CN117586844B - 一种提高免疫力的肽酒及其生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肽酒生产领域，具体涉及一种提高免疫力的肽酒及其生产工艺。本发明的肽酒是由基酒和海参肽组成，基酒采用重组工程菌和乳酸菌分别进行第一阶段发酵和第二阶段发酵获得，重组工程菌是将枯草芽孢杆菌中编码碱性蛋白酶的基因序列，通过质粒转化到酿酒酵母中获得，能对植物源原材料起到较好的利用和降解。本发明获得的肽酒含有植物源和动物源小分子肽，易于吸收，具有较高的自由基清除率，即能实现较佳的抗氧化效果，日常饮用可提升身体免疫力。

Description

一种提高免疫力的肽酒及其生产工艺
技术领域
本发明属于肽酒生产领域，具体涉及一种提高免疫力的肽酒及其生产工艺。
背景技术
根据不同生产工艺可以将饮料酒分为发酵酒、蒸馏酒和配制酒，发酵酒是以粮谷、薯类、水果、乳类等为主要材料，经发酵或部分发酵酿制而成的饮料酒，蒸馏酒是以粮谷、薯类、水果、乳类等为主要材料，经发酵、蒸馏、经或不经勾调而成的饮料酒，配制酒是以发酵酒、蒸馏酒、食用酒精等为酒基，加入可食用的原辅料和/或食品添加剂，进行调配和/或再加工制成的饮料酒。
肽酒是用微生物发酵法获得的，其富含小分子肽。因肽酒属一种小分子蛋白质营养酒，其小分子肽不用消化直接吸收，对人体生理功能的调节有着重要的意义。肽酒是一种营养酒，适量饮用对提高人体免疫、促进血液循环、调节肠胃功能、保肝护肝有较好的保健作用，适宜于因身体不佳，不能饮酒，可喝此酒，以此酒代酒的人群。
但目前肽酒的生产工艺不一，很多富含蛋白质的植物源原材料，如大豆、豌豆等，以及动物源原材料利用不充分，导致肽酒中小分子肽含量不高，肽酒宣传的保健效果得不到保障，因此需要多向筛选合适的原材料，并开发高效的生产工艺，以获得确实富含小分子肽，能实现清除自由基、提高抗氧化能力的肽酒。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种提高免疫力的肽酒及其生产工艺，肽酒是由基酒和海参肽组成，基酒是对原材料豆类、糯米、小麦、水果进行两段发酵获得，本发明制得的肽酒充分包含动物源和植物源小分子肽，适宜吸收，风味较佳。
本发明提供一种提高免疫力的肽酒，是由基酒和海参肽组成，基酒和海参肽的质量比为100：0.1-0.5，基酒具体是由以下质量份的原材料经发酵制得：30-50份糯米、20-40份豆类、15-30份小麦、5-15份水果；
较佳地，豆类具体为豌豆与绿豆混掺，且豌豆与绿豆的质量比=2-5:1；
较佳地，水果不限制具体品种，经采摘经验充分的工人通过颜色、按压判断已达到食用成熟度的水果，优选1-3种水果进行添加；
所述基酒采用两段发酵法进行发酵，两段发酵法包括第一阶段发酵和第二阶段发酵，第一阶段发酵是采用重组工程菌进行，第二阶段发酵是采用乳酸菌进行；
其中，重组工程菌是将枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，通过质粒转化到酿酒酵母中获得，具体获得方法如下：
L1.重组质粒的构建：
在GenBank数据库以基因序列标识符MK814958.1进行检索，获得枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，经化学方式合成基因片段，以此基因片段设计引物，上游引物为5’-TCACTCGAGATGTTTGGGTACTCTATGGTACAAATGGTG-3’，下游引物为5’-GACTGGATCCATTGGCCGGGAACGGAATTT-3’，进行PCR扩增基因片段，0.7-0.9%琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物，将pEGFP-N2质粒载体采用限制性内切酶XhoⅠ和BamHI进行酶切，然后琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的质粒载体，将PCR扩增产物与酶切后的质粒载体进行连接，获得重组质粒；
L2.重组工程菌的构建：
将酿酒酵母接种于PDA培养基中，40-45℃，转速220-250rpm培养10-12小时后取出，以4℃、4500-4800rpm的转速离心5-8分钟，收集沉淀并用无菌水充分清洗，以4℃，5400-5600rpm转速离心4-6分钟，沉淀加入1M的山梨醇，再将步骤L1获得的重组质粒加入，轻晃混匀后冰浴3-5分钟，以1300-1600V电击6-8ms，将电击结束后的混合液涂布于抗性平板中，40-45℃培养2-4天，挑出抗性菌落，将抗性菌落培养于培养基中，获得重组工程菌；
