CN117568235B - 一种产亚硝酸盐氧化还原酶的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种产亚硝酸盐氧化还原酶的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产亚硝酸盐氧化还原酶的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程领域，该枯草芽孢杆菌的保藏编号GDMCC No：64078；本发明还公开了一种产亚硝酸盐氧化还原酶的方法，包括将枯草芽孢杆菌YXSY‑01进行发酵，收集发酵液的步骤。本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株YXSY‑01具有高产亚硝酸盐氧化还原酶和显著降解水体亚硝酸盐的能力；该菌株为亚硝酸盐氧化还原酶的深入研究及利用奠定重要基础，并且能显著降低养殖水体中亚硝酸盐的含量，为开发安全、生态的水体净化菌剂提供新思路。

Description

一种产亚硝酸盐氧化还原酶的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种产亚硝酸盐氧化还原酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
小棚虾养殖中后期由于高蛋白饲料的过度使用，导致氮元素循环受阻，水体中积累了大量的无机氮源，水体中亚硝酸盐的含量过高，严重影响了水生动物的健康，给养殖造成很大的损失。亚硝酸盐对水生动物的影响主要包含以下几个方面：
亚硝酸盐的毒性机制，会影响对虾的氧气输送过程。亚硝酸盐进入血液，抑制氧气与血氰胺铁分子的结合，导致氧气难以输送到组织。亚硝酸盐在养殖环境中的升高，导致组织中缺氧，并破坏对虾的呼吸代谢，池塘水中亚硝酸盐的毒性会降低水质，降低生长速度，增加氧气消耗和氨的浓度，甚至导致虾死亡。亚硝酸盐浓度超标严重降低了水产养殖的成功率。目前去除水中的亚硝酸常用的方法有物理法、化学法和生物法。
物理方法主要使用物理吸附和换水方法，物理吸附法方法仅是把水体中的亚硝酸盐吸附在固体表面，并没有从根本上减少。换水方法是通过补换新的水源置换部分亚硝酸盐高的水体，换水方法见效慢，换水量大容易造成对虾应激问题。化学方法去除亚硝酸盐主要有化学阻隔剂、强氧化剂等。化学阻隔剂主要是阻断氨氮向亚硝酸盐的转化过程，化学阻隔剂只能短暂的压制亚硝酸盐的增长，但是会造成氨氮的升高及后续亚硝酸盐的爆发式增长。强氧化剂主要是将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，强氧化剂会引起对虾的应激反应，在小棚虾养殖中后期，水体有机质含量很高，强氧化剂很难起到降低亚硝酸盐的效果。生物法主要是利用硝化细菌和反硝化细菌将亚硝酸盐逐步转化成氮气，硝化细菌和反硝化细菌反应条件温和、又能减少水体中总氮含量，理论上是最为安全有效的方法。目前生物法使用的硝化细菌和反硝化细菌存在生长速度慢、处理效率低、实际使用过程中不易保存的特点，致使硝化细菌和反硝化细菌在实际小棚虾养殖过程中无法发挥降解亚硝酸盐的作用。因而，亟需筛选更加安全有效的微生物菌种来快速降解小棚虾养殖水体亚硝酸盐。
另外，亚硝酸盐氧化还原酶(nitrite oxidoreductase, NXR)是硝化细菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的关键酶。由于它是可溶性的膜内酶，其催化机理与膜内电子传递密切联系，给它的研究带来了一定的困难。作为降解有毒物质亚硝酸盐的关键酶，NXR不仅已应用于水体污染综合治理，以及养殖水体防止鱼虾中毒，更可应用于人类的食品饮品中去除亚硝酸盐。但是，目前生产亚硝酸盐氧化还原酶的报道相对较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种产亚硝酸盐氧化还原酶的枯草芽孢杆菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该枯草芽孢杆菌具有高产亚硝酸盐氧化还原酶和显著降解水体亚硝酸盐的能力，为亚硝酸盐氧化还原酶的深入研究及利用奠定重要基础，并且为开发安全、生态的水体净化菌剂提供新思路。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种产亚硝酸盐氧化还原酶的枯草芽孢杆菌YXSY-01，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：64078，保藏时间为2023年11月27日。
