CN117587115A - Il9基因中与血脂相关的snp位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术研究领域，公开了IL9基因中与血脂相关的SNP位点及其应用。IL9基因rs31563位点TT基因检测剂在制备高密度脂蛋白高水平筛查试剂中的应用；或，IL9基因rs31563位点CT或CC基因检测剂在制备高密度脂蛋白中低水平筛查试剂中的应用。基因载体在制备防治低密度脂蛋白水平高的药物中的应用，所述基因载体含有基因片段，所述基因片段为IL9基因中rs31563位点等位基因中单核苷酸为单核苷酸T。本发明发现了新的冠心病检测位点，同时针对不同等位基因发现了不同的风险等级，对后续冠心病的诊断预防等都提供新的方案。

Description

IL9基因中与血脂相关的SNP位点及其应用

本申请是申请日为2021-08-25，申请号为2021109788161，发明名称为与血脂相关的SNP及其应用的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于基因技术研究领域，尤其涉及IL9基因中与血脂相关的SNP位点及其应用。

背景技术

血脂异常是一类较常见的疾病，是人体内脂蛋白的代谢异常，主要包括总胆固醇(Tch)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、甘油三酯(TG)升高和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)降低等。血脂异常与心血管疾病密切相关，是导致动脉粥样硬化(AS)的重要因素之一，是冠心病(CAD)和缺血性脑卒中的独立危险因素。在我国血脂异常的发生率高，还有逐渐上升的趋势，这与我国人民的生活水平明显提高、饮食***均值为4.50mmol/L，高胆固醇血症的患病率为4.9％；甘油三酯平均值为1.38mmol/L，高TG血症的患病率为13.1％；高密度脂蛋白胆固醇平均值为1.19mmol/L，低HDL－C血症的患病率为33.9％。中国成人血脂异常总体患病率高达40.40％。

关于动脉粥样硬化的发病机制，德国病理学家Virchow于1863年提出脂质浸润假说，认为AS病变主要由血浆脂质水平升高引起。以低LDL-c或Tch升高为特点的血脂异常是动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)重要的危险因素；血脂水平与AS的发病率呈现正相关，降低LDL-c水平，可显著减少ASCVD的发病及死亡危险，在预防心血管疾病进行调脂治疗时，应将降低低密度脂蛋白胆固醇作为首要目标。目前流行病学及临床研究证明HDL-c与CAD、AS等疾病发生机率呈负相关,HDL-c主要在肝脏合成，可将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢，由胆汁排出体外，是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白。我国《血脂异常防治建议(2015版)》提出将HDL-C从原来的<35mg/dL(0.9mmol/L)提高到<40mg/dL(1.03mmol/L)可以让更多的人得到预防性治疗。因此血脂异常的早期发现和早期干预对于降低心血管事件有重要作用。

血脂异常除少数是由于全身性疾病所致的继发性血脂异常外，绝大多数是因遗传基因缺陷或与环境因素相互作用引起的原发性血脂异常。随着医学科学发展，目前已经发现有相当部分血脂异常患者存在一个或多个遗传基因缺陷。但是我们血脂异常的发病率仍再逐年增加，给社会和民众造成了极大的经济负担。有效控制血脂异常，对于ASCVD防控具有重要意义，定期检查血脂是血脂异常防治和心血管病防治的重要措施，因此需要对血脂异常早期开始诊断和干预。

发明内容

针对上述问题，本发明提供IL9基因中与血脂相关的SNP位点及其应用，主要弥补现有血脂指标研究部分空白，探索研究新的检测和治疗方案。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

