CN117534851A - 一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光标定板技术领域，提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板及其制备方法和应用，包括：将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，向混合液中加入丙烯酰胺和纳米纤维素悬浮液，随后加入引发剂和交联剂发生交联反应得到水凝胶溶液；将吲哚菁绿加入水凝胶溶液中得到混合凝胶溶液；低温冷冻后置于室温下解冻得到中间凝胶；随后浸泡于硅酸钠的乙醇水溶液中，取出清洗得到水凝胶；配制多组含吲哚菁绿的水凝胶，并分别注入试样管中，固定于多孔板内，将多孔板重复冻融至少三次。本发明可以极大地提高吲哚菁绿在水凝胶体系中的稳定性，不易发生光漂白和降解，从而保持荧光标定板长期稳定的荧光强度。
Description
技术领域
本发明属于荧光标定板技术领域，涉及一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板及其制备方法和应用。
背景技术
吲哚菁绿溶液存在极易发生光漂白和降解等问题，使得吲哚菁绿的浓度梯度溶液无法稳定保存，无法重复使用，每次对光学手术导航***的荧光检测功能以及灵敏度进行检验时，都需要重新配制吲哚菁绿溶液，不可避免地造成了吲哚菁绿的浪费；此外，由于吲哚菁绿水凝胶的力学性能较差，因此无法长期保存，影响了荧光导航操作过程的工作效率。
CN115819667A公开了一种水凝胶基吲哚菁绿荧光标定板及其制备方法和应用，包括如下步骤：将含有聚合单体、交联剂、引发剂和水的混合溶液进行聚合反应，生成水凝胶溶液；其中，所述聚合单体包括丙烯酰胺和二烯丙基二甲基氯化铵；向所述水凝胶溶液中加入吲哚菁绿，得到含有吲哚菁绿的水凝胶溶液；将所述含有吲哚菁绿的水凝胶溶液固化成型，得到水凝胶基吲哚菁绿荧光标定板。但该技术方案制备得到的荧光标定板的力学性能和稳定性较差，无法满足使用要求。
因此，亟需对现有的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备工艺进行改进，以提高荧光标定板的力学性能和稳定性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板及其制备方法和应用，本发明采用聚乙烯醇/海藻酸钠作为第一半互穿凝胶网络，采用聚丙烯酰胺/海藻酸钠作为第二半互穿凝胶网络，形成了半互穿双网络凝胶结构，可以极大地提高吲哚菁绿在水凝胶体系中的稳定性，不易发生光漂白和降解，从而保持荧光标定板长期稳定的荧光强度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，所述制备方法包括：
（Ⅰ）将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，混合均匀后得到混合液；向混合液中依次加入丙烯酰胺和纳米纤维素悬浮液，混合均匀后得到前体溶液；向前体溶液中加入引发剂和交联剂，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（Ⅱ）将吲哚菁绿加入步骤（Ⅰ）得到的水凝胶溶液中，混合均匀后进行超声除泡，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液低温冷冻至完全凝固，随后置于室温下解冻，得到中间凝胶；将中间凝胶浸泡于硅酸钠的乙醇水溶液中，浸泡后取出清洗，得到水凝胶；
（Ⅲ）配制多组含不同浓度吲哚菁绿的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于低温环境下冷冻，随后置于室温下解冻，重复冷冻和解冻至少三次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
海藻酸钠具有优异的生物相容性和吸水保湿性，且原料来源广、安全无毒、可降解，在生物材料方面具有越来越广泛的应用。但是海藻酸钠水凝胶具有凝胶可控性差，机械强度低的缺点，在单独使用时往往难以满足人们对水凝胶的实际应用要求，这极大地限制了其应用范围。本发明通过互穿网络技术将聚乙烯醇和海藻酸钠进行复合，海藻酸钠分子进入聚乙烯醇网络中并与聚乙烯醇分子产生物理缠结，破坏了聚乙烯醇水凝胶的交联点密度，形成第一半互穿凝胶网络。
丙烯酰胺单体在引发剂和交联剂的作用下通过热引发自由基聚合形成共价交联的聚丙烯酰胺网络结构，海藻酸钠线性大分子穿插其中构成第二半互穿凝胶网络，聚丙烯酰胺的氨基和海藻酸钠的羟基之间形成氢键，加强了聚丙烯酰胺分子和海藻酸钠分子之间的分子间作用力，从而提高了第二半互穿凝胶网络的力学性能。
本发明采用聚乙烯醇/海藻酸钠作为第一半互穿凝胶网络，采用聚丙烯酰胺/海藻酸钠作为第二半互穿凝胶网络，形成了由第一半互穿凝胶网络和第二半互穿凝胶网络组成的半互穿双网络凝胶结构，双网络水凝胶中的聚乙烯醇分子链和聚丙烯酰胺分子链之间的氢键作为“牺牲键”可以有效抵抗外界载荷，水凝胶在反复拉伸或载重后依然能够快速恢复原状。
本发明在海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺的半互穿双网络凝胶体系中加入了纳米纤维素，制备得到质地柔软、能保持一定形状且长效稳定的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。本发明通过纳米纤维素与聚乙烯醇和聚丙烯酰胺进行物理交联，纳米纤维素可以作为高聚物增强相，聚丙烯酰胺分子链上存在大量氨基，聚乙烯醇分子链上存在大量的羟基，可以通过物理或化学交联形成水凝胶。纳米纤维素表面含有大量羟基，在水溶性聚合物中有良好的分散性，能与聚乙烯醇分子链上的羟基以及聚丙烯酰胺分子链上的氨基结合形成牢固的氢键，起到纳米增强作用。
本发明将冻融循环和硅酸钠盐析相结合，制备得到了具有致密皮层和多孔内层的水凝胶。当中间凝胶在硅酸钠的乙醇水溶液中浸泡一段时间后，硅酸钠与海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺凝胶体系之间会发生盐析效应和极化效应，在盐析效应的作用下，导致海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺凝胶体系发生脱水现象，在脱水过程中凝胶体系形成由有序堆积的氢键构成的微晶组织。在极化效应的作用下，具有碱性的硅酸钠可通过原位掺杂以增强海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺凝胶体系中羟基官能团的相互作用，溶液中的乙醇在碱性环境中脱质子，使得羟基官能团得到极化增强效果，表现出偶极-偶极相互作用，从而增强了微晶组织的稳定性。借助硅酸钠与中间凝胶之间发生的盐析效应和极化效应，会迅速引发中间凝胶表面的聚合物链的强聚集和微晶的形成，得到了更致密、更稳定的定向多孔网络结构的皮层，一方面，致密皮层的形成可以作为吲哚菁绿水凝胶的保护屏障，提高吲哚菁绿水凝胶在不同溶剂环境中的稳定性；另一方面，由于皮层具有致密的网络结构，使得水凝胶的力学性能得到大幅提升。当致密皮层形成后，硅酸钠的乙醇水溶液对凝胶的渗透作用会逐渐减弱，硅酸盐难以继续渗透至中间凝胶的内部，因此，得到的水凝胶的内部则为具有多孔的半互穿双网络凝胶结构。
本发明采用的凝固浴的溶剂为乙醇水溶液，乙醇在离子交联过程中可以有效控制水凝胶的溶胀度，且对离子交联过程没有其他不良影响。硅酸钠和乙醇的协同作用使得形成的水凝胶中间层的多孔网络结构更加均匀规整，网络孔径减少，孔密度增加，力学性能得到大幅提升。交联均匀的多孔网络结构为水凝胶优异的吸水保湿性提供了稳固的结构基础，也能赋予水凝胶良好的力学弹性。