较佳地，步骤L1中PCR扩增的条件为PCR反应采用50μL体系，94℃变性2-3min，55℃退火30-50s，73℃延伸50-70s，循环30-50次，在73℃继续延伸6-8min，然后扩增产物保存于4℃下；
较佳地，酿酒酵母选择耐高温型，能适应40-50℃环境下良好生长，进一步地，能适应40-45℃环境下良好生长；
其中，乳酸菌为混合菌种，具体由乳酸乳球菌、乳杆菌、乳酸片球菌按照质量比2-3：1-3：0.8-1.5组成；
所述基酒的制备过程如下：
S1.第一阶段发酵：
S11.将豆类、糯米、小麦清洗干净，豆类单独加水浸泡12-24小时获得豆类浸泡物，水的添加量为豆类质量的2-4倍，糯米和小麦混合后加水浸泡10-20小时获得糯米-小麦浸泡物，水的添加量为糯米和小麦总质量的3-6倍；
S12.将步骤S11中的豆类浸泡物在1000-1200bar压力下破碎匀浆20-30分钟，获得豆类混合物；
S13.将步骤S11中的糯米-小麦浸泡物，与步骤S12的豆类混合物混合，加入重组工程菌进行8-14小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在40-45℃，pH保持在7-8，间歇式无氧发酵，以100-150rpm的转速进行搅拌20-30分钟，停止搅拌15-30分钟，发酵进行到10-12小时，添加0.1-0.3%的聚乙二醇，发酵结束后获得第一阶段发酵物；
S2.第二阶段发酵：
S21.将步骤S13获得的第一阶段发酵物在110-120℃蒸汽中维持30-45分钟，然后自然冷却至常温；
S22.将水果清洗干净，保留果肉，加入果肉体积2-3倍的水，在500-800bar下破碎匀浆10-30分钟，然后添加到步骤S21冷却后的第一阶段发酵物中，再补充乳酸菌进行4-6小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在30-35℃，pH保持在6.8-7.4，发酵进行到4-5小时，添加0.2-0.4%的聚乙二醇，发酵结束后获得第二阶段发酵物，将第二阶段发酵物进行纱布过滤，充分挤压获得基酒；
较佳地，步骤S13中重组工程菌的添加量为8-15%，步骤S22中乳酸菌的添加量为6-9%。
所述海参肽的制备方法如下：
D1.将新鲜打捞的海参，去除内脏，保留可食用部位，去腥后充分清洗，保持温度10-30℃进行冷风烘干，烘干后磨碎并过筛，获得200-800目海参粉；
D2.在步骤D1获得的海参粉中加入碱性蛋白酶和水，在40-50℃下酶解30-45分钟，液体在100-120℃高温蒸汽下保持60分钟，纱布粗过滤，再采用10μm超滤膜进一步分离，获得的液体进行喷雾干燥，即得海参肽；
较佳地，步骤D2中海参粉：水的质量比为1：10-20，碱性蛋白酶的添加量为1-5%。
所述提高免疫力的肽酒的生产工艺，具体生产过程如下：
X1.搅拌溶解，在采用两段发酵法获得的基酒中添加海参肽，采用涡轮式搅拌机以300-500rpm的转速持续搅拌20-30分钟使海参肽完全溶解，获得均匀体系；
X2.过滤，将步骤X1的均匀体系采用离心机进行过滤，即以800-1000g离心力维持8-12分钟，获得澄澈的上清液；
X3.灌装，采用无菌灌注设备对步骤X2获得的上清液进行自动化灌装，每瓶装入量为瓶子容积的75-85%，封口后即获得肽酒。
本发明的有益效果如下：
本发明将枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，通过质粒转化到酿酒酵母中，获得能高产碱性蛋白酶的重组工程菌，此重组工程菌较好地结合酿酒酵母和碱性蛋白酶的功能，能对豆类、小麦、糯米进行充分发酵，乳酸菌作为安全等级较高的生产菌种，适宜水果发酵，海参肽作为动物源小分子肽的主要提供者，能与发酵液中的植物源小分子肽相互配合达到更易于吸收的效果。本发明还采用两段发酵的方式，第一阶段发酵整体干净、高效，用菌简洁，能完好的获得肽酒的大部分成分，过程可控，第二阶段发酵作为肽酒风味发酵的补充，能使肽酒具有浅层水果香味，易于入口，提升喜爱度。经过本发明生产获得的肽酒，具有较高的自由基清除率，即能实现较佳的抗氧化效果，日常饮用可提升身体免疫力。
附图说明
图1为重组质粒的图谱示意图；
图2为大豆蛋白和β-伴大豆蛋白在发酵前后的含量对比图，“**”表示P<0.01；
图3为实施例1-3的SDS-PAGE图；
图4为肽酒的抗氧化能力测试图；
图5为肽酒的感官评价打分图；
