CN117646077A - 一组用于鼻咽癌早期诊断的组织内微生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组用于鼻咽癌早期诊断的组织内微生物标志物。本发明提供了一组微生物标志物组合，包括肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)中的至少一种。通过该标志物组合可以构建用于预测早期鼻咽癌的诊断模型，计算受试者的风险评分，该模型在全组病人中ROC曲线下面积为0.954，灵敏度89.8％，特异度88.9％，可以精确判断受试者是否具有早期鼻咽癌的高度风险，为罹患鼻咽癌高风险患者提供进一步个体化精准治疗打下基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组用于鼻咽癌早期诊断的组织内微生物标志物。
背景技术
鼻咽癌是我国最常见的头颈部恶性肿瘤之一，以广东等华南地区最高发，严重威胁我国人民生命健康。不幸的是，早期鼻咽癌患者没有症状或者症状较轻，容易误诊或漏诊。目前新诊断的鼻咽癌超过70％为局部晚期或者出现远处转移，这是影响生存率的最重要因素。因此即使现代影像学技术的发展,放射治疗技术的改进和放化综合治疗方案的应用,使鼻咽癌的局部控制率已显著提高，但鼻咽癌的总体预后仍较差。目前检测特异性疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)的DNA和抗体是鼻咽癌无创性早期诊断的重要方法。但是对于EBV的各种方法的检测敏感性和特异性各不相同。由此可见,如何准确对鼻咽癌患者进行早期诊断,进而实施“个体化”干预治疗,是进一步提高疗效的关键。
作为人体与外界环境的重要交通枢纽，鼻咽部是微生物的重要栖息地。微生物群作为人体的“隐形器官”，参与调控人体的新陈代谢和免疫***，其功能紊乱可导致各种疾病，尤其是与多种癌症的发生发展密切关联。目前，已有研究通过分析直肠癌及腺瘤以及健康人的肠粘膜及粪便标本，发现健康人与肿瘤病人之间的微生物谱存在显著差别；另有报道发现，对肺癌及良性肺疾病病人的肺泡灌洗液中的微生物组成进行分析，结果显示两组的肺部微生物明显不同。表明微生物与肿瘤生物学行为密切关联，使其在肿瘤早期诊断方面展现出重要价值，有望作为新的标志物类型用于疾病的早期诊断。
在鼻咽癌中，目前没有组织内微生物与鼻咽癌发生及早期诊断的关系研究。因此，筛选健康与鼻咽癌患者关键的差异微生物，建立鼻咽癌早期诊断模型，甄选罹患鼻咽癌高风险患者进一步开展个体化精准治疗，是提高鼻咽癌患者疗效的关键，可为最终实现鼻咽癌的个体化治疗以及提高鼻咽癌患者的治愈率奠定基础。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于提供一组微生物标志物组合的检测试剂在制备产品中的应用。
本发明第二个方面的目的，在于提供一组微生物标志物组合。
本发明第三个方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第四个方面的目的，在于提供一种用于鼻咽癌诊断的模型的构建方法。
本发明第五个方面的目的，在于提供一种用于鼻咽癌诊断的***。
为了实现本发明的上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供检测标志物的试剂在制备产品中的应用，所述产品用于鼻咽癌的诊断，所述标志物包含肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)中的至少一种。
优选地，所述应用的特征在于：所述标志物为a1)-a5)中任一种：
a1)肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)；
a2)贪铜菌属(Cupriavidus)；
a3)短杆菌属(Brevibacterium)；
a4)***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)；
a5)肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)。
优选地，所述标志物为肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)。
优选地，所述标志物为贪铜菌属(Cupriavidus)。
优选地，所述标志物为短杆菌属(Brevibacterium)。
优选地，所述标志物为***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)。
优选地，所述标志物为肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)。
优选地，所述标志物还包含其他用于鼻咽癌诊断的标志物，包括EBV DNA、EBV-VCA-IgM、EBV-VCA-IgA、EBV-VCA-IgG、miR-BARTs、miR-93、miR-142-3p、miR-26a、miR-29c、miR-30e、miR-154-5p、miR-449b-5p、miR-140-5p、miR-34c-5p、miR-22、miR-572、miR-638、miR-1234、miR-9、miR-203、miR-23a、RKIP、Maspin、GRP78、P85-Ab、甲基化CDKN2A、甲基化DLEC1、甲基化DAPK1和甲基化UCHL1中的至少一种。
优选地，所述试剂包含检测所述标志物的含量或丰度的试剂。
优选地，所述试剂包含用于选自下组的一种或多种检测方法的试剂：16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列、PCR-ELISA。
优选地，所述试剂包含对所述标志物具有特异性的引物、探针、适配体、抗体中的至少一种。
优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、***中的至少一种。