本发明在水凝胶中加入吲哚菁绿后通过冻融循环固化成型制备得到了水凝胶基吲哚菁绿荧光标定板，该水凝胶基吲哚菁绿具有固定形状，通过本发明提供的制备方法制备得到的水凝胶基吲哚菁绿荧光标定板不会影响吲哚菁绿的荧光性能，而且可以极大地提高吲哚菁绿在水凝胶体系中的稳定性，不易发生光漂白和降解，从而保持荧光标定板长期稳定的荧光强度，为检测光学手术导航***的荧光功能及灵敏度提供便利。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤（Ⅰ）中，所述聚乙烯醇溶液采用如下方法制备得到：
将所述聚乙烯醇溶解于去离子水中，对所述去离子水加热并混合搅拌直至聚乙烯醇完全溶解，得到所述聚乙烯醇溶液。
在一些可选的实例中，将所述去离子水加热至80~90℃，例如可以是80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述聚乙烯醇在所述去离子水中的混合搅拌的时间为10~30min，例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min、22min、24min、26min、28min或30min，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述聚乙烯醇溶液中的聚乙烯醇的浓度为10~20g/mL，例如可以是10g/mL、11g/mL、12g/mL、13g/mL、14g/mL、15g/mL、16g/mL、17g/mL、18g/mL、19g/mL或20g/mL，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述海藻酸钠与所述聚乙烯醇溶液中的聚乙烯醇的质量比为1:(0.1~0.3)，例如可以是1:0.1、1:0.12、1:0.14、1:0.16、1:0.18、1:0.2、1:0.22、1:0.24、1:0.26、1:0.28或1:0.3，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明将海藻酸钠与聚乙烯醇复合形成第一半互穿凝胶网络，在混合过程中，海藻酸钠线性大分子链贯穿于聚乙烯醇网络中，填补了聚乙烯醇网络的空隙，与聚乙烯醇分子链相互缠绕，共同抵抗外力作用，从而提高了水凝胶的力学性能。但海藻酸钠不能无限度的添加，本发明特别限定了海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1:(0.1~0.3)。
随着海藻酸钠添加量的提高，海藻酸钠线性大分子链间的缠结点的密度增加，分子间范德华力和氢键作用共同导致混合液的黏度增大。当混合液中海藻酸钠的添加量超过本发明限定的范围上限时，会导致混合液的黏度过高，流动性较差，不利于水凝胶的制备，同时，对后续丙烯酰胺和纳米纤维素的分散均匀性也会产生不利影响。
其次，当海藻酸钠的添加量在本发明限定的质量比范围内时，由于海藻酸钠大分子中含有大量羧基，具有较强的亲水性，对水凝胶的溶胀具有促进作用，因此，随海藻酸钠添加量的提高，水凝胶的平衡溶胀比逐渐增大。但随着海藻酸钠添加量的继续提高并超过本发明限定的范围上限时，海藻酸钠大分子链在第一半互穿凝胶网络中的缠结程度增加，使得第一半互穿凝胶网络结构过于致密，容纳水分子的空间变小，不利于水分子的自由移动，从而使得水凝胶的平衡溶胀比降低。
再次，当海藻酸钠的添加量在本发明限定的质量比范围内时，随着海藻酸钠添加量的提高，第一半互穿凝胶网络结构的致密度逐渐增加，在受到外力作用时，应力得以分散，因此水凝胶的拉伸强度和断裂伸长率均得以提高。但当海藻酸钠的添加量继续提高并超过本发明限定的范围上限时，第一半互穿凝胶网络结构已较为完善，继续提高海藻酸钠的添加量会导致第一半互穿凝胶网络的结构过于致密，分子链的活动性降低，受到外力作用时，分子链无法自由移动，导致水凝胶的脆性提高，断裂伸长率减小。
在一些可选的实例中，所述海藻酸钠在所述聚乙烯醇溶液中的混合搅拌的时间为1~5h，例如可以是1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h或5.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤（Ⅰ）中，所述前体溶液采用如下方法制备得到：
将丙烯酰胺分散于混合液中，对所述混合液加热并混合搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，维持混合液的温度不变并持续搅拌，同时向混合液中加入所述纳米纤维素悬浮液，继续搅拌得到所述前体溶液。
在一些可选的实例中，所述丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为(0.3~0.5):1，例如可以是0.3:1、0.32:1、0.34:1、0.36:1、0.38:1、0.4:1、0.42:1、0.44:1、0.46:1、0.48:1或0.5:1，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明特别限定了丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为(0.3~0.5):1，当丙烯酰胺的添加量低于本发明限定的质量比范围下限时，其自由基聚合反应不充分，没有足够的丙烯酰胺单体进行有效交联，交联度较低，形成的第二半互穿凝胶网络的结构不完善。随着水分子进入水凝胶内部并溶胀，第二半互穿凝胶网络部分变形坍塌，水分子无法固定于低交联的第二半互穿凝胶网络结构中，最终导致制备得到的水凝胶的平衡溶胀比较低。随着丙烯酰胺添加量的提高，单位体积内的丙烯酰胺单体的数量增加，提高了参与化学交联的有效丙烯酰胺单体的数量，第二半互穿凝胶网络的化学交联点增多，足够的交联点能够支撑溶胀状态下的第二半互穿凝胶网络结构的完整，使得水凝胶的平衡溶胀比增加。但当丙烯酰胺添加量继续增大并超过本发明限定的质量比范围上限时，第二半互穿凝胶网络结构的交联密度过大，使得水凝胶的平衡溶胀比出现下降趋势。
此外，随着丙烯酰胺添加量的提高，水凝胶的拉伸强度和断裂伸长率有所增加，这是由于参与化学交联的丙烯酰胺单体的有效数量增加，形成的第二半互穿凝胶网络结构更加完善，受到外力作用时第二半互穿凝胶网络中的聚丙烯酰胺分子链段的运动重排使得应力均匀分布，可以有效防止裂纹的发生和延伸。但当丙烯酰胺的添加量继续提高并超过本发明限定的质量比范围上限时，会导致水凝胶的断裂伸长率出现下降趋势，这是由于随着丙烯酰胺添加量的继续增加，丙烯酰胺单体过度交联使得聚丙烯酰胺分子链的活动性降低，在外力作用下易出现局部应力使得水凝胶的结构遭到破坏，从而造成水凝胶韧性降低。
在一些可选的实例中，将所述混合液加热至40~50℃，例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，加入丙烯酰胺后搅拌1~5h直至丙烯酰胺完全溶解，例如可以是1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h或5.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述纳米纤维素悬浮液的质量分数为1.5~3wt%，例如可以是1.5wt%、1.6wt%、1.7wt%、1.8wt%、1.9wt%、2.0wt%、2.1wt%、2.2wt%、2.3wt%、2.4wt%、2.5wt%、2.6wt%、2.7wt%、2.8wt%、2.9wt%或3.0wt%，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述纳米纤维素悬浮液的加入量为：每克聚乙烯醇对应加入15~20mL的纳米纤维素悬浮液，例如可以是15mL、15.5mL、16mL、16.5mL、17mL、17.5mL、18mL、18.5mL、19mL、19.5mL或20mL，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
单独的聚乙烯醇形成的凝胶结构松软且无弹性，在加入纳米纤维素后，可以有效提高水凝胶的力学性能，这是由于当不加入纳米纤维素时，聚乙烯醇之间只通过化学结合成氢键，因此形成的第一半互穿凝胶网络的结构松散不致密。当纳米纤维素加入后，纳米纤维素与聚乙烯醇和丙烯酰胺之间可以通过化学和物理交联共同作用，使分子间相互缠绕在一起形成互穿聚合物三维网络结构，从而极大地提升了水凝胶的力学性能。
