CN117587013B - 一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法,属于遗传工程技术领域。本发明采用特异性sgRNA敲除斑马鱼10号染色体上如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列构建斑马鱼模型,发现该模型的血管发育异常,说明该基因片段的缺失和血管发育异常存在显著的关联性,这为血管发育异常引起的疾病药物筛选奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程技术领域,特别是涉及一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法。
背景技术
斑马鱼在基因组、蛋白质组、胚胎发育以及疾病发生机制等方面与人类高度一致的特点使其成为了研究脊椎动物胚胎、组织器官发育和人类疾病的理想遗传学和发育生物学模式生物。此外,斑马鱼还具有体积小、生殖能力强、生殖周期短、体外受精、胚胎透明且生长迅速等独特的优势。尤为突出的是,斑马鱼的血液及心血管***早期发育与人类极为相似,而血液和心血管***有缺陷的突变体仍然可以存活数天,为其研究血液和心脑血管***提供了极为有利的条件。
斑马鱼早期胚胎发育过程中,造血***起源于腹侧中胚层。在永久造血阶段,造血过程发生于后部血岛,或者称为尾部造血组织的部位。永久造血干细胞起源于背主动脉腹侧壁,随后迁移至尾部造血组织,在这里它们经历进一步增殖、分化。于5dpf时期迁移至成体斑马鱼造血器官—肾脏,在13dpf时期,肾脏作为成体斑马鱼造血器官持续终生造血。
斑马鱼胚胎造血过程中,参与其中的多种信号通路分子和转录因子同样与哺乳动物高度守。一些转录因子如scl、gata2、lmo2在早期血液和血管前体细胞表达,认为是早期调控造血过程的因子。转录因子c-myb和runX1了是永久造血过程中的关键因子,被认为是造血干细胞的标志基因。在gata1缺失的斑马鱼胚胎中,红系前体细胞向髓系细胞转化,表明gata1在早期红细胞形成过程中起关键作用。编码血红蛋白的Hbae1是成熟红细胞的特异性标记物。Pu.1是转录因子ETS家族成员之一,与髓系细胞早期发育有关。髓过氧化物酶mpo、l-plastin和lyC特定表达在髓系各个细胞谱系发育时段,较Pu.1表达出现晚,大约持续表达到4-6dpf,是较晚的髓系前体细胞标志物。Mpo是粒细胞特异性标志物,l-plastin则主要标记巨噬细胞。此外,斑马鱼淋巴***发育起始较其它谱系晚,rag1特异性标记淋巴细胞。
血管内皮细胞与周细胞等多种血管邻近细胞,以及它们的分泌产物共同构成血管微环境,通过多种方式调控造血等重要生理过程。内皮细胞构成血管的内壁,参与了血液—组织屏障的形成、血液滤过、血管张力的维持、营养物质的运输和免疫调节等多种生理过程。血管微环境对造血的调控主要通过维持HSC的生存和功能实现。体外培养的HSC可以通过与内皮细胞共培养来维持自身生存,其中骨血管内皮细胞的作用最显著。此外,血管周细胞在造血干细胞的维持中也发挥重要作用,大部分造血干细胞与LEPR+细胞和CAR细胞存在邻近的位置关系,并且这些细胞的清除会引起HSC数量减少。内皮细胞是骨血管微环境中多种重要细胞因子的来源,包括趋化因子CXC配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、BMP和Notch配体等。条件性敲除内皮细胞的CXCL12或SCF会导致造血干细胞的数量大幅减少,造血稳态的维持受到破坏。除了细胞因子的调控作用外,微环境的代谢和理化特征也会对HSC产生影响,如氧张力、缬氨酸等。
血管微环境对周围的细胞和组织至关重要,深入解析其组成和功能不仅有助于加深对机体重要生理过程的理解,也将为血液和骨骼疾病提供新的治疗策略。基于此,本发明构建了一个新的血管和血液疾病模型,为深入探索血管微环境和造血之间的关系奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法,以解决上述现有技术存在的问题,通过敲除斑马鱼10号染色体上基因间序列41048109-41048123位碱基构建斑马鱼模型,发现该模型的血管发育异常,说明该基因片段的缺失和血管发育异常存在显著的关联性,这为血管发育异常引起的疾病药物筛选奠定基础。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种sgRNA,所述sgRNA作用于斑马鱼10号染色体上的基因片段,所述sgRNA的靶向结构域选自SEQ ID NO:3-5任意一项所示的序列:
SEQ ID NO:3为:5’-ACACGGAATCTGCGCGCGC-3’;
SEQ ID NO:4为:5’-CAGATTTTCTGCAAGTTA-3’;
SEQ ID NO:5为:5’-TTATTAATTCTGTTTATT-3’。
优选的是,扩增权利要求1所述的sgRNA的引物组,所述引物组包括(1)-(3)所示任意一项组合:
(1)sgRNA-F1(SEQ ID NO:6):
5’-GCGTAATACGACTCACTATAGGTAACTTGCAGAAAATCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’;
sgRNA-R(SEQ ID NO:7):5’-AAGCACCGACTCGGTGCCACT-3’;
(3)sgRNA-F2(SEQ ID NO:8):5’-GCGTAATACGACTCACTATAGGGCGCGCGCAGATTCCGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’;
sgRNA-R(SEQ ID NO:9):5’-AAGCACCGACTCGGTGCCACT-3’;
(3)sgRNA-F3(SEQ ID NO:10):5’-GCGTAATACGACTCACTATAGGTTATTAATTCTGTTTATTGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’‘
sgRNA-R(SEQ ID NO:11):5’-AAGCACCGACTCGGTGCCACT-3’。
本发明还提供一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法,包括采用所述的sgRNA敲除斑马鱼10号染色体上的基因片段得到所述血管发育异常的斑马鱼模型的步骤;
所述斑马鱼10号染色体上的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或SEQ IDNO:2所示。
SEQ ID NO:1为:
上述序列中,斜体加粗标记的序列表示PAM序列,为cas9蛋白的识别剪切位点。灰色高亮为靶位点序列3,波浪线表示靶位点序列2,双下划线表示靶位点序列1。单下划线表示检测引物序列F2,点状虚线检测引物F1,间断直线为检测引物R(检测引物F1和F2共用一个反向检测引物R),正体加粗的碱基以及斜体加粗的“CCG”为小片段缺失和突变的碱基序列。
SEQ ID NO:2为:ACACGGAATC TGCGCGCGCA GAATTCCGCA GATTTTCTGC AGAATTCCGCAGATTTTCTGC AAGTTATTAG。
优选的是,通过将所述sgRNA和Cas9 mRNA混合物导入斑马鱼中,以敲除所述斑马鱼10号染色体上的基因片段。
本发明还提供一种所述的sgRNA在制备血管发育异常的斑马鱼模型中的应用。
本发明公开了以下技术效果:
本发明发现斑马鱼10号染色体的aak1b和antxr1b基因之间序列存在多个结合位点,能够与cebpd、zbtb14等基因结合,这些基因均与血管及造血相关。因此,推断位于10号染色体的该段基因间序列可能与血管发育及造血相关。通过敲除斑马鱼10号染色体上SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列,结果显示:斑马鱼的血管发育异常,且胚胎出现大量的死亡,说明10号染色体基上SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列与血管发育存在显著的关联性,这为血管性疾病的药物筛选提供了新的作用靶点和方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为生物信息分析结果;