优选地，所述产品的受试样品选自待测对象的体液、组织、细胞、分泌物中的至少一种。
优选地，所述体液包含血液、淋巴液中的至少一种。
优选地，所述血液包括血清、血浆、干血斑、全血中的至少一种。
优选地，所述组织包含鼻咽组织。
优选地，所述分泌物包含鼻涕、黏膜液中的至少一种。
优选地，所述待测对象包含哺乳动物，例如人类、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。
优选地，所述待测对象包含人类。
本发明的第二方面，提供一种微生物标志物组合，包含肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)。
优选地，所述标志物组合用于鼻咽癌的诊断。
本发明的第三方面，提供一种产品，包含用于检测本发明第二方面的微生物标志物组合的试剂。
优选地，所述产品用于鼻咽癌的诊断。
优选地，所述试剂包含检测所述标志物的含量或丰度的试剂。
优选地，所述试剂包含用于选自下组的一种或多种检测方法的试剂：16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列、PCR-ELISA。
优选地，所述试剂包含对所述标志物具有特异性的引物、探针、适配体、抗体中的至少一种。
优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、***中的至少一种。
优选地，所述产品的受试样品选自待测对象的体液、组织、细胞、分泌物中的至少一种。
优选地，所述体液包含血液、淋巴液中的至少一种。
优选地，所述血液包括血清、血浆、干血斑、全血中的至少一种。
优选地，所述组织包含鼻咽组织。
优选地，所述分泌物包含鼻涕、黏膜液中的至少一种。
优选地，所述待测对象包含哺乳动物，例如人类、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。
优选地，所述待测对象包含人类。
本发明的第四方面，提供一种用于鼻咽癌诊断的模型的构建方法，所述方法包括使用本发明的第三方面所述的标志物组合进行模型构建。
优选地，所述模型的构建的算法包括对数回归、线性判别分析、特征基因线性判别分析、支持向量机、随机森林、递归分区树、XGBoost决策树分类技术、ShrunkenCentroids、StepAIC、Kth-Nearest Neighbor、Boosting、神经网络、贝叶斯网络、隐马尔可夫模型。
本发明的第五方面，提供一种用于检测鼻咽癌诊断的***，所述***包含根据本发明的第四个方面所述的标志物组合的检测结果判断是否患鼻咽癌的计算装置。
优选地，所述检测结果是针对来自待测对象的受试样本进行检测得到。
优选地，所述受试样品选自体液、组织、细胞、分泌物中的至少一种。
优选地，所述体液包含血液、淋巴液中的至少一种。
优选地，所述血液包括血清、血浆、干血斑、全血中的至少一种。
优选地，所述组织包含鼻咽组织。
优选地，所述分泌物包含鼻涕、黏膜液中的至少一种。
优选地，所述待测对象包含哺乳动物，例如人类、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。
优选地，所述待测对象包含人类。
优选地，所述***还包括检测装置。
优选地，所述检测包含检测所述标志物组合中的标志物的含量或丰度。
优选地，所述检测装置用于执行下组一种或多种检测方法：16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列、PCR-ELISA。
优选地，所述***还包括以下任意一种或多种：
1)检测结果收集装置，也可称为检测结果输入装置，具体地可以是鼠标、键盘、触摸屏显示器、一个或多个按钮、一个或多个开关、一个或多个触发器等等中的一个或多个；
2)诊断结果输出装置，也可称为诊断结果显示装置，具体地可以是液晶显示器(LCD)、发光二极管(LED)显示器、等离子体显示器、投影显示器、触摸屏显示器等等中的一个或多个；
3)诊断结果发送装置，所述结果发送装置可以将受试者的是强或弱风险人群的分辨结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一组微生物标志物组合，包括肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)。通过该标志物组合可以构建用于预测早期鼻咽癌的诊断模型，计算受试者的风险评分，该模型在训练组中ROC曲线下面积为0.951，灵敏度83.0％，特异度94.4％，在验证组中ROC曲线下面积为0.959，灵敏度87.8％，特异度94.4％，在全组病人中ROC曲线下面积为0.954，灵敏度89.8％，特异度88.9％，可以精确判断受试者是否具有早期鼻咽癌的高度风险，为罹患鼻咽癌高风险患者提供进一步个体化精准治疗打下基础。
附图说明
图1：Lefse分析(LDA Effect Size分析)筛选出4个鼻咽癌组及正常组之间的差异细菌。
图2：热图显示训练组中肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)在各个病人组织中的丰度高低。
图3：ROC曲线显示训练组中组织内微生物早期诊断标志物的曲线下面积(AUC)。
图4：ROC曲线显示验证组中组织内微生物早期诊断标志物的曲线下面积(AUC)。
图5：ROC曲线显示全组病人中组织内微生物早期诊断标志物的曲线下面积(AUC)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1样品来源及制备
1、样品来源
本申请使用的样品来自于中山大学肿瘤防治中心，包括36例非鼻咽癌病人的鼻咽组织标本，及343例鼻咽癌组织标本。
2、纳入标准
非鼻咽癌病人纳入标准为：①既往没有肿瘤病史；②因病情需要进行病理活检以排除鼻咽癌。
