CN117512180B - 小麦茎基腐抗病位点Qfcr.cau.2A的KASP分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦茎基腐抗病位点Qfcr.cau.2A的KASP分子标记及其应用，属于分子标记和植物遗传育种技术领域。所述KASP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1所示序列的第101位碱基处存在A/G突变。所述KASP分子标记可用于鉴定小麦对茎基腐病的抗性或筛选对小麦茎基腐病抗病和感病的品种或品系。本发明提供的分子标记能够快速准确鉴定出小麦对FCR的抗性，为小麦抗FCR种质资源筛选提供了非常有价值的分子工具。

Description

小麦茎基腐抗病位点Qfcr.cau.2A的KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记和植物遗传育种技术领域，特别是涉及小麦茎基腐抗病位点Qfcr.cau.2A的KASP分子标记及其应用。

背景技术

小麦茎基腐病(Fusarium crown rot，FCR)是一种由镰刀菌侵染造成的世界性土传病害，先后在澳大利亚、加拿大、美国和中国等国家被报道。小麦茎基部和根部受到病原菌侵染后会导致组织坏死，破坏植株水分和养分运输，从而对小麦穗粒数、粒重、株高、分蘖数和产量等重要农艺性状产生不利影响。近年来伴随着秸秆还田、节水节肥等耕作措施的应用，该病已严重威胁到小麦的安全生产，成为一种常见的新发病害。

种植抗病品种是防控茎基腐病发生和危害最为有效的措施之一。到目前为止，在国际范围内对该病表现高抗的材料还没有发现，仅有部分材料表现中等抗性。国际科技工作者利用这些中抗材料构建重组自交系等遗传群体，通过QTL定位分析发现多个控制小麦茎基腐病抗性的QTL。例如，Ma等利用“CSCR6/Lang”群体在3BL染色体上定位到一个强效抗病位点，能够解释49％变异，来源于“CSCR6”的3BL染色体上的位点在4个重组自交系中得到了验证，该位点能够平均降低33％的茎基腐病害(Ma et al.2010)。Poole等通过一系列的田间和温室实验从两个重组自交系中(“Sunco/Macon”，“Sunco/Otis”)定位到5个具有显著效应的抗病位点，分别位于2B、3B、4B、4D和7A染色体上，在所有实验中一致性和效应显著性最高的位点是来自于“Macon”和“Otis”的3B染色体，解释36％的表型变异(Poole etal.2012)。

由于小麦茎基腐病抗性性状的复杂性和多基因性，筛选更多的抗性种质和位点/基因可以极大地促进FCR抗性的遗传改良，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供小麦茎基腐抗病位点Qfcr.cau.2A的KASP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的KASP分子标记能够快速准确鉴定出小麦对FCR的抗性，为小麦抗FCR种质资源筛选提供了非常有价值的分子工具。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供小麦茎基腐抗病位点Qfcr.cau.2A的KASP分子标记，所述KASP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1所示序列的第101位碱基处存在A/G突变。

本发明还提供一种检测所述KASP分子标记的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物R。

本发明还提供所述的引物组在制备检测小麦茎基腐病抗性的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测小麦茎基腐病抗性的试剂盒，包含所述的引物组。

本发明还提供一种所述的引物组或所述的试剂盒的应用，用于如下任一项应用中：

(1)鉴定小麦对茎基腐病的抗性；

(2)筛选对小麦茎基腐病抗病和感病的品种或品系。

本发明还提供一种鉴定小麦对茎基腐病抗性的方法，包括如下步骤：

以待测小麦样品的基因组DNA作为模板，利用所述的引物组或所述的试剂盒对模板进行PCR扩增，利用扩增结果判断待测小麦对茎基腐病的抗性；

若扩增结果显示释放出蓝色荧光，则判断待测小麦对茎基腐病表现为抗病；若扩增结果显示释放出橙红色荧光，则判断待测小麦对茎基腐病表现为感病。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：2μL 10ng/μLDNA、5μL 2×Master mix和0.14μL10μM混合引物。

