CN117551668B - 一种水稻纹枯病菌效应蛋白基因RsIA_SSP6及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻纹枯病菌效应蛋白基因RsIA_SSP6及其应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对水稻纹枯病菌效应蛋白基因RsIA_SSP6的克隆及其功能分析，有助于揭示水稻纹枯病与水稻品种间特异性互作及其进化的分子机理。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻纹枯病菌效应蛋白基因RsIA_SSP6及其应用。
背景技术
水稻纹枯病(rice sheath blight)是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的一种世界范围内的水稻真菌性病害，被称为水稻的三大病害之一。该病害分布范围较广，就全球水稻种植区而言，主要在亚洲、美洲和非洲水稻种植的国家频繁发生。这种真菌可以引起玉米、水稻和高粱的带状叶枯病、棉花猝倒病、绿豆和大豆的空中枯萎病和茎腐病、鞘腐病、甘蓝心腐病、马铃薯黑斑病和以及叶面枯萎病。
植物与病原菌互作中，往往会分泌大量的效应蛋白到寄主细胞内，调控寄主的免疫反应及代谢途径。立枯丝核菌能够侵染多种作物与其分泌的效应蛋白分子有关，这种分子可以调节宿主的先天免疫并增强病原菌的侵染。水稻纹枯病菌基因组预测的编码分泌蛋白的基因为965个，其中氨基酸数目在100-300之间、无跨膜结构域的小分泌蛋白基因为91个。
目前对水稻纹枯病菌效应分子的生物化学活性以及它们是如何调节植物的免疫反应仍然知之甚少，尤其是未见有水稻纹枯病菌效应蛋白RsIA_SSP6方面的报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种水稻纹枯病菌效应蛋白基因RsIA_SSP6及其应用，本发明通过对立枯丝核菌效应蛋白基因的克隆及其功能分析，有助于揭示水稻纹枯病与水稻品种间特异性互作及其进化的分子机理。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种水稻纹枯病效应蛋白基因RsIA_SSP6，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或所述SEQ ID NO.1序列经一个或多个核苷酸的替换、***或缺失后，其功能相同的核苷酸序列。
本发明提供的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个氨基酸的替换、***或缺失后，其功能还与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列功能相同，该序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。
本发明包括将该基因的编码区和一个诱导型启动子连接，该启动子可以在IPTG诱导下，在大肠杆菌细胞中表达这个基因。本发明还包括将该基因的编码区和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下及在侵入组织的不同时期表达。这种组成型的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称为诱导型启动子。这样，环境的改变，侵入植株的不同时期都可以改变基因的表达。其中环境条件包括植株的生长状况、温度、湿度等，侵入植株的不同时期包括孢子萌发、侵入分化和侵染菌丝扩展等。
此外，根据本发明提供的RsIA_SSP6基因序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易的获得与RsIA_SSP6等同的基因，或对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行修饰，得到具有较高同源性，且也能编码具有同等活性的蛋白的核苷酸序列，具体包括：(1)通过数据库检索获得；(2)以RsIA_SSP6基因片段为探针筛选立枯丝核菌或其它病原菌的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据RsIA_SSP6基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从立枯丝核菌AG-1IA或其它病原菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在RsIA_SSP6基因序列基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
本发明的第二个目的是提供一种水稻纹枯病效应蛋白RsIA_SSP6，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的水稻纹枯病效应蛋白RsIA_SSP6是水稻纹枯病病菌的一个小分泌蛋白(small secreted protein)基因AG1IA_01042编码的蛋白，含有153个氨基酸，分子量为15.8KD，N端16-17个氨基酸为信号肽序列。本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，例如在非活性位点，取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸，得到由该蛋白衍生的蛋白；或者通过截短，获得包含该蛋白的关键功能域的肽段，这些衍生的蛋白也属于本发明的范围。