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的技术方案和实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1：本实施例提供一种重组工程菌的获得方式，具体步骤如下：
L1.重组质粒的构建：
在GenBank数据库以基因序列标识符MK814958.1进行检索，获得枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，经化学方式合成基因片段并进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃变性2min，55℃退火30s，73℃延伸50s，循环30次，在73℃继续延伸6min，然后扩增产物保存于4℃下，0.7%琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物，将pEGFP-N2质粒载体采用限制性内切酶XhoⅠ和BamHI进行酶切，然后琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的质粒载体，将PCR扩增产物与酶切后的质粒载体进行连接，获得重组质粒；
L2.重组工程菌的构建：
将酿酒酵母接种于PDA培养基中，40℃，转速220rpm培养10小时后取出，以4℃、4500rpm的转速离心5分钟，收集沉淀并用无菌水充分清洗，以4℃，5400rpm转速离心4分钟，沉淀加入1M的山梨醇，再将步骤L1获得的重组质粒加入，轻晃混匀后冰浴3分钟，以1300V电击8ms，将电击结束后的混合液涂布于抗性平板中，40℃培养2天，挑出抗性菌落，将抗性菌落培养于培养基中，获得重组工程菌；
实施例2：本实施例提供一种重组工程菌的获得方式，具体步骤如下：
L1.重组质粒的构建：
在GenBank数据库以基因序列标识符MK814958.1进行检索，获得枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，经化学方式合成基因片段并进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃变性2min，55℃退火40s，73℃延伸60s，循环40次，在73℃继续延伸7min，然后扩增产物保存于4℃下，0.8%琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物，将pEGFP-N2质粒载体采用限制性内切酶XhoⅠ和BamHI进行酶切，然后琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的质粒载体，将PCR扩增产物与酶切后的质粒载体进行连接，获得重组质粒；
L2.重组工程菌的构建：
将酿酒酵母接种于PDA培养基中，43℃，转速240rpm培养11小时后取出，以4℃、4600rpm的转速离心6分钟，收集沉淀并用无菌水充分清洗，以4℃，5500rpm转速离心5分钟，沉淀加入1M的山梨醇，再将步骤L1获得的重组质粒加入，轻晃混匀后冰浴4分钟，以1500V电击7ms，将电击结束后的混合液涂布于抗性平板中，43℃培养3天，挑出抗性菌落，将抗性菌落培养于培养基中，获得重组工程菌。
实施例3：本实施例提供一种重组工程菌的获得方式，具体步骤如下：
L1.重组质粒的构建：
在GenBank数据库以基因序列标识符MK814958.1进行检索，获得枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，经化学方式合成基因片段并进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃变性3min，55℃退火50s，73℃延伸70s，循环50次，在73℃继续延伸8min，然后扩增产物保存于4℃下，0.9%琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物，将pEGFP-N2质粒载体采用限制性内切酶XhoⅠ和BamHI进行酶切，然后琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的质粒载体，将PCR扩增产物与酶切后的质粒载体进行连接，获得重组质粒；
L2.重组工程菌的构建：