鼻咽癌病人纳入标准如下：①病理活检证实为鼻咽癌；②初诊病人，且未发生复发转移；③既往没有肿瘤病史；④未进行任何形式的抗癌治疗；⑤有完整的病历记录及规律的随访；⑥可获取组织样本及足够DNA用于后续实验。
排除标准均为：①既往有恶性肿瘤病史；②接受过抗癌治疗；③不能获得组织标本或足够组织DNA。
该项目已经得到医院伦理委员会审查批准。
3、样品制备
采用临床常规鼻咽组织获取方法，利用AllPrep DNA/RNA Micro Kit(QIAGENGmbH)试剂盒提取DNA，详细操作步骤见试剂盒说明书。
实施例2获取鼻咽组织中的微生物组成及丰度数据
以收集鼻咽组织样本DNA为模板，根据测序区域的选择，使用特异引物对338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’SEQ ID NO.1)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’SEQ IDNO.2)，进行PCR扩增(广东美格基因科技有限公司)。其次，按照UltraTMIIDNALibrary Prep Kit for/>(New England Biolabs，USA)的标准流程进行建库；应用Illumina Nova6000平台对构建的扩增子文库进行测序。通过QIIME2等软件获取鼻咽组织中的微生物组成及丰度数据；再通过去除来自宿主、测序平台以及DNA提取、PCR扩增过程的污染，并去除单一序列(singletons)，最后得到29个高平均相对丰度(≥0.1％)、高流行率(≥50％)的候选细菌。
实施例3鉴定鼻咽癌早期诊断标志物
将整组病人(36例非鼻咽癌病人的鼻咽组织标本及343例初诊非复发转移鼻咽癌组织标本)随机分为训练组(18例正常鼻咽组织及171例初诊非复发转移鼻咽癌患者)和验证组(18例正常鼻咽组织及172例初诊非复发转移鼻咽癌患者)。
在训练组中，运用R软件中的“microeco”包，使用“trans_diff$new”函数来进行线性判别分析(LDA Effect Size，LEfSe)。LEfSe分析首先使用非参数Kruskal-Wallis秩和检验检测组间丰度差异显著的物种，然后使用Wilcoxon秩和检验上一步的差异物种在不同组间子分组中的差异一致性，最后采用线性回归分析(LDA)来估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，从而找到组间在丰度上有显著差异的物种)，按照alpha＝0.001，最终识别出4个鼻咽癌与健康鼻咽组织之间的差异微生物，分别为肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)。
进一步地在LEfSe分析结果中评估计算这4个差异显著微生物的影响力指数LDAscore，结果如图1所示。其中Enterobacteriaceaes的LDA score为4.62，Cupriavidus的LDAscore为4.39，Brevibacterium的LDA score为4.09，Comamonas.testosteroni的LDAscore为3.78。
其中，Enterobacteriaceaes和Brevibacterium在鼻咽癌组织中丰度提高，Cupriavidus和Comamonas.testosteroni在鼻咽癌组织中丰度下降。这4种差异微生物在训练组189个病人中的丰度情况如图2所示。
将这4个差异微生物用其对应的LDA score进行加权，从而建立起鼻咽组织内微生物的鼻咽癌早期诊断模型，风险评分＝(4.62×Enterobacteriaceaes菌科丰度)-(4.39×Cupriavidus菌属丰度)+(4.09×Brevibacterium菌属丰度)-(3.78×Comamonas.testosteroni菌种丰度)；式中，细菌丰度为经16s rRNA测序方法检测所获得，系数为差异细菌对应的LDA score。
实施例4实验结果
对该早期鼻咽癌诊断模型风险评分绘制ROC曲线用于评估模型预测的敏感性和特异度，同时单独检验四种微生物分别作为评估模型的效果。
如图3所示，该鼻咽癌早期诊断模型在训练组中ROC曲线下面积(AUC)＝0.951，灵敏度83.0％，特异度94.4％，而以Enterobacteriaceaes作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.876，以Cupriavidus作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.763，以Brevibacterium作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.778，以Comamonas.testosteroni作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.702。
如图4所示，该鼻咽癌早期诊断模型在验证组中ROC曲线下面积(AUC)＝0.959，灵敏度87.8％，特异度94.4％，而以Enterobacteriaceaes作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.851，以Cupriavidus作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.849，以Brevibacterium作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.741，以Comamonas.testosteroni作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.796。
