CN117581145A - 使用浸没液体的显微镜***和方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种显微镜设备，其能够(i)将液浸物镜移动到能够将油或水等液体施加到该液浸物镜的位置，以及(ii)将其上施加有液体的液浸物镜移动到样品架，以用于获取样品的图像。该液体施加过程能够自动化，以便根据需要补充物镜上的液体。该设备能够自动聚焦镜头以方便扫描，并且能配置为更换物镜。还描述了其他实施例，包括在高内涵/高吞吐量扫描中使用这种设备。

Description

使用浸没液体的显微镜***和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求同时于2021年4月28日提交的美国临时申请no.63/180693和63/180694的巴黎公约优先权和美国权益。所述两个临时申请的内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及样品的精确光学扫描和成像领域，更具体地，涉及使用合适的浸没液体(例如稳定的油)作为物镜和样品之间的介质的生物显微镜。

背景技术

用于观察生物样品的高内涵显微镜***是本领域已知的。这种显微镜***通常基于静态的大型显微镜主体，并且包括与光学单元(例如物镜转塔、照明单元、滤光轮、快门、相机、内部光学器件和其他单元)的复杂连接。为了能够扫描给定的样品，在显微镜主体上添加了能够使样品架在X、Y和Z方向上运动的设备。在这些显微***的成像过程中，移动样品以沿样品的不同位置捕获图像，同时光学单元是静止的。

已经开发了各种自动扫描***，在这些自动扫描***中样品和物镜相对于彼此移动，物镜自动聚焦，并且在没有人工干预的情况下进行扫描。一些这样的***还能够在多个不同的物镜之间自动改变，例如美国专利No.9170412描述了一种这样的***，该专利的内容通过引用并入本文。

虽然这种自动扫描***可用于利用在空气环境中工作的物镜扫描生物材料，但这些***不适用于液体浸没显微镜。这尤其是由于以下事实：当物镜和样品相对于彼此移动时，浸没液体沿着样品板扩散，使得需要定期补充浸没液体。虽然已经开发***来尝试补充液体(例如，参见EP 1717628B1、DE 202017000475 U1、US 7304793 B2、https://www.leica-microsytems.com/products/light-microscopes/p/leica-water-immersion-micro-dispenser/以及https://www.marzhauser.com/en/products/liquid-immersion.html)，但此类***具有各种缺点，例如它们的设计增加了物镜的重量、减少了扫描面积以及降低了显微镜***的吞吐量。

因此，本领域需要一种用于利用浸没液体的自动高内涵显微镜的***和方法。

具体实施方式

通过以下详细描述以及参考附图将更好地理解本发明的实施例，其中：

图1是能够适用于根据本发明实施例的显微镜***实施例的示意图；

图2是被构造和操作以适用于根据本发明实施例的装置的等距视图；

图3是可用在根据本发明实施例中的安装在物镜支架上并附接至运动底座的物镜的剖视图；

图4是图3中的部件的俯视分解等距视图；

图5是图3中的部件的仰视分解等距视图；

图6是图4和图5中的运动件的等距视图；

图7示出了图3-图5的物镜单元的下部如何装进图6的运动底座的V形凹槽中；

图8和图9分别是俯视和仰视等距视图，其示出了安装在物镜支架中的物镜和附接有磁体的运动底座；

图10和11示出了根据本发明的实施例如何存储和改变物镜；

图12是根据本发明实施例的油加载子组件的局部分解图，该油加载子组件具有设置在透镜更换子组件上方的浸油筒；

图13是根据本发明实施例的油加载子组件的分解视图；

图14A、图14B、图14C和图14D分别是图13的油加载子组件在构造时的透视图、平面前视图、平面侧视图和剖视图；

图15A、图15B和图15C是将浸油筒***到图13、图14A、图14B、图14C和图14D的油加载子组件中的步骤的剖视图；

图16A和图16B是示出图13、图13、图14A、图14B、图14C、图14D、图15A、图15B和图15C的油加载子组件内的油流动路径的剖视图；

图17是示出图1-图11的透镜更换子组件和图12、图13、图14A、图14B、图14C和图14D的油加载子组件的透视图，包括处于透镜更换子组件的浸油加载位置中的物镜；

图18A和图18B分别是在图17的结构中将浸油加载到物镜上的正视图和侧视图。

图19A、图19B和图19C示出了当物镜相对于观察表面移动时浸油的扩散；

图20是概述根据本发明实施例的使用油浸透镜扫描样品并将浸油重新加载到油浸透镜上的方法的流程图；

图21A、图21B和图21C是概述根据本发明实施例的用于将油载油浸透镜自动聚焦在生物样品上的方法的流程图；

图22A、图22B和图23是概述根据本发明实施例的用于扫描样品的方法的流程图；

图24是根据本发明另一实施例的油加载子组件的透视图；

图25是根据本发明另一实施例的浸油筒的剖视图；和

图26A和图26B是将图25的浸油筒***图24的油加载子组件中的步骤的剖视图。

应当理解，尽管彩色附图和照片在科学文献中很流行，并且很容易以电子格式呈现，但PCT规则仍然深陷19世纪的困境，并且仍然不允许提交彩色附图或照片。而美国专利商标局仅允许根据请求书使用彩色附图或照片。因此，图13、图14A、图14B、图14C、图14D、图15A、图15B、图15C、图16A、图16B、图17、图18A、图18B、图19B、图19C、图24、图25、图26A和图26B是以黑白附图的形式与该本PCT申请一起提交的。然而，原始图画是彩色的，为了公开，已将其上传到公开的图片共享服务Shutterfly，任何人都能够在互联网上使用链接https://dripperpatentcolordrawings.com/pictures#n_5对其进行访问。该链接是在提交本专利申请时首次共享的，并且彩色附图通过引用并入本文。

现在参考图1，其是示意性地示出装置10的框图，装置10被构造和操作以适用于根据本发明的实施例。装置10包含支架12，支架12可被配置为保持样品板13，例如通常用于保持生物样品并具有下表面13A和上表面13B的6孔板、24孔板、96孔板、384孔板或1536孔板，正如本领域已知的那样，下表面13A和上表面13B分别包含待观察的单个样品或多个样品。支架12还可以被配置为保持显微镜载玻片、培养皿或具有底部的另一基板，该底部对于感兴趣的一个或多个波长的电磁辐射是透明的。作为参考，其本身不是装置的一部分的样品板13位于XY平面中，使得包含在样品板中的样品通过其下表面13A将与下文描述的装置10的部件相对。

无转塔物镜，即，作为线性XYZ扫描仪16的一部分的单个物镜14被布置为使得该透镜朝向样品架(并且，当存在样品板13时，朝向样品板13的下表面13A)，物镜14的光轴相对于样品架沿着Z轴。“线性XYZ扫描仪”是指被构造和操作以在三个相互垂直的方向上移动物镜14的机构，其中“Z”方向用于表示沿着光轴的移动。这种扫描仪本身在本领域中是已知的，例如来自2001年6月19日提交的标题为“Compact Linear Scanner System”的以色列专利No.143836或美国专利No.6850362，这两个专利的内容通过引用并入本文。应当理解，为了简单起见，图1中仅示出了XYZ扫描仪16的部分部件；下文将对该部件进行更详细的描述。图1所示的XYZ扫描仪的部件中有反射镜18和20，它们一起工作以沿着物镜14的光轴重新引导光，例如当XYZ扫描仪被布置为在倒置显微镜配置中操作时，以使来自照明单元22和来自自动聚焦单元24的光反射通过物镜14。反射镜18被构造并可操作以在X和Y方向上与物镜14一起移动，并且反射镜20被构造并可操作以在X方向上与物镜14和反射镜18一起移动，以确保光能够沿着物镜14的光轴行进。反射镜18和20还反射从样品接收的光(包括来自照明单元22或自动聚焦单元24的反射入射光或由样品的荧光产生的光)，使光沿着物镜14的光轴远离样品。

如图1所示，装置10还包括自动聚焦单元24。自动聚焦单元本身用于聚焦非流体浸没物镜，即，本领域已知的不使用油或水的物镜。如图1中所示的用法，自动聚焦优选为可用于高分辨率、高吞吐量显微镜应用的自动聚焦单元，例如2003年3月13日提交的标题为“Auto-focusing method and device”的PCT专利公布WO 03/077008或相同标题的美国专利no.7109459中所述的自动聚焦单元和方法，这两个专利的内容均通过引用并入本文。