图2为扩增合成sgRNA的电泳检测结果;M为标准DNA分子,1-2为PCR扩增产物;
图3为纯化的sgRNA进行琼脂糖凝胶电泳检测;M为标准DNA分子,1-2为转录的sgRNA;
图4为不同时期的斑马鱼胚胎;A:5dpf的野生型胚胎;B:5dpf的hemorrhagicstroke突变体斑马鱼胚胎;C:4dpf时表型正常的sibling胚胎和hemorrhagic stroke突变体斑马鱼胚胎的血液流速测定结果;
图5为扩增结果;s1-s4为sibling胚胎的PCR扩增结果,m1-m5为有表型的胚胎的PCR扩增结果,M为标准DNA分子;
图6为mutant突变体测序结果;
图7为中性染色结果;
图8为野生型和hemorrhagic stroke斑马鱼的差异基因火山图;
图9为野生型和hemorrhagic stroke斑马鱼的差异基因GO富集分析结果;
图10为野生型和hemorrhagic stroke斑马鱼的差异基因KEGG富集分析结果;
图11为血细胞相关标志基因的Q-PCR结果;
图12为血管相关标志基因的Q-PCR结果;
图13为p53信号通路部分基因的Q-PCR结果;
图14为显微注射斑马鱼胚胎后进行PCR扩增验证注射有效性的电泳检测结果;M为标准DNA分子,WT为野生型胚胎的扩增结果,1-8为注射后胚胎的扩增结果;
图15为基因突变体斑马鱼形态学观察结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明中所使用的术语“野生型”或者“WT”都是指野生型斑马鱼。
本发明中所使用的术语“dpf”指受精后的天数,hpf指受精后的小时数。
实施例1
1、生信分析
通过生信分析(ALGGEN-PROMO(https://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3))发现位于斑马鱼10号染色体的aak1b和antxr1b基因之间的41048073-41048142位碱基(SEQ ID NO:2),该段碱基序列上的位点能够与cebpd(C/EBPdelta)、zbtb14(ZF5)、stat4等基因结合(见图1和表1),是这些基因的候选靶点。其中cebpd通过CEBPD-has-miR-429-VEGFA信号调控血管生成,通过BRD4/CEBPD信号可以导致血管炎症;zbtb14调控pu.1表达;stat4在中性粒细胞中表达,具有髓系特异性。这些基因均与血管及造血相关。因此认为位于10号染色体的该段基因间序列可能与血管发育及造血相关。
表1
2、小片段基因敲除品系的构建
2.1引物设计
在位于10号染色体的aak1b和antxr1b基因之间的41048073-41048142位碱基的序列上设计CRISPR/Cas9的敲除靶位点,并合成sgRNA。
sgRNA引物如下所示。
sgRNA-F1: (下划线为靶位点序列)
sgRNA-R(通用反向引物):5’-AAGCACCGACTCGGTGCCACT-3’;
通用模板序列:TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT。
2.1 PCR扩增
以通用模板序列为模板,sgRNA-R为反向引物,用sgRNA-F1为正向引物进行PCR扩增得到用于特异性gRNA合成的双链DNA。
PCR反应体系如下(50μL):ddH2O 3μL、5X enhancer buffer 10μL、2×Buffer(含20mM Mg2+)25μL、sgRNA-F1(或sgRNA-F2,10μM)5μL、sgRNA-R(10μM)5μL和模板(合成)2μL。
震荡混匀之后,4℃离心,于PCR仪上进行扩增反应;检测确定条带正确之后,进行琼脂糖凝胶DNA回收,纯化回收PCR产物。
2.2体外转录
测定纯化的DNA浓度,再以此DNA为模板,用20μL体系进行体外转录,合成特异性gRNA;体外转录反应体系见表2。
表2
将反应物全部加入1.5mL EP管中,混匀之后,于37℃水浴2h;水浴结束后,消化DNA模板,然后进行琼脂糖电泳。
2.3纯化sgRNA