将酿酒酵母接种于PDA培养基中，45℃，转速250rpm培养12小时后取出，以4℃、4800rpm的转速离心8分钟，收集沉淀并用无菌水充分清洗，以4℃，5600rpm转速离心6分钟，沉淀加入1M的山梨醇，再将步骤L1获得的重组质粒加入，轻晃混匀后冰浴5分钟，以1600V电击6ms，将电击结束后的混合液涂布于抗性平板中，45℃培养4天，挑出抗性菌落，将抗性菌落培养于培养基中，获得重组工程菌。
此外，实施例1-3重组工程菌获得过程中，其他处理步骤如下：
实施例1-3所采用的PCR引物：上游引物序列具体如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列具体如SEQ ID NO.2所示，涉及的GenBank数据库中基因序列标识符为MK814958.1的基因序列如SEQ ID NO.3所示，即为枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，全长1329bp；
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是由中国科学院植物所分离并进行保存的，保藏编号为CGMCCNo.4378，经实验室协商购买后用于小试试验；
实施例1-3获得的重组质粒的图谱示意图如图1所示，图中标注了编码碱性蛋白酶的基因所在位置，并标注了上下游引物的位置；
PCR反应过程中采用的限制性内切酶、缓冲液等均由试剂供应商提供来自NewEngland Biolab的商品，PCR反应体系如下：
表1 PCR反应体系
PCR扩增产物的酶切反应体系：PCR扩增产物25μL、10×缓冲液5μL、XhoⅠ和BamHI各1μL、ddH2O18μL，整个体系50μL；
质粒酶切反应体系：pEGFP-N2质粒载体5μL、10×缓冲液5μL、XhoⅠ和BamHI各1μL、ddH2O38μL，整个体系50μL；
PCR扩增产物与酶切后质粒进行连接具体是如下进行：
取PCR扩增产物酶切并经琼脂糖凝胶电泳回收后的片段10μL、酶切后的质粒1μL，加入1μL10×T4缓冲液，1μL T4连接酶，将以上混合后，在室温下孵育30分钟，即获得重组质粒。
实施例4：本实施例提供一种肽酒及其生产工艺，具体步骤如下：
本实施例提供的肽酒，是由质量比100：0.1的基酒和海参肽组成。
所述基酒的制备方法如下：
按照以下质量份数准备原材料：30份糯米、20份豆类，豆类按照豌豆：绿豆=2：1的质量比进行配置、15份小麦、5份水果，水果选择枸杞和红枣，枸杞为宁夏枸杞，红枣选择晋枣，枸杞：红枣的质量比= 3：1；
S1.第一阶段发酵：
S11.将豆类、糯米、小麦清洗干净，豆类单独加水浸泡12小时获得豆类浸泡物，水的添加量为豆类质量的2倍，糯米和小麦混合后加水浸泡10小时获得糯米-小麦浸泡物，水的添加量为糯米和小麦总质量的3倍；
S12.将步骤S11中的豆类浸泡物在1000bar压力下破碎匀浆20分钟，获得豆类混合物；
S13.将步骤S11中的糯米-小麦浸泡物，与步骤S12的豆类混合物混合，加入8%实施例1获得的重组工程菌进行8小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在40℃，pH保持在7，间歇式无氧发酵。以100rpm的转速进行搅拌20分钟，停止搅拌15分钟，发酵进行到10小时，添加0.1%的聚乙二醇，发酵结束后获得第一阶段发酵物；
S2.第二阶段发酵：
S21.将步骤S13获得的第一阶段发酵物在110℃蒸汽中维持30分钟，然后自然冷却至常温；
S22.将水果清洗干净，保留果肉，去除红枣核，加入果肉体积2倍的水，在500bar下破碎匀浆10分钟，然后添加到步骤S21冷却后的第一阶段发酵物中，再补充6%乳酸菌进行4小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在30℃，pH保持在6.8，发酵进行到4小时，添加0.2%的聚乙二醇，发酵结束后获得第二阶段发酵物，将第二阶段发酵物进行纱布过滤，充分挤压获得基酒；
所述海参肽的制备方法如下：
D1.将新鲜打捞的海参，去除内脏，保留可食用部位，置于含10%食盐的溶液中浸泡1小时去除腥味，充分清洗后，保持温度10℃进行冷风烘干，烘干后磨碎并过筛，获得200目海参粉；
D2.按照质量比1：10称量步骤D1获得的海参肽和水，再添加1%碱性蛋白酶，在40℃下酶解45分钟，液体在100℃高温蒸汽下保持60分钟，纱布粗过滤，再采用10μm超滤膜进一步分离，获得的液体进行喷雾干燥，即得海参肽；
本实施例的肽酒的生产工艺，具体生产过程如下：
X1.搅拌溶解，按照质量比分别称量以上基酒和海参肽，采用涡轮式搅拌机以300rpm的转速持续搅拌30分钟使海参肽完全溶解，获得均匀体系；