本发明的第三个目的是提供一种包含上述基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种包含上述基因或上述表达载体的宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供一种应用，即将上述基因用于设计农药分子靶点，或者将上述基因用于筛选培育抗病品种，或者将上述基因用于感病群体的监测等。
上述基因的实际用途可以分为以下几个方面：
(1)可以根据上述基因的结构及功能来设计新型农药的分子靶点；
(2)可以将上述基因的序列连接到任何一种含有荧光蛋白的转化载体上，用任何一种转化方法将上述基因和荧光蛋白基因共价导入水稻或其它植物细胞。利用荧光共聚焦透射电镜可以观察到在水稻或其它植物细胞中与荧光蛋白融合表达的效应蛋白在植物细胞中的迁移及定位。利用此效应为诱饵蛋白钓出水稻或其它植株中与该效应蛋白结合的受体蛋白。利用基因工程方法敲除水稻或其它植物细胞中该受体基因或删除、添加、突变该受体基因的一个或多个碱基以缺失或改变受体基因的功能，得到抗某一效应蛋白的抗性植株。
(3)根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态性)、SSR(简单序列重复多态性)、RFLP(限制性内切酶长度多态性)、CAP(切割扩增片段多肽)。用这些标记可检测田间纹枯病群体的生理小种及其遗传结构的动态变化，以及该基因在田间自然群体中的分布情况；有助于水稻品种的抗病性鉴定和立枯丝核菌小种的鉴定；也有助于抗病品种的合理布局和轮换，以便有效地控制纹枯病的发生。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过对水稻纹枯病菌效应蛋白基因RsIA_SSP6的克隆及其功能分析，有助于揭示水稻纹枯病与水稻品种间特异性互作及其进化的分子机理。
本发明研究发现RsIA_SSP6在烟草中瞬时表达能够引起细胞坏死以及免疫反应途径基因的表达，而其缺失信号肽片段则不能诱导细胞坏死。截短实验发现，该蛋白的功能关键区域位于其1-90氨基酸片段。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在实践上可以根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；可以将水稻等宿主细胞中该效应蛋白的受体蛋白基因敲除或突变，以得到相应抗病品种；有助于建立水稻纹枯病菌自然群体致病性变异的分子检测体系，研究水稻纹枯病效应蛋白基因RsIA_SSP6在田间自然群体中的分布情况，揭示水稻纹枯病菌群体中小种的组成和变异特点；也有助于水稻品种的抗病性鉴定及其合理布局和轮换，以便有效地控制水稻纹枯病的发生。其他含有RsIA_SSP6同源基因植物病原菌也可以利用其效应蛋白功能的特点建立自然群体致病性变异的分子检测体系，揭示相应病菌群体中小种的组成和变异特点或进行抗病性鉴定等。
附图说明
图1为水稻纹枯病菌部分小分泌蛋白基因表达热图。
图2为Signal4.0预测的RsIA_SSP6的信号肽序列。
图3为水稻纹枯病效应分子基因RsIA_SSP6与RsIA_SSP6Δsp(RsIA_SSP6去信号肽序列)的PCR检测结果图；其中，图3中m为分子量标记，由下至上依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1为RsIA_SSP6的PCR产物；泳道2为RsIA_SSP6Δsp。
图4为基因RsIA_SSP6在烟草叶片中瞬时表达，引起过敏性坏死反应的结果。
图5为基因RsIA_SSP6在烟草中瞬时表达诱导的免疫相关基因表达图。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：RsIA_SSP6基因的克隆
RsIA_SSP6基因的克隆过程具体如下：
在超净工作台下，用接菌环接种活化的立枯丝核菌AG1IA的菌体，接入至50mL PDB培养基中，28℃，220r/m培养两天后，用四层纱布过滤收集菌丝，用液氮研磨提取总RNA。然后用oligod T做引物，反转录得到cDNA。
根据预测的序列设计引物，具体序列如下：
以cDNA为模板，分别以引物RsIA_SSP6-F为前引物，以RsIA_SSP6-R、RsIA_SSP6-1-R、RsIA_SSP6-2-R、RsIA_SSP6-3-R、RsIA_SSP6-4-R、RsIA_SSP6-5-R为后引物克隆得到目的基因片段，克隆得到的基因RsIA_SSP6如图1中箭头所示；以RsIA_SSP6Δsp-F/RsIA_SSP6-R为引物克隆得到RsIA_SSP6去信号肽片段(图2RsIA_SSP6信号肽预测结果)。
上述PCR反应体系包括：DNA polymerase 1μL、10×Ex Taq buffer 25μL、cDNAtemplete 3μL、dNTP 1μL、Forward primer(10μM)2μL、Reverse primer(10μM)2μL，最后加ddH2O至50μL；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃后延伸5min。
实施例2：RsIA_SSP6基因及其截短DNA分子表达载体的构建