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA,即sgRNA-1,保存于-20℃;进行琼脂糖凝胶电泳,以检验纯化产物,并用Nano drop测定纯化之后的gRNA浓度。
2.4显微注射
首先并将0.5μL sgRNA-1与0.5μLcas9(Thermo Fisher公司)及2μL RNase-free水混匀,并注射约1.0nL Cas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的斑马鱼受精卵内;注射过的受精卵放置于E3水中,28℃孵化。
2.5品系构建
将注射后的胚胎养大至成鱼,将其与野生型TU斑马鱼杂交,获得F1代胚胎,在F1代胚胎发育至36hpf时,收集胚胎,每管两颗胚胎。提取胚胎总基因组进行基因型鉴定。PCR扩增引物如下所示:
检测引物F1:5’-CCTTAACTTATTGGTAGGCCCA-3’;
检测引物R:5’-TTCCTCCCAAAAGAAATCCAC-3’。
模板为从胚胎中提取的基因组。
PCR产物进行PAGE凝胶电泳,其中1条斑马鱼后代PCR扩增产物出现与野生型不同的条带。该斑马鱼为敲除成功的F0代斑马鱼。将此斑马鱼的后代培养至3个月剪尾进行基因型鉴定。挑选出敲除成功的F1代斑马鱼,将其自交。在自交后代中发现约1/4在第4天开始出现血流缓慢至第6天所有胚胎血流和心跳均停止,同时伴有小头、小眼、围心腔膨大(见图4)。收集有表型的胚胎和sibling胚胎进行基因型鉴定。如图5所示,s1-s4为sibling胚胎的PCR扩增结果,m1-m5为有表型的胚胎的PCR扩增结果。结果显示,有表型的胚胎均为纯合子,sibling胚胎为野生型和杂合子。因此判断该表型由41048073-41048142位碱基片段突变导致。
将纯合突变胚胎的PCR扩增产物送至生工生物公司进行sanger测序。测序结果见图6,分析结果显示该序列与NCBI参考序列相比,缺失32bp(斑马鱼10号染色体上基因间序列41048093-41048122和41048125-41048126位碱基缺失);与本实验室所测得的野生型序列相比,突变体序列缺失11bp,突变1个碱基。
NCBI参考序列:(波浪线和下划线标记的碱基表示实际测出的野生型与参考序列相比缺失的序列,下划线标记的碱基表示mutant较野生型缺失的序列,C/T和G/T表示NCBI参考序列及突变体/本实验室野生型的突变碱基)
突变体与NCBI野生型参考序列的序列比对。Query为野生型,Sbjct为突变体。
突变体与本实验室野生型的序列比对。Query为野生型,Sbjct为突变体。
2.6中性红染色
4dpf时,将野生型与mutant胚胎分别用2.5μg/mL中性红染色液(活体染色,每皿胚胎30mL E3水+75μg中性红粉末)染色6小时,用E3水漂洗后在体式显微镜下观察其中性粒细胞的数量及分布情况。如图7所示,在野生型胚胎中,巨噬细胞集中分布在尾部造血组织中,而在突变体胚胎中,巨噬细胞信号遍布全身。巨噬细胞分为常驻巨噬细胞和浸润性巨噬细胞,当有炎症发生时,浸润性巨噬细胞会向炎症部位聚集。野生型与突变体胚胎的中性红信号分布差异表明突变体存在较为广泛的炎症反应。巨噬细胞是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF-A)的重要来源,血源性巨噬细胞的募集、巨噬细胞衍生的VEGF-A能够启动血管生成并增加血管通透性,促进内皮细胞的增殖、迁移。因此,巨噬细胞分布异常可能暗示突变体胚胎血管发育异常。
2.7通过转录组分析和Q-PCR的方法检测突变体胚胎中的差异表达基因
收集5dpf WT和5dpf突变体的幼鱼,由美吉生物进行转录组测序,剩余胚胎使用trizol提取胚胎的总RNA,按照说明书的操作步骤实施。用逆转录酶逆转录成cDNA。用斑马鱼18s为内参基因进行Q-PCR检测,其中引物的序列信息如下表3所示,Q-PCR反应体系和反应程序如表4和表5所示。
表3
表4 RT-qPCR反应体系
表6 RT-qPCR反应条件