X2.过滤，将步骤X1的均匀体系以800g离心力维持12分钟，获得澄澈的上清液；
X3.灌装，采用无菌灌注设备对步骤X2获得的上清液进行自动化灌装，每瓶装入量为瓶子容积的75%，封口后即获得肽酒。
本实施例使用的乳酸菌均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其中乳酸乳球菌保藏编号为CGMCCNo.1.62，乳杆菌保藏编号为CGMCCNo.1.12934，乳酸片球菌保藏编号为CGMCCNo.1.123，商业途径订购使用，本实施例中的乳酸菌为乳酸乳球菌：乳杆菌：乳酸片球菌按照质量比2：1：0.8配置而成。
实施例5：本实施例提供一种肽酒及其生产工艺，具体步骤如下：
本实施例提供的肽酒，是由质量比100：0.3的基酒和海参肽组成。
所述基酒的制备方法如下：
按照以下质量份数准备原材料：40份糯米、30份豆类，豆类按照豌豆：绿豆=3：1的质量比进行配置、20份小麦、10份水果，水果选择苹果和梨，苹果选择国光和嘎啦两个品种，梨选择雪花梨品种，国光：嘎啦：雪花梨的质量比=2：1：1；
S1.第一阶段发酵：
S11.将豆类、糯米、小麦清洗干净，豆类单独加水浸泡16小时获得豆类浸泡物，水的添加量为豆类质量的3倍，糯米和小麦混合后加水浸泡15小时获得糯米-小麦浸泡物，水的添加量为糯米和小麦总质量的4倍；
S12.将步骤S11中的豆类浸泡物在1100bar压力下破碎匀浆25分钟，获得豆类混合物；
S13.将步骤S11中的糯米-小麦浸泡物，与步骤S12的豆类混合物混合，加入12%实施例2获得的重组工程菌进行10小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在42℃，pH保持在7.5，间歇式无氧发酵，以120rpm的转速进行搅拌25分钟，停止搅拌18分钟，发酵进行到11小时，添加0.2%的聚乙二醇，发酵结束后获得第一阶段发酵物；
S2.第二阶段发酵：
S21.将步骤S13获得的第一阶段发酵物在115℃蒸汽中维持40分钟，然后自然冷却至常温；
S22.将水果清洗干净，保留果肉，去除果核，加入果肉体积2.5倍的水，在600bar下破碎匀浆15分钟，然后添加到步骤S21冷却后的第一阶段发酵物中，再补充7%乳酸菌进行5小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在32℃，pH保持在7，发酵进行到4.5小时，添加0.3%的聚乙二醇，发酵结束后获得第二阶段发酵物，将第二阶段发酵物进行纱布过滤，充分挤压获得基酒；
所述海参肽的制备方法如下：
D1.将新鲜打捞的海参，去除内脏，保留可食用部位，置于含10%食盐的溶液中浸泡1小时去除腥味，充分清洗后，保持温度20℃进行冷风烘干，烘干后磨碎并过筛，获得600目海参粉；
D2.按照质量比1：15称量步骤D1获得的海参肽和水，再添加3%碱性蛋白酶，在45℃下酶解35分钟，液体在110℃高温蒸汽下保持60分钟，纱布粗过滤，再采用10μm超滤膜进一步分离，获得的液体进行喷雾干燥，即得海参肽；
本实施例的肽酒的生产工艺，具体生产过程如下：
X1.搅拌溶解，按照质量比分别称量以上基酒和海参肽，采用涡轮式搅拌机以400rpm的转速持续搅拌25分钟使海参肽完全溶解，获得均匀体系；
X2.过滤，将步骤X1的均匀体系以900g离心力维持10分钟，获得澄澈的上清液；
X3.灌装，采用无菌灌注设备对步骤X2获得的上清液进行自动化灌装，每瓶装入量为瓶子容积的80%，封口后即获得肽酒。
本实施例使用的乳酸菌均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其中乳酸乳球菌保藏编号为CGMCCNo.1.62，乳杆菌保藏编号为CGMCCNo.1.12934，乳酸片球菌保藏编号为CGMCCNo.1.123，商业途径订购使用，本实施例中的乳酸菌为乳酸乳球菌：乳杆菌：乳酸片球菌按照质量比2：2：1.2配置而成。
实施例6：本实施例提供一种肽酒及其生产工艺，具体步骤如下：
本实施例提供的肽酒，是由质量比100：0.5的基酒和海参肽组成。
所述基酒的制备方法如下：
按照以下质量份数准备原材料：50份糯米、40份豆类，豆类按照豌豆：绿豆=5：1的质量比进行配置、30份小麦、15份水果，水果选择黑果蓝莓；
S1.第一阶段发酵：
S11.将豆类、糯米、小麦清洗干净，豆类单独加水浸泡24小时获得豆类浸泡物，水的添加量为豆类质量的4倍，糯米和小麦混合后加水浸泡20小时获得糯米-小麦浸泡物，水的添加量为糯米和小麦总质量的6倍；
