含天然或遗传工程化的细胞毒性白细胞的细胞治疗组合物，优选人细胞毒性白细胞，例如CAR-T细胞、CAR-NK细胞或TIL。这些细胞通常用于过继转移到患者中。由于NKG2D也在离体扩增的NK细胞和T细胞(CAR-T、CAR-NK细胞或TIL)上表达，因此过继转移细胞的细胞毒活性可以通过NKG2D靶向分子调节。通过NKG2D刺激，转移细胞的细胞毒活性可能会增强。

本发明的第七方面涉及本发明的多特异性抗体、本发明的核酸序列、本发明的载体、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物，用于治疗或预防肿瘤或自身免疫性疾病。

应当理解，就本发明的这一方面而言，如果要治疗或预防肿瘤，则多特异性抗体特异性结合肿瘤细胞的表面上表达的抗原。类似地，如果要治疗或预防自身免疫性疾病，则多特异性抗体特异性结合自身反应性免疫细胞的表面上表达的抗原。

在下文的实施例中，证实本发明的多特异性抗体有效且高特异性地介导肿瘤细胞的杀伤。因此，本发明的多特异性抗体适用于治疗患者的肿瘤。选择性杀伤肿瘤细胞也使得本发明的多特异性抗体也可以治疗自身免疫性疾病至少是合理的，因为自身免疫性疾病也是由特定的细胞群体介导的，去除这些细胞会具有治疗或预防效果。

肿瘤可以是良性或恶性肿瘤。肿瘤优选为恶性肿瘤，并且恶性肿瘤在本文中也称为癌症。

此外，根据本发明的第七方面的优选实施方案，使用(a)抗体，其特异性结合(i)的抗原以外的、肿瘤细胞的表面上表达的抗原，其中(a)的抗体优选特异性结合CD19或CD38，和/或使用(b)抗体，其特异性结合(ii)的抗原以外的、细胞毒性淋巴细胞的表面上表达的抗原，其中(b)的抗体优选特异性结合T细胞的表面上表达的CD3，或者NK细胞的表面上表达的CD16或CD32，和/或(c)细胞产物，优选嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体自然杀伤细胞，其中所述细胞产物表达(ii)的抗原，并且其中所述细胞产物优选包含细胞毒性淋巴细胞，所述细胞毒性淋巴细胞优选经遗传修饰以表达合成免疫受体，其含有对(i)以外的肿瘤细胞表达的抗原的结合位点。

如上文关于本申请的第六方面所讨论的，任选地存在于本发明药物组合物中的抗体可以通过与肿瘤或自身反应性免疫细胞(抗体(a))表达的抗原结合和/或与免疫细胞(抗体(b))表达的活化受体结合而发挥免疫激活剂功能，并通过本发明多特异性抗体的免疫调节剂功能增强其功能。另外，已经结合本发明的第六方面定义了细胞产物，并且根据本发明的第七方面定义了相同的细胞产物。

本发明的第八方面涉及一种抗体，优选多特异性抗体，其包含SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VL GKN、或者SEQ ID NO 11-15和CDR2 VL GKN的6个CDR，并且优选包含SEQ ID NO 16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21的可变重链区和可变轻链区。

这种抗体是抗NKG2D抗体。如上文所讨论的，将36种抗NKG2D抗体加工成Fab-scFv融合蛋白，其中Fab片段针对CD20，并且scFv片段针对NKG2D。从这36种Fab-scFv融合蛋白中，特别是在实施例中提及的具有抗NKG2D抗体3、32和35的三个克隆能够诱导有效的NK细胞活化。

由于NKG2D在人中由NK细胞、NK1.1+T细胞、γδT细胞和CD8+αβT细胞表达，因此认为，抗NKG2D抗体3、32和35不仅特别有利于以本发明的多特异性抗体的形式激活这些细胞，而且克隆3、32和35通常是表现出色的抗NKG2D抗体。

本文还描述一种抗体，其包含可变重链区和可变轻链区，其与SEQ ID NO 16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21，按递增的优选，至少90％、至少95％、至少98％、以及至少99％相同。对此，优选地，这样的抗体包含(i)SEQ ID NO 1-5和CDR2 VLGNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VL GKN、或者SEQ ID NO 11-15和CDR2 VL GKN的没有改变的6个CDR。

本发明的第九方面涉及第八方面的抗体，用于***、自身免疫性疾病、炎性疾病或移植物抗宿主疾病。

已知抗NKG2D抗体适用于治疗疾病，例如肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病或移植物抗宿主疾病。各种研究已经证明NKG2D介导的自然杀伤细胞以及常规和非常规T细胞的抗肿瘤功能。NKG2D控制肿瘤生长和感染(Shepppard et al.,Front Immunol.2018；9:1808)。抗NKG2D抗体用于治疗克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的临床试验(Vadstrupand Bendtsen,Int J Mol Sci.2017Sep；18(9):1997)。

关于本说明书中表征的实施方案，特别是在权利要求中，意图将从属权利要求中提到的每个实施方案与所述从属权利要求所引用的每个权利要求(独立或从属)的每个实施方案相结合。例如，如果独立权利要求1列举了3个可选方案A、B和C，从属权利要求2列举了3个可选方案D、E和F，权利要求3引用权利要求1和2并列举了3个可选方案G、H和I，则应理解，除非另外指明，说明书明确公开了对应于以下组合的实施方案：A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I。