此外，加入纳米纤维素后还可以极大地提高水凝胶的保水性能，这是由于纳米纤维素通过物理交叉缠绕形成了三维网络结构，使得水凝胶的结构稳定，密度增大，限制了水分子的流失；此外，由于纳米纤维素表面具有大量的亲水性官能团，可以将水分子束缚在三维网络结构中，从而赋予了高分子水凝胶良好的保水性能。
在一些可选的实例中，加入所述纳米纤维素悬浮液后继续搅拌0.5~1.5h，例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1.0h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h或1.5h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤（Ⅰ）中，所述引发剂为过硫酸铵、四甲基乙二胺、过硫酸钾中的任意一种或至少两种的组合。
在一些可选的实例中，所述引发剂的加入量为丙烯酰胺质量的2~5wt%，例如可以是2.0wt%、2.2wt%、2.4wt%、2.6wt%、2.8wt%、3.0wt%、3.2wt%、3.4wt%、3.6wt%、3.8wt%、4.0wt%、4.2wt%、4.4wt%、4.6wt%、4.8wt%或5.0wt%，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
丙烯酰胺在引发剂作用下发生自由基聚合反应形成共价交联的大分子网络结构，引发剂的用量直接影响了第二半互穿凝胶网络的交联程度和聚合分子量，最终影响了水凝胶的力学性能。
随着引发剂添加量的提高，水凝胶的平衡溶胀比呈现先增加后减少的趋势。当引发剂的添加量低于2wt%时，产生的活化自由基数量过少，引发丙烯酰胺单体聚合反应不充分，达不到有效引发交联的目的，因此形成的第二半互穿凝胶网络结构不完善，最终导致水凝胶的平衡溶胀比过低。随着引发剂添加量的提高，引发自由基聚合的反应增强，第二半互穿凝胶网络结构趋于完善，水凝胶的平衡溶胀比增加。当引发剂的添加量超过5wt%时，引发的丙烯酰胺单体聚合反应增多，共价交联点增多，形成的第二半互穿凝胶网络结构过于致密，水凝胶的尺寸变小，使得水凝胶的平衡溶胀比降低。
此外，随着引发剂添加量的提高，水凝胶的拉伸强度和断裂伸长率也有所增大，这是由于丙烯酰胺单体在引发剂的作用下发生自由基聚合反应，随着引发剂添加量的提高，可以活化产生更多的自由基，使得丙烯酰胺单体的聚合反应更加充分彻底，共价交联分子链更加规整性，形成的聚丙烯酰胺共价交联网络更加完善，在受到外力作用时，应力分散更加均匀，最终导致水凝胶的拉伸强度和断裂伸长率得以提高。
在一些可选的实例中，所述交联剂为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、环氧氯丙烷、戊二醛、硼砂、聚乙二醇中的任意一种或至少两种的组合。
在一些可选的实例中，所述交联剂的加入量为丙烯酰胺质量的3~10wt%，例如可以是3.0wt%、3.5wt%、4.0wt%、4.5wt%、5.0wt%、5.5wt%、6.0wt%、6.5wt%、7.0wt%、7.5wt%、8.0wt%、8.5wt%、9.0wt%、9.5wt%或10.0wt%，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤（Ⅱ）中，所述吲哚菁绿与所述水凝胶溶液的混合方式为机械搅拌。
在一些可选的实例中，所述机械搅拌的时间为1~3h，例如可以是1.0h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2.0h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h或3.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述机械搅拌的转速为60~120rpm，例如可以是60rpm、65rpm、70rpm、75rpm、80rpm、85rpm、90rpm、95rpm、100rpm、105rpm、110rpm、115rpm或120rpm，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述超声除泡采用的超声功率为3~5kW，例如可以是3.0kW、3.2kW、3.4kW、3.6kW、3.8kW、4.0kW、4.2kW、4.4kW、4.6kW、4.8kW或5.0kW，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述超声除泡的时间为10~20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤（Ⅱ）中，所述混合凝胶溶液的低温冷冻温度为-20~-10℃，例如可以是-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃或-10℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述混合凝胶溶液的低温冷冻时间为4~6h，例如可以是4.0h、4.2h、4.4h、4.6h、4.8h、5.0h、5.2h、5.4h、5.6h、5.8h或6.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述混合凝胶溶液在室温下的解冻时间为3~5h，例如可以是3.0h、3.2h、3.4h、3.6h、3.8h、4.0h、4.2h、4.4h、4.6h、4.8h或5.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤（Ⅱ）中，所述硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为30~40wt%，例如可以是30wt%、31wt%、32wt%、33wt%、34wt%、35wt%、36wt%、37wt%、38wt%、39wt%或40wt%，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明制备得到的水凝胶由结构致密的皮层和疏松多孔的中间层组成，在浸泡过程中，中间凝胶表面的聚乙烯醇首先接触硅酸钠，盐析效应将导致中间凝胶表面首先脱水形成结构致密的皮层；同时，由于硅酸钠具有的强碱性，使得聚乙烯醇中的-OH被诱导极化，从而增强了聚乙烯醇分子链之间的氢键相互作用，进一步稳定了皮层的致密结构；最后，由于硅酸钠的分子尺寸较大，同时随着皮层致密度的提升，很难再进一步扩散到水凝胶内部，最终得到了具有致密皮层的水凝胶。
皮层的致密结构由于有序极化氢键交联而具有溶胀稳定性，在皮层的保护作用下，水凝胶在高温下长期浸入强酸溶液或强碱溶液中也能保持良好的力学性能。水凝胶的内部则是由聚乙烯醇/海藻酸钠的第一半互穿凝胶网络和聚丙烯酰胺/海藻酸钠的第二半互穿凝胶网络组成的半互穿双网络凝胶，该结构具有疏松大孔结构，能锁住大量的吲哚菁绿，并能使得吲哚菁绿在该结构中稳定分散，结构和交联度的协同作用使得吲哚菁绿水凝胶能够承受复杂的机械和环境载荷。
随着硅酸钠浓度的增加，导致形成的致密皮层的厚度增加，皮层厚度的增加使得水凝胶的机械性能大幅提高。当水凝胶因为硅酸钠的耦合效应形成致密皮层后，硅酸钠对水凝胶的渗透作用会逐渐减弱，即便继续提高硅酸钠的浓度，形成的致密皮层的厚度也不会继续增加。此外，当硅酸钠浓度过高，会导致形成的皮层过厚，相应地，水凝胶内部的高水化多孔结构半互穿双网络凝胶的孔隙减小，可储存吲哚菁绿的空腔体积降低。