S12.将步骤S11中的豆类浸泡物在1200bar压力下破碎匀浆30分钟，获得豆类混合物；
S13.将步骤S11中的糯米-小麦浸泡物，与步骤S12的豆类混合物混合，加入15%实施例3获得的重组工程菌进行14小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在45℃，pH保持在8，间歇式无氧发酵，以150rpm的转速进行搅拌30分钟，停止搅拌30分钟，发酵进行到12小时，添加0.3%的聚乙二醇，发酵结束后获得第一阶段发酵物；
S2.第二阶段发酵：
S21.将步骤S13获得的第一阶段发酵物在120℃蒸汽中维持45分钟，然后自然冷却至常温；
S22.将水果清洗干净，保留果肉，去除红枣核，加入果肉体积3倍的水，在800bar下破碎匀浆30分钟，然后添加到步骤S21冷却后的第一阶段发酵物中，再补充9%乳酸菌进行6小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在35℃，pH保持在7.4，发酵进行到5小时，添加0.4%的聚乙二醇，发酵结束后获得第二阶段发酵物，将第二阶段发酵物进行纱布过滤，充分挤压获得基酒；
所述海参肽的制备方法如下：
D1.将新鲜打捞的海参，去除内脏，保留可食用部位，置于含10%食盐的溶液中浸泡1小时去除腥味，充分清洗后，保持温度30℃进行冷风烘干，烘干后磨碎并过筛，获得800目海参粉；
D2.按照质量比1：20称量步骤D1获得的海参肽和水，再添加5%碱性蛋白酶，在50℃下酶解30分钟，液体在120℃高温蒸汽下保持60分钟，纱布粗过滤，再采用10μm超滤膜进一步分离，获得的液体进行喷雾干燥，即得海参肽；
本实施例的肽酒的生产工艺，具体生产过程如下：
X1.搅拌溶解，按照质量比分别称量以上基酒和海参肽，采用涡轮式搅拌机以500rpm的转速持续搅拌20分钟使海参肽完全溶解，获得均匀体系；
X2.过滤，将步骤X1的均匀体系以1000g离心力维持8分钟，获得澄澈的上清液；
X3.灌装，采用无菌灌注设备对步骤X2获得的上清液进行自动化灌装，每瓶装入量为瓶子容积的85%，封口后即获得肽酒。
本实施例使用的乳酸菌均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其中乳酸乳球菌保藏编号为CGMCCNo.1.62，乳杆菌保藏编号为CGMCCNo.1.12934，乳酸片球菌保藏编号为CGMCCNo.1.123，商业途径订购使用，本实施例中的乳酸菌为乳酸乳球菌：乳杆菌：乳酸片球菌按照质量比3：3：1.5配置而成。
实施例4-6采用的碱性蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司，为枯草芽孢菌来源的丝氨酸碱性蛋白酶。
实验检测：
一、将实施例2制备的重组工程菌用于豆粕，判断其对大豆蛋白的降解情况，具体步骤参考以下文献：张若兰,刘庆国,王敏等.枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在酿酒酵母中的表达和应用[J].食品与发酵工业,2018,44(07):76-81，按照文献记载，将实施例2制备的重组工程菌5mL接于YNB试管培养基中，以200rpm，28℃下摇床培养14-16小时，获得菌悬液，将此菌悬液按10%接种量接种于固体发酵培养基中，28℃下发酵2天，采用酶联免疫试剂盒测定发酵前后豆粕中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白的含量，试剂盒均来自上海白益生物科技有限公司。
结果如图2所示，由图2可知，实施例2制备的重组工程菌，相比文献中记载的重组工程菌，对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白均实现了较高的降解效果。
二、将实施例1-3制备的重组工程菌接种于YPD培养基中，45℃、200rpm下发酵2天，然后重复离心三次收集上清液，收集发酵上清液并进行SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE分析图如图3所示，由图3可知，实施例1-3制备的重组工程菌均有一个较为明显的条带，与marker进行比对，略高于marker上46.4KDa的条带，已知本发明采用的碱性蛋白酶含有422个氨基酸，换算后接近48KDa，证明实施例1-3获得的重组工程菌均表达出了碱性蛋白酶，且含量不低于在枯草芽孢杆菌中的表达量。