类似地，并且在独立和/或从属权利要求没有列举替代方案的情况下，应当理解，如果从属权利要求引用多个在先的权利要求，则认为其涵盖的主题的任何组合都被明确公开。例如，在独立权利要求1、引用权利要求1的从属权利要求2和引用权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，可以得出权利要求3和1的主题的组合与权利要求3、2和1的主题的组合一样清楚明确地公开。如果存在引用权利要求1至3中任何一项的另一从属权利要求4，则可以得出，清楚而明确地公开了权利要求4和1、权利要求4、2和1、权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合。

上述考虑因素适用于所有所附的权利要求。

附图说明

图1：NKG2D结合scFv的分离和序列分析。

(A)ScFv噬菌体，其通过针对人NKG2D抗原淘洗从幼稚抗体文库分离。使用NKG2D-Fc融合蛋白和类似构建的对照蛋白NKp30-Fc，通过噬菌体ELISA分析结合的特异性。不相关的噬菌体被用作额外的对照。(B)根据不同的种系基因片段家族及其VH/VL组合，通过序列分析将分离的NKG2D特异性scFv分为3个不同的组。突出显示了进一步表征的克隆#3(蓝色)和#32(红色)以及后来使用的对照scFv#24(绿色)。

图2：双特异性[CD20×NKG2D]抗体的产生和表征。

(A)用于产生双抗体形式的双特异性[CD20×NKG2D]抗体的表达盒的示意图。CMV，巨细胞病毒启动子；Igκ，人Igκ分泌先导序列；VH_A，VL_A，分别编码抗CD20抗体利妥昔单抗的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的序列；CH1，CL，分别编码人免疫球蛋白重链恒定区1和人免疫球蛋白κ轻链恒定区的序列；VH_B，VL_B，编码NKG2D特异性scFv的可变重链和可变轻链区的cDNA序列；L1，L2，编码接头肽的序列；c-myc，6×His，分别编码c-myc表位和六组氨酸标签的序列。(B)双特异性双抗体形式的块结构。NKG2D特异性scFv与CD20针对的Fab遗传融合。S-S，二硫键。(C)在还原条件下，通过考马斯染色的SDS-PAGE分析了由轻链(LC，约25kDa)和重链衍生物(HC，70-75kDa)组成的纯化的双特异性抗体的纯度和完整性。显示了***性实验中的一个。

图3：双特异性[CD20×NKG2D]抗体的同时抗原结合。

(A)最初将CD20阳性Raji淋巴瘤细胞与不同的双特异性[CD20×NKG2D]抗体孵育，然后在随后的孵育步骤中与含有融合至人IgG1-Fc部分的NKG2D的胞外域的融合蛋白(NKG2D-Fc)或与对照蛋白NKp30-Fc反应。通过流式细胞术通过针对人Fc的荧光偶联抗体可视化结合。只有通过同时结合细胞CD20和可溶性NKG2D才能进行检测。作为对照，将细胞与Fc融合蛋白，在不存在[CD20×NKG2D]bsAbs(NKG2D-Fc；NKp30-Fc)的情况下或仅与FITC偶联的检测抗体(缓冲液)孵育。结果显示了bsAb[CD20×NKG2D#3]的示例性结果，其仅与NKG2D-Fc相互作用而不与NKp30-Fc相互作用。(B)各种单独的[CD20×NKG2D]bsAbs同时结合CD20和NKG2D的能力。每个数据点代表单独的克隆。突出显示了进一步表征的克隆#3(正方形)和#32(三角形)以及后来使用的对照scFv#24(菱形)。数据代表三个独立的实验。

图4：用双特异性[CD20×NKG2D]抗体激活NK细胞。

在GRANTA-519套细胞淋巴瘤细胞存在下，将NK细胞与[CD20×NKG2D]bsAbs(10μg/ml)孵育。4h后，通过流式细胞术在CD56+/CD3-NK细胞上分析早期激活标志物CD69的诱导表达。在不存在bsAb作为对照的情况下孵育NK细胞和淋巴瘤细胞。突出显示了进一步表征的克隆#3(正方形)和#32(三角形)以及后来使用的对照scFv#24(菱形)。将数据点标准化为克隆#3诱导的CD69表达，并表示来自3个独立实验的平均值。

图5：双特异性抗体[CD20×NKG2D#3]和[CD20×NKG2D#32]的细胞毒性及其与CD38抗体达雷木单抗的协同效果。

(A)在单核细胞(MNC；E:T比：40:1)或NK细胞(E:T比：10:1)作为效应物群体的存在下，将CD20⁺/CD38⁺GRANTA-519MCL细胞分别与达雷木单抗、双特异性[CD20×NKG2D]抗体或其组合孵育。4h后，分析靶细胞的裂解。数据点代表三个独立实验的平均值±SEM。(*，与仅用达雷木单抗处理相比统计学显著差异；p≤0.05)。(B)[CD20×NKG2D#3]增强达雷木单抗触发的针对来自两名不同MCL患者的肿瘤细胞(p)的ADCC。NK细胞用作效应物群体。数据点代表两个独立实验的平均值±SEM。(*，与仅用达雷木单抗处理相比统计学显著差异；≤0.05)。