在一些可选的实例中，所述硅酸钠的乙醇水溶液中，乙醇和水的体积比为1:(2~3)，例如可以是1:2、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:3，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明特别限定了乙醇和水的体积比为1:(2~3)，在对中间凝胶进行浸泡的过程中，乙醇可以控制浸泡过程中水凝胶的溶胀程度。随着乙醇含量的增加，中间凝胶的溶胀度降低，制备得到的水凝胶的凝胶尺寸变小，单位面积内凝胶结构变得更加致密，导致水凝胶内部未发生交联反应的分子不易溶出；此外，随着乙醇含量的增加，溶液中的水含量相对减少，使得浸泡过程中水凝胶的溶胀度得以控制，单位体积内水凝胶结构中的含水量降低，凝胶网络的交联密度提高，水凝胶的平衡溶胀比减小。
在一些可选的实例中，所述中间凝胶在所述硅酸钠的乙醇水溶液中的浸泡时间为1~5h，例如可以是1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h或5.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
中间凝胶在硅酸钠的乙醇水溶液中可发生明显的溶胀效果，首先，硅酸钠的乙醇水溶液中的水分子由中间凝胶的表面向内部扩散，与中间凝胶外层的聚乙烯醇和聚丙烯酰胺发生相互作用逐渐形成具有致密网络结构的高度水化的皮层；在皮层的致密结构尚未完全成型前，水分子会穿过中间凝胶的皮层向内部渗透，水分子进入水凝胶内部后会分散于聚合物的三维网络中，并与聚合物分子链和纳米纤维素分子链上的亲水性官能团发生氢键作用，聚合物分子链段在氢键作用下松弛伸展，使得水凝胶网络开始溶胀，水凝胶的体积大大增加。随着浸泡时间的延长，一方面，中间凝胶外层结构逐渐致密，水分子难以穿透皮层进入凝胶内部；另一方面，水凝胶内部的聚合物分子链也充分溶胀，最终导致水凝胶的溶胀比增加趋势减缓；在溶胀末期，聚合物分子链的弹性收缩力会促使三维网络收缩，最终达到溶胀平衡。
在一些可选的实例中，所述中间凝胶浸泡于50~60℃的硅酸钠的乙醇水溶液，例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明特别限定了中间凝胶的浸泡温度为50-60℃，在此温度范围内可促进盐析效果，使得更多的羟基官能团被暴露出来并相互作用，有利于凝胶体系中羟基官能团之间形成氢键；当浸泡温度超过60℃时，会导致水凝胶的力学性能有所下降，这是由于浸泡温度过高，水凝胶中的脆性网络增加到临界状态，导致其力学性能降低。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤（Ⅲ）中，分别配制吲哚菁绿的浓度为10- 1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶。
在一些可选的实例中，所述冷冻的环境温度为-50~-20℃，例如可以是-50℃、-48℃、-46℃、-42℃、-40℃、-38℃、-36℃、-34℃、-32℃、-30℃、-28℃、-26℃、-24℃、-22℃或-20℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述冷冻的时间为8~12h，例如可以是8.0h、8.5h、9.0h、9.5h、10.0h、10.5h、11.0h、11.5h或12.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，所述解冻的时间为4~7h，例如可以是4.0h、4.2h、4.4h、4.6h、4.8h、5.0h、5.2h、5.4h、5.6h、5.8h、6.0h、6.2h、6.4h、6.6h、6.8h或7.0h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
在一些可选的实例中，重复冷冻和解冻3~7次，例如可以是3次、4次、5次、6次或7次，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
随着冷冻和解冻的循环次数的增加，水凝胶的平衡溶胀比逐渐增大，当循环次数达到7次后水凝胶的平衡溶胀比增加趋势减缓，说明此时的水凝胶已形成完善的网络结构。聚乙烯醇分子链和聚丙烯酰胺分子链经冷冻后，分子链内和分子链间的羟基接触形成交联节点。而部分未发生交联的聚乙烯醇分子链和丙烯酰胺分子链在解冻后仍具有一定的运动能力，使得相互接触的羟基经再次冷冻后形成新的交联节点，因此随着循环次数的增加，聚乙烯醇和聚丙烯酰胺的交联密度增大，聚合物分子链内和链间的氢键作用增强，聚乙烯醇分子链和海藻酸钠分子链共同形成更加致密的第一半互穿凝胶网络，聚丙烯酰胺分子链和海藻酸钠分子链共同形成更加致密的第二半互穿凝胶网络，规整的交联结构使得水凝胶抵御外力作用的能力加强，最终导致水凝胶的拉伸强度和断裂伸长率有所提高。当循环次数达到7次后，聚乙烯醇分子链的交联点数量和聚丙烯酰胺分子链的交联点数量基本固定，分子链的活动性减弱，因此继续增加循环次数对水凝胶的平衡溶胀比的提升并不明显。同时，随着冻融循环次数的增加，物理交联点的密度增大，聚合物分子链的结合更加致密，形成的凝胶网络的孔隙变小，孔隙中所能容纳的水分含量降低，从而导致水凝胶的溶胀度降低。
第二方面，本发明提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板，所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板采用第一方面所述的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的应用，所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板用于光学手术导航。
示例性地，本发明提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶解于去离子水中，对去离子水加热至80~90℃并混合搅拌10~30min直至聚乙烯醇完全溶解，得到浓度为10~20g/mL的聚乙烯醇溶液；将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1:(0.1~0.3)，混合搅拌1~5h后得到混合液；
（2）将丙烯酰胺分散于步骤（1）得到的混合液中，丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为(0.3~0.5):1，对混合液加热至40~50℃并混合搅拌1~5h直至丙烯酰胺完全溶解；维持混合液的温度不变并持续搅拌，在搅拌过程中向混合液中加入质量分数为1.5~3wt%的纳米纤维素悬浮液，每克聚乙烯醇对应加入15~20mL的纳米纤维素悬浮液，继续搅拌0.5~1.5h后得到前体溶液；
（3）向步骤（2）得到的前体溶液中加入引发剂和交联剂，其中，引发剂的加入量为丙烯酰胺质量的2~5wt%，交联剂的加入量为丙烯酰胺质量的3~10wt%，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（4）将吲哚菁绿加入步骤（3）得到的水凝胶溶液中，采用60~120rpm的转速进行机械搅拌1~3h，随后通过3~5kW的超声波对水凝胶溶液进行超声除泡10~20min，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液置于-20~-10℃的低温环境下冷冻4~6h至完全凝固，随后置于室温下解冻3~5h，得到中间凝胶；
（5）将步骤（4）得到的中间凝胶浸泡于50~60℃的硅酸钠的乙醇水溶液中，硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为30~40wt%，乙醇和水的体积比为1:(2~3)，中间凝胶浸泡1~5h后取出清洗，得到水凝胶；
（6）按照步骤（4）和步骤（5）的操作步骤分别配制吲哚菁绿的浓度为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于-50~-20℃的低温环境下冷冻8~12h，随后置于室温下解冻4~7h，重复冷冻和解冻3~7次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