在图1中，自动聚焦单元24发射激光束，其波长对于载有样品的载具而言是透明的，例如635nm，然后该激光束被分束器件(二向色滤光器26)反射到物镜14的光轴上，从反射镜18和20反射通过物镜14到达样品架中的载具上。然后它沿着相同的路径被反射回来，并被二向色滤光器26反射回自动聚焦单元，在那里它被传感器(未示出)和控制器(未示出)感测，控制器被编程以在必要时调整物镜沿Z轴的焦点。当自动聚焦单元24与包含荧光标记的样品一起使用时，可以选择自动聚焦光的波长以便不在样品中引发荧光响应，尽管这通常并不重要，因为自动聚焦过程通常将在图像捕捉过程开始之前完成。当使用例如油浸透镜时，能够采用类似的过程，但由于油的使用而进行某些改变，如下文将更详细描述的。

图1中还示出了照明单元22。照明单元22包括照明源(未示出)，例如水银灯、LED灯、激光器或其他合适的辐射源。如果需要，照明单元22包括准直光学器件。在样品包含一个或更多个荧光探针等的情况下，布置合适的分束器件以将激发光反射到物镜14的光轴上。该分束器件可以是四向滤光器28，其反射由照明单元产生的激发波长的光，但允许其他波长的光通过，特别是允许样品中的荧光探针的荧光所产生的光通过。应当理解，照明单元22可以被配置为产生不止一种波长的电磁辐射，或者可以采用不止一个照明单元以便产生不止一种波长的电磁辐射，例如如果被观察的样品中采用了多个荧光探针，则假设还采用适当的分束器件来确保激发光反射到物镜14的光轴上并且使感兴趣波长的光(例如由样品中的荧光探针产生的荧光)通过。另外，应当理解，虽然图1示出了自动聚焦单元24位于照明单元24和物镜14之间，但是原则上照明单元22和自动聚焦单元24的位置可以互换，只要提供适当的光学器件即可，以确保只有感兴趣波长的光通过达到图像捕获器件30。

如图1所示，被样品反射的光或由样品(通过荧光)产生的光，或者如果从上表面13b的侧面照射样品，则透射穿过样品的光在被一个或更多个图像捕捉器件30检测到之前沿着物镜14的光轴行进并且穿过二向色滤光器26和四向滤光器28。图1描绘了一种装置，在该装置中存在三个这样的图像捕捉器件，即，三个CCD相机30、30'和30”，并且在该装置中，在穿过分束器件26和28之后但在照射到CCD相机上之前，光穿过管透镜32、从折叠镜34反射并且被RGB棱镜36分开，然后穿过发射滤光器38、38'和38”，所述发射滤光器38、38'和38”滤除样品中荧光探针的发射带之外的所有光。在图1中，发射滤光器38允许红光通过，发射滤光器38'允许绿光通过并且发射滤光器38”允许蓝光通过。应当理解，棱镜36可以不是RGB棱镜，并且滤光器38、38'和38”因此可以过滤不同范围的波长。

图1中所示的***的操作由一个或更多个控制器(未示出)控制，这些控制器被共同编程以控制自动聚焦单元、照明单元的操作和XYZ扫描仪的移动。还可以提供用于对图像捕获器件获得的图像进行分析的分析单元(未示出)，该分析单元也可以是一个或更多个控制器的一部分或者可以是单独的单元，并且可以被配置为向所述一个或更多个控制器提供反馈。此外，如本领域技术人员将理解的，还可以提供输入和/或输出设备(例如键盘、光或磁存储读取器和/或写入器、打印机)、显示设备(例如等离子或LCD显示器)以及存储设备。

本领域技术人员将理解，根据本发明的实施例，可以采用图1所示的装置的变型；下文描述了至少一种这样的变型，用于在使用油浸透镜时实现自动聚焦方法。

如图1所示的XYZ扫描仪能够并入根据本发明实施例的装置中。例如，参见图2，其以等距视图示出了装置810的部分，该装置810被构造和操作使得其能够适用于根据本发明的实施例。装置810包含样品架812，样品架812保持96孔样品板813。样品板813位于与物镜814的光轴垂直的平面中，物镜814是扫描仪816的一部分并且在三个相互正交的方向(即，X、Y和Z方向)上可移动。扫描仪816包括反射镜818和反射镜820，反射镜818安装在沿X和Y方向可移动的反射镜安装件819中、反射镜820安装在沿X方向可移动的反射镜安装件821中。

图2还示出自动聚焦单元824和反射镜827，反射镜827将光从自动聚焦单元引导到二向色滤光器826或者相反；二向色滤光器826将光从自动聚焦单元824引导到物镜814的光轴。还示出了照明单元822的一部分(其包括光缆束822a和准直光学器件822b)和被布置成将光从照明单元反射到物镜814的光轴的四向滤光器828。然后，从样品反射或者由样品板中的荧光(例如荧光探针的荧光)产生并且未被四向滤光器828滤除的光被管透镜832聚焦并被折叠镜834反射到相机830；滤光轮837包含滤光器838、838'和838”，能够选择这些滤光器来过滤进入相机830的光。

根据本发明的一些实施例，该装置配备有耦合机构以方便更换物镜，但是应当理解，该机构能够用于其他光学仪器中。现在参考图3-图9，其示出了这种机构的一个实施例。如图3、图8和图9所示，物镜1010永久地安装在物镜底座1020上。物镜1010和物镜底座1020一起形成物镜单元1060。物镜单元1060附接到运动底座1040。根据本发明的一些实施例，运动底座1040可以永久地安装在XYZ扫描仪的Z轴部件的顶部上，使得包含物镜(例如透镜338)的物镜单元1060可以停放在其上，如现在所描述的；或者，该运动底座可以形成为XYZ扫描仪的Z轴部件的顶部的一部分。

如现在所描述的，如图所示，物镜底座1020和运动底座1040之间的附接使用特定的运动安装结构，该运动安装结构提供50纳米范围或更佳的定位精度。物镜底座1020包含多个耦合球1030(图3-图9中描绘了三个这样的球)并且被加工成使得在设置就位之后，耦合球1030相对于物镜1010的光轴的空间位置具有高精度。耦合球1030具有高刚度(例如53-58RCSS或更高的硬度)并且具有合适的直径，例如3～3.5mm。每个耦合球1030在形成于物镜底座1020的下表面中的孔1020a之一中被保持就位，使得球直径的30～40％向下突出到物镜底座1020的下表面之外。孔1020a可以仅部分穿透进入物镜底座1020中，从而形成一端封闭的圆柱体，或者它们可以完全穿过物镜底座1020的底部。每个孔1020a与放置在其中的耦合球1030具有干涉直径公差，由此将球牢牢地固定到位。物镜底座1020由诸如17-4PH的铁磁钢制成。

如图所示，运动底座1040通常为圆环形状，并且具有形成于其上侧的呈V形凹槽1040a形式的多个凹口。耦合球1030和凹槽1040a的间隔使得耦合球适配到三个凹槽中，如图7中以简化形式示出的。运动底座1040还可以由高性能铁磁钢(例如17-4PH)制成，其经过热处理达到39RC或更高的表面硬度，使得运动底座1040在透镜单元1060的周期性加载和卸载操作期间保持附接精度。为了确保运动底座1040具有所需的表面硬度，进行以下制造过程：(a)将零件制造成最终尺寸，为最终凹槽1040a磨削过程留下50微米；(b)进行热硬化过程；(c)将V形凹槽1040a磨削至最终尺寸。

如图所示，运动底座1040形成有穿过其中的三个孔1040b，这三个孔1040b围绕底座大致均匀地间隔开。将磁体1050***到每个孔1040b中并粘合到位。当部件离得非常近时，磁体1050一起引起与物镜单元1060的磁性附接力。该附接力通过平衡施加在运动耦合件上的附接力将物镜定位在适当位置，并且在光学***以高加速度移动时将物镜单元1060保持在适当位置。应当理解，磁体不一定必须与物镜底座1060接触，也不一定必须如例如在图9中所示穿过孔1040b突出。因此，在本申请中，当描述这样的磁体“安装在”与铁磁表面相对的表面“内”时，磁体可以从它们“安装在”的表面突出、或者嵌入在其内或者甚至在其下方，因为磁性吸引力无需直接物理接触即可发挥作用。

尽管图3-图9示出了耦合机构的特定实施例，但是应当理解，所示内容的变型是可能的。这是因为球1030和凹槽1040a的共同作用是不仅将物镜单元1060精确地定位在XY平面中而且还限制物镜单元1060在XY平面和负Z方向上的运动，并且磁力的添加限制了物镜单元在正Z方向上的运动，并且这些效果原则上能够通过其他装置来实现。因此，例如，可以采用更多或更少的孔1040b以及相应地更多或更少的磁体，并且磁体可以安装在透镜物镜单元的底部以及运动底座内，或者磁体可以专门安装在透镜物镜单元的底部内。类似地，凹口和球的位置可以互换，使得物镜单元1060的底部包含凹口(例如凹槽)，并且运动底座的上表面具有从其突出的球，或者物镜单元和运动底座两者都可以具有凹口和球，或者运动底座可以具有突起和两个凹槽，并且物镜单元1060的底部可以具有对应的凹槽和两个对应的突起。