三、检验实施例4-6制备的肽酒中包含的小分子肽，将肽酒通过0.22µm滤膜进行过滤，并采用截留分子量的超滤膜进行分级，并将各级的肽组分通过真空冷冻干燥机制备成冻干粉末状，保存于-20℃，采用双缩脲法测定各级肽组分的浓度，并使用质谱仪分析肽组分的MW分布。
最终将肽酒分为四级肽组分，分别为一级：≤1000KDa，二级：>1000且≤3000KDa，三级：>3000且≤10000KDa，四级：>10000KDa；
通过质谱检验，实施例4-6制备的肽酒，一级肽组分占了总截留肽的58-62%，进一步对≤1000KDa的肽段进行成分分析，发现多数肽段均具有较高的疏水性，具体表现为亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸含量高于其他氨基酸，并且检验到有氨基酸组成为缬氨酸-脯氨酸-酪氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-精氨酸的肽段，此肽段在发酵骆驼乳中有被验证，具有较好的自由基清除效果。
四、肽酒的抗氧化能力检测
对实施例4-6制备的肽酒，采用DPPH法进行抗氧化能力测定，以实施例4制备的肽酒为例，称量0.1984gDPPH，分析纯无水乙醇溶解，定容至50mL，摇匀，吸取2mL，同样采用分析纯无水乙醇定容至100mL，即得DPPH溶液。A0为2mLDPPH溶液+2mL分析纯无水乙醇，Ai为2mLDPPH溶液+2mL肽酒稀释液，Aj为2mL肽酒稀释液+2mL分析纯无水乙醇，清除率S=（Ai-Aj）/A0×100%，具体肽酒稀释液按照表2获得。实施例5、实施例6的肽酒检测步骤同上。
表2 肽酒稀释液配比
注：肽酒倍数是指相对于未稀释的肽酒而言，未稀释的肽酒其肽酒倍数为1
实施例4-6制备的肽酒的抗氧化能力如图4所示，由图4可知，未稀释的肽酒，其抗氧化能力较高，随着肽酒倍数的降低，自由基清除率降低，即抗氧化能力会有所下降，当肽酒倍数<0.25时，自由基清除率会有较为明显的下降，因此不建议饮用实施例4-6的肽酒时进行过度稀释。此外，实施例4与实施例6的抗氧化能力相当，实施例5略弱，可能是由于生产工艺中枸杞、蓝莓同样显现出了一定程度的抗氧化性能。
五、肽酒感官评价
征集志愿者品尝实施例4-6制备的肽酒，要求志愿者近期无感冒症状，味觉嗅觉正常。共征集了21名志愿者，随机分为三组，第一组按照实施例4-实施例5-实施例6的顺序进行品尝，每人每次以洁净塑料杯5mL肽酒进行品尝，实施例4的肽酒品尝结束后，需在10分钟内给出评价并进行记录，品尝实施例5的肽酒前，需要充分漱口，并与实施例4的品尝的时间间隔要大于1小时，实施例6的肽酒品尝同样要充分漱口并保持大于1小时的时间间隔。第二组按照实施例5-实施例6-实施例4的顺序进行品尝，其他要求与第一组一致，第三组按照实施例6-实施例4-实施例5的顺序进行品尝，其他要求与第一组一致。此外，品尝应尽可能在完整时段进行，根据志愿者的时间协调集中在午饭结束后的一小时开始。
从三个方面评价肽酒，即外观、香味、口感，外观主要为肽酒的颜色和清澈度，任一评价项均有5分满分，按照个人喜爱度对其进行打分，结果如图5所示，由图5可知，实施例4-6制备的肽酒均得到了较好的评价，其中实施例4制备的肽酒，在颜色、清澈度、香味和口感上略有优势，对志愿者进行了解，有一半的志愿者觉得可以闻到枸杞和红枣的香甜味，较为淡雅，能带来较为愉悦的享受，志愿者普遍反映实施例4-6制备的肽酒酒味较淡，区别与常见白酒的强烈酒香味，饮用几乎无苦涩感。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种提高免疫力的肽酒，其特征在于，所述肽酒由基酒和海参肽组成，基酒和海参肽的质量比为100：0.1-0.5，所述基酒由以下质量份的原材料经发酵制得：30-50份糯米、20-40份豆类、15-30份小麦、5-15份水果；
豆类为豌豆与绿豆混掺，且豌豆与绿豆的质量比=2-5:1；
基酒采用两段发酵法进行发酵，两段发酵法包括第一阶段发酵和第二阶段发酵，第一阶段发酵采用重组工程菌进行，第二阶段发酵采用乳酸菌进行；
所述乳酸菌为混合菌种，具体由乳酸乳球菌、乳杆菌、乳酸片球菌按照质量比2-3：1-3：0.8-1.5组成；
所述基酒的制备过程如下：
S1.第一阶段发酵：
S11.将豆类、糯米、小麦清洗干净，豆类单独加水浸泡12-24小时获得豆类浸泡物，水的添加量为豆类质量的2-4倍，糯米和小麦混合后加水浸泡10-20小时获得糯米-小麦浸泡物，水的添加量为糯米和小麦总质量的3-6倍；