图6：双特异性抗体[CD20×NKG2D#3]和[CD20×NKG2D#32]的细胞毒性以及与Fc工程化的CD19抗体(CD19-DE)的协同效果。

在4h ⁵¹Cr释放测定中分析了双特异性抗体[CD20×NKG2D#3](A)和[CD20×NKG2D#32](B)单独或与Fc工程化CD19-DE抗体组合的细胞毒性功能。使用GRANTA-519MCL cells(CD19⁺,CD20⁺)作为靶细胞，并将从健康供体分离的MNC用作效应物群体(E:T比：40:1)。使用非结合单克隆IgG1 Ab作为对照。数据点代表三次独立实验的平均值±SEM。(*，与仅用CD19-DE处理相比统计学显著差异；≤0.05)。

图7：双特异性[CD20×NKG2D]抗体的细胞毒活性，CD8阳性αβT细胞作为效应物群体。

(A)CD8⁺αβT细胞通过MACS分离。使用适当荧光染料标记的CD3、CD8、CD16和CD56抗体通过流式细胞术确定纯度。显示的是CD3⁺/CD8⁺细胞的直方图(右上矩形)，在这个代表性实验中相对量为94％。(B)将纯化的T细胞用白介素-2(300U/ml)刺激3天，并作为双特异性抗体[CD20×NKG2D#3]和[CD20×NKG2D#32]的效应细胞(E:T比：20:1)以及它们与[CD19×CD3]bsscFv的组合在4h ⁵¹Cr释放测定中进行测试。使用GRANTA-519MCL细胞作为靶细胞。数据点代表三个独立实验的平均值±SEM。(*，与仅用[CD19×CD3]处理相比统计学显著差异；≤0.05)。使用双特异性scFv[HER2×CD3]作为对照。

图8：双特异性抗体[CD20×NKG2D#32]的尺寸排阻色谱(SEC)。

通过SEC分析双特异性抗体[CD20×NKG2D#32]，并与选定的质量标准(669kDa、158kDa、13kDa)进行比较。显示了一个代表性的实验。

图9：双特异性抗体[CD20×NKG2D#3]和[CD20×NKG2D#24]的细胞毒性及其分别与达雷木单抗的协同效果。

在4h ⁵¹Cr释放测定中分析了双特异性抗体[CD20×NKG2D#3]和[CD20×NKG2D#24]单独或与达雷木单抗组合的细胞毒性功能。将来自MCL患者的肿瘤细胞(CD38⁺,CD20⁺)用作靶细胞，并将从健康供体分离的NK细胞用作效应物群体(E:T比：10:1)。使用非结合单克隆IgG1 Ab作为对照。数据点代表三次独立实验±SEM的平均值。(*，显示统计学显著差异；p≤0.05)。

图10：双特异性[4D5×NKG2D#32]与西妥昔单抗组合的细胞毒性。

在4h 51Cr释放测定中分析了双特异性抗体[4D5×NKG2D#32](B)单独或与西妥昔单抗组合的细胞毒性功能。西妥昔单抗和4D5xNKG2D#32以1:1000的摩尔比施用。将SKBR3细胞(Her2+,EGFR+,CD20-)用作靶细胞，并将从健康供体分离的MNC用作效应物群体(E:T比：40:1)。使用非结合单克隆IgG1 Ab作为对照。数据点代表一式三份孔的平均值±SEM。

图11：双特异性[CS1×NKG2D#32]、[CD138×NKG2D#32]抗体与达雷木单抗组合的细胞毒性。

在4h 51Cr释放测定中分析了双特异性抗体[CS1×NKG2D#32](A)或[CD138×NKG2D#32](B)与达雷木单抗组合的细胞毒性功能。达雷木单抗双特异性抗体的摩尔比为1:16.6。将L363细胞(CS1+、CD38+、CD138+)用作靶细胞，并将从健康供体分离的MNC用作效应物群体(E:T比：20:1)。数据点代表4次独立实验的平均值±SEM。

图12：双特异性[CD20×NKG2D]抗体与小鼠NKG2D的交叉反应性。

将CD20阳性Ramos Burkitt淋巴瘤细胞与双特异性[[CD20×NKG2D]抗体孵育，然后与小鼠NKG2D胞外域和人IgG1 Fc结构域的融合蛋白(小鼠NKG2D Fc)孵育，或与人NKG2DFc融合蛋白(人NKG2D Fc)或对照蛋白NKp46-Fc([CD20×NKG2D]+Fc融合)进行比较。

然后用流式细胞仪分析的针对人Fc结构域的FITC偶联抗体检测融合蛋白的结合。结果，双特异性抗体[CD20×NKG2D#3]与人NKG2D(左，上)和小鼠NKG2D(中，上)反应，但不与对照蛋白(右)反应。另一方面，抗体[CD20×NKG2D#32]仅显示与人NKG2D融合蛋白的反应(左，下)。

实施例

以下实施例阐明本发明。

实施例1-材料与方法

噬菌体展示

如前所述进行噬菌体展示实验[29]。幼稚抗体基因文库HAL7和HAL7b用于针对重组人NKG2D-Fc融合蛋白的生物淘选。使用类似构建的NKp30-Fc作为对照。