此外，凹口可以是除V形凹槽之外的形状，例如，凹口中的一个或更多个可以是井的形状，其为搁置在其中的球1030提供三个接触点而非如V形凹槽中的两个接触点。一个这样的井，与单个V形凹槽和运动底座的表面以及适当定位的足够强度的磁体相结合，可以具有与三个V形凹槽相同的效果。另外，也可以采用与这些凹口适配的球形以外的突起。因此，例如，本领域技术人员将理解，尽管在附图中示出了多个球1030被保持在孔中，但是其他构造装置也是可能的，例如可以使用圆头钉子。

凹口的相对位置也可以不同于图3-图9所示的位置：凹口可以被布置成使得来自相对件的突起仅以一种方式适配在其中，从而仅提供了仅一种方式使物镜单元在运动底座上设置到位。或者，可以使用三个突起(以确保具有突起的部件位于平面上)，例如如上文关于物镜单元所描述的，但是在相对件中存在三个或六个V形凹槽(例如，如上文关于运动底座所示的)，可以采用更大量(例如9个或12个)均匀间隔的、径向定向的V形凹槽，以便于更容易地放置透镜单元，例如当在像下文描述的物镜更换器那样的物镜更换器中使用时。

此外，虽然图3-图9示出了由物镜1010和物镜底座1020形成的物镜单元1060，但应当理解，物镜1010可以以不需要物镜底座1020的方式形成，例如如果物镜1010的底部由铁磁材料制成并被机械加工以具有从其突出的耦合球1030。应当理解，当在说明书或权利要求书中陈述物镜具有“与其相关联”的表面时，该表面可以是物镜组件自身的表面，或者它可以是透镜支架的表面或其上安装有物镜的底座的表面，如图3-图9所示。

上述耦合机构使得物镜能够以足以允许使用物镜获得高精度观察的足够精度重复地***到光学设备中和从中移除。因此，本文描述的机构有利于在光学设备中使用多个物镜，因为透镜能够换入和换出；在图中所示的设备的情况下，这能够在不给XYZ扫描仪增加整个物镜的重量负担的情况下实现，因此与XYZ扫描仪承受整套物镜的重量所实现的加速度和稳定时间相比，其有利于实现更高的加速度和更快的稳定时间。相反，物镜可以存储在装置中的其他地方并且当期望改变放大倍率时根据需要进行更换。另外，虽然承载多个物镜的转塔是已知的，但这种转塔中的物镜被布置成使得使用中的物镜与沿Z轴的焦点路径对准，而不使用的物镜则相对于Z轴成一定角度，因此将一个油浸透镜切换为另一个油浸透镜会导致随着转塔旋转并且透镜移动到远离垂直方向的角度出现油损失。因此，如图10和图11所示，透镜更换子组件1000包括匣盒1080，匣盒1080将多个物镜单元1060保持在多个站1070中。匣盒1080中的每个物镜单元1060大致与XYZ扫描仪1090的Z轴对准并且大致垂直于连接到XYZ扫描仪1090上部的运动底座1040的平面，此外，如下所述，从每个物镜单元1060的底部突出的耦合球1030被定位成使得当XYZ扫描仪升起以接触物镜单元时它们将与运动底座中的V形凹槽1040a接合。每个站1070包括一对臂1072，使得每对相邻的臂能够保持物镜单元1060。如图10和图11所示，匣盒1080保持三个物镜单元1060，原则上光学设备可被设计成保持更多个这样的物镜单元。

为了说明如何采用耦合机构来更换物镜，假设扫描仪1090最初没有附接有物镜单元，如图10所示，并且至少一个物镜单元1060加载在匣盒1080的一个站1070上。扫描仪1090首先移动到Z位置，该位置足够低以使其能够在选定的物镜单元1060下方移动。然后，XYZ台在XY平面中移动到某一位置，在该位置中，放置在站1070中的所选物镜的光轴大致与一旦定位用于XYZ扫描仪1090上时物镜所需的光轴对齐。然后向上移动Z台，以便与所选物镜单元1060的下部接触。这导致耦合球1030搁置在凹槽1040a中。磁体1050靠近由铁磁材料制成并因此被磁体吸引的物镜单元1060的底部，导致耦合球1030沉降在凹槽中并被保持在那里。如图3-图11所示，当耦合球和V形凹槽被加工得足够精确时(例如，在50nm公差内)，使用三个大约120°间隔的耦合球和从运动底座的中心径向定向的V形凹槽，并且耦合球适配在V形凹槽中，这些使得可以以足够的精度设置物镜的光轴，从而无需进一步校准即可使用物镜。Z台进一步向上移动，足以将物镜单元1060提升离开臂1072。然后可以将XY台移出站1070。光学***现在准备好使用所选择的物镜进行操作。

当从第一物镜更换为第二物镜时，重复类似的过程。扫描仪移动到开放站1070，并以与上述顺序相反的顺序操作，将第一物镜单元1060放置在站1070中。然后XYZ台移动到匣盒1080的不同站并以与以上针对第一物镜所述的方式类似的方式加载第二物镜。

应当理解，XYZ扫描仪的移动可以是自动的，通过适当的电动机实现并由为此目的而编程的微处理器控制。

还应当理解的是，尽管在图10和图11中，XYZ光学扫描仪1090被示出为用于方便将物镜转移到光学***上并从光学***移开的设备，但所描述的方法并不局限于与XYZ光学扫描仪一起使用并且能够用在任何具有移动光学元件的***中，该移动光学元件由电机、编码器、传感器、伺服控制器或其他自动化元件组合控制。此外，在移动光学***不能到达所有物镜单元的情况下，可以采用辅助运动***(未示出)来移动匣盒1080，使得待使用的特定透镜处于光学***可访问的位置。

此处参考图3-图11所描述的透镜更换子组件1000对于使用液浸物镜进行生物样品的自动化高内涵或高吞吐量筛选是特别有利的。然而，应当理解，在本发明的一些实施例中，该装置或设备并不具有透镜更换子组件，仅使用单个物镜的装置或设备在X和/或Y方向上足够大，使得(a)：物镜能够沿Z轴远离样品架移动同时保持其三维方向(例如，俯仰、滚动和偏航)，并在XY平面中移动到补油位置，然后在补油后返回到XY平面中的同一位置，并且在Z方向上重新聚焦后，从中断的位置继续扫描；(b)：在保持其在XYZ坐标空间中的取向的同时，样品架能够从其固定位置移动进行扫描，以便于补油，然后移回扫描中断的同一位置，使得物镜在Z方向重新聚焦后，能够从扫描中断处继续扫描；或者(c)：(a)和(b)的组合。

生物样品的液浸扫描的挑战之一是需要定期补充物镜上的液体。当在物镜相对于样品移动且靠近或接触样品架(例如多孔板、培养皿或样品承载载玻片)表面的情况下进行扫描时，这一点尤其重要，因为物镜和样品架之间的相对运动导致浸没液体扩散，直至浸没液体层不足以正确观察样品时。因此，扫描被限制在必须补充浸没液体之前物镜能够移动的距离。

如上面的背景讨论中所指出的，用于补油的现有技术***具有各种缺点，例如它们需要在物镜本身上放置额外的物品，从而增加了物镜组件的重量及其有效尺寸，这会减少被扫描样品的面积，并限制镜头本身与样品架的接近程度。另外，当手动完成此操作时，人类用户必须停止***的操作并手动地或者在专门设计的装置的帮助下将浸没液体补充到物镜上。这极大地延迟了***的运行，并且需要操作人员定期注意。因此，它也更容易出错。另外，手动补充浸没液体的需求限制或阻止了对彼此相距很远的许多位置进行扫描的大型筛选过程。

将浸油手动施加到物镜的另一个挑战是操作人员可能施加太少的油，导致显微镜***频繁停止。或者，操作员可能施加过多的油，导致油在物镜单元运动期间溢出，例如从操作员将浸没液体施加到扫描位置的位置处溢出。另一个问题是，为了避免透镜从其聚焦位置移动，迄今为止，有必要在将物镜保持在靠近样品架表面的位置(例如靠近多孔板的底部)的同时进行油补充，这为向透镜添加油留下很少的操作空间。

根据本发明的实施例，如下文关于图12-图19B所描述的，构成显微镜***的一部分的透镜更换子组件确保存在固定位置，物镜能够自动移动到该固定位置，并且在该固定位置中物镜不会被布置在样品下方。这种固定位置的存在有利于将下面讨论的创新性浸没液体加载子组件构造在透镜更换组件的匣盒的预定位置的正上方。如下文所述并根据本发明的实施例，在使用时，浸液物镜周期性地移动到透镜更换组件的匣盒的预定位置，并且油从液体加载子组件自动施加到物镜上，之后，***自动将物镜返回到扫描位置，以便继续扫描过程。