海藻酸钠具有优异的生物相容性和吸水保湿性，且原料来源广、安全无毒、可降解，在生物材料方面具有越来越广泛的应用。但是海藻酸钠水凝胶具有凝胶可控性差，机械强度低的缺点，在单独使用时往往难以满足人们对水凝胶的实际应用要求，这极大地限制了其应用范围。本发明通过互穿网络技术将聚乙烯醇和海藻酸钠进行复合，海藻酸钠分子进入聚乙烯醇网络中并与聚乙烯醇分子产生物理缠结，破坏了聚乙烯醇水凝胶的交联点密度，形成第一半互穿凝胶网络。
丙烯酰胺单体在引发剂和交联剂的作用下通过热引发自由基聚合形成共价交联的聚丙烯酰胺网络结构，海藻酸钠线性大分子穿插其中构成第二半互穿凝胶网络，聚丙烯酰胺的氨基和海藻酸钠的羟基之间形成氢键，加强了聚丙烯酰胺分子和海藻酸钠分子之间的分子间作用力，从而提高了第二半互穿凝胶网络的力学性能。
本发明采用聚乙烯醇/海藻酸钠作为第一半互穿凝胶网络，采用聚丙烯酰胺/海藻酸钠作为第二半互穿凝胶网络，形成了由第一半互穿凝胶网络和第二半互穿凝胶网络组成的半互穿双网络凝胶结构，双网络水凝胶中的聚乙烯醇分子链和聚丙烯酰胺分子链之间的氢键作为“牺牲键”可以有效抵抗外界载荷，水凝胶在反复拉伸或载重后依然能够快速恢复原状。
本发明在海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺的半互穿双网络凝胶体系中加入了纳米纤维素，制备得到质地柔软、能保持一定形状且长效稳定的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。本发明通过纳米纤维素与聚乙烯醇和聚丙烯酰胺进行物理交联，纳米纤维素可以作为高聚物增强相，聚丙烯酰胺分子链上存在大量氨基，聚乙烯醇分子链上存在大量的羟基，可以通过物理或化学交联形成水凝胶。纳米纤维素表面含有大量羟基，在水溶性聚合物中有良好的分散性，能与聚乙烯醇分子链上的羟基以及聚丙烯酰胺分子链上的氨基结合形成牢固的氢键，起到纳米增强作用。
本发明将冻融循环和硅酸钠盐析相结合，制备得到了具有致密皮层和多孔内层的水凝胶。当中间凝胶在硅酸钠的乙醇水溶液中浸泡一段时间后，硅酸钠与海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺凝胶体系之间会发生盐析效应和极化效应，在盐析效应的作用下，导致海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺凝胶体系发生脱水现象，在脱水过程中凝胶体系形成由有序堆积的氢键构成的微晶组织。在极化效应的作用下，具有碱性的硅酸钠可通过原位掺杂以增强海藻酸钠/聚乙烯醇/丙烯酰胺凝胶体系中羟基官能团的相互作用，溶液中的乙醇在碱性环境中脱质子，使得羟基官能团得到极化增强效果，表现出偶极-偶极相互作用，从而增强了微晶组织的稳定性。借助硅酸钠与中间凝胶之间发生的盐析效应和极化效应，会迅速引发中间凝胶表面的聚合物链的强聚集和微晶的形成，得到了更致密、更稳定的定向多孔网络结构的皮层，一方面，致密皮层的形成可以作为吲哚菁绿水凝胶的保护屏障，提高吲哚菁绿水凝胶在不同溶剂环境中的稳定性；另一方面，由于皮层具有致密的网络结构，使得水凝胶的力学性能得到大幅提升。当致密皮层形成后，硅酸钠的乙醇水溶液对凝胶的渗透作用会逐渐减弱，硅酸盐难以继续渗透至中间凝胶的内部，因此，得到的水凝胶的内部则为具有多孔的半互穿双网络凝胶结构。
本发明采用的凝固浴的溶剂为乙醇水溶液，乙醇在离子交联过程中可以有效控制水凝胶的溶胀度，且对离子交联过程没有其他不良影响。硅酸钠和乙醇的协同作用使得形成的水凝胶中间层的多孔网络结构更加均匀规整，网络孔径减少，孔密度增加，力学性能得到大幅提升。交联均匀的多孔网络结构为水凝胶优异的吸水保湿性提供了稳固的结构基础，也能赋予水凝胶良好的力学弹性。
本发明在水凝胶中加入吲哚菁绿后通过冻融循环固化成型制备得到了水凝胶基吲哚菁绿荧光标定板，该水凝胶基吲哚菁绿具有固定形状，通过本发明提供的制备方法制备得到的水凝胶基吲哚菁绿荧光标定板不会影响吲哚菁绿的荧光性能，而且可以极大地提高吲哚菁绿在水凝胶体系中的稳定性，不易发生光漂白和降解，从而保持荧光标定板长期稳定的荧光强度，为检测光学手术导航***的荧光功能及灵敏度提供便利。
附图说明
图1为本发明实施例1-5及对比例1-8提供的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备工艺流程图；
图2为本发明实施例1制备得到的水凝胶的光学图片；
图3为本发明实施例1制备得到的水凝胶的皮层的扫描电镜图；
图4为本发明实施例1制备得到的水凝胶的中间层在10μm比例尺下的扫描电镜图；
图5为本发明实施例1制备得到的水凝胶的中间层在5μm比例尺下的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及其附图，对本发明技术方案进行详细说明。在此记载的实施例为本发明的特定的具体实施方式，用于说明本发明的构思；这些说明均是解释性和示例性的，不应理解为对本发明实施方式及本发明保护范围的限制。除在此记载的实施例外，本领域技术人员还能够基于本申请权利要求书及其说明书所公开的内容采用显而易见的其它技术方案，这些技术方案包括采用对在此记载的实施例的做出任何显而易见的替换和修改的技术方案。
实施例1-5及对比例1-8中采用的主要化学试剂的制造商、产品牌号等参数信息如下：
聚乙烯醇：PVA205，上海凯茵化工有限公司；
海藻酸钠：M29284，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
丙烯酰胺：M26842，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
纳米纤维素：固含量≥2wt%，北方世纪（江苏）纤维素材料有限公司；
纳米纤维素悬浮液：将市售的纳米纤维素与去离子水按比例混合分散，搅拌均匀后配置得到不同浓度的纳米纤维素悬浮液；
过硫酸铵：M33145，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
四甲基乙二胺：M02049，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
过硫酸钾：M26049，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：M71555，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
环氧氯丙烷：M32070，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
戊二醛：M83903，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
硼砂：M69848，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
聚乙二醇：M12024，上海迈瑞尔生化科技有限公司；
吲哚菁绿：KM0146，北京百奥莱博科技有限公司；
硅酸钠：JR1687，河南锦润新材料有限公司。
实施例1
本实施例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，如图1所示，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶解于去离子水中，对去离子水加热至80℃并混合搅拌30min直至聚乙烯醇完全溶解，得到浓度为10g/mL的聚乙烯醇溶液；将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1:0.1，混合搅拌1h后得到混合液；
（2）将丙烯酰胺分散于步骤（1）得到的混合液中，丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为0.3:1，对混合液加热至40℃并混合搅拌5h直至丙烯酰胺完全溶解；维持混合液的温度不变并持续搅拌，在搅拌过程中向混合液中加入质量分数为1.5wt%的纳米纤维素悬浮液，每克聚乙烯醇对应加入20mL的纳米纤维素悬浮液，继续搅拌0.5h后得到前体溶液；