测序，序列分析

Sanger测序用于鉴定不同的NKG2D特异性scFv并验证DNA序列。使用VBASE2和Vector NTI Advance 11.5.4软件进行序列分析。

细胞培养

将Raji细胞(DSMZ)维持在补充有10％胎牛血清(FCS；Invitrogen)、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素(Invitrogen)的RPMI 1640Glutamax-I培养基(Invitrogen)中。将GRANTA-519(DSMZ)和Lenti-X 293T细胞(Takara Bio Europe/Clontech)在补充有10％FCS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’smodified Eagle medium)-Glutamax-I培养基(Invitrogen)中培养。将中国仓鼠卵巢(CHO)-S，悬浮适应的CHO细胞(Life Technologies)保存在含有1％ GlutaMax(200mM L-Ala-L-Gln,Gibco/Invitrogen)和1％ HT补充物的CD CHO-培养基(Gibco/Invitrogen)中用于维持，并在补充有1％ Pluronic-F68、1％ GlutaMax和1％ HAT补充物(CHO生产培养基)的CD OptiCHO(Gibco)中用于抗体产生。

bsAb和抗体衍生物的克隆、表达和纯化

为了构建双特异性双抗体的重链衍生物，将不同抗NKG2D scFv的DNA序列作为NcoI/NotI盒连接到表达载体pΔIRES-RTX-VH-CH1(M.Peipp，未发表)中，所述表达载体是pIRES-ZSK Green的衍生物，其中内部核糖体进入位点和GFP编码序列均已被编码利妥昔单抗VH先导序列、利妥昔单抗VH链、IgG1 CH1结构域和抗体的上游铰链区的序列代替。为了用于[CD20×NKG2D]bsAb筛选的少量生产，将Lenti-X 293T细胞用编码双抗体的重链衍生物或利妥昔单抗轻链[30]的表达载体通过磷酸钙法[9]瞬时共转染。如前所述，使用MaxCyteSTX电穿孔***(MaxCyte)，通过流式电穿孔，将选定的克隆也在CHO-S细胞中瞬时表达[31]。然后，将细胞在32℃，5％ CO₂和143rpm的CHO生产培养基(REF)中培养，直到细胞活力降至50％以下。每天补充原料液，其含有70％ CHO CD Efficient Feed A原液(Invitrogen)、14％ Yeastolate TC UF(Becton Dickinson)、3.5％ GlutaMax(200mM)和12.5％葡萄糖(450g/L,Sigma)。收集细胞培养上清液，并按照制造商的说明，使用CaptureSelect IgG-CH1亲和基质(Thermo Fisher Scientific)通过亲和层析纯化蛋白。BsscFvs[CD19×CD3]和[HER2×CD3]，均基于来自博纳吐单抗的CD3 scFv部分(WO2005/040220)，如前所述进行表达和纯化[32]。融合蛋白NKG2D-Fc和NKp30-Fc的产生如先前发表制备[33]。在对磷酸盐缓冲盐水(PBS,Invitrogen)进行广泛透析后，将分子储存在4℃直至使用。

SDS-PAGE

根据标准程序，在还原或非还原条件下，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行重组BSAb的分离和检测。通过考马斯染色(考马斯亮蓝G250溶液，CarlRoth GmbH)分析蛋白的数量和质量。根据利妥昔单抗的标准曲线估计纯化的抗体的浓度(Roche)。

流式细胞术

在Navios流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行流式细胞术实验。在补充有1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)和0.1％叠氮化钠(PBA)的PBS中洗涤30万个细胞。通过将Raji细胞与[CD20×NKG2D]bsAbs(50μg/mL)预孵育，然后与NKG2D-Fc(100μg/mL)或对照蛋白NKp30-Fc在冰上孵育60分钟，来证明同时结合。最后，通过用多克隆FITC偶联的抗人IgG-FcF(ab′)₂片段(Beckman Coulter)染色来检测表面结合的复合物。分离的NK或T细胞根据制造商的建议，使用FITC或Pacific Blue缀合的CD3抗体、APC偶联的CD56抗体、PE缀合的CD16抗体(Beckman Coulter)和相应的同种型对照，通过流式细胞术进行表征。使用PE或FITC缀合的抗体(Beckman Coulter)类似地分析靶细胞上的CD19、CD20和CD38表达。

MNC的制备和NK细胞和T细胞的分离

所有实验均由Kiel(Kiel,Germany)的Christian-Albrechts-University的伦理委员会批准。在获得书面知情同意后，从健康捐献者抽取血液。通过Ficoll-Paque PLUS密度梯度(GE Healthcare)从患者和健康志愿者的外周血或从白细胞减少***室制备MNC。离心后，在血清/Ficoll界面收集MNC，并通过低渗裂解除去剩余的红细胞。通过MACS技术，使用NK细胞分离试剂盒和CD8⁺T细胞隔离试剂盒(Miltenyi)，按照制造商的方法，通过阴性选择从MNC分别分离NK细胞和CD8阳性αβT细胞。纯化的MNC直接用于功能测定。将富集的NK细胞在补充有10％FCS、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的RPMI 1640Glutamax-I培养基中以2×10⁶细胞/mL的密度培养过夜。将CD8⁺T细胞用IL-2(300U/mL)刺激48h，然后将其用于功能测定。在补充有10％FCS、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的RPMI 1640Glutamax-I培养基中，将细胞保持在1×10⁶细胞/mL的密度。