应当理解，下文描述的浸没液体子组件及其使用方法适合与任何合适的浸没液体一起使用，例如合成烃基油、水、甘油、硅油等，并且本文公开的范围应被解释为包括适用于显微镜检查、特别是适用于生物样品的显微镜检查的所有类型的浸没液体。然而，为了简洁和清楚起见，以下讨论涉及基于合成烃的浸油，即涉及油目标、浸油的加载等。

现在参考图12，其是根据本发明实施例的油加载子组件200的局部分解图，该油加载子组件200具有设置在透镜更换子组件400上方的浸油筒300。透镜更换子组件400在结构和操作上与上文描述的透镜更换子组件1000基本相似。如图所示，透镜更换子组件400包括透镜保持匣盒410，透镜保持匣盒410具有用于保持物镜的多个位置，这里示出为三个位置。匣盒410的最左侧位置412被示出为临时容纳油浸物镜单元500，类似于上文关于图3-图9所描述的物镜单元。最左侧的位置412被预先确定为油加载位置，使得油加载子组件200的出油口设置在油加载位置412的上方，处于将油滴到物镜单元500的物镜上的位置。下文将进一步详细描述的浸油筒300定位在油加载子组件200中的相应井的上方，并且适于***其中，如本文所解释的。应当理解，因为位置412被保留用于油加载，所以如图所示的透镜更换子组件400可以实现两个透镜之间的更换，这两个透镜可以存储在位置412右侧的其他两个位置中。还应当理解，透镜更换子组件400可以形成有额外位置，以便于在更多数量的透镜之间进行更换。或者，如前所述，原则上不需要透镜更换子组件，例如，如果装置中有足够的空间来提供距样品足够远的油加载位置，从而不将扫描限制为仅扫描样品的一部分。

选择油加载位置412，使得该位置总是在扫描样品的透镜的扫描路径之外。

在一些实施例中，透镜更换子组件400的油加载位置412可以包括称重机构，用于确定物镜单元500处在该位置时的重量。例如，当物镜单元500被放置在油加载位置412中时，该称重机构能够获得基准重量或去皮重量。因此，该称重机构能够识别物镜单元的重量变化，例如在将浸油施加到其上之后。基于浸油的性质，与该称重机构相关联的控制器能够确定有多少浸油被施加到物镜单元500，以及是否需要额外施加油。

称重机构可以是用于对物镜单元500称重的任何合适的机构。在一些实施例中，称重机构可以包括附接到透镜更换子组件400的框架结构402的柔性叶片420。一对柔性臂422从叶片420延伸，当物镜单元处于位置412时，臂围绕物镜单元500设置，使得物镜单元500靠在臂422上。例如在臂的自由区域内，附接到每个臂422的一个或更多个表面，但是在一些实施例中，在靠近叶片420和/或靠近框架结构402处，存在薄的、扁平的应变仪(未明确示出)。每个应变仪电连接(例如，通过细线，未示出)到位于臂422下方的薄的、扁平的电子卡(未明确示出)。电子卡可被定位成使得应变仪和卡之间的连接长度最小化。电子卡电耦合到处理器(未示出)。应当理解，应变仪和电子卡的使用允许将臂422的偏转与电路中的电阻变化相关联，例如使用也位于电子卡上的惠斯通电桥测量，从而允许计算物镜单元500的重量变化，从而计算施加到物镜的浸油的质量。这样，臂422与应变仪一起形成信号提供器，用于提供指示施加到物镜单元的浸油量的信号。如果浸油的密度已知，则有助于计算所添加的浸油的体积。例如，可以在每次施加浸油之后迭代地计算施加到物镜的浸油的量，并因此实时识别是否已经施加了足够量的浸油。这样，如下所述，与称重机构相关联的控制器可以在功能上与油加载子组件200的油泵相关联，使得基于与物镜单元的重量相关的信息来启动和停止施加浸油的泵的操作。

在一些实施例中，溢流托盘(未明确示出)可以设置在匣盒410的下方，或至少设置在油加载位置412的下方，以收集从油加载子组件200滴到物镜单元500上的任何溢出的浸油或当油加载位置没有放置任何物镜时则可能会溢出的浸油。还应当理解的是，用于透镜的支架(例如图5中的物镜底座1020)的存在可以在油从物镜流出时提供油捕集器。

或者，能够通过校准从油加载子组件释放的一滴油的平均油量来计算所添加的油量，并且能够对施加到透镜的油滴的数量进行计数以计算所添加的油量，例如通过连接到传感器的光束，每次油滴中断光束时传感器都会提供信号；或者通过耦合到自动图像分析程序的相机来检测和计数掉落的油滴。或者，每次补充物镜上的油时，能够计算从油储存器移除的油量(例如通过测量储存器中的重量变化)，以计算施加到透镜的油量。

无论是通过直接测量重量来确定的，还是通过计算油滴数、添加的总油量以及因此组件中剩余以进一步施加到透镜的油的总量来确定的，都能计算所施加的油量并可选地显示在屏幕或其他输出设备上。

现在参考图13，其是根据本发明实施例的油加载子组件200的分解视图，并且参考图14A、图14B、图14C和图14D，它们分别是油加载子组件200被构造并且其中设置有浸油筒300时的透视图、平面前视图、平面侧视图和剖视图。这种筒可以由任何合适的材料制成，这些材料不与其中所包含的油或其他液体显著相互作用或导致其降解。在图13-图18B所示的实施例中，匣盒优选由金属制成，例如铝。在图24-图26B所示的实施例中，匣盒优选由塑料制成。

如图所示，油加载子组件200包括主体部分210和泵座孔216，主体部分210具有与油观察开口214流体连通的中心油盆212，泵座孔216终止于泵入口管道217(参见图14D)。如图14D所示，油流管道218从油盆212的基部并且邻近的泵入口管道217延伸，并终止于主体部分210的边缘，其中油流管道被阻挡件220密封。观察窗口222设置在油观察开口214内并将油观察开口214密封。从图14B中清楚可见，观察窗口222包括大体圆形透明部分224，允许操作员观察油加载子组件200中的油位，并且确定何时必须更换浸油筒300，如下文进一步详细解释的。在其变型中，该窗口可以设置有盖子，以在用户不直接观察油位时将光线挡在窗口之外；或者，油加载子组件200能够既不设置观察开口214也不设置窗口222。

筒穿刺元件230位于中心油盆212内，并且通过紧固件232(例如螺钉或螺栓)附接到其上。然而，紧固件232可以由任何其他合适的附接机构替代，例如焊接、粘合等。筒穿刺元件230包括底座234和穿刺针236，穿刺针236具有纵向延伸穿过其中的中空通道238，该通道包括孔239(参见图15B-图15C)并且终止于锋利尖端。当浸油筒300安装在中心油盆212中时，如图14A-图14D所示，中空通道238与中心油盆212以及油流管道218流体连通(参见图14D和图16A)。

隔膜泵250设置在泵座孔216内，使得其入口252位于泵入口管道217内，并且其出口管道254向下延伸出主体部分210。隔膜泵250适合于将油从油流管道218通过出口管道254吸到布置在出口管道下方的物品上，在使用时，该物品是浸油物镜。

油加载子组件200还包括底座安装件260，底座安装件260安装到主体部分210的底侧上并且适于将油加载子组件200附接至显微镜***的其他部件，位于透镜更换子组件400上方。后安装件265安装到主体部分210，位于中心油盆212的后方。底座安装件260和后安装件265两者都可以通过紧固件268(例如螺钉、螺栓等)连接到主体部分210。然而，任何其他合适的连接方式，例如粘合、焊接等，都被认为在本发明的范围内。

现在参考图15A、图15B和图15C，它们是示出了将浸油筒300***到油加载子组件200中的步骤的剖视图。如图15A所示，浸油筒300包括由大致圆柱形壁部分302形成的壳体301，该壁部分302限定具有第一内径的空腔304，并终止于唇缘306。在其远离唇缘306的一端，壁部分302延伸至大致横向的肩部310，该肩部使壁部分的内径变窄以形成具有第二内径的大致圆柱形中空颈部部分312。颈部部分312的第二内径可小于壁部分302的第一内径。在颈部部分312的远离肩部310的一端处，颈部部分312的壁的厚度减小，从而限定具有第三内径的第一腔室，该第三内径大于第二内径。第一腔室包括环形肩部316，并且终止于唇缘318。在其外表面上，颈部部分包括卡扣配合的突起和/或凹槽319，其适于与中心油盆212的内周中的对应凹槽和/或突起219卡扣配合。

大致环形的横向壁320在布置在唇缘306和颈部部分312之间的位置处从壁部分302径向向内延伸，其到唇缘306的距离比到颈部部分312小得多。环形横向壁320径向向内终止于罩部分322中，环形横向壁320与壁部分302大致同心。环形横向壁320和唇缘306之间的体积限定第二腔室。经由由颈部部分312限定的中空部、由壁部分302限定的中空部以及罩部分322的中空部，在第一腔室和第二腔室之间存在着流体流动路径。