进一步地，在所述混合引物中，所述上游引物F1、所述上游引物F2和所述下游引物R的体积比为12:12:30。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃持续10min；变性阶段95℃持续20s；复性延伸阶段65℃40s，10个循环，每个循环降低1℃；变性阶段95℃20s，55℃40s，35个循环。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用来源于C549和3642的重组自交系群体，结合16K单核苷酸多态性(SNP)序列对C549中与FCR抗性相关的遗传位点进行了研究，在小麦2A染色体长臂上发现一个稳定的茎基腐病抗性QTL。进一步针对该位点开发了可用于大规模材料筛选的KASP分子标记，在来源于C549和CN16为亲本构建的F₇ RIL群体中验证了所开发分子标记与抗病性的紧密关联程度。该KASP分子标记能够快速准确鉴定出小麦对FCR的抗性，为小麦抗FCR种质资源筛选提供了非常有价值的分子工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为小麦材料茎基腐病严重程度，从左至右为抗病对照Sunco，抗病亲本C549，感病亲本3642和川农16；

图2为C549和3642定位群体的FCR抗性分布；

图3为C549/3642群体中赋予FCR抗性的QTL，其中a：利用遗传图谱定位与FCR相关的QTL，相对于染色体(y轴)绘制来自每个cM的LOD值(x轴)，并且用虚线指示用于表明QTL存在的阈值LOD值；b：带有SNP标记的2A染色体遗传图谱，红线代表QTL的遗传位置；

图4为KASP-5996在C549和CN16重组自交系群体中的分型情况；

图5为显示QTL对C549和CN16重组群体FCR抗性影响的箱线图，**表明P＜0.01的显著水平。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

发明人从甲基磺酸乙酯(EMS)诱导的川农16(优良小麦品种CN16)突变体库中鉴定出一个遗传稳定的FCR抗性突变体(C549)。利用来源于C549、CN16和中国小麦种质3642的两个重组自交系(RIL)群体，对C549中与FCR抗性相关的遗传位点进行了研究和验证。

具体如下：

1、小麦茎基腐病的表型分析

假禾谷镰孢野生型菌株WZ2-8A在PDA活化打成菌饼接种到CMC液体培养基，25℃180r/min振荡4天，4层纱布过滤，调整孢子悬浮液浓度为1×10⁶个/mL，获得孢子悬浮液。待RIL群体种子芽长约0.5-1cm时，浸种孢子悬浮液(含有体积分数0.1％的吐温20)1min。种子移栽到5×10穴盘中，每穴2粒，采用从底部浇水，首次浸透式浇水，之后干旱(约6-7天)至严重失水时进行浇水。温室温度为25/15℃，白/夜。同时接种抗病对照材料Sunco，感病对照新麦26，待对照感病级别为5级(约移栽后42天)时，根据表1对小麦茎基部进行病级调查。按照公式病情指数(％)＝∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×最高病级)×100计算病情指数。

表1小麦茎基腐病抗性分级标准及评价标准

对C549和3642的F₇重组自交系群体进行了抗病等级调查，如图1所示，感病亲本3642茎基部褐色病变明显，相反，抗病亲本C549茎秆褐色病变面积较少，植株正常生长(图1)，利用Excel2013进行统计分析，结果发现：群体病情指数呈连续性分布，符合正态分布，属于典型的数量性状(图2)，病情指数变化范围为5.00-75.45。广义遗传力为0.91，表明群体包含了足够的遗传变异水平(表2)。

表2 C549和3642群体镰刀菌冠腐病严重程度

2、分子标记分析

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取定位群体的DNA后，委托测序公司进行芯片测序。将小麦16K SNP阵列数据按照MAF<0.05，缺失>10％，杂合>20％的原则过滤。使用软件Join Map 4进行连锁分析。LOD阈值从3到10进行测试，直到得到一个连锁群上保持连锁顺序和距离的最佳标记数的阈值。最终共有1452个SNPs被用于构建遗传连锁图谱(表3)。这些单核苷酸分布在所有21条染色体上。B组单核苷酸多态性最高(667)，其次是A组(600)和D组(185)。SNP标记的数目在染色体上各不相同，在2D染色体上最少有16个标记，在6B染色体上最多有154个标记。