对实施例1中的PCR产物进行电泳检测，其结果如图3所示，根据图3可知，所得目的基因电泳检测没有杂带，然后对目的基因片段进行回收，把目的基因连接到表达载体35S-pMDC32-2xFLAG上，经过测序，基因RsIA_SSP6的序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，根据检测结果可知，基因RsIA_SSP6的序列与预测序列有个别碱基的差别。同样的将RsIA_SSP6去信号肽的DNA分子RsIA_SSP6Δsp以及截短的DNA分子RsIA_SSP6-1、RsIA_SSP6-2、RsIA_SSP6-3、RsIA_SSP6-4，RsIA_SSP6-5也分别连接到表达载体35S-pMDC32-2xFLAG上，并转化大肠杆菌DH5α中，转化条件与常规大肠杆菌转化条件相同，37℃培养，挑取阳性转化子，送测序检验。
上述基因RsIA_SSP6的核苷酸序列如下：
ATGAAGTTCGTCGCTATCTTGGCAGTCACTGCATCTGTTGTCACCGCCTCTGTAGTTCAGCGTTCCGGCACTCCTATGACGCAAGCTGCAGCACAAGCTAAGCTTCAGTCTGCTGGCATATATGCGTCCTCCTCTGGCGGATGCACGACCAAATCCAACCCCACGTGTACGTCATACGACGGGATTCTGAGTGGCACTGTAGATAATGTGATCACTCTCAAAAATGCCTGCGGTTGTGCTATAACCATAACTGGTGGGACCGAGACTGGTCATGCAAGCGGAACCTACAGCCACGCGAACGGATACAAAGTCGATATTCGTCACGCATCTGGGATTGACGCTTATGTCAAGAACTCATTCACTAAGATTGGGAATCGAGGCGATGGATATCCTCAGTGGAAATCGGCAGCAGGAAACATTTATTGCGACGAAGGTAGCCACTGGGATGTCACTTACTACTGA(SEQ ID NO.1)。
上述效应蛋白RsIA_SSP6的氨基酸序列如下：
MKFVAILAVTASVVTASVVQRSGTPMTQAAAQAKLQSAGIYASSSGGCTTKSNPTCTSYDGILSGTVDNVITLKNACGCAITITGGTETGHASGTYSHANGYKVDIRHASGIDAYVKNSFTKIGNRGDGYPQWKSAAGNIYCDEGSHWDVTYY(SEQ ID NO.2)。
上述RsIA_SSP6Δsp、RsIA_SSP6-1、RsIA_SSP6-2、RsIA_SSP6-3、RsIA_SSP6-4和RsIA_SSP6-5的核苷酸序列及位置如下：
RsIA_SSP6Δsp：
GTAGTTCAGCGTTCCGGCACTCCTATGACGCAAGCTGCAGCACAAGCTAAGCTTCAGTCTGCTGGCATATATGCGTCCTCCTCTGGCGGATGCACGACCAAATCCAACCCCACGTGTACGTCATACGACGGGATTCTGAGTGGCACTGTAGATAATGTGATCACTCTCAAAAATGCCTGCGGTTGTGCTATAACCATAACTGGTGGGACCGAGACTGGTCATGCAAGCGGAACCTACAGCCACGCGAACGGATACAAAGTCGATATTCGTCACGCATCTGGGATTGACGCTTATGTCAAGAACTCATTCACTAAGATTGGGAATCGAGGCGATGGATATCCTCAGTGGAAATCGGCAGCAGGAAACATTTATTGCGACGAAGGTAGCCACTGGGATGTCACTTACTACTGA(SEQ ID NO.3)。
RsIA_SSP6-1(1-375bp)：
ATGAAGTTCGTCGCTATCTTGGCAGTCACTGCATCTGTTGTCACCGCCTCTGTAGTTCAGCGTTCCGGCACTCCTATGACGCAAGCTGCAGCACAAGCTAAGCTTCAGTCTGCTGGCATATATGCGTCCTCCTCTGGCGGATGCACGACCAAATCCAACCCCACGTGTACGTCATACGACGGGATTCTGAGTGGCACTGTAGATAATGTGATCACTCTCAAAAATGCCTGCGGTTGTGCTATAACCATAACTGGTGGGACCGAGACTGGTCATGCAAGCGGAACCTACAGCCACGCGAACGGATACAAAGTCGATATTCGTCACGCATCTGGGATTGACGCTTATGTCAAGAACTCATTCACTAAGATTGGGAAT(SEQ ID NO.4)。
RsIA_SSP6-2(1-300bp)：
ATGAAGTTCGTCGCTATCTTGGCAGTCACTGCATCTGTTGTCACCGCCTCTGTAGTTCAGCGTTCCGGCACTCCTATGACGCAAGCTGCAGCACAAGCTAAGCTTCAGTCTGCTGGCATATATGCGTCCTCCTCTGGCGGATGCACGACCAAATCCAACCCCACGTGTACGTCATACGACGGGATTCTGAGTGGCACTGTAGATAATGTGATCACTCTCAAAAATGCCTGCGGTTGTGCTATAACCATAACTGGTGGGACCGAGACTGGTCATGCAAGCGGAACCTACAGCCACGCGAAC(SEQ ID NO.5)。