穿刺活塞330设置在壳体301内。穿刺活塞330包括大致圆形的底座332，中心轴334从该底座延伸并终止于尖锐边缘336，尖锐边缘336可以包括一个或更多个点。在轴334的靠近边缘336的上部部分处，轴334限定中空部338，并且包括将中空部338与围绕轴334的环境连接的一个或更多个孔340。轴334的其余部分是非中空的。

在如图15A所示的浸油筒300的初始、闭合、操作取向中，第一密封件350可以是对油呈惰性的材料(例如尼龙或铝箔)，其设置在第一腔室中并接合环形肩部316。穿刺活塞330的底座332设置在颈部部分312的中空部内并接合第一密封件350，使得轴334延伸穿过由颈部部分312、壁部分302和罩部分322限定的中空部。尖锐边缘336不延伸超过环形横向壁320的端部，并且可以与其齐平。第二密封件352可以是对油呈惰性的材料(例如尼龙或铝箔)，其设置在第二腔室中并且接合横向壁320。这样，在浸油筒300的闭合操作取向中，筒被密封，其中设置有油(为了清楚起见，图15A中未示出油)。

为了使用筒300中的浸油，用户沿箭头360的方向移动筒，使得第一密封件350面向中心油盆212和设置在其中的穿刺元件230。

转向图15B，可以看出，当使用者将浸油筒300推入中心油盆212中时，中心油盆212的穿刺元件230，特别是穿刺销236刺穿第一密封件350，并推动穿刺活塞330的底座332朝向第二密封件352。因此，整个穿刺活塞330沿箭头362的方向朝壁部分320移动，并且轴334的尖锐边缘336刺穿第二密封件352。浸油筒300的卡扣配合突起和/或凹槽319与中心油盆212的内周中的对应凹槽和/或突起219接合，确保筒在油井内卡扣配合。在此取向中，密封件350和352被刺穿，空气能够流入浸油筒300中，并且油能够流出筒，如图15C所示。这样，油流出筒，围绕穿刺活塞330的底座332，并通过穿刺元件230的通道238和孔239，进入中心油盆212内。

现在另外参考图16A和图16B，它们是示出油加载子组件200内的油流动路径的剖视图。如图所示，在如图15A至图15C所示的将浸油筒300开封之后，油从中心油盆212经由油流管道218流至泵入口管道217。应当理解，为了减少灰尘或其他材料污染油的可能性，油筒300在已安放并被刺穿以将油释放到盆212中之后可留在原位，或者该装置可设有盖子(未示出)，当油筒300被移除时该盖子覆盖油盆212。

隔膜泵250的操作，例如响应于从控制器接收的信号或输入，导致泵经由位于泵入口管道217中的入口252将油吸入其中，如图16A所示。被吸入隔膜泵250中的油然后经由泵的出口管道254从泵滴出，如图16B所示。在操作中，油浸物镜单元设置在出口管道254下方，使得油滴落到物镜上，如下文进一步详细描述的。

现在参考图17，其是透镜更换子组件400和油加载子组件200的透视图图示，其中物镜单元500设置在浸油加载位置412中。另外参考图18A和18B，它们分别是在图17的结构中将浸油加载到物镜上的正视图和侧视图。

如图所示，浸油筒300安装在油加载子组件200中，油加载子组件200安装在透镜更换子组件400上方。包含油浸透镜502的物镜单元500位于透镜更换子组件的油加载位置412中，使得隔膜泵的出口管道254位于油浸透镜502的正上方。如图18A所示，在接收到触发隔膜泵250操作的合适控制信号时，浸油滴504被从出口管道254排到浸没透镜502上。在一些实施例中，油滴包含20～30μl的油。由于浸油的表面张力，油滴在透镜上保留为丘状506。在一些实施例中，透镜单元500可以例如通过透镜更换子组件200的运动而升高，使得透镜502靠近出口管道254的出口开口。这可以确保排出的油直接滴到透镜上，并且没有被浪费。

在一些实施例中，在每次进行油加载时，可以将多滴油施加到透镜单元500。一旦足够量的油被施加到透镜单元500，透镜单元就可以返回到其扫描位置，例如如上文关于图10和图11所描述的。如下文进一步详细解释的，滴到透镜上的油量可以例如基于考虑到透镜已经执行的运动的预期油扩散来估计，或者可以例如通过如上所述的称重机构来计算。

现在参考图19A、图19B和图19C，其示出了在使用显微镜***期间当物镜单元相对于观察表面移动时浸油的扩散。

如图19A和图19B所示，多孔板600设置在板支架602内。多孔板具有下表面604和多个孔606，每个孔包括生物样品。油浸透镜单元500设置在下表面604下方，并且最初定位成扫描井606a中的第一样品。如图的放大部分所示，在这个阶段，即在将浸油加载到透镜单元500上之后的初始阶段，布置在透镜单元500的透镜上的油滴通过与透镜单元500的紧密靠近而扩散到下表面604，形成油层610。任何多余的油可以流到物镜单元的倾斜边缘510，并且可以被捕获在物镜单元的顶部部分处的圆周凹槽512中。浸油的表面张力确保油和多余的油将与一侧的物镜单元以及另一侧的板保持接合。正如下面将详细讨论的，油通常经过配制，使其折射率与多孔板或其他样品容纳容器的底部的折射率相同；通常该底部是由玻璃制成的。

图19B示出了在透镜单元500沿着板600移动、扫描井606b和606c并且现在已经到达井606d之后的透镜单元500。在此阶段，油层610的厚度相对于图19A所示的厚度有所减小。这是因为通过物镜单元的运动，浸油已经沿着板的下表面604扩散。如下文进一步详细解释的，与物镜单元相关联的控制器(例如上文讨论的显微镜***或XYZ移动的控制器)可以被配置为确定物镜单元的运动距离已达到阈值，此时，预期浸油将扩散得太薄，并且控制物镜单元的操作以使物镜单元返回到油加载位置以向其施加额外的油。

图19C示出了设置在透镜单元500顶部的油滴的五种不同状态。如图所示，在初始阶段(i)——该阶段通常在将油施加到透镜单元之后立即发生)——根据油的表面张力，油滴形成圆顶。事实上，此时的油滴实际上是液滴的形状。

在(ii)处，透镜单元接近板的表面604，但尚未沿着该表面扩散。此时，液滴在板的下表面和透镜单元的上表面之间垂直拉伸。在油滴从板分离期间，当接近板时或者当透镜单元相对于板降低时这种构造可能发生。

在(iii)处，透镜单元已经更接近表面604，使得油滴沿着围绕透镜单元区域的板的一部分扩散。然而，油仍然仅包含在透镜单元区域中。在一些实施例中，如(iii)中所示的油滴的构造可以在高度等于初始扫描高度时出现，如下文关于图21A和图21B所述。

图像(iv)显示了在物镜聚焦之后以及在板的初始区域或井的扫描期间的油的构造，如下文详细描述的。如图所示，油相对于(iii)更加分散，但仍然仅位于物镜上方，并且与其基本同心。透镜单元移动以例如扫描井的另一个区域或另一个井后，一些油残留在物镜先前扫描的板部分上，并且一些油随着物镜移动到新区域，导致油还扩散到不位于物镜正上方的区域，如(v)所示，其中物镜相对于板移动到右侧，并且油现在扩散到物镜上方和物镜的左侧。

图20是概述根据本发明实施例的用于使用油浸透镜扫描样品并将浸油重新加载到油浸透镜上的方法的流程图。下面的描述针对图19A和图19B所示的板600进行，板600具有下表面604，并且每个孔具有上表面，生物样品布置在该上表面上。然而，本公开同样适用于具有下表面和上表面的任何其他样品承载结构。

如图20所示，在第一设置步骤700中，粗略估计板600的下表面604的Z轴位置。该近似值被存储，并将作为用于扫描整个板的板高的近似值来使用。这样的粗略估计步骤可以针对所检查的每个单独的板进行，或者可以针对多个板或样品载体进行一次。

在一些实施例中，可以使用快速激光扫描来执行板的下表面的Z轴位置的粗略估计，从而在计划扫描的几个位置处识别板的底表面。在一些其他实施例中，可以使用激光扫描为板或板的区域确定多个焦点，例如3个或4个焦点，并且基于所述多个焦点来确定板的下表面的近似平面。

如下文所解释的，板的下表面的近似高度被用作板的后续聚焦操作的基础，如本文所解释的，该聚焦操作是使用激光束反射的最大信号的搜索来进行的。有多种方法可以执行该初始粗略估计。一种选择是使用空气物镜确定板的下表面的近似高度，然后切换到油浸物镜进行实际聚焦和扫描。另一种选择是基于板和装置的结构来确定高度，已知来自特定制造商的特定型号的板的底部的平均距离将是板的底部边缘上方的给定距离，并且已知装置的尺寸。在一些实施例中，板的下表面的高度的初始粗略估计可以通过与用于扫描样品的油浸物镜相比具有更低放大倍率的油浸物镜来执行，然后切换到用于实际扫描的更高放大倍率的油浸物镜。