NK细胞活化的分析

将十万个NK细胞与等量的GRANTA-519细胞一起在200μL体积的微量滴定板中孵育。添加[CD20×NKG2D]bsAbs、利妥昔单抗(Roche)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Roche)或PBS。4h后，将细胞用针对CD69(PE缀合，Beckman Coulter)、CD56(APC,Beckman Coulter)、CD19(FITC,Beckman Coulter)和CD3(Pacific Blue,Beckman Coulter)的抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。门控CD56阳性、CD3和CD19阴性NK细胞，并确定CD69的表达水平。

NK细胞和T细胞细胞毒性的分析

如之前所述[9]，在标准4h ⁵¹Cr释放实验中分析细胞毒性，其在96孔微量滴定板中进行，总体积为200μL。人NK细胞、CD8⁺T细胞或MNC以指定的效应细胞与靶细胞(E:T)比用作效应物群体。

统计分析和数据处理

使用重复测量ANOVA和Bonferroni后检验确定p值。对于p<0.05，零假设被拒绝。使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计和图形分析。通过使用GraphPad Prism 5.0软件插值不同作用水平下所需的抗体剂量，并使用公式CI_x＝D_A/D_xA+D_B/D_xB(D_xA和D_xB，单独产生x％效果的药物A和B的剂量；D_A和D_B，联合产生相同效果的药物A和B的剂量)计算组合指数(CI)值来分析协同效果[34]。协同作用分为强协同作用(CI＝0.1-0.3)，协同作用(CI＝0.3-0.7)，中度协同作用(CI 0.7-0.85)，轻微协同作用(CI＝0.85-0.95)和无拮抗作用(CI>1)。

实施例2-通过噬菌体展示分离人NKG2D抗体

为了产生新的人NKG2D特异性抗体，通过对由人NKG2D的胞外域和人IgG1 Fc结构域组成的重组融合蛋白进行生物淘选，筛选了幼稚人噬菌体展示scFv文库[29]。通过这种方式，分离出38种不同的噬菌体，其在酶联免疫吸附测定(ELISA)中结合人NKG2D Fc，但不结合含有NKp30的胞外域的类似构建的对照分子(图1A)。通过比对不同NKG2D反应性scFv的可变区进行的详细序列分析表明，单个克隆可以分配给不同的种系基因片段家族，具有各种V_H/V_L组合，并且可以分为三组。最大的组具有IGHV3和IGLV3框架家族的组合(25个克隆)，其次是IGHV3/IGLV1(9个克隆)。此外，鉴定了IGHV1/IGLV3(2个克隆)、IGHV1/IGLV6和IGHV5/IGLV1(各自1个克隆)的罕见组合。除了IGLV6外，所有分析的V区均属于主要的人V_H-(V_H1-V_H6)和V_L家族(V_κ1-V_κ4；V_λ1-V_λ3)[35]。如所预期的，IGHV3出现在大多数克隆中，因为据报道其是具有最高热力学稳定性和可溶性蛋白产量的结构域[36]。

实施例3-双特异性抗体的产生

将38个分离的克隆加工成双特异性[CD20×NKG2D]抗体。为了确保有效的筛选过程，我们使用了异二聚体双抗体形式，其含有源自单克隆CD20抗体利妥昔单抗的抗原结合片段(Fab)，其通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头与不同的抗NKG2D scFv遗传融合(图2A和B)。通过CH1特异性亲和层析，从细胞培养上清液瞬时表达和纯化所得的bsAb。38种单独的抗NKG2D scFv中的36种以双特异性形式成功产生。对于两个克隆，由于未知原因，蛋白表达不可行。在考马斯染色的SDS-PAGE中分析蛋白的完整性和纯度(图2C)。对于选定的实验，通过尺寸排阻色谱法去除多聚体(图8)。

实施例4-抗原结合

然后，通过流式细胞术分析不同[CD20×NKG2D]抗体的结合能力。特别地，分析了两种抗原同时结合的能力，这对于交联靶细胞和效应细胞至关重要。因此，首先将CD20阳性淋巴瘤细胞与双特异性[CD20×NKG2D]抗体孵育，然后与可溶性人NKG2D-Fc或对照蛋白NKp30-Fc反应。随后用针对人Fc结构域的抗体检测细胞结合的Fc融合蛋白。只有当bsAb同时结合细胞CD20和可溶性NKG2D-Fc时，才能检测到整个复合物。如平均荧光强度(MFI)的变化所示，除了一个克隆(图3A和3B)之外，不同的NKG2D特异性bsAb与CD20和NKG2D反应。有趣的是，克隆显示出各种MFI值，这可能是由于与NKG2D的结合亲和力不同。相反，与对照分子NKp30-Fc孵育后，未检测到结合，证实了bsAb对人NKG2D胞外域的特异性。

实施例5-NK细胞活化

效应细胞针对的bsAb的重要能力是它们激活靶向的免疫效应细胞群的能力。因此，分析了36种不同的[CD20×NKG2D]双特异性抗体激活人NK细胞的能力。因此，在双特异性NKG2D抗体存在下，孵育NK细胞和淋巴瘤细胞，并测量CD56阳性NK细胞上早期激活标记物CD69的诱导表达。有趣的是，大多数bsAb无效或只是中等有效的(图4)。然而，鉴定了三种不同的NKG2D scFv克隆(#3，#32，#35)，其诱导有效的NK细胞活化。在以下实验中，我们专注于含有抗NKG2D scFv克隆#3(蓝色)和#32(红色)的bsAb，其显示出最高的活化效率。两个克隆都具有IGVL3框架，但在VH域框架中有所不同(图1B)。选择克隆#24(绿色)作为具有低活化特征的bsAb的代表性对照。