（3）向步骤（2）得到的前体溶液中加入过硫酸铵和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，其中，过硫酸铵的加入量为丙烯酰胺质量的2wt%，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的加入量为丙烯酰胺质量的3wt%，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（4）将吲哚菁绿加入步骤（3）得到的水凝胶溶液中，采用60rpm的转速进行机械搅拌3h，随后通过3kW的超声波对水凝胶溶液进行超声除泡20min，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液置于-10℃的低温环境下冷冻6h至完全凝固，随后置于室温下解冻5h，得到中间凝胶；
（5）将步骤（4）得到的中间凝胶浸泡于50℃的硅酸钠的乙醇水溶液中，硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为30wt%，乙醇和水的体积比为1:2，中间凝胶浸泡5h后取出清洗，得到水凝胶；
（6）按照步骤（4）和步骤（5）的操作步骤分别配制吲哚菁绿的浓度为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于-20℃的低温环境下冷冻12h，随后置于室温下解冻7h，重复冷冻和解冻3次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
图2为本实施例制备得到的水凝胶的光学图片，可以看出其形成了分层结构，出现了致密结构的皮层和多孔结构的中间层。
图3为本实施例制备得到的水凝胶皮层的扫描电镜图，可以看出水凝胶皮层结构致密平整，无孔隙。
图4为10μm比例尺下的水凝胶中间层的扫描电镜图，可以看出水凝胶中间层具有多孔结构且孔径均一，这表明聚乙烯醇分子链、聚丙烯酰胺分子链和纳米纤维素通过氢键、共价键或分子间作用力形成了强力结合。
图5为5μm比例尺下的水凝胶中间层的扫描电镜图，可以看出分散在水凝胶多孔结构中的纳米纤维素（圆圈处），这些纤维的直径在100nm以下，且与多孔结构之间的结合较为紧密。
实施例2
本实施例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，如图1所示，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶解于去离子水中，对去离子水加热至82℃并混合搅拌25min直至聚乙烯醇完全溶解，得到浓度为12g/mL的聚乙烯醇溶液；将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1:0.15，混合搅拌2h后得到混合液；
（2）将丙烯酰胺分散于步骤（1）得到的混合液中，丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为0.35:1，对混合液加热至42℃并混合搅拌4h直至丙烯酰胺完全溶解；维持混合液的温度不变并持续搅拌，在搅拌过程中向混合液中加入质量分数为1.8wt%的纳米纤维素悬浮液，每克聚乙烯醇对应加入18mL的纳米纤维素悬浮液，继续搅拌0.8h后得到前体溶液；
（3）向步骤（2）得到的前体溶液中加入过硫酸铵和环氧氯丙烷，其中，过硫酸铵的加入量为丙烯酰胺质量的3wt%，环氧氯丙烷的加入量为丙烯酰胺质量的5wt%，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（4）将吲哚菁绿加入步骤（3）得到的水凝胶溶液中，采用70rpm的转速进行机械搅拌2.5h，随后通过3.5kW的超声波对水凝胶溶液进行超声除泡18min，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液置于-12℃的低温环境下冷冻5.5h至完全凝固，随后置于室温下解冻4.5h，得到中间凝胶；
（5）将步骤（4）得到的中间凝胶浸泡于52℃的硅酸钠的乙醇水溶液中，硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为32wt%，乙醇和水的体积比为1:2.2，中间凝胶浸泡4h后取出清洗，得到水凝胶；
（6）按照步骤（4）和步骤（5）的操作步骤分别配制吲哚菁绿的浓度为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于-30℃的低温环境下冷冻11h，随后置于室温下解冻6h，重复冷冻和解冻4次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
实施例3
本实施例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，如图1所示，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶解于去离子水中，对去离子水加热至85℃并混合搅拌20min直至聚乙烯醇完全溶解，得到浓度为15g/mL的聚乙烯醇溶液；将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1:0.2，混合搅拌3h后得到混合液；
（2）将丙烯酰胺分散于步骤（1）得到的混合液中，丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为0.4:1，对混合液加热至45℃并混合搅拌3h直至丙烯酰胺完全溶解；维持混合液的温度不变并持续搅拌，在搅拌过程中向混合液中加入质量分数为2wt%的纳米纤维素悬浮液，每克聚乙烯醇对应加入17mL的纳米纤维素悬浮液，继续搅拌1h后得到前体溶液；
（3）向步骤（2）得到的前体溶液中加入过硫酸钾和戊二醛，其中，过硫酸钾的加入量为丙烯酰胺质量的3.5wt%，戊二醛的加入量为丙烯酰胺质量的7wt%，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（4）将吲哚菁绿加入步骤（3）得到的水凝胶溶液中，采用80rpm的转速进行机械搅拌2h，随后通过4kW的超声波对水凝胶溶液进行超声除泡15min，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液置于-15℃的低温环境下冷冻5h至完全凝固，随后置于室温下解冻4h，得到中间凝胶；
（5）将步骤（4）得到的中间凝胶浸泡于55℃的硅酸钠的乙醇水溶液中，硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为35wt%，乙醇和水的体积比为1:2.5，中间凝胶浸泡3h后取出清洗，得到水凝胶；
（6）按照步骤（4）和步骤（5）的操作步骤分别配制吲哚菁绿的浓度为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于-35℃的低温环境下冷冻10h，随后置于室温下解冻5.5h，重复冷冻和解冻5次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
实施例4
本实施例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，如图1所示，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶解于去离子水中，对去离子水加热至88℃并混合搅拌15min直至聚乙烯醇完全溶解，得到浓度为18g/mL的聚乙烯醇溶液；将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1:0.25，混合搅拌4h后得到混合液；