本发明还提供一种产亚硝酸盐氧化还原酶的菌剂，包含上述枯草芽孢杆菌YXSY-01。
本发明还提供一种产亚硝酸盐氧化还原酶的方法，包括将上述枯草芽孢杆菌YXSY-01进行发酵，收集发酵液的步骤。
进一步地，所述发酵的培养基组成为：玉米淀粉5-30g/L、亚硝酸钠0.5-3g/L、磷酸氢二钾0.5-3g/L、硫酸镁0 .3-0 .8g/L和硫酸亚铁0.0001-0.01 g/L，水补足至1L。
进一步地，所述发酵的条件为：温度25-35℃，150转/分钟摇床培养16-24h。
本发明还提供一种上述的枯草芽孢杆菌YXSY-01或上述的菌剂在降低养殖水体亚硝酸盐含量中的应用。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌YXSY-01以发酵液的形式接种至养殖水体中。
进一步地，所述发酵液的活菌数为1.0×107～1.0×109 cfu/mL。
进一步地，所述养殖水体包含小棚虾养殖水体。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株YXSY-01具有高产亚硝酸盐氧化还原酶和显著降解水体亚硝酸盐的能力。该菌株在以亚硝酸钠为唯一氮源的发酵培养基上发酵生产亚硝酸盐氧化还原酶，酶活性高达0.65U/mL，为亚硝酸盐氧化还原酶的深入研究及利用奠定重要基础。该菌株还能在24-48h内将1000ppm的亚硝酸钠降解到0ppm，证明该菌株具有优异的亚硝酸盐降解能力，其能显著降低养殖水体中亚硝酸盐的含量，减少亚硝酸盐对虾的伤害，为开发安全、生态的净化菌剂提供新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为菌株YXSY-01在发酵培养过程中亚硝酸钠降解变化图；
图2为菌株YXSY-01的显微镜图；
图3为菌株YXSY-01的菌落形态图；
图4为亚硝酸盐标准曲线图；
图5为硝酸盐标准曲线图；
图6为枯草芽孢杆菌YXSY-01高产亚硝酸盐氧化还原酶含量的结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1 菌株的分离、鉴定和保藏
1 菌株的分离
采用10倍系列梯度稀释分离法在筛选培养基YX-1平板上对2023年5月采集自广东省台山市小棚虾养殖池塘的底泥进行微生物筛选。
所用筛选培养基YX-1：玉米淀粉20g/L，亚硝酸钠1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01 g/L；琼脂粉20g/L，调节pH至7.3，加热使其溶解，121℃灭菌20min。
在筛选培养基YX-1平板上，将筛选的菌株转接在YX-1液体培养基中，30℃，150r/min，培养48小时。
YX-1液体培养基：玉米淀粉20g/L，亚硝酸钠1g/L（即1000ppm），磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，水补足至1L，调节pH至7.3，加热使其溶解，121℃灭菌30min。
检测培养完成后，通过发酵液中的活菌数（检测培养基为筛选培养基YX-1）和硝酸盐（检测方法为GB/T 35496-2017）的含量，最终筛选得到以亚硝酸钠为唯一氮源的条件下，活菌数高且转化亚硝酸钠为硝酸盐能力强的菌株YXSY-01。图1为菌株YXSY-01在发酵培养过程中亚硝酸钠降解变化图，结果显示该菌株能在短时间内将1000ppm的亚硝酸钠降解到0ppm，证明该菌株具有优异的亚硝酸盐降解能力。
2 菌株YXSY-01的鉴定
2.1 形态学鉴定和生理生化特性检测
将分离到的菌株接种到筛选培养基YX-1平板上，30℃恒温培养72h，观察菌落生长情况，挑取菌体制备涂片，进行革兰氏染色，显微观察菌体形态和芽孢形成情况，进行形态学鉴定。
图2为菌株YXSY-01的显微镜图，图3为菌株YXSY-01的菌落形态图。结果显示：菌落圆形，边缘不整齐，不透明；单个细胞0.5～0.7×2.0～2.6微米，革兰氏阳性，芽孢形成后菌体不膨大，芽孢0.6～0.8×1.0～1.5微米，位于菌体中央或稍偏，柱状。
2.2 分子生物学鉴定
将菌株YXSY-01接种于YX-1液体培养基中，接种量为5%（V/V），温度33℃，摇床转速150转/分钟，培养24h，采用DNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组。以细菌基因组为模板，进行16SrRNA基因和特异性基因GryA的PCR扩增，将扩增产物交由广东省微生物菌种保藏中心进行测序分析。
获得的菌株YXSY-01的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示：
CGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACAC（SEQ ID NO：1）。
获得的菌株YXSY-01的GryA基因序列如SEQ ID NO：2所示：
CTCTTCCGGATGTTCGTGACGGTTTAAAACCGGTTCATAGACGGATTTTGTATGCAATGAATGATTTAGGCATGACAAGTGACAAGCCTTATAAAAAATCCGCGCGTATCGTTGGAGAAGTTATCGGGAAATACCACCCGCACGGTGATTCAGCGGTATATGAATCCATGGTCAGAATGGCTCAGGATTTCAACTACCGTTATATGCTCGTTGACGGTCACGGAAACTTCGGTTCTGTTGACGGAGACTCAGCGGCGGCCATGCGTTATACAGAAGCACGAATGTCTAAAATCTCAATGGAGATTCTTCGCGACATCACAAAAGACACAATCGATTACCAGGATAACTATGACGGGTCAGAAAGAGAACCTGTCGTTATGCCTTCAAGGTTCCCGAATCTGCTCGTGAACGGTGCTGCCGGCATTGCGGTAGGTATGGCAACAAACATTCCTCCGCACCAGCTGGGAGAAATCATTGACGGTGTACTTGCTGTTAGTGAGAATCCGGACATTACAATTCCAGAGCTTATGGAAGTCATTCCAGGGCCTGATTTCCCGACCGCGGGTCAAATCTTGGGACGCAGCGGTATCCGGAAAGCATACGAATCAGGCCGAGGCTCTATCACGATCCGGGCAAAAGCTGAGATCGAACAAACATCTTCGGGTAAAGAAAGAATTATCGTTACAGAGTTACCTTACCAAGTAAATAAGGCGAAATTAATTGAGAAAAATTGCTGATCTCGTAAGGGACAAAAAGATAGAGGGTATCACAGATCTGCGTGATGAGTCAGATCGTACAGGTATGAGAATTGT（SEQ ID NO：2）。
将16SrRNA基因序列在NCBI上比对发现：样品与Bacillus subtilis、Bacillus tequilensis、Bacillus spizizenii、Bacillusmojavensis的同源性均达到100%；在EZBioCloud上比对发现：样品与Bacillus tequilensis、Bacillus cabrialesii、Bacillus inaquosorum的同源性均达到99.93%，与Bacillus subtilis、Bacillus rugosus的同源性均达到99.85%，与Bacillus halotolerans、Bacillus stercoris、Bacillus spizizenii的同源性均达到99.78%。通过特异性基因GryA鉴定发现，样品与模式菌株Bacillus subtilis的同源性达到99.88%，与其他芽孢杆菌的同源性均低于95%。结合菌株的形态学特征、生理生化特性和基因序列比对结果，最终将菌株YXSY-01鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
3 菌株YXSY-01的保藏
将筛选到的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YXSY-01保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：64078，保藏时间为2023年11月27日。
实施例2 枯草芽孢杆菌YXSY-01高产亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）
具体包括以下步骤：
1) 粗酶液的制备：
将枯草芽孢杆菌YXSY-01接种至液体发酵培养基（玉米淀粉30g/L、亚硝酸钠1g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L和硫酸亚铁0.01 g/L，水补足至1000mL），接种量为5%（V/V），温度33℃，摇床转速150转/分钟，培养24h，获得发酵液，发酵液用细胞超声破碎仪，超声破碎30秒，即为待测粗酶液。
吸取粗酶液于95℃水浴30min，获得灭活粗酶液，作为后续酶活性测定的对照组。设定3个生物学重复。
2) 亚硝酸盐氧化还原酶活性测定：