RsIA_SSP6-3(1-270bp)：
ATGAAGTTCGTCGCTATCTTGGCAGTCACTGCATCTGTTGTCACCGCCTCTGTAGTTCAGCGTTCCGGCACTCCTATGACGCAAGCTGCAGCACAAGCTAAGCTTCAGTCTGCTGGCATATATGCGTCCTCCTCTGGCGGATGCACGACCAAATCCAACCCCACGTGTACGTCATACGACGGGATTCTGAGTGGCACTGTAGATAATGTGATCACTCTCAAAAATGCCTGCGGTTGTGCTATAACCATAACTGGTGGGACCGAGACTGGT(SEQ ID NO.6)。
RsIA_SSP6-4(1-240bp)：
ATGAAGTTCGTCGCTATCTTGGCAGTCACTGCATCTGTTGTCACCGCCTCTGTAGTTCAGCGTTCCGGCACTCCTATGACGCAAGCTGCAGCACAAGCTAAGCTTCAGTCTGCTGGCATATATGCGTCCTCCTCTGGCGGATGCACGACCAAATCCAACCCCACGTGTACGTCATACGACGGGATTCTGAGTGGCACTGTAGATAATGTGATCACTCTCAAAAATGCCTGCGGTTGTGCT(SEQ ID NO.7)。
RsIA_SSP6-5(1-150bp)：
ATGAAGTTCGTCGCTATCTTGGCAGTCACTGCATCTGTTGTCACCGCCTCTGTAGTTCAGCGTTCCGGCACTCCTATGACGCAAGCTGCAGCACAAGCTAAGCTTCAGTCTGCTGGCATATATGCGTCCTCCTCTGGCGGATGCACGACC(SEQ ID NO.8)。
实施例3：在烟草中瞬时表达
将实施例2构建的含有目的基因的35S-pMDC32-2xFLAG表达载体转入农杆菌GV3101中，于含有利福平(40mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的YEP培养液中，28℃培养16h，离心收集菌体，MES重悬菌液[5mM MES(pH 5.6)，5mM MgSO4，以及100μM乙酰丁香酮，再于室温条件下，黑暗中培养2-3h后，调整菌液浓度OD600＝0.5，用无针头的1ml无菌注射器注射烟草叶片，并观察烟草叶片情况，其结果见图4。
由图4A可知，阴性对照(携带含GFP表达载体的农杆菌菌液)注射后不引起本氏烟叶片的细胞坏死反应，阳性对照(携带含小鼠凋亡蛋白BAX的表达载体的农杆菌菌液)和携带含目的基因RsIA_SSP6的表达载体的农杆菌菌液注射本氏烟叶片出现明显的细胞坏死反应，而携带目的基因RsIA_SSP6Δsp的农杆菌菌液注射本氏烟叶片没有出现明显的细胞坏死反应，说明基因RsIA_SSP6能在烟草叶片中表达，能够引起细胞坏死，而RsIA_SSP6Δsp不能诱导细胞坏死。由图4B-D可知，截短后的RsIA_SSP6只有RsIA_SSP6-1以及RsIA_SSP6-2能诱导烟草细胞坏死，而RsIA_SSP6-3、RsIA_SSP6-4、RsIA_SSP6-5均未能诱导细胞坏死，说明RsIA_SSP6能够诱导细胞坏死的关键区域位于1-100aa之内。
实施例4：effector基因的诱导烟草免疫反应
病原菌与寄主互作过程往往通过分泌大量小蛋白到寄主中改变寄主的免疫反应。具体实施过程为：取注射了含有RsIA_SSP6以及对照GFP(不携带任何表达载体的农杆菌菌液)表达载体的农杆菌12-48小时后的烟草叶片各100mg，3个重复，用液氮研磨至粉状，提取RNA，再用反转录试剂盒合成cDNA，浓度为1ug/ul。通过烟草cDNA为模板进行RT-PCR检测免疫反应相关途径基因的ERF1、LOX、PR2b、PR4a、RBOHB表达。RT-PCR扩增体系为：AceQ qPCRSYBR Green Master Mix 10μL前引物(10μM)0.4μL、后引物(10μM)0.4μL、cDNA模板2μL，最后用加ddH2O到20μL；扩增程序为：预变性95℃5min，95℃10sec，60℃30sec，40个循环，溶解曲线58℃～96℃15sec。
同时，取注射后48小时的烟草叶片进行DAB染色观察。结果如图5A-C所示，与注射对照GFP相比，注射RsIA_SSP6的24-48小时，免疫途径相关基因及ROS途径基因RBOHB也上调表达；如图5D所示，DAB染色结果也证实发生了ROS反应。
实施例5：基因RsIA_SSP6的应用
利用本发明提供的RsIA_SSP6基因的序列信息，根据该基因的结构及功能设计新型农药的分子靶点；将该基因蛋白产物在水稻中的受体蛋白基因或信号通路中的基因沉默或敲除掉，以培育抗病品种；根据该基因序列产生的分子标记在田间纹枯病群体监测中的应用；以及根据监测的结果指导抗病品种合理布局中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1. 水稻纹枯病效应蛋白基因RsIA_SSP6在设计针对水稻纹枯病菌引起的水稻纹枯病的农药分子靶点中的应用；其中，水稻纹枯病效应蛋白基因RsIA_SSP6的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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