CN117511885A - 提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化til细胞及其应用 - Google Patents

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CN117511885A CN202410022305.6A CN202410022305A CN117511885A CN 117511885 A CN117511885 A CN 117511885A CN 202410022305 A CN202410022305 A CN 202410022305A CN 117511885 A CN117511885 A CN 117511885A
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Abstract

本发明提供了一种提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化TIL细胞及其应用。本发明涉及基因工程及细胞治疗技术领域。本发明的工程化TIL细胞表面含有外源的膜结合型的DAP10‑CD3ζ融合蛋白，其内质网或高尔基体中含有滞留型融合蛋白。具体地，本发明提供了一种膜结合型DAP10‑CD3ζ融合蛋白，使TIL细胞通过NKG2D‑NKG2DL途径识别肿瘤细胞后，可以被本发明的激活型融合蛋白激活，从而对肿瘤细胞进行有效杀伤。本发明还提供了滞留型融合蛋白，使TIL细胞激活时表达的内源NKG2DL能与本发明的滞留型融合蛋白结合，从而滞留在细胞内，避免了TIL细胞间的相互识别和杀伤，提升了TIL细胞的活率。

Description

提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化TIL细胞及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及细胞治疗技术领域，具体地涉及提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化TIL细胞及其应用。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞疗法是指从肿瘤组织中分离肿瘤浸润的淋巴细胞，在体外培养和大量扩增后回输到病人体内的疗法。TIL由具有多种个TCR克隆的T细胞组成，可以识别多个肿瘤特异性的新生抗原及肿瘤相关抗原，使其更有效地应对肿瘤异质性。TIL通常含有一定效应性记忆性T细胞，在体内被肿瘤抗原刺激后表达趋化因子受体，使其在回输后更容易定位于肿瘤组织。此外，TIL来源于患者自身，具有较低的毒性。TIL疗法在实体瘤领域内表现出了巨大的潜力。
来源肿瘤组织的TIL细胞富含肿瘤特异性T细胞，然而，这些肿瘤特异性T细胞在肿瘤特异性激活后往往处于终末分化、耗竭状态，导致TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力减弱。此外，培养出来的TIL细胞中有大部分细胞是非肿瘤特异性的旁观者细胞，如何将旁观者细胞转变为对肿瘤细胞具有识别和杀伤功能的效应细胞是亟待解决的问题。此外，肿瘤细胞往往降低MHC-I分子的表达或TAP基因突变等导致抗原递呈功能丧失等，从而逃逸免疫细胞的杀伤。
TIL细胞表面的NKG2D分子可以结合肿瘤细胞表面的NKG2DL分子，从而使TIL细胞识别肿瘤细胞。然而，TIL细胞在激活状态下会短暂表达NKG2DL，这使得TIL细胞之间存在互相残杀，导致TIL细胞活力显著下降。
因此，本领域迫切需要开发对肿瘤细胞具有识别和杀伤肿瘤细胞功能、减少免疫逃逸、并能减少TIL细胞自相残杀的工程化TIL细胞。
发明内容
本发明的目的就是提供对肿瘤细胞具有识别和杀伤肿瘤细胞功能、减少免疫逃逸、并能减少TIL细胞自相残杀的工程化TIL细胞及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种工程化肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)，所述工程化TIL细胞表达选自下组的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滞留型融合蛋白、或其组合；
其中，所述激活型融合蛋白为膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白；
所述滞留型融合蛋白包括：NKG2D胞外区和KDEL序列。
在另一优选例中，所述工程化TIL细胞表达激活型融合蛋白和滞留型融合蛋白。
在另一优选例中，所述激活型融合蛋白包括：(1) 胞外结构域，所述胞外结构域包含DAP10元件或其活性片段；
(2) 跨膜域；和