表321染色体上SNP分布情况

3、QTL分析和验证

利用软件QTL IciMapping将表型数据和分子标记联合进行QTL分析，共发现10个QTL与FCR抗性显著相关，分别位于1A，2A，3B，4A，6B和7B染色体。其中，位于2A染色体的QTL(Qfcr.cau.2A，636.90-659.58Mb之间的22.68Mb区段内，位于2A染色体长臂，基因版本IWGSC 1.0)位点在6次试验中均被检测到，解释了24.42％的表型变异率(图3)。

根据位于2A染色体长臂上与茎基腐病抗性显著关联的分子标记KASP-5996(SEQID NO.1)，设计了KASP引物，如下所示：

上游引物F1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCACATACTAGCTACTTCCATGATG-3’(SEQ ID NO.2)

上游引物F2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCACATACTAGCTACTTCCATGATA-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物R：5’-GCACTTGGAGGCTCAACAACGTTTA-3’(SEQ ID NO.4)

其中，上游引物中的下划线斜体部分为接头序列，3’末尾的加粗的一个碱基G(针对SEQ ID NO.2)和A(针对SEQ ID NO.3)为分型位点。

分子标记KASP-5996的序列如下：

TTTAGAAAATGAGTTAACGTAATATTCAAAATGTTAGTTATATTCAAAATGTAAGTTAATGTTCCATGTCCAATGTTCACATACTAGCTACTTCCATGATRTCTACTACACAACCTTCTTCTTGTAAACGTTGTTGAGCCTCCAAGTGCAGAGGTTTGTAGGACAGTAGCAAATTTCCCTCAAGTGGATGACCTAAGGTTT(SEQ ID NO.1)。其中，加粗标记的“R”为SNP位点，即如SEQ ID NO.1所示序列第101位碱基处为SNP位点，其碱基为A或G。

感病亲本CN16在上述SNP位点的碱基为G，抗病亲本C549在上述SNP位点的碱基为A，利用分子标记KASP-5996基因分型检测F₇群体对小麦茎基腐病抗性分布，PCR检测的反应体系为：2μL 10ng/μLDNA样品、5μL 2×Master mix和0.14μL混合引物，混合引物的终浓度为10μM，其中，上游引物F1：上游引物F2：下游引物R＝12:12:30(V/V/V)；反应程序为：预变性阶段95℃持续10min；变性阶段95℃持续20s；然后复性延伸阶段65℃40s，10个循环，每个循环降低1℃；最后变性阶段95℃20s，55℃40s，35个循环。

分型结果如图4所示，当分子标记KASP-5996所在的等位基因中均为G时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出橙红色荧光基团，从而可以通过荧光颜色判断其为感病的基因型；当分子标记KASP-5996所在的等位基因中均为A时，检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，从而可以通过荧光颜色判断其为抗病的基因型。上述SNP在CN16和C549的F₇群体中以3:1的分离比例共同分离，表明这些单核苷酸多态性位点之间有很强的连锁关系。在148个F₇个体中，113个为CN16等位基因纯合(病指均值为48.15)，35个为C549等位基因纯合(病指均值为30.63)，两组均值相差36.38％(图5)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.小麦茎基腐抗病位点Qfcr.cau.2A的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1所示序列的第101位碱基处存在A/G突变。

2.一种检测权利要求1所述KASP分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物R。

3.如权利要求2所述的引物组在制备检测小麦茎基腐病抗性的试剂盒中的应用。

4.一种检测小麦茎基腐病抗性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物组。

5.一种如权利要求2所述的引物组或如权利要求4所述的试剂盒的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：

(1)鉴定小麦对茎基腐病的抗性；

(2)筛选对小麦茎基腐病抗病和感病的品种或品系。

6.一种鉴定小麦对茎基腐病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以待测小麦样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒对模板进行PCR扩增，利用扩增结果判断待测小麦对茎基腐病的抗性；

若扩增结果鉴定的基因型为AA基因型，则判断待测小麦对茎基腐病表现为抗病；若扩增结果鉴定的基因型为GG基因型，则判断待测小麦对茎基腐病表现为感病。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2μL 10ng/μLDNA、5μL 2×Master mix和0.14μL 10μM混合引物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述混合引物中，所述上游引物F1、所述上游引物F2和所述下游引物R的体积比为12:12:30。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃持续10min；变性阶段95℃持续20s；复性延伸阶段65℃40s，10个循环，每个循环降低1℃；变性阶段95℃20s，55℃40s，35个循环。