亚硝酸盐氧化还原酶(nitrite oxidoreductase,NXR)是硝化细菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的关键酶，本方案通过测试粗酶液将底物中亚硝酸钠氧化成硝酸钠的过程，来测算亚硝酸盐氧化还原酶的酶活。
根据GB/T 2367-2016和GB/T 35496-2017分别绘制亚硝酸盐和硝酸盐的标准曲线，图4为亚硝酸盐标准曲线图，图5为硝酸盐标准曲线图。
吸取5mL 500ppm亚硝酸钠溶液和200μL的粗酶液混匀，33℃恒温水浴30min，95℃水浴5min灭活，冷却检测硝酸盐的含量。活力单位(U/mL)定义为：每分钟产生1μmol产物（硝酸钠/硝酸根离子）所需要的酶量。硝酸钠/硝酸根离子检测方法为GB/T 35496-2017。图6的检测结果显示：粗酶液中亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）的活性为0.65U/mL。本实施例证实枯草芽孢杆菌YXSY-01发酵生产亚硝酸盐氧化还原酶，为亚硝酸盐氧化还原酶的深入研究及利用奠定重要基础。
实施例3 枯草芽孢杆菌YXSY-01降解小棚虾养殖水体亚硝酸盐的实验室测试结果
取小棚虾养殖水体（养殖中后期），将水体分装至300毫升三角瓶中，每瓶100毫升，将实施例2获得的枯草芽孢杆菌菌株YXSY-01发酵液（活菌数为5.0×108cfu/mL）按照0.01%（V/V）的添加量，添加到三角瓶中，摇床100转/分钟，培养温度30℃，培养48小时。以市售枯草芽孢杆菌（活菌数1000亿，江苏绿科生物技术有限公司）降解小棚虾养殖水体亚硝酸盐作为对比，以未接种枯草芽孢杆菌作为对照。培养完成后检测水体亚硝酸盐含量（GB/T 2367-2016）。结果如表1所示。
表1 枯草芽孢杆菌YXSY-01降解小棚虾水体亚硝酸盐结果
表1实验结果显示，实验室条件下，枯草芽孢杆菌YXSY-01具有优异的亚硝酸盐降解能力，其显著高效降低养殖水体中亚硝酸盐的含量，为净化养殖水体提供更加安全有效的微生物菌株。
实施例4 枯草芽孢杆菌菌株YXSY-01在小棚虾水产养殖中降解亚硝酸盐的应用
试验塘和对照塘基本相同，水体面积320立方，平均水深0.8米，主养南美白对虾，共放苗6万尾，养殖天数60天，（试验塘2口，对照塘1口，共3口塘）。处理方式如下：
试验塘：每2天使用实施例2获得的枯草芽孢杆菌菌株YXSY-01发酵液（活菌数为5.0×108cfu/mL）3升，共使用5次，每天上午8点和下午5点检测亚硝酸盐的含量（GB/T2367-2016）。
对照塘：除去使用枯草芽孢杆菌菌株YXSY-01发酵液，其他与试验塘相同。
结果如表2所示。
表2 枯草芽孢杆菌菌株YXSY-01发酵液降解小棚虾养殖水体亚硝酸盐的结果
从表2可以看出，试验塘使用枯草芽孢杆菌菌株YXSY-01发酵液可以显著性降低小棚虾养殖水体的亚硝酸盐含量。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种产亚硝酸盐氧化还原酶的方法，其特征在于，包括将枯草芽孢杆菌YXSY-01进行发酵，收集发酵液的步骤；
所述枯草芽孢杆菌YXSY-01保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：64078，保藏时间为2023年11月27日；
所述枯草芽孢杆菌YXSY-01采集自广东省台山市小棚虾养殖池塘。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基组成为：玉米淀粉5-30g/L、亚硝酸钠0.5-3g/L、磷酸氢二钾0.5-3g/L、硫酸镁0.3-0.8g/L和硫酸亚铁0.0001-0.01 g/L，水补足至1L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：温度25-35℃，150转/分钟摇床培养16-24h。
4.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YXSY-01在降低养殖水体亚硝酸盐含量中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YXSY-01以发酵液的形式接种至养殖水体中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵液的活菌数为1.0×107～1.0×109 cfu/mL。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述养殖水体包含小棚虾养殖水体。
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