实施例6-与天然和Fc工程化抗体组合的细胞毒性能力和协同活性

在以前的研究中，我们已经证实，结合(engaging)NKG2D的双特异性免疫配体触发NK细胞细胞毒性，并通过治疗性抗体增强NK细胞介导的ADCC[19,20]。

为了研究新的双特异性[CD20×NKG2D]抗体是否发挥了这些功能，将bsAb作为单一物质或与CD38抗体达雷木单抗(daratumumab)组合进行分析，并且用单核细胞(MNC)和纯化的NK细胞分析细胞毒性。使用来自两名MCL患者的CD38/CD20双阳性套细胞淋巴瘤(MCL)GRANTA-519细胞或分离的淋巴瘤细胞作为靶细胞。两种双抗体[CD20×NKG2D#3]和[CD20×NKG2D#32]诱导GRANTA-519MCL细胞的大量裂解，作为单一物质的纯化的NK细胞作为效应细胞群体。此外，[CD20×NKG2D#3]也能够介导患者淋巴瘤靶细胞的裂解(图5B)。然而，当应用MNC时，两种双抗体在GRANTA-519靶细胞上没有观察到显著影响(图5A)。重要的是，CD38抗体和CD20针对的bsAbs[CD20×NKG2D#3]或[CD20×NKG2D#32]的组合在触发效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤方面比单一物质更有效。当分析细胞系GRANTA-519(图5A)和来自MCL患者的分离的肿瘤细胞(图5B)时都是这种情况。有趣的是，含有NKG2D特异性scFv的bsAb，例如在CD69诱导方面具有低活化能力的克隆#24，不能与单克隆抗体组合增加肿瘤细胞裂解(图8)。

通过增加对FcγRIIIa的亲和力来进行mAb的Fc工程化代表了增强其细胞毒性潜力的有效方法[6]。在先前的研究中，我们已经证实，增加对FcγRIIIa的亲和力超过某个阈值并不能转化为ADCC活性的进一步增加[37]，这表明难以增强Fc工程化抗体的ADCC。为了研究NK细胞介导的ADCC的这个上限是否是由于FcγRIIIa活化的某个最大限度或者NK细胞的细胞毒性能力的更一般的限制，分析了NKG2D双特异性抗体和Fc工程化抗体的组合的细胞溶解能力。为了解决这个问题，在ADCC反应中，测试了与新的双特异性[CD20×NKG2D]抗体组合的修饰为增强结合活化FcγR的Fc工程化CD19抗体(CD19-DE)[38]。BSAb对NKG2D的共刺激甚至增强CD19-DE介导的针对GRANTA-519MCL靶细胞的ADCC(图6)，其表达大量的CD19和CD20(数据未显示)。因此，与作为单一物质的CD19-DE相比，克隆#3的最大裂解从16.3±0.9％增加到24.5±1.2％，克隆#32的最大裂解从17.2±1.7％增加到28.2±2.2％。此外，CD19-DE介导的ADCC通过两种bsAb的NKG2D结合而协同增强。在使用mAb和NKG2D特异性bsAb的所有组合实验中都是如此(表1)。

表1：达雷木单抗或CD19-DE与[CD20×NKG2D]bsAb的组合的CI值

使用GraphPad Prism 5.0软件，使用指定的靶细胞和效应细胞，从两种不同效应水平的剂量应答曲线计算组合指数(CI)。值得注意的是，当在饱和浓度下用单一物质处理未达到指定的效果水平时，未计算CI值(n.a.，不适用)(强协同CI＝0.1-0.3；协同CI＝0.3-0.7；中度协同CI 0.7-0.85；轻微协同0.85-0.95；拮抗CI>1)。

实施例7-双特异性T细胞衔接子的共刺激

与其作为NK细胞的主要激活受体的作用相反，NKG2D也在CD8⁺αβ-和γδT细胞上表达，但这里有更复杂的功能。我们在先前的研究中证实，双特异性NKG2D针对的免疫配体能够通过γδT细胞系诱导淋巴瘤细胞裂解[39]，但外周血αβT细胞的活性水平较低[19]。为了研究新的双特异性抗体的潜在T细胞刺激功能，分析了由bsAb[CD20×NKG2D#3]和[CD20×NKG2D#32]单独或与[CD19×CD3]bsscFv以BiTE样形式组合触发的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。有趣的是，与bsscFv[CD19×CD3]组合，两种bsAb都能够显著增加T细胞介导的GRANTA-519MCL靶细胞的裂解，即使它们没有可测量的单一物质活性(图7B)。

总之，鉴定了两个抗NKG2D scFv克隆，当转化为双特异性抗体时，两者都能够作为单一物质触发NK细胞细胞毒性，尽管处于中等水平，通过天然和Fc工程化单克隆抗体协同增强ADCC，并增强CD3针对的双特异性抗体通过诱导CD8阳性T细胞来杀伤肿瘤细胞。