IL9基因rs31563位点或位点检测剂在制备高密度脂蛋白水平和/或心血管疾病风险检测试剂中的应用；

优选的，所述应用为IL9基因rs31563位点TT基因检测剂在制备血脂异常和/或心血管疾病低风险筛查试剂中的应用，

所述应用为IL9基因rs31563位点CC或CT基因检测剂在制备血脂异常和/或心血管疾病高风险筛查试剂中的应用；

优选的，所述IL9基因rs31563位点检测剂包括该位点扩增引物对、核酸探针，所述心血管疾病风检测试剂为心血管疾病低风险检测试剂。

高密度脂蛋白水平和/或心血管疾病风险检测试剂，含有IL9基因rs31563位点检测剂；

优选的，高密度脂蛋白高水平表征和/或心血管疾病低风险检测试剂，含有IL9基因rs31563位点TT基因检测剂，

高密度脂蛋白中低水平表征试剂，含有IL9基因rs31563位点CT或CC基因检测剂；

优选的，所述IL9基因rs31563位点检测剂包括该位点扩增引物对、核酸探针。

一些方式中，所述扩增引物对位至少为

上游引物序列：GCTTAGCAAGGGTAAAGGCC，

下游引物序列：AGGTGCCTCGCTCTTTGATA。

基因片段在制备防治高密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病中的应用，其中，所述基因片段为IL9基因rs31563位点基因型为TT的基因片段。

基因载体，含有能将IL9基因rs31563位点等位基因中任一单核苷酸替换为单核苷酸T并表达的基因片段；优选的，所述IL9基因rs31563位点等位基因中单核苷酸为单核苷酸G。

前述基因载体在制备防治血脂异常和/或心血管疾病药物中的应用。

防治高密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病的药物，含有前述的基因载体；

一些方式中，所述高密度脂蛋白水平低表征为血脂异常疾病，高密度脂蛋白水平高表征为血管疾病低风险。

本发明的有益效果是：

为血脂中一些指标参数含量提供了新的检测方案，同时针对一些如血脂异常疾病也提供检测方案；并且针对一些致病机理引起的病症给出了相应的检测、治疗方案和产品。

附图说明

图1为基于HapMap数据库中中国和日本人群数据构建IL9基因连锁不平衡图谱；

图2为扩增程序示意图；

图3为网站对SNP进行综合评分机制。

具体实施方式

下面对本发明做进一步说明：

本发明第一方面提供如下方案：

IL9基因rs2069870位点或位点检测剂在制备低密度脂蛋白水平和/或心血管疾病筛查试剂中的应用；

优选的，所述应用为IL9基因rs2069870位点AA基因检测剂在制备低密度脂蛋白水平高和/或心血管疾病高风险筛查试剂中的应用，

所述应用为IL9基因rs2069870位点GG或GA基因检测剂在制备低密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病低风险筛查试剂中的应用；

优选的，所述IL9基因rs2069870位点检测剂包括该位点扩增引物对、核酸探针。

前述一些具体应用方式可参见后续相关说明，凡是没有做特别说明的，即采用现有或后续新出现等同的技术均在本发明范围内。其中作为防治药物使用时，其在药物制备过程中可作为治疗靶点等，或相关含有上述位点的基因片段作为冠心病防治药物制备过程中一些辅助试剂，如生物药物制备过程中作为测试、提取等步骤中应用。

低密度脂蛋白水平和/或心血管疾病筛查试剂，含有IL9基因rs2069870位点检测剂；

优选的，低密度脂蛋白水平高和/或心血管疾病中高风险筛查试剂中，所述IL9基因rs2069870位点检测剂为IL9基因rs2069870位点AA基因型检测剂，

低密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病低风险筛查试剂中，所述IL9基因rs2069870位点检测剂为IL9基因rs2069870位点GG或GA基因型检测剂；

优选的，所述IL9基因rs2069870位点检测剂包括扩增引物对、核酸探针。

一些方式中，前段所述扩增引物对位至少为(但不限于)

上游引物序列：TGACAAATTACTCCCCACCTCA，

下游引物序列：GCCTGACCATACTAGCAACA。

基因片段在制备防治低密度脂蛋白水平高和/或心血管疾病的药物中的应用，其中，所述基因片段为IL9基因中rs2069870位点等位基因中至少一个单核苷酸为G的基因片段。

当前述低密度脂蛋白水平检测应用于其他疾病试剂时，也应当等同在本发明范围内。

基因载体，含有能将IL9基因rs2069870位点的等位基因中任一单核苷酸替换为单核苷酸G并表达的基因片段；即，在替换过程中只要能将其中任一非单核苷酸G的等位基因替换修改为单核苷酸G。

优选的，前段所述IL9基因rs2069870位点的等位基因中任一单核苷酸为A，即只要该等位基因中含有一个G即可；当然，前述不限定一定需要完整的含有等位基因两个单核苷酸，单链或双链等均在本发明范围内。