S12.将步骤S11中的豆类浸泡物在1000-1200bar压力下破碎匀浆20-30分钟，获得豆类混合物；
S13.将步骤S11中的糯米-小麦浸泡物，与步骤S12的豆类混合物混合，加入重组工程菌进行8-14小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在40-45℃，pH保持在7-8，间歇式无氧发酵，以100-150rpm的转速进行搅拌20-30分钟，停止搅拌15-30分钟，发酵进行到10-12小时，添加0.1-0.3%的聚乙二醇，发酵结束后获得第一阶段发酵物；
S2.第二阶段发酵：
S21.将步骤S13获得的第一阶段发酵物在110-120℃蒸汽中维持30-45分钟，然后自然冷却至常温；
S22.将水果清洗干净，保留果肉，加入果肉体积2-3倍的水，在500-800bar下破碎匀浆10-30分钟，然后添加到步骤S21冷却后的第一阶段发酵物中，再补充乳酸菌进行4-6小时的发酵，发酵过程中发酵罐内温度保持在30-35℃，pH保持在6.8-7.4，发酵进行到4-5小时，添加0.2-0.4%的聚乙二醇，发酵结束后获得第二阶段发酵物，将第二阶段发酵物进行纱布过滤，充分挤压获得基酒；
步骤S13中重组工程菌的添加量为8-15%，步骤S22中乳酸菌的添加量为6-9%；
所述重组工程菌是将枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，通过质粒转化到酿酒酵母中获得，具体获得方法如下：
L1.重组质粒的构建：
在GenBank数据库以基因序列标识符MK814958.1进行检索，获得枯草芽孢杆菌Bacillus sp. D9中编码碱性蛋白酶的基因序列，经化学方式合成基因片段，以此基因片段设计引物，上游引物为5’-TCACTCGAGATGTTTGGGTACTCTATGGTACAAATGGTG-3’，下游引物为5’-GACTGGATCCATTGGCCGGGAACGGAATTT-3’，进行PCR扩增基因片段，0.7-0.9%琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物，将pEGFP-N2质粒载体采用限制性内切酶XhoⅠ和BamHI进行酶切，然后琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的质粒载体，将PCR扩增产物与酶切后的质粒载体进行连接，获得重组质粒；
L2.重组工程菌的构建：
将酿酒酵母接种于PDA培养基中，40-45℃，转速220-250rpm培养10-12小时后取出，以4℃、4500-4800rpm的转速离心5-8分钟，收集沉淀并用无菌水充分清洗，以4℃，5400-5600rpm转速离心4-6分钟，沉淀加入1M的山梨醇，再将步骤L1获得的重组质粒加入，轻晃混匀后冰浴3-5分钟，以1300-1600V电击6-8ms，将电击结束后的混合液涂布于抗性平板中，40-45℃培养2-4天，挑出抗性菌落，将抗性菌落培养于培养基中，获得重组工程菌；
步骤L1中PCR扩增的条件为PCR反应采用50μL体系，94℃变性2-3min，55℃退火30-50s，73℃延伸50-70s，循环30-50次，在73℃继续延伸6-8min，然后扩增产物保存于4℃下。
2.根据权利要求1所述的提高免疫力的肽酒，其特征在于，所述海参肽的制备方法如下：
D1.将新鲜打捞的海参，去除内脏，保留可食用部位，去腥后充分清洗，保持温度10-30℃进行冷风烘干，烘干后磨碎并过筛，获得200-800目海参粉；
D2.在步骤D1获得的海参粉中加入碱性蛋白酶和水，在40-50℃下酶解30-45分钟，液体在100-120℃高温蒸汽下保持60分钟，纱布粗过滤，再采用10μm超滤膜进一步分离，获得的液体进行喷雾干燥，即得海参肽；
步骤D2中海参粉：水的质量比为1：10-20，碱性蛋白酶的添加量为1-5%。
3.一种根据权利要求1-2任一项所述的提高免疫力的肽酒的生产工艺，其特征在于，所述肽酒的具体生产过程如下：
X1.搅拌溶解，在采用两段发酵法获得的基酒中添加海参肽，采用涡轮式搅拌机以300-500rpm的转速持续搅拌20-30分钟使海参肽完全溶解，获得均匀体系；
X2.过滤，将步骤X1的均匀体系采用离心机进行过滤，即以800-1000g离心力维持8-12分钟，获得澄澈的上清液；
X3.灌装，采用无菌灌注设备对步骤X2获得的上清液进行自动化灌装，每瓶装入量为瓶子容积的75-85%，封口后即获得肽酒。
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