实施例8-曲妥珠单抗在乳腺癌中的共刺激

为了评估将针对NKG2D的(NKG2D-directed)双特异性抗体与经批准的治疗性抗体组合的概念是否更普遍适用，将靶向实体瘤上的Her2抗原的双特异性抗体与临床批准的抗体西妥昔单抗(cetuximab)组合。将单核细胞用作效应细胞，SKBR3乳腺癌细胞用作靶细胞。与淋巴瘤模型的结果相似，在这种情况下，双特异性抗体显著增强西妥昔单抗的ADCC活性(图10)。因此，使用针对NKG2D的双特异性作为已经批准的免疫治疗剂的增强剂的提议概念广泛适用于在肿瘤细胞或自身反应性免疫细胞的表面上表达的各种抗原。

4D5(曲妥珠单抗)VH核苷酸序列:

gaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggactattggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcg(SEQ ID NO:30)

4D5(曲妥珠单抗)VH氨基酸序列:

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvss(SEQ ID NO:31)

CDR1 VH:GFNI(SEQ ID NO:32)

CDR2 VH:IYPTNGYT(SEQ ID NO:33)

CDR3 VH:SRWGGDGFYAMDY(SEQ ID NO:34)

4D5(曲妥珠单抗)VL核苷酸序列:

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctattctggagtcccttctcgcttctctggatccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaa(SEQ ID NO:35)

4D5(曲妥珠单抗)VL氨基酸序列:

diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveik(SEQ ID NO:36)

CDR1 VL:QDVNTA(SEQ ID NO:37)

CDR2 VL:SAS

CDR3 VL:QQHYTTPPT(SEQ ID NO:38)

实施例9-达雷木单抗在多发性骨髓瘤中的共刺激

为了进一步评估将NKG2D针对的双特异性抗体与经批准的治疗性抗体组合的概念是否可以推广，将靶向多发性骨髓瘤的CS1(CD319)或CD138的双特异性抗体[CS1xNKG2D#32]或[CD138xNKG2D#32]与临床批准的抗体达雷木单抗组合。单核细胞用作效应细胞，并且SKBR3乳腺癌细胞用作靶细胞。与淋巴瘤模型和乳腺癌模型的结果相似，在这种情况下，双特异性抗体显著增强达雷木单抗的ADCC的活性(图11)。

CD138 VH核苷酸序列:

caggtgcagctgcagcagtctggatccgagctgatgatgcctggggcctcagtgaagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtaactactggatagagtgggtaaagcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaacaggtaggactatatacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatatttcctccaacacagtccagatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagaagggactattacggcaacttctactatgctatggactactggggccaagggaccagcgtcaccgtctcctcg(SEQ IDNO:39)

CD138 VH氨基酸序列:

qvqlqqsgselmmpgasvkisckatgytfsnywiewvkqrpghglewigeilpgtgrtiynekfkgkatftadissntvqmqlssltsedsavyycarrdyygnfyyamdywgqgtsvtvss(SEQ ID NO:40)

CDR1-VH:GYTFSNYW(SEQ ID NO:41)

CDR2-VH:ILPGTGRT(SEQ ID NO:42)

CDR3-VH:ARRDYYGNFYYAMDY(SEQ ID NO:43)

CD138 VL核苷酸序列:

gatatccagatgacacagtctacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattaacaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttgaactcctgatctattacacatcaactttacagtcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattggcacttactattgtcagcagtatagtaagcttcctaggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa(SEQ ID NO:44)

CD138 VL氨基酸序列:

diqmtqstsslsaslgdrvtiscsasqginnylnwyqqkpdgtvelliyytstlqsgvpsrfsgsgsgtdysltisnlepedigtyycqqysklprtfgggtkleik(SEQ ID NO:45)

CDR1-VL:QGINNY(SEQ ID NO:46)

CDR2-VL:YTS

CDR3-VL:QQYSKLPRT(SEQ ID NO:47)

CD319(CS-1)VH核苷酸序列:

gaggtgcagcttgtcgagtctggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgagactctcctgtgcagcctcaggattcgattttagtagatactggatgagttgggtccggcaggctccagggaaagggctagaatggattggagaaattaatccagatagcagtacgataaactatgcgccatctctaaaggataaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatagcctgtacctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacagccgtttattactgtgcaagacctgatgggaactattggtacttcgatgtctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:48)

CD319(CS-1)VH氨基酸序列:

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfdfsrywmswvrqapgkglewigeinpdsstinyapslkdkfiisrdnaknslylqmnslraedtavyycarpdgnywyfdvwgqgtlvtvss(SEQ ID NO:49)

CDR1-VH:GFDFSRYW(SEQ ID NO:50)

CDR2-VH:INPDSSTI(SEQ ID NO:51)

CDR3-VH:ARPDGNYWYFDV(SEQ ID NO:52)

CD319(CS-1)VL核苷酸序列:

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcaaggcgagtcaggacgttggcattgctgtagcctggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaaactcctgatctattgggcatccactcggcacacaggagtcccagatcggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcaacagtatagcagttacccgtacacttttggccaggggaccaaggtggagatcaaa(SEQ ID NO:53)

CD319(CS-1)VL氨基酸序列:

diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqdvgiavawyqqkpgkvpklliywastrhtgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqqyssypytfgqgtkveik(SEQ ID NO:54)