（2）将丙烯酰胺分散于步骤（1）得到的混合液中，丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为0.45:1，对混合液加热至48℃并混合搅拌2h直至丙烯酰胺完全溶解；维持混合液的温度不变并持续搅拌，在搅拌过程中向混合液中加入质量分数为2.5wt%的纳米纤维素悬浮液，每克聚乙烯醇对应加入16mL的纳米纤维素悬浮液，继续搅拌1.2h后得到前体溶液；
（3）向步骤（2）得到的前体溶液中加入过硫酸钾和硼砂，其中，过硫酸钾的加入量为丙烯酰胺质量的4wt%，硼砂的加入量为丙烯酰胺质量的8wt%，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（4）将吲哚菁绿加入步骤（3）得到的水凝胶溶液中，采用100rpm的转速进行机械搅拌1.5h，随后通过4.5kW的超声波对水凝胶溶液进行超声除泡12min，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液置于-18℃的低温环境下冷冻4.5h至完全凝固，随后置于室温下解冻3.5h，得到中间凝胶；
（5）将步骤（4）得到的中间凝胶浸泡于58℃的硅酸钠的乙醇水溶液中，硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为38wt%，乙醇和水的体积比为1:2.8，中间凝胶浸泡2h后取出清洗，得到水凝胶；
（6）按照步骤（4）和步骤（5）的操作步骤分别配制吲哚菁绿的浓度为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于-40℃的低温环境下冷冻9h，随后置于室温下解冻5h，重复冷冻和解冻6次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
实施例5
本实施例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，如图1所示，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶解于去离子水中，对去离子水加热至90℃并混合搅拌10min直至聚乙烯醇完全溶解，得到浓度为20g/mL的聚乙烯醇溶液；将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1:0.3，混合搅拌5h后得到混合液；
（2）将丙烯酰胺分散于步骤（1）得到的混合液中，丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为0.5:1，对混合液加热至50℃并混合搅拌1h直至丙烯酰胺完全溶解；维持混合液的温度不变并持续搅拌，在搅拌过程中向混合液中加入质量分数为3wt%的纳米纤维素悬浮液，每克聚乙烯醇对应加入15mL的纳米纤维素悬浮液，继续搅拌1.5h后得到前体溶液；
（3）向步骤（2）得到的前体溶液中加入四甲基乙二胺和聚乙二醇，其中，四甲基乙二胺的加入量为丙烯酰胺质量的5wt%，聚乙二醇的加入量为丙烯酰胺质量的10wt%，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（4）将吲哚菁绿加入步骤（3）得到的水凝胶溶液中，采用120rpm的转速进行机械搅拌1h，随后通过5kW的超声波对水凝胶溶液进行超声除泡10min，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液置于-20℃的低温环境下冷冻4h至完全凝固，随后置于室温下解冻3h，得到中间凝胶；
（5）将步骤（4）得到的中间凝胶浸泡于60℃的硅酸钠的乙醇水溶液中，硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为40wt%，乙醇和水的体积比为1:3，中间凝胶浸泡1h后取出清洗，得到水凝胶；
（6）按照步骤（4）和步骤（5）的操作步骤分别配制吲哚菁绿的浓度为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于-50℃的低温环境下冷冻8h，随后置于室温下解冻4h，重复冷冻和解冻7次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
对比例1
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（1）中海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比调整为1:0.05，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对比例2
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（1）中海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比调整为1:0.4，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对比例3
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（2）中丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比调整为0.2:1，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对比例4
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（2）中丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比调整为0.6:1，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对比例5
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（2）中每克聚乙烯醇对应加入10mL的纳米纤维素悬浮液，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对比例6
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（2）中每克聚乙烯醇对应加入25mL的纳米纤维素悬浮液，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对比例7
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（5）中硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数调整为25wt%，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对比例8
本对比例提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤（5）中硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数调整为45wt%，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
对实施例1-5及对比例1-8提供的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的平衡溶胀比、拉伸强度和断裂伸长率进行测试，具体测试过程如下：
（1）平衡溶胀比
将制备得到的水凝胶干燥至恒重W0，放入去离子水中进行溶胀，室温下溶胀平衡后用滤纸擦拭干净表面的水分,记录下此时水凝胶的质量Wn。水凝胶的平衡溶胀比（ESR）采用下式计算：
（2）拉伸强度和断裂伸长率