该位点突变总结为，AA基因型为致病型，GG或GA基因型中G为保护等位。

前述基因载体在制备防治低密度脂蛋白水平高和/或心血管疾病的药物中的应用。

防治低密度脂蛋白水平高和/或心血管疾病的药物，含有前述基因载体或前述基因片段。

所述低密度脂蛋白水平高一种情况表征为血脂异常。

本发明第二方面提供如下方案(两方案均为IL9基因位点相关)：

IL9基因rs31563位点或位点检测剂在制备高密度脂蛋白水平和/或心血管疾病风险检测试剂中的应用；

优选的，所述应用为IL9基因rs31563位点TT基因检测剂在制备高密度脂蛋白水平高和/或心血管疾病低风险筛查试剂中的应用，

所述应用为IL9基因rs31563位点CC或CT基因检测剂在制备高密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病中高风险筛查试剂中的应用；

优选的，所述IL9基因rs31563位点检测剂包括该位点扩增引物对、核酸探针。

前述一些具体应用方式可参见后续相关说明，凡是没有做特别说明的，即采用现有或后续新出现等同的技术均在本发明范围内。其中作为防治药物使用时，其在药物制备过程中可作为治疗靶点等，或相关含有上述位点的基因片段作为冠心病防治药物制备过程中一些辅助试剂，如生物药物制备过程中作为测试、提取等步骤中应用。

高密度脂蛋白水平和/或心血管疾病风险检测试剂，含有IL9基因rs31563位点检测剂；

优选的，高密度脂蛋白高水平表征试剂和/或心血管疾病低风险检测试剂，含有IL9基因rs31563位点TT基因检测剂，

高密度脂蛋白中低水平表征和/或心血管疾病高风险检测试剂，含有IL9基因rs31563位点CT或CC基因检测剂；

优选的，所述IL9基因rs31563位点检测剂包括该位点扩增引物对、核酸探针。

一些方式中，前段所述扩增引物对位至少为(但不限于)

上游引物序列：GCTTAGCAAGGGTAAAGGCC，

下游引物序列：AGGTGCCTCGCTCTTTGATA。

基因片段在制备防治高密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病中的应用，其中，所述基因片段为IL9基因rs31563位点基因型为TT的基因片段。

基因载体，含有能将IL9基因rs31563位点等位基因中任一单核苷酸替换为单核苷酸T并表达的基因片段；即，在替换过程中只要能将其中任意非T单核苷酸的等位基因均替换修改为单核苷酸T。在一些情况中，主要表现为将C或G替换为T。

优选的，前段所述IL9基因rs31563位点等位基因中任一单核苷酸为G或C；当然，前述不限定一定需要完整的含有等位基因两个单核苷酸，单链或双链等均在本发明范围内。

该位点突变总结为，TT基因型为疾病低风险，CT或CC基因型为疾病高风险。

前述基因载体在制备防治高密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病药物中的应用。

防治高密度脂蛋白水平低和/或心血管疾病的药物，含有前述的基因载体和/或前述的基因序列；

一些方式中，所述高密度脂蛋白水平低表征为血脂异常疾病，高密度脂蛋白水平高表征为血管疾病低风险。

本发明第三方面对基因位点应用方法做进一步介绍：

以一基因位点为例，在涉及到这些基因位点的新应用范围中，对其应用的一些具体方法做出说明：

筛选心血管疾病低风险的生物样品的方法：

以待检测生物样品提取核酸样本；

以提取出的核酸样本为模板特异性扩增IL9基因，回收纯化扩增产物，并确定所述扩增产物的核酸序列；

判断前述确定的核酸序列的rs31563位点基因型是否为TT，若是，则待检测生物样品为心血管疾病低风险的生物样品，和/或

判断前述确定的核酸序列的rs2069870位点等位基因是否存在G，若是，则待检测生物样品为心血管疾病低风险的生物样品，反之，若其中基因型为AA则为心血管疾病高风险。