如图5所示，该鼻咽癌早期诊断模型在全组中ROC曲线下面积(AUC)＝0.954，灵敏度89.8％，特异度88.9％，而以Enterobacteriaceaes作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.863，以Cupriavidus作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.805，以Brevibacterium作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.760，以Comamonas.testosteroni作为单一标志物进行评估的ROC曲线下面积为0.749。
上述结果显示，联合四种差异细菌影响力指数的早期鼻咽癌诊断模型对早期鼻咽癌具有良好的预测效果，4种微生物标志物Enterobacteriaceaes、Cupriavidus、Brevibacterium和Comamonas.testosteroni的单一模型风险评分也具有一定的预测效果。
Claims (10)
1.检测标志物的试剂在制备产品中的应用，所述产品用于鼻咽癌的诊断，所述标志物包含肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述标志物为a1)～a5)中任一种：a1)肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)；
a2)贪铜菌属(Cupriavidus)；
a3)短杆菌属(Brevibacterium)；
a4)***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)；
a5)肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)；
优选地，所述试剂包含检测所述标志物的含量或丰度的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述试剂包含用于选自下组的一种或多种检测方法的试剂：16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列、PCR-ELISA；
优选地，所述试剂包含对所述标志物具有特异性的引物、探针、适配体、抗体中的至少一种；
优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、***中的至少一种；
优选地，所述产品的受试样品选自待测对象的体液、组织、细胞、分泌物中的至少一种；
优选地，所述体液包含血液、淋巴液中的至少一种；
优选地，所述血液包括血清、血浆、干血斑、全血中的至少一种；
优选地，所述组织包含鼻咽组织；
优选地，所述分泌物包含鼻涕、黏膜液中的至少一种；
优选地，所述待测对象包含哺乳动物；
优选地，所述待测对象包含人类；
优选地，所述标志物还包含其他用于鼻咽癌的诊断的标志物。
4.一种微生物标志物组合，包含肠杆菌科(Enterobacteriaceaes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和***丛毛单胞菌(Comamonas.testosteroni)。
5.一种产品，包含检测权利要求4所述的标志物组合的试剂。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：
所述试剂包含检测所述标志物组合中的标志物的含量或丰度的试剂；
优选地，所述试剂包含用于选自下组的一种或多种检测方法的试剂：16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列、PCR-ELISA；
优选地，所述试剂包含对所述标志物具有特异性的引物、探针、适配体、抗体中的至少一种；
优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、***中的至少一种；
优选地，所述产品的受试样品选自待测对象的体液、组织、细胞、分泌物中的至少一种；
优选地，所述体液包含血液、淋巴液中的至少一种；
优选地，所述血液包括血清、血浆、干血斑、全血中的至少一种；
优选地，所述组织包含鼻咽组织；
优选地，所述分泌物包含鼻涕、黏膜液中的至少一种；
优选地，所述待测对象包含哺乳动物；
优选地，所述待测对象包含人类。
7.一种用于鼻咽癌诊断的模型的构建方法，所述方法包括使用权利要求4所述的标志物组合进行模型构建；
优选地，所述模型的构建的算法包括对数回归、线性判别分析、特征基因线性判别分析、支持向量机、随机森林、递归分区树、XGBoost决策树分类技术、ShrunkenCentroids、StepAIC、Kth-Nearest Neighbor、Boosting、神经网络、贝叶斯网络、隐马尔可夫模型。
8.一种用于鼻咽癌诊断的***，所述***中包含根据对权利要求4所述的标志物组合的检测结果判断是否患鼻咽癌的计算装置。
9.根据权利要求8所述的***，其特征在于：
所述检测结果是针对来自待测对象的受试样本进行检测得到；
优选地，所述受试样品选自体液、组织、细胞、分泌物中的至少一种；
优选地，所述体液包含血液、淋巴液中的至少一种；
优选地，所述血液包括血清、血浆、干血斑、全血中的至少一种；
优选地，所述组织包含鼻咽组织；
优选地，所述分泌物包含鼻涕、黏膜液中的至少一种；
优选地，所述待测对象包含哺乳动物；
优选地，所述待测对象包含人类；
优选地，所述***还包括检测装置；
优选地，所述检测包含检测所述标志物组合中的标志物的含量或丰度；
优选地，所述检测装置用于执行下组一种或多种检测方法：16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列、PCR-ELISA。
10.根据权利要求8或9所述的***，其特征在于：
所述***还包括以下任意一种或多种：
1)检测结果收集装置；
2)诊断结果输出装置；
3)诊断结果发送装置。
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