在第二设置步骤702中，例如使用用户界面来定义板或载玻片的一个或更多个扫描区域，并将其提供给如本文所述的控制物镜的XYZ运动的控制器。在第三设置步骤704中，在对油浸物镜补油之前，确定其能够损失的油的最大阈值量；如下所述，该量能够根据物镜的总移动、重量损失或油厚度来跟踪。在一些实施例中，***会被编程为在每次补油之后根据施加到透镜的油量动态地调整该阈值。

尽管在图20中以特定顺序描述了设置步骤700、702和704，但是也可以以不同的顺序执行它们，只要它们在启动生物样品的扫描之前发生即可。

在步骤706(该步骤也发生在开始扫描之前)中，物镜单元被放置在透镜更换组件的油加载位置，并且初始量的油从油加载子组件滴到物镜上，如本文所述。例如，当物镜处于正确位置时，与隔膜泵相关联的控制器向泵提供信号以将浸油滴到物镜上。

在一些实施例中，油的初始量大于如本文所述的在稍后阶段加载的后续油量。

在一些实施例中，使用如上文所述的称重***来确定加载到物镜上的油的准确量。在一些其他实施例中，基于施加到物镜上的油滴的数量、泵所抽吸的每滴浸油的体积(其是已知值)以及所需吸出的油量来粗略估计加载到物镜上的油量。

在步骤708中，控制器控制油加载物镜的XYZ运动以使透镜到达用于扫描的适当XY位置，如步骤702中所确定的位置。当启动扫描时，XY位置是应该开始扫描的位置。在稍后对物镜补充油的迭代之后，如下所述，XY位置是扫描停止以补充浸油的XY位置，或者是下一个XY位置。在步骤710中，控制器使物镜升高到预定的初始扫描高度，通常距板的下表面的近似Z轴位置几微米，如在步骤700所确立的。该预定高度被选择为足够靠近板的下表面，使得物镜上的油滴扩散到板的底表面上，如图19A所示。

在步骤712中，例如使用下文参考图21所描述的方法，自动计算样品处于聚焦状态时板相对于样品的距离，并且将物镜移动到焦距。一旦物镜处于所确立的焦距处，则在步骤714中开始对样品进行扫描。

在扫描期间，物镜相对于样品或板600在不同位置之间移动，如上文关于图19A和图19B所述。例如通过与物镜相关联的控制器来跟踪物镜所经过的距离，包括涂油物镜与板的表面接触时的移动和物镜不与板接触时的移动。控制器能够配置为计算由于这种移动所导致的物镜损失的油量，以及物镜沿Z轴降低而与板脱离接触时损失的油量。在一些实施例中，控制器还考虑物镜沿着板移动或脱离与板的接触时板材料的差异对油损失量的影响。可选地或附加地，可以通过监测涂油物镜自其被涂油时起的重量变化，和/或通过检查物镜上的油的厚度(例如用相机或通过激光测量)来跟踪油损失量。

在步骤716(其可以连续地或周期性地发生)中，控制器检查由于物镜移动而损失的油量是否大于在步骤704中确立的最大阈值量。如果所经过的距离小于最大阈值油损失，则在步骤714中继续扫描。

否则，如果计算出的油损失量等于或大于最大阈值量，则在步骤718中相对于板600降低物镜，并且在XY平面中移动物镜至油加载位置。然后在步骤720中将补充量的油加载到物镜上，基本上如上文关于步骤706所述的那样，不同之处在于补充油量可能少于初始油量。如上所述，可以计算在物镜上需要补充的油滴的油量，例如基于称重机构，或者可以基于物镜经过的距离或者基于任何其他相关参数来粗略估计。然后该流程返回到步骤708，用于将物镜移回到扫描位置以继续扫描样品。

现在参考图21A、图21B和图21C，它们是概述根据本发明实施例的用于将将油载油浸透镜自动聚焦在生物样品上的方法的流程图。图21A至图21C的方法假设初始扫描高度是已知的，该初始扫描高度通常为距离板的下表面的近似Z轴位置几微米。初始扫描高度通常基于板的下表面的高度，例如在图20的步骤700中确立的初始扫描高度。每次将透镜重新定位在不同的XY位置处时进行该自动聚焦，包括补充油后。

初始扫描高度是已知的设置在油物镜上的油滴与油物镜和板的下表面接合并且在油物镜和板的下表面之间扩散的高度。如上所述，通常将油配制为具有与构成板底部的材料(通常是玻璃)相同的折射率。因此，选择浸油和初始扫描高度，以确保当光在油和多孔板材料之间通过时，不会出现不期望的反射或折射，即确保油与透镜和板底部均接触。因此，当光束从物镜经由油和板材料进入样品时，光只会在板材料和样品材料之间的过渡处折射一次，这发生在井的上表面处。

转向图21A，可以看出，在聚焦过程的初始步骤750中，物镜被带到已知的预定初始高度，使得油与板的下表面接触。这相当于图20的步骤710。在进行到该方法的下一步骤之前等待预定持续时间(例如500至2000毫秒)的延迟，以便允许油-表面相互作用稳定。在步骤752中，测量经由物镜发射的激光信号的反射。

在步骤754中，将物镜沿着Z轴移动到更靠近板的下表面的另一高度，并且在步骤756中测量新位置处的激光信号的反射。记录在新Z轴高度处的反射值。然后，基本上连续地重复该过程。预期测量值增加，直到达到焦距，然后开始减少。

在步骤758中，控制器评估所收集的反射数据并评估在最后几次迭代中所测量的信号反射是否存在减少。如果不是，则流程返回到步骤754以测量新的Z轴位置处的信号。然而，如果测量到的反射减小，则在步骤760中将物镜移动到信号最大的Z轴位置。沿Z轴的该位置被认为是物镜相对于样品的焦距。

在一些实施例中，如果激光信号中的衰减是0.1V的持续衰减，则认为衰减足够显著。

图21的方法用于在每次扫描新样品或板时以及在每次补充浸油之后找出样品的焦距。

在一些实施例中，使用类似的过程来确保物镜被聚焦，例如当移动到板的新区域时或者当物镜已经位于单个位置时，在相同的位置(例如，以避免偏离预定位置的问题)进行长时间成像。然而，当移动到新的区域时，或者当物镜已经长时间位于单个位置而重新计算时，之前的焦距是已知的。因此，在这种情况下，在步骤752中，物镜在已知的焦距±预定搜索范围的范围内的高度之间移动。此处，焦距也被确定为获得最大信号的点。

转向图21B，可以看出，在聚焦过程的初始步骤770中，物镜被带到已知的预定初始高度，使得油与般的下表面接触。这相当于图20的步骤710。在进行到该方法的下一步骤之前等待预定持续时间(例如500至2000毫秒)的延迟，以便允许油-表面相互作用稳定。在步骤772中，当物镜沿Z轴移动预定距离时，重复测量经由物镜发射的激光信号的反射。选择沿着Z轴的预定距离，使得预期所测量的信号反射在物镜的Z轴运动期间将达到峰值，然后减小。

在步骤774中，计算在步骤772进行的所有测量中收集的信号峰值的最佳拟合高斯(或多项式)曲线以确定峰值最大值，并且将物镜移动到高斯(或多项式)最大的Z轴位置处。沿Z轴的该位置被认为是物镜相对于样品的焦距。

在步骤776中，将物镜移动到在步骤774中确定的焦距处，并且启动扫描。作为扫描的一部分，在焦点位置拍摄样品的图像，直到完成该区域的扫描，或者直到经过最大扫描持续时间。

在步骤778中，控制器评估区域的扫描是否完成。如果区域的扫描完成，则在步骤780中将物镜降低并移动到新的XY位置。然后流程返回到步骤770，以对新位置处的物镜重新聚焦。

否则，如果区域的扫描未完成，则在步骤782中，控制器评估最大扫描持续时间是否已经过去。如果最大扫描持续时间尚未过去，则流程返回到步骤776并继续扫描。如果最大扫描持续时间已过，则流程返回到步骤772以重新聚焦物镜，并确保在扫描过程中物镜或样品没有漂移。然而，当移动到新的区域或长时间保持在同一位置时，先前的焦距是已知的。因此，在这种情况下，在步骤772中，物镜在已知的焦距±预定搜索范围的范围内的高度之间移动。此处，焦距也被确定为获得最大信号的点。