基因载体一些表现形式为质粒，腺病毒载体。比如转录激活因子样效应蛋白核酸酶等都是已经经过实践证明的技术。通过替换突变基因或其他致病基因，使其恢复成正常或低致病基因序列实现治疗，起到防、治目的。目前，基因载体优选考虑已知且成熟的，当然未来新出现能获得认可的也应当在本发明范围内；但所有的技术均应在法律允许范围内。其中具体的基础检测原理参考后续具体项目研究资料所得结果。核酸探针一种方式可采用相近基因检测探针，可行即可，不做特别限定。前文所述得物质水平、疾病风险评判标准在一些方式中可参考其他检测手段。

低密度脂蛋白水平低可以理解为心血管疾病风险低，低密度脂蛋白水平是心血管疾病风险的独立危险因素，也是传统的危险因素，当然低密度脂蛋白水平可能也是其他疾病的危险因素，心血管疾病包含很多，冠心病，糖尿病，高胆固醇血症，中风，心衰等。相反，高密度脂蛋白目前被认为是心血管疾病的保护因素，高密度脂蛋白水平越高，心血管疾病的患病风险越低。

另外说明的是：本发明所针对的疾病检测主要是为医护人员提供评判参考依据，不一定完全限制为采用现行标准来判断高中低风险，在实际使用时可以根据检测出的待检物质含量数值范围作为参考依据，权利要求中所述得高低风险不需严格参考现行医学标准，能够判断患病风险即可。当然，在需要严格配合诊断治疗方案时，可参考诊断时的风险评判。现行标准下，实际上血脂异常也泛指包括低HDL-C血症在内的各种血脂异常。实验室检查结果是诊断血脂代谢异常的主要依据。《中国成人血脂异常防治指南》根据国人的实际情况设定了血脂的新标准，胆固醇：<5.18mmol/L为合适范围，5.18～6.19mmol/L之间为边缘升高，≥6.22mmol/L为升高。低密度脂蛋白：<3.37mmol/L为合适范围，3.37～4.12mmol/L之间为边缘升高，≥4.14mmol/L为升高。甘油三酯：1.70mmol/L以下为合适范围，1.70～2.15mmol/L之间为边缘升高，≥2.26mmol/L为升高。高密度脂蛋白：男性不应<1.04mmol/L，女性不应<1.30mmol/L。但，在标准修改后，只要不偏离本发明对疾病检测、治疗的方案构思，评判标准的变化不影响技术方案落入本发明保护范围内。

上述给出的突变位点以及序列等，均是以Human GRCh38/hg38版本作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。

本发明第四方面结合一具体项目研究进行说明：

1.IL9基因Tag SNP选择

于HapMap 3期数据库上查询基因的位置信息，在Haploview软件中构建中国和日本人群的连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)图谱。选取IL9基因上的TagSNP，选点原则如下：

1)在Haploview V4.2版本的CHB+JPT(中国和日本)人群中构建覆盖整个基因及其上下游5kbp区域LD Block图谱，挑选TagSNP。

2)MAF>0.05，r2>0.8。

3)优先选择文献中已报道与炎症相关的SNP。

4)优先选择位于启动子区和外显子区的SNP。

如图1中所示，基于HapMap数据库中中国和日本人群数据构建IL9基因连锁不平衡图谱。每个方框表示SNP之间连锁不平衡程度，框内数值表示r2；连锁不平衡程度用D’颜色表示：表示强连锁；/>表示低连锁。黑色方框代表挑选的TagSNP。

根据以上原则：覆盖IL9基因及其上下游5kbp的区域的SNP经MAF>0.05过滤后剩下1、4、5、6、8、9、12号这几个SNP，构建LD图谱后1、4、6、8这4个SNP是存在连锁的r²>0.8，所有在这之中选择一个SNP即可代表其他几个SNP，而8号SNP是位于启动子区，所以优先考虑这个SNP，其他5、9、12这几个SNP互相不连锁，所以都入选。IL9基因最终有4个TagSNP纳入研究：rs31564、rs2069870、rs2069868、rs31563。所选SNP的详细信息见表1。

表1 IL9基因所选SNP信息

2.样本收集

收集1863例CAD样本和1920例对照样本，收集详细的临床资料信息包括：年龄、性别、身高、体重、入院诊断、出院诊断、吸烟史、饮酒史、高血压病史、糖尿病病史、血压水平、血脂四项(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)和空腹血糖等生化检测指标信息，该研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求，且获得了伦理委员会的批准。

3.人外周血全基因组DNA提取、分装与保存

人外周血全基因组DNA采用康为世纪提供的BloodGen Mini Kit血液基因柱式小量提取试剂盒(CW 2087)进行提取。操作步骤依照试剂盒使用说明书.