CDR1-VL:QDVGIA(SEQ ID NO:55)

CDR2-VL:WAS

CDR3-VL:QQYSSYPYT(SEQ ID NO:56)

实施例10-NKG2D克隆#3对小鼠NKG2D有交叉反应性

对于临床前评估，跨物种反应性有利于在临床前动物模型(例如小鼠模型)中表征潜在的临床候选物。NKG2D克隆#3显示出与小鼠和人NKG2D的显著结合，因此可以是小鼠模型中评估的有趣候选物(图12)。

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Claims (13)

1.一种Fab-scFv融合蛋白，其

(i)通过Fab支架，特异性结合肿瘤细胞或自体反应性免疫细胞的表面上表达的抗原，和

(ii)通过scFv片段，特异性结合白细胞，优选细胞毒性淋巴细胞的表面上表达的抗原。

2.权利要求1的Fab-scFv融合蛋白，其中

(ii)的抗原在自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和/或细胞毒性胸腺细胞(T细胞)，和/或其遗传工程化的细胞上表达。

3.权利要求1或2的Fab-scFv融合蛋白，其中

(ii)的抗原选自NKG2D、CD137、NKp30、NKp46、NKp44、2B4、DNAM-1、CD2、CD4、CD8和CD28，其中所述抗原优选为NKG2D。

4.权利要求1-3中任一项的Fab-scFv融合蛋白，其中

(i)的抗原选自CD20、CD19、CD22、CD37、CD38、CD7、CD33、CD44、CD54、CD64、CD75s、CD79b、CD96、CD138、CD123、CD317、CD319、BCMA、FCRL5、FLT3、EGFR、HER2、EpCAM CEA、GD2和Claudin 6/18，其中所述抗原优选为CD20。

5.权利要求1-4中任一项的Fab-scFv融合蛋白，其中所述Fab-scFv融合蛋白，

在(i)的情况下，包含SEQ ID NO 22-26和CDR2 VL ATS的6个CDR；和/或

在(ii)的情况下，包含SEQ ID NO 1-5和CDR2 VL GNN、或者SEQ ID NO 6-10和CDR2 VLGKN、或者SEQ ID NO 11-15和CDR2 VL GKN的6个CDR。

6.权利要求1-5中任一项的Fab-scFv融合蛋白，其中所述Fab-scFv融合蛋白，

在(i)的情况下，包含SEQ ID NO 27和28的可变重链区和可变轻链区；和/或

在(ii)的情况下，包含SEQ ID NO 16和17、或者SEQ ID NO 18和19、或者SEQ ID NO 20和21的可变重链区和可变轻链区。

7.一种核酸序列或核酸序列组，其编码权利要求1-6中任一项的Fab-scFv融合蛋白。

8.一种载体或载体组，其编码可表达形式的权利要求1-6中任一项的Fab-scFv融合蛋白。

9.一种宿主细胞，优选非人宿主细胞，其包含权利要求8的载体。

10.一种制备权利要求1-6中任一项的Fab-scFv融合蛋白的方法，其包括，

(a)在宿主细胞表达权利要求1-6中任一项的多特异性抗体的条件下，培养权利要求9的宿主细胞，和

(b)分离(a)中表达的权利要求1-6中任一项的多特异性抗体。

11.一种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的Fab-scFv融合蛋白、权利要求7的核酸序列、权利要求8的载体或者权利要求9的宿主细胞，并且任选地包含

(a)抗体，其特异性结合肿瘤细胞的表面上表达的(i)的抗原之外的抗原，其中(a)的抗体优选特异性结合CD19或CD38，和/或

(b)抗体，其特异性结合细胞毒性淋巴细胞的表面上表达的(ii)的抗原之外的抗原，其中(b)的抗体优选特异性结合T细胞和NKT细胞的表面上表达的CD3，和/或NK细胞的表面上表达的CD16或CD32，和/或

(c)细胞产物，优选嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体自然杀伤细胞，其中所述细胞产物表达(ii)的抗原，并且其中所述细胞产物优选包含细胞毒性淋巴细胞，所述细胞毒性淋巴细胞优选经遗传修饰以表达合成的免疫受体，其含有对(i)以外的抗原的结合位点。

12.权利要求1-6中任一项的Fab-scFv融合蛋白、权利要求7的核酸序列、权利要求8的载体、权利要求9的宿主细胞或者权利要求11的药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤或自身免疫性疾病。

13.根据权利要求12使用的Fab-scFv融合蛋白、核酸序列、载体、宿主细胞或药物组合物，其中，额外地，

(a)使用抗体，其特异性结合肿瘤细胞的表面上表达的(i)的抗原之外的抗原，其中(a)的抗体优选特异性结合CD19或CD38，和/或

(b)使用抗体，其特异性结合细胞毒性淋巴细胞的表面上表达的(ii)的抗原之外的抗原，其中(b)的抗体优选特异性结合T细胞的表面上表达的CD3，或NK细胞的表面上表达的CD16或CD32，和/或

(c)细胞产物，优选嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体自然杀伤细胞，其中所述细胞产物表达(ii)的抗原，并且其中所述细胞产物优选包含细胞毒性淋巴细胞，所述细胞毒性淋巴细胞优选经遗传修饰以表达合成的免疫受体，其含有对(i)以外的抗原的结合位点。