结果如图8,野生型和hemorrhagic stroke斑马鱼的差异基因火山图,进一步分析这些差异基因,结果如图9和图10所示,与野生型相比,hemorrhagic stroke斑马鱼的差异表达基因主要富集在代谢和细胞凋亡相关的信号通路上,如脂质代谢、药物代谢、p53信号通路等。如图11-图13,经Q-PCR检测,在hemorrhagic stroke斑马鱼血细胞标志基因表达异常,造血相关基因如cmyb表达显著下调,成熟红细胞标志基因hbae1、髓系标志基因I-plaetin和lyz、淋系标志基因rage1等均显著上调;血管标志基因fli1a和kdrl显著上调;p53信号通路如tp53、mdm2等基因显著上调。结果表明在该突变体斑马鱼中,血管发育和造血过程出现紊乱,细胞凋亡增加,出现炎症。
3、大片段基因敲除品系的构建
3.1为了进一步证实位于10号染色体的aak1b和antxr1b基因之间的41048073-41048142位碱基与造血之间的联系,设计了sgRNA-2和sgRNA-3,sgRNA-2和sgRNA-3可将10号染色体41048073-41048142位碱基完全敲除。
sgRNA-F2:
sgRNA-F3:
上述序列中加粗的序列为靶位点序列。
3.2sgRNA的合成及注射与上述“2、小片段基因敲除品系的构建”中步骤一致(gDNA合成结果见图2,gRNA纯化结果见图3)。显微注射时体系改为cas9蛋白0.5μL,sgRNA-2 0.5μL,sgRNA-3 1.5μL和无酶水0.5μL。
3.3检测敲除是否成功
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,收集8管发育至2dpf的胚胎,每管2颗胚胎,检测该基因间序列是否存在突变。
PCR扩增引物如下所示:
检测引物F2:5’-CTGCAAAACTGACGCACACT-3’;
检测引物R:5’-TTCCTCCCAAAAGAAATCCAC-3’。
.PCR产物(SEQ ID NO:1)进行琼脂糖凝胶电泳。
结果如图14所示,1、4、5、6、7号泳道除469bp(见SEQ ID NO:1)的野生型条带还有一条小带,表明敲除成功。
3.4基因突变体斑马鱼形态学观察
4dpf时在体式显微镜下观察注射的胚胎,如图15所示,出现小头、小眼、围心腔膨大、血流缓慢甚至停止等表型,与上述小片段基因敲除品系的表型一致。且注射后的胚胎出现大量死亡(超3/4),表明该基因间序列在斑马鱼血管发育过程中具有重要功能。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种sgRNA,其特征在于,所述sgRNA作用于斑马鱼10号染色体上的基因片段,所述sgRNA的靶向结构域选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列。
2.扩增权利要求1所述的sgRNA的引物组,其特征在于,所述引物组包括(1)-(2)所示任意一项组合:
(1)sgRNA-F1:
5’-GCGTAATACGACTCACTATAGGTAACTTGCAGAAAATCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’;
sgRNA-R:5’-AAGCACCGACTCGGTGCCACT-3’;
(2)sgRNA-F2:5’-GCGTAATACGACTCACTATAGGGCGCGCGCAGATTCCGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’;
sgRNA-R:5’-AAGCACCGACTCGGTGCCACT-3’。
3.一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法,其特征在于,包括采用权利要求1所述的sgRNA敲除斑马鱼10号染色体上的基因片段得到所述血管发育异常的斑马鱼模型的步骤;
所述斑马鱼10号染色体上的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,通过将所述sgRNA和Cas9 mRNA混合物导入斑马鱼中,以敲除所述斑马鱼10号染色体上的基因片段。
5.一种如权利要求1所述的sgRNA在制备血管发育异常的斑马鱼模型中的应用。
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