1)用超微量分光光度计(NanoDrop2000c)测量所提取DNA浓度与纯度。

2)根据各样本DNA浓度进行稀释，使稀释后的DNA浓度为30ng/μL，体积为30μL，该部分稀释后的样本按编号分装在经紫外照射灭菌的96孔板中作为实验用的工作液，保存在-20℃冰箱，剩下DNA母溶液保存在-80℃冰箱。

4.引物设计

在Ensemble数据库(Human GRCh38/hg38版本)中输入基因IL9后，得到全部的基因序列，显示全部的变异位点，找到各个SNP所在的位置，查阅位点前后是否存在MAF值较高的变异，避开MAF值高的变异得到SNP位点附近的序列，根据如上引物设计原则，用Primer和Genetool软件设计引物，得到引物后在UCSC网站上进行电子PCR，PCR结果显示无特殊结构且PCR目的条带单一，则可定制合成引物。

3)根据以上引物设计原则，对IL9上所选的SNP设计的基因分型引物如表2所示。

表2HRM分型引物

5.PCR扩增

扩增体系(25μL)：

扩增程序如图2中所示。

6.HRM基因分型

在PCR反应前将核酸荧光染料与普通PCR反应体系混合，在PCR过程中荧光染料会***到DNA双螺旋结构的小沟中，待PCR结束后直接将产物置于Rotor-Gene 6000检测仪器中，当仪器设置的温度从50℃逐渐上升到95℃时，PCR产物逐渐解链，原先与双链结合的荧光染料分子就与DNA脱离。在检测的初期，荧光强度很高，随着温度升高，PCR产物逐渐解链，荧光强度也随之下降。当温度每上升0.02-0.1℃，HRM仪器通过照相机记录下荧光变化并对数据作图。因此，随着温度的升高，检测样品的荧光信号由强变弱，形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个检测样品都以一个峰形曲线形式呈现。

将36个样本PCR扩增产物放入Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪上进行分型检测，读取结果，并分别选取每个SNP的3种基因型的PCR产物送天一辉远公司进行一代测序验证，检测HRM分型准确性，若HRM分型结果与一代测序结果一致说明HRM分型准确，经验证该方法分型准确性达到100％，且该方法每8分钟可以检测36个样本，大大提高检测效率。

7.统计分析

(1)数据处理

SPSS软件计算数据只能以数值的形式呈现，所以在进行计算时，需要将数据全部转换成数值。

不同分析模式处理(以一个SNP位点为例，该位点存在两个等位基因，在人群中会存在两种等位基因，以等位基因C和T为例，T为小等位，则在人群中会存在三种基因型CC、CT、TT)，SNP可能在不同的遗传模式比如显性模式(Dominantmodel，DOM，TT+CT/CC)、隐性模式(Recessive model，REC，TT/CT+CC)和加性模式(Additivetmodel，ADD，TT/CT/CC)下与疾病作用，将每个SNP进行等位基因模式(Allele model，ALLE，C/T)和3种不同基因型模式下将基因型转换成数值。

ALLE模式下：先将基因型TT替换成2，基因型CT替换成2，基因型CC替换成1，再复制同样的样本将基因型TT替换成2，基因型CT替换成1，基因型CC替换成1；

ADD模式下：基因型TT替换成3，基因型CT替换成2，基因型CC替换成1；

REC模式下：基因型TT替换成2，基因型CT替换成1，基因型CC替换成1；

DOM模式下：基因型TT替换成2，基因型CT替换成2，基因型CC替换成1。

(2)哈迪-温伯格平衡

哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)是群体遗传中最重要的原理，它解释了繁殖如何影响群体的基因和基因型频率。他们提出在一个无限大的随机交配且没有进化的压力(突变、迁移和自然选择)的群体中，当基因进行逐代传递时，群体的基因频率和基因型频率将保持不变。在病例和对照的关联分析研究中，所检测的变异往往需要在对照人群中进行哈迪-温伯格平衡检验，只有通过该检验的变异(p>0.001)才能说明该变异在所研究的群体中没有发生偏移，能代表整个群体的遗传特征。研究中应剔除没有通过哈迪-温伯格平衡检验的变异。