在一些实施例中，如果激光信号中的衰减是0.1V的连续衰减，则认为衰减足够显著。

图21B的方法用于在每次扫描新样品或板时以及在每次补充浸油之后找出样品的焦距。

现在参考图22A、图22B和图23，其示出了概述根据本发明实施例的扫描以及图像处理和分析方法的流程图。图22A中的流程图概述了根据本发明的一些实施例的扫描过程。最初，根据用户定义的参数，例如尺寸(例如，忽略大于和/或小于特定尺寸的物体)、形状(忽略非圆形物体或非半圆形物体)、强度等，对目标执行第一扫描操作。然后对如此获得的扫描图像进行处理以识别感兴趣的物体及其特征；该处理可以使用本领域目前已知的或将来可能开发的图像处理算法来实现。然后根据预定义的规则分析图像处理结果，以确定对同一区域执行进一步扫描操作的最佳参数。根据分析结果，定义新的扫描参数，以获取同一目标的新图像。然后使用新的扫描参数执行至少一次第二扫描操作。例如，***因此可以扫描具有96孔(每个孔的直径为6mm)的生物样品板。在扫描过程中，图像处理算法会识别板中存在的每个活细胞；如果两个或更多个细胞附着在一起，或者如果单个细胞大于一定的大小，则***可能会将此视为不寻常事件，应使用更高放大倍率的光学器件对其作进一步观察；如果存在诸如上述的物镜更换器，则能够更换透镜以促进这种观察。然后***确定定义高放大倍率扫描的适当图像质量的参数。在一些实施例中，在第一扫描操作仍在进行时执行图像处理，在这种情况下，根据新定义的参数，分析的结果可以实时影响扫描操作。在一些实施例中，所述至少一次第二扫描操作以比第一扫描操作更高的放大倍率进行；在本方法与配备有如上所述的物镜更换器的装置结合使用的一些实施例中，通过使用物镜更换器更换为更高放大倍率物镜来执行更高放大倍率的第二扫描操作，然后以更高的放大倍率扫描感兴趣的区域。

图22B是根据本发明一些实施例的扫描过程的流程图。在扫描的第一阶段，获取指定位置处的低倍率图像；重复该过程直到获取多个指定位置处的图像。采集后，将每张扫描图像传输到图像处理和分析模块，该模块在收到第一个图像后开始图像处理和分析；该模块可以并入控制光学设备的整体操作的软件中，或者可以位于不同的软件应用程序或计算机处。处理和分析模块使用处理和分析的结果来开始生成位置矩阵，该位置矩阵包含与初始扫描的物体的感兴趣区域及其特征有关的信息。因此，可以在完成低放大倍率扫描之后不久完成位置矩阵。或者，可以在所有处理和分析完成之后生成位置矩阵。根据该位置矩阵，执行第二阶段的扫描，在此期间获取指定感兴趣位置处的高倍率图像。

图23是根据本发明一些实施例的图像处理和分析过程的流程图。在图像处理的第一阶段，执行以下步骤：获取低倍率图像；对获得的数据应用低通滤波器；对获得的数据应用高通滤波器；以及执行分水岭变换。基于这些图像处理步骤，检测并提取物体和物体属性/特征。接下来，使用用户参数/属性/特征选择相关物体，并提取物体中心(L[Cx,Cy])。然后获取所选物体的高倍率图像，从中创建物体之间的3D变换矩阵(M)，然后使用该3D变换矩阵。

图24是根据本发明另一个实施例的油加载子组件1200的透视图。油加载子组件1200基本上类似于图13至图14D的油加载子组件200，相似的附图标记代表相似的元件。为了简洁起见，以下描述集中于油加载子组件1200和油加载子组件200之间的区别。

如图所示，油加载子组件1200包括主体部分1210，主体部分1210包括中心油盆1212和泵座孔，中心油盆1212可与油观察开口流体连通，泵座孔终止于泵入口管道，如上文关于图14D所描述的。类似于图14D所示，油流管道邻近泵入口管道从油盆1212的底座延伸，并终止于主体部分1210的边缘，其中油流管道被阻挡件密封。如上文关于图14B所描述的观察窗口可设置在油观察开口内且使油观察开口密封，但如上文所解释，这样的窗口不是必需的。

筒穿刺元件1230位于中心油盆1212内，并且可以通过任何合适的附接机构附(例如紧固件、焊接、粘合等)接到其上。筒穿刺元件1230包括底座1234和中心穿刺销1236，中心穿刺销1236具有纵向延伸穿过其中的中空通道1238，该通道终止于尖锐尖端并与形成在筒穿刺元件1230的侧面中的孔1239流体连通。一对***穿刺销1240从底座1234的边缘延伸，并且可以基本上彼此平行。每个穿刺销1240基本上是平面的，并且在其大部分纵向长度上具有第一厚度。每个穿刺销1240的远离底座1234的一端具有小于第一厚度的第二厚度，使得肩部1242形成在穿刺销的端部附近。每个穿刺销1240终止于尖锐尖端1244。

当浸油筒1300安装在中心油盆1212中时，如下文关于图26A和图26B所示，中心穿刺销1236的中空通道1238以类似于图14D和图16A所示的方式与中心油盆1212以及油流管道流体连通。

隔膜泵1250设置在泵座孔内，使得泵1250的入口位于泵入口管道内，并且泵的出口管道1254(参见图26A和图26B)向下延伸出主体部分1210，基本上类似于图13至图14D所示。如上文参考隔膜泵250所述，隔膜泵1250适合于将油从油流管道通过泵出口管道吸到布置在泵出口管道下方的物品上，在使用时，该物品是浸油物镜。

油加载子组件1200还包括底座安装件1260，底座安装件1260安装到主体部分1210的底侧上并且适于将油加载子组件1200附接至显微镜***的其他部件，位于透镜更换子组件400上方。后安装件1265安装到主体部分1210，位于中心油盆1212的后方。底座安装件1260和后安装件1265两者都可以通过任何合适的连接方式(例如紧固件、粘附、焊接等)连接到主体部分1210。

现在另外参考图25，其是根据本发明另一实施例的浸油筒1300的剖视图。

如图25所示，浸油筒1300包括大致圆柱形的壳体1301。壳体1301包括底座1302，第一圆柱形壁部分1304从底座1302延伸，第一圆柱形壁部分1304具有第一宽度，并且限定具有第一内径d1的第一腔室1305。第二圆柱形壁部分1306从第一圆柱形壁部分1304延伸。第二壁部分1306具有小于第一宽度的第二宽度。第二壁部分1306的外表面与第一壁部分1304的外表面齐平，并且内肩部1308形成在壁部分1304和1306的内表面之间。第三圆柱形壁部分1310从第二圆柱形壁部分1306延伸。第三壁部分1310具有小于第二宽度的第三宽度，并且形成筒1300的颈部部分。第三壁部分1310的内表面与第二壁部分1306的内表面齐平，并且外肩部1312形成在壁部分1310和1306的外表面之间。第三圆柱形壁部分1310终止于远离底座1302的唇缘1314。第二壁部分1306和第三壁部分1310一起限定第二腔室1315，第二腔室1315具有第二内径d2。第二腔室1315与第一腔室1305流体连通。

在一些实施例中，第三壁部分1310的远离外肩部1312的外表面可包括卡扣配合的突起和/或凹槽，其适于与中心油盆1212的内周中的对应凹槽和/或突起卡扣配合。

基本上圆柱形的油容器1320布置在壳体1301内，并且限定中空部1321。油容器1320的第一端1322布置在第一腔室1305内并且接合底座1302的内表面。油容器1320的第二端1324基本上与唇缘1314齐平，使得油容器1320的大部分设置在第二腔室1315内。油容器1320包括多个孔1326，这些孔1326到第一端1322的距离比到第二端1324的距离小，同时与第二腔室1315流体连通。在第二腔室1315内，在壳体1301和油容器1320之间形成圆柱形间隙1330。

大致圆柱形的推动元件1340围绕油容器1320设置在间隙1330内，并且相对于油容器可纵向移动。推动元件1340的第一端1342适于设置为更靠近油容器1320的第一端1322，并且推动元件的第二端1344适于设置为更靠近油容器的第二端1324。圆柱形推动元件1340包括多个孔1346，这些孔1346适于与油容器1320的孔1326径向对准。孔1346和孔1326的纵向对准取决于推动元件1340相对于油容器1320的位置，如下文将进一步详细解释。

推动元件1340的第一端1342适于推动设置在间隙1330内的环形O形环1350。如关于图26A和图26B进一步所解释的，当O形环1350设置在孔1326下方时，其密封间隙1330，使得中空部1321和间隙1330之间不存在流体路径。相比之下，如图25所示，当O形环1350被推动以抵靠肩部1308并且孔1326和1346彼此对准时，通过孔1326和1346在间隙1330和中空部1321之间形成流体路径。

在筒1300的存储操作取向中，密封箔1360(参见图26A)或任何其他密封件抵靠壳体1301的唇缘1314和油容器1320的第二端1324以将油密封在筒内。在存储取向中，O形环1350设置在孔1326下方，并且密封间隙1330，使得中空部1321和间隙1330之间不存在流体路径。