将水凝胶切成40mmx10mm的条状试样，在万能型材料机上进行拉伸测试，拉伸速率设定为50mm/min，拉伸至试样断裂时停止。水凝胶的拉伸强度（TS）采用下式计算：
其中，Fmax为最大拉伸应力，A为试样的横截面积；
水凝胶的断裂伸长率（E）采用下式计算：
其中，L0和Ln分别为试样初始长度和试样在断裂时的长度。
测试结果见表1。
表1实施例1-5及对比例1-8的测试结果
由实施例1-5提供的测试数据可以看出，本发明提供的水凝胶具备优异的吸湿保水性和力学性能，从而实现了对吲哚菁绿的稳定储存。
由实施例1、对比例1和对比例2提供的测试数据可以看出，对比例1中海藻酸钠的添加量过高，导致第一半互穿凝胶网络结构过于致密，不利于水分子的自由移动，从而使得水凝胶的平衡溶胀比降低，同时，分子链的活动性降低，受到外力作用时，分子链无法自由移动，导致水凝胶的脆性提高，断裂伸长率减小；而对比例2中海藻酸钠的添加量过低，无法形成完善的互穿凝胶网络结构，导致水凝胶的力学性能下降。
由实施例1、对比例3和对比例4提供的测试数据可以看出，对比例3中丙烯酰胺的添加量过低，其自由基聚合反应不充分，没有足够的丙烯酰胺单体进行有效交联，交联度较低，形成的第二半互穿凝胶网络的结构不完善，导致水凝胶的平衡溶胀比和力学性能降低；对比例4中丙烯酰胺添加量过高，使得第二半互穿凝胶网络结构的交联密度过大，导致水凝胶的平衡溶胀比降低，同时聚丙烯酰胺分子链的活动性下降，造成水凝胶的断裂伸长率降低。
由实施例1、对比例5和对比例6提供的测试数据可以看出，对比例5中纳米纤维素悬浮液的添加量过低，无法有效发挥纳米纤维素的力学增强和吸水保湿作用，导致水凝胶的平衡溶胀比、拉伸强度和断裂伸长率均有所降低；对比例6中纳米纤维素悬浮液的添加量过高，导致前提溶液的黏度过大，流动性变差，影响后续引发剂和交联剂在前体溶液中的分散均匀性，进而影响丙烯酰胺的交联反应，导致聚丙烯酰胺形成的第二半互穿凝胶网络结构不完善，最终导致水凝胶的力学性能降低。
由实施例1、对比例7和对比例8提供的测试数据可以看出，对比例7中硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的浓度过低，导致皮层的厚度较小且致密程度较低，最终影响了水凝胶的力学性能；对比例8中硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的浓度过高，硅酸钠对水凝胶的渗透作用减弱，同时皮层过于致密导致硅酸钠也无法继续渗透至水凝胶内部，因此皮层的厚度不会继续增加，对水凝胶力学性能的提升并不明显。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
（Ⅰ）将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，混合均匀后得到混合液；向混合液中依次加入丙烯酰胺和纳米纤维素悬浮液，混合均匀后得到前体溶液；向前体溶液中加入引发剂和交联剂，混合均匀并发生交联反应，得到水凝胶溶液；
（Ⅱ）将吲哚菁绿加入步骤（Ⅰ）得到的水凝胶溶液中，混合均匀后进行超声除泡，得到混合凝胶溶液；将混合凝胶溶液低温冷冻至完全凝固，随后置于室温下解冻，得到中间凝胶；将中间凝胶浸泡于硅酸钠的乙醇水溶液中，浸泡后取出清洗，得到水凝胶；
（Ⅲ）配制多组含不同浓度吲哚菁绿的水凝胶，并将其分别注入独立的试样管中，将试样管固定于多孔板内，将多孔板置于低温环境下冷冻，随后置于室温下解冻，重复冷冻和解冻至少三次，得到所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板。
2.根据权利要求1所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，步骤（Ⅰ）中，所述聚乙烯醇溶液采用如下方法制备得到：
将所述聚乙烯醇溶解于去离子水中，对所述去离子水加热并混合搅拌直至聚乙烯醇完全溶解，得到所述聚乙烯醇溶液；
其中，将所述去离子水加热至80~90℃；
所述聚乙烯醇在所述去离子水中的混合搅拌的时间为10~30min；
所述聚乙烯醇溶液中的聚乙烯醇的浓度为10~20g/mL；
所述海藻酸钠与所述聚乙烯醇溶液中的聚乙烯醇的质量比为1:(0.1~0.3)；
所述海藻酸钠在所述聚乙烯醇溶液中的混合搅拌的时间为1~5h。
3.根据权利要求1所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，步骤（Ⅰ）中，所述前体溶液采用如下方法制备得到：
将丙烯酰胺分散于混合液中，对所述混合液加热并混合搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，维持混合液的温度不变并持续搅拌，同时向混合液中加入所述纳米纤维素悬浮液，继续搅拌得到所述前体溶液；
其中，所述丙烯酰胺与聚乙烯醇的质量比为(0.3~0.5):1；
将所述混合液加热至40~50℃；
加入丙烯酰胺后搅拌1~5h直至丙烯酰胺完全溶解；
所述纳米纤维素悬浮液的质量分数为1.5~3wt%；
所述纳米纤维素悬浮液的加入量为：每克聚乙烯醇对应加入15~20mL的纳米纤维素悬浮液；
加入所述纳米纤维素悬浮液后继续搅拌0.5~1.5h。
4.根据权利要求1所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，步骤（Ⅰ）中，所述引发剂为过硫酸铵、四甲基乙二胺、过硫酸钾中的任意一种或至少两种的组合；
所述引发剂的加入量为丙烯酰胺质量的2~5wt%；
所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、环氧氯丙烷、戊二醛、硼砂、聚乙二醇中的任意一种或至少两种的组合；
所述交联剂的加入量为丙烯酰胺质量的3~10wt%。
5.根据权利要求1所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，步骤（Ⅱ）中，所述吲哚菁绿与所述水凝胶溶液的混合方式为机械搅拌；
所述机械搅拌的时间为1~3h；
所述机械搅拌的转速为60~120rpm；
所述超声除泡采用的超声功率为3~5kW；
所述超声除泡的时间为10~20min。
6.根据权利要求1所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，步骤（Ⅱ）中，所述混合凝胶溶液的低温冷冻温度为-20~-10℃；
所述混合凝胶溶液的低温冷冻时间为4~6h；
所述混合凝胶溶液在室温下的解冻时间为3~5h。
7.根据权利要求1所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，步骤（Ⅱ）中，所述硅酸钠的乙醇水溶液中硅酸钠的质量分数为30~40wt%；
所述硅酸钠的乙醇水溶液中，乙醇和水的体积比为1:(2~3)；
所述中间凝胶在所述硅酸钠的乙醇水溶液中的浸泡时间为1~5h；
所述中间凝胶浸泡于50~60℃的硅酸钠的乙醇水溶液。
8.根据权利要求1所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的制备方法，其特征在于，步骤（Ⅲ）中，分别配制吲哚菁绿的浓度为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L的6组不同含量的水凝胶；
所述冷冻的环境温度为-50~-20℃；
所述冷冻的时间为8~12h；
所述解冻的时间为4~7h；
重复冷冻和解冻3~7次。
9.一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板，其特征在于，所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板采用权利要求1至8任一项所述的制备方法制备得到。
10.一种权利要求9所述的吲哚菁绿水凝胶荧光标定板的应用，其特征在于，所述吲哚菁绿水凝胶荧光标定板用于光学手术导航。
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