(3)卡方检验

在等位基因关联分析和显性模式，隐性模式下基因型关联分析时采用2×2列表卡方检验，而在加性模式下采用2×3列表卡方检验。等位基因关联分析和显性模式，隐性模式下关联分析是比较两组间的中位数基因频率分布差异，可计算出相应的OR值(Odds ratio)和95％的置性区间(95％Confidence interval，95％CI)。OR值又称优势比或比值比，是指病例组中暴露人数与非暴露人数的比值与对照组中暴露人数与非暴露人数的比值的比值。它是流行病学病例对照研究中常用的一个指标，当OR值大于1时说明暴露因素对疾病有害；当OR值小于1时说明暴露因素对疾病有保护作用；当OR值等于1时说明暴露因素对疾病无作用。

(4)线性回归分析

线性回归分析(Linerregression analysis)是指利用数理统计中回归分析，来确定两种或两种以上变量间定量关系的一种统计分析方法，运用十分广泛。关联分析中用来研究基因多态性与数量性状之间的关系，当SNP的基因型存在加性效应时，可能会与数量性状之间存在线性关系。如果通过线性回归方程检测出P值小于0.05则说明基因型与数量性状存在显著的线性关联，且具有统计学意义，计算得出的回归系数β的绝对数值大小显示这两种变量间的关联程度，绝对值越大，说明两者间关系越大，β数值为正数时，表示正相关；β数值为负数时，表示负相关。

在线性回归分析中，若有多个(≥2)自变量，则称之为多元线性回归(Mutipleregression analysis)。事实上，一种性状或者疾病常与多种因素有关，由多个自变量的最优组合共同预测或估计因变量，比只用单个自变量进行预测或估计更有效且更切合实际。因此与一元线性回归相比，多元线性回归更具有实用意义。在研究SNP基因型与血脂水平之间的关系中利用多元线性回归分析排除了性别，年龄和BMI等因素的影响，评估SNP基因型对血脂水平独立影响。

研究结果

1.IL9与CAD的关联分析

IL9上四个位点在对照人群中都没有偏离Hardy-Weinberg平衡，P值大于0.001。对IL9上4个SNP：rs2069868、rs31563、rs31564、rs2069870进行了基因型关联分析，分别在加性模式、显性模式和隐性模式下分析不同基因型与CAD之间的关系，但是IL9上4个SNP不论是观察P值还是矫正后P值，均不显著。

表3在中国汉族人群中IL9上SNP与CAD进行基因型关联分析

说明：Pobs，观察P值；Padj，通过协变量调整的P值；OR，调整后的优势比；年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟史、Tch、TG、HDL-c和LDL-c为调整参数；

ADD，加性模式，rs31563_TT/CT/CC；rs2069868_AA/AG/GG；rs2069870_GG/AG/AA；rs31564_TT/GT/GG；

DOM，显性模式，rs31563_TT+CT/CC；rs2069868_AA+AG/GG；rs2069870_GG+AG/AA；rs31564_TT+GT/GG；

REC，隐性模型，rs31563_TT/CT+CC；rs2069868_AA/AG+GG；rs2069870_GG/AG+AA；rs31564_TT/GT+GG。

2.IL9与血脂水平关联分析

血脂在冠心病的发生发展中起着重要的作用，也是与冠心病关系最密切的独立危险因素，进一步探究IL9上的SNP与四项血脂(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)之间的关系。在加性模式、隐性模式和显性模式下用多元线性回归模型计算IL9和上SNP与血脂之间的关系。(详细数据见表4)

表4IL9与血脂进行基因型关联分析

名词说明：Tch，总胆固醇；TG甘油三酯；HDL-c，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-c，低密度脂蛋白胆固醇。