现在另外参考图26A和图26B，其是将图25的浸油筒1300***图24的油加载子组件1200中的步骤的剖视图。

如图26A所示，筒1300处于存储取向，壳体1301的唇缘1314、油容器1320的第二端1324和推动元件1340的第二端1344全部彼此齐平，并且被布置抵靠密封箔1360。在存储取向中，O形环1350设置在孔1326下方，抵靠推动元件1340的第一端1342。O形环密封间隙1330，使得中空部1321与间隙1330之间不存在流体路径。油1365设置在中空部1321内，使得油的高度不会延伸到孔1326上方。

为了将筒1300加载到油加载子组件1200中，筒1300沿箭头1370的方向朝中心油盆1212移动，直到中心销1236刺穿密封箔1360并进入中空部1321。在该初始安装步骤中，O形环1350保持在孔1326下方，并且中空部1321和间隙1330之间的流体路径保持阻塞。

当筒1300继续沿箭头1370的方向移动时，***穿刺销1240的尖端1244在间隙1330附近刺穿箔片1360的***。***穿刺销1240的肩部1242接合推动元件1340的第二端1344，并且当筒继续下降时，由肩部1242施加到第二端1344的压力将使推动元件1340朝着壳体1301的底座1302移动，这又将O形环1350推向肩部1308。

如图26B所示，在筒1300的安装操作取向中，***穿刺销1240的肩部1242和推动元件1340推动O形环1350使其抵靠肩部1308。在这种装置中，推动元件1340的孔1346与油容器1320的孔1326对准，使得在中心油盆1212、间隙1330、油容器1320的中空部1321和中心穿刺元件1236的通道1238之间存在流体路径。在该装置中，油会流出容器1320进入中心油盆1212中，并且***的操作基本上如上所述继续。

应当理解，诸如本文描述的油分配装置或其他液体分配装置也可以与共焦显微镜结合使用。另外，照明源不一定是传统的激光器，而可以是发光二极管(LED)或者LED的组合或阵列。因此，配备有诸如本文所述的油分配装置或其他液体分配装置的显微镜或扫描仪可以用于高内涵成像(HCI，有时也称为高内涵筛选)以获得图像，然后能够根据已知技术对这些图像进行处理，例如根据光激活定位显微镜(PALM)(参见例如Betzig,E.等人的“Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution”，Science313,1642-1645(2006))或随机光学重建显微镜(STORM)(参见Rust,M.L,Bates,M.和Zhuang,X.的“Subdiffraction-limit imaging by stochastic optical reconstructionmicroscopy”(STORM)，Nature Methods 3,793-795(2006))。在一个实施例中，能够根据超分辨率径向波动(SRRF)对使用配备有诸如本文所述的油分配装置的采集设备所获得的图像进行处理，正如Gustafsson等人的“Fast live-cell conventional fluorophorenanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations”，NatureCommunications 7:12471(2016年8月12日发表))中所述。此类处理可以使用ImageJ软件插件来进行，该插件可在https://henriqueslab.github.io/resources/NanoJ-SRRF/上免费获取。本文所述的装置和方法有利于将油(或其他液体)自动分配到物镜，这意味着该装置能够与完全自动化的图像采集相结合：自动扫描、自动聚焦、自动物镜更换、自动分配透镜浸没介质，以及自动检测感兴趣的目标。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的方法类似或等同的方法能够用于本发明的实践或测试，但是本文描述了合适的方法。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在限制。

本领域技术人员将理解，本发明并不局限于上文已经具体示出和描述的内容。相反，本发明的范围由执行与实施例中举例说明的相同功能的部件的一般组合来限定，并且包括上文描述的各种特征的组合和子组合及其变化和修改，本领域技术人员在阅读前文描述后会想到这些组合和子组合及其变化和修改。

Claims (22)

1.一种用于对设置在样品架上的样品进行观察或成像的显微镜设备，其包括：

具有三维取向的第一液浸物镜；

第一液体施加位置和与所述第一位置不同的第二位置，所述样品架不能放置在所述第一液体施加位置处，所述样品架能够放置在所述第二位置处；

与所述第一液浸物镜分离并布置在所述第一液体施加位置处的装置，所述装置被配置为当所述第一液浸物镜布置在所述装置下方的第一液体施加位置处时，向所述第一液浸物镜施加液体；以及

配置为在XYZ坐标空间中在不改变所述第一液浸物镜的三维取向的情况下将所述第一液浸物镜从所述第一液体施加位置移动到第二扫描位置的机构，所述第二扫描位置具有与所述第一液体施加位置不同的X坐标和Y坐标，并且当所述样品架放置在所述第二位置中时，在所述第二扫描位置中，所述第一物镜上的液体与所述样品架接触。

2.根据权利要求1所述的显微镜设备，还包括控制器，当所述第一液浸物镜加载有液体并放置在所述第二扫描位置处然后沿Z轴朝向所述样品架移动时，所述控制器能够确定聚焦Z轴位置。

3.根据权利要求1或2所述的显微镜设备，其中，所述设备包括不同于所述第一液浸物镜的第二液浸物镜，并且所述机构还被配置为将所述第一液浸物镜放置在第一存储位置，从第二存储位置取出所述第二液浸物镜，并且将所述第二液浸物镜移动到所述第一液体施加位置和所述第二扫描位置中的至少一个。

4.一种方法，其包括：

提供根据权利要求1至3中任一项所述的显微镜设备，在所述显微镜设备中，在所述第二扫描位置处放置有含有样品的样品架；

利用所述装置向位于所述第一液体施加位置的第一液浸物镜施加液体；以及

将其上布置有所述液体的第一液浸物镜移动至所述第二扫描位置。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，其上布置有所述液体的所述第一液浸物镜和所述第二扫描位置处的所述样品架的表面之间的距离是距所述样品架的所述表面的预定距离。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在将其上布置有所述液体的第一液浸物镜移动到所述第二扫描位置之前，使用空气物镜来确定所述表面的Z坐标，在用所述装置施加所述液体之前，将所述空气物镜换成所述第一液浸物镜。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，在将其上布置有所述液体的第一液浸物镜移动到所述第二扫描位置之前，使用与用于扫描样品的所述第一液浸物镜相比具有更低放大倍率的第二液浸物镜来确定所述表面的Z坐标，在用所述装置将液体施加到所述第一液浸物镜之前，将所述第二液浸物镜换成所述第一液浸物镜。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述样品架是特定型号的商业样品板，并且在将所述第一液浸物镜移动到所述第二扫描位置之前，基于所述特定型号板的底部距该板的底部边缘的距离并结合所述显微镜设备的尺寸确定所述表面的Z坐标。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，还包括：在将其上布置有所述液体的第一液浸物镜移动到所述第二扫描位置之后，确定所述第一液浸物镜的聚焦位置。

10.根据权利要求9所述的方法，还包括：在确定所述第一液浸物镜的所述聚焦位置之后，使所述第一液浸物镜返回到所述第一液体施加位置并向其施加液体。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括：在所述确定所述第一液浸物镜的所述聚焦位置之后扫描所述样品，并且其中，所述返回是响应于所述扫描达到阈值而进行的，所述阈值包括以下中的一项或更多项：(a)所述第一液浸物镜的液体损失，其是扫描时所述第一液浸物镜在XY平面中行进的距离的函数；(b)由于所述第一液浸物镜沿着Z轴远离所述样品架移动而导致的所述第一液浸物镜的液体损失；(c)所测量的载有液体的第一液浸物镜的重量的减少；和(d)所测量的第一液浸物镜上的液体的厚度。

12.根据权利要求10或11所述的方法，还包括：在将所述第一液浸物镜返回到所述第一液体施加位置并向所述第一液浸物镜施加液体之后，将所述第一液浸物镜移动到(a)所述第二扫描位置或者(b)第三位置，所述第三位置具有与所述第一液体施加位置不同的X坐标和Y坐标，并且至少一个X坐标或Y坐标与所述第二扫描位置不同，在所述第三位置中，第一液浸物镜上的液体能够与放置在所述第二位置中的样品架接触。

13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，还包括通过所述第一液浸物镜获取所述样品的多个图像。

14.根据权利要求13所述的方法，还包括处理所述多个图像。

15.根据权利要求4至14中任一项所述的方法，其中所述液体是油。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述油是烃基油。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述液体是硅油。

18.根据权利要求4至14中任一项所述的方法，其中所述液体是水。

19.根据权利要求1至3中任一项所述的显微镜设备，其中所述液体是油。

20.根据权利要求19所述的显微镜设备，其中所述油是烃基油。

21.根据权利要求19所述的显微镜设备，其中所述液体是硅油。

22.根据权利要求1至3中任一项所述的显微镜设备，其中所述液体是水。