1)总胆固醇

在显性模式(GG+GA/AA)下，IL9上rs2069870位点与总胆固醇水平成负相关，矫正后P值为0.049，β值为-0.034。IL9上其他位点在显性模式、隐性模式和加性模式下均没有发现与总胆固醇相关，P值均大于0.05。

2)甘油三酯

IL9上位点在显性模式、隐性模式和加性模式下均没有发现与甘油三酯相关，P值均大于0.05。

3)高密度脂蛋白

在隐性模式(TT/CT+CC)下，IL9上rs31563位点与高密度脂蛋白水平成正相关。矫正后P值为0.016，β值为0.038。IL9上其他位点在显性模式、隐性模式和加性模式下均没有发现与高密度脂蛋白相关，P值均大于0.05。

4)低密度脂蛋白

在加性模式(GG/GA/AA)和显性模式(GG+GA/AA)下，IL9上rs2069870位点显示与低密度脂蛋白水平成显著负相关，加性模式下矫正后P值为0.006，β值为-0.047；显性模式下矫正后P值为0.004，β值为-0.049。IL9上其他位点在显性模式、隐性模式和加性模式下均没有发现与总胆固醇相关，P值均大于0.05。

总之，在与四项血脂的关联分析中发现，IL9上rs31563位点与血浆中高密度脂蛋白水平成正相关，rs2069870与血浆低密度脂蛋白和总胆固醇水平相关。rs2069870位点GG或GA基因型携带者LDL-c，Tch水平低，rs2069870位点AA基因型携带者的LDL-c，Tch水平高于rs2069870位点GG或GA基因型携带者。说明G等位是个保护等位，GG或GT基因型携带患心血管疾病风险低，而AA基因型携带者是血脂异常和心血管高风险人群。rs31563位点TT基因型携带者HDL-c水平高，而HDL-c高目前认为是心血管疾病的有利因素，说明TT基因型携带者患心血管风险低。

本项目的血脂异常易感位点rs31563和rs2069870均位于IL9基因的启动子区，对于IL-9转录起到重要作用。

大多数疾病易感位点位于基因非编码区，由于研究方法的限制使得大部分位点的具体机制仍未被阐明。RegulomeDB是一个对非编码区SNP和基因调控元件进行注释的数据库，注释包括表达数量性状基因座(Expression quantitative trait loci，eQTL)、DNA酶I超敏感结合区域(DNase)、转录因子合位点和已知启动子区域等。根据这些注释，网站会对SNP进行综合评分(1a、1b、1c、1d、1e、1f、2a、2b、2c、3a、3b、4、5、6、no data)，如图3，根据评分可以推测感兴趣SNP可能参与的调控机制，进而为研究提供思路。我们在RegulomeDB数据库上对rs31563和rs2069870位点进行检索，结果显示rs31563和rs2069870得分分别为4和5，peaks数分别为7个和9个，说明这两个位点所在位置存在大量的调控元件，很有可能调控基因表达。

我们前期动物的研究数据发现，高脂饮食(西方饮食)10周情况下，与C57BL/6小鼠相比，ApoE-/-小鼠(小鼠ApoE缺失后，动物体内脂蛋白代谢和转运发生一系列改变，导致胆固醇的清除率降低，会表现出异常高血脂症状，因而该基因敲除小鼠广泛应用于高脂血症、动脉粥样硬化的研究)血浆中的IL-9水平明显增加，说明IL-9在血脂中起到重要的作用，而rs31563和rs2069870均位于IL9基因的启动子区，调控IL-9的转录和表达。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (5)

1.IL9基因rs31563位点TT基因检测剂在制备高密度脂蛋白高水平筛查试剂中的应用；或，IL9基因rs31563位点CT或CC基因检测剂在制备高密度脂蛋白低水平筛查试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，IL9基因rs31563位点检测剂包括该位点扩增引物对、核酸探针。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述高密度脂蛋白低水平表征为血脂异常，高密度脂蛋白高水平表征为心血管疾病低风险。

4.基因载体在制备防治高密度脂蛋白水平高的药物中的应用，其中，所述基因载体含有基因片段，所述基因片段为IL9基因中rs31563位点等位基因中单核苷酸为T。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述基因片段能将IL9基因rs31563位点的等位基因中单核苷酸C替换为单核苷酸T并表达的基因片段。