(3) 胞内信号域，所述胞内信号域包含DAP10胞内结构域和CD3ζ；
其中，所述胞外结构域和胞内信号域，通过所述跨膜域串联在一起。
在另一优选例中，所述的工程化TIL细胞的细胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化TIL细胞的内质网或高尔基体中具有所述的滞留型融合蛋白。
在另一优选例中，所述工程化TIL细胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的激活型融合蛋白和/或所述的滞留型融合蛋白。
在另一优选例中，所述工程化TIL细胞含有一核酸构建物，所述核酸构建物包含第一表达盒，所述第一表达盒包含编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
在另一优选例中，所述工程化TIL细胞含有一载体，所述载体包含：编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
在另一优选例中，所述工程化TIL细胞还表达膜结合型IL-15融合蛋白，其包括以下元件：
(i) 白细胞介素15或其功能活性片段；
(ii) 跨膜域；和
(iii) 胞内域；
其中，所述胞内域为CD86胞内域。
在另一优选例中，所述CD86胞内域包括全长胞内域、或其活性片段。
在另一优选例中，所述IL-15包括全长的、成熟形式的IL-15、或其活性片段。
在另一优选例中，所述IL-15包括野生型和突变型。
在另一优选例中，所述IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
在另一优选例中，所述融合多肽进一步包括铰链区。
在另一优选例中，所述融合多肽进一步可选地包括信号肽和/或连接子(linker)。
在另一优选例中，所述连接子位于所述元件(i)和元件(ii)之间，元件(ii)和元件(iii)之间，元件(i)和铰链区之间，或者铰链区和元件(ii)之间。
在另一优选例中，所述连接子包括柔性连接子或刚性连接子。
在另一优选例中，所述连接子的氨基酸序列如为SEQ ID NO: 7所示。
在另一优选例中，所述融合多肽的结构式如式(I)所示：
X-IL15-L-H-TM-Cyto (I)
其中，
“-”各自独立地为无或连接肽；
X为无或信号肽；
IL15为白细胞介素15元件；
L为无或连接子；
H为铰链区；
TM为跨膜域；
Cyto为胞内域，其中所述胞内域为CD86胞内域。
在另一优选例中，所述跨膜域为CD86跨膜域。
在另一优选例中，所述CD86跨膜域和胞内域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
在另一优选例中，所述铰链区为CD86铰链区，优选地，所述CD86铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
在另一优选例中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
在另一优选例中，所述工程化TIL细胞具有选自下组的一个或多个性能：
(1) 增强的识别和杀伤肿瘤细胞的能力；
(2) 减少激活的TIL细胞间相互识别和杀伤的能力；
(3) 扩大的TIL细胞识别靶抗原谱；
(4) 有效防止肿瘤的免疫逃逸和复发。
在本发明第二方面，提供了一种激活型融合蛋白，所述激活型融合蛋白包括：
(1) 胞外结构域，所述胞外结构域包含DAP10元件或其活性片段；
(2) 跨膜域；和
(3) 胞内信号域，所述胞内信号域包含DAP10胞内结构域和CD3ζ；
其中，所述胞外结构域和胞内信号域，通过所述跨膜域串联在一起。
在另一优选例中，在胞内信号域中，DAP10胞内结构域和CD3ζ直接相连或通过连接肽连接。(较佳地，所述连接肽的长度为1-10aa，较佳地1-6aa，更佳地1-3aa)。
在另一优选例中，所述胞内信号域进一步包括共刺激域。
在另一优选例中，所述胞内信号域进一步包括一个、两个或多个共刺激域。
在另一优选例中，所述共刺激域为来自选自下组的蛋白的共刺激域：CD28、CD27、4-1BB、CD40、OX40、或其组合。
在另一优选例中，所述的共刺激域位于DAP10胞内结构域和CD3ζ之间，和/或位于CD3ζ的C端。
在另一优选例中，在胞内信号域含有额外的共刺激域时，DAP10胞内结构域和所述共刺激域之间，和/或CD3ζ与所述共刺激域之间，可直接相连或通过连接肽连接；较佳地，所述连接肽的长度为1-10aa，更佳地1-6aa，最佳地1-3aa。
在另一优选例中，所述的融合蛋白还含有位于N端的信号肽。
在另一优选例中，所述的信号肽选自下组：DAP10信号肽、CD8a信号肽、CD28信号肽。
在另一优选例中，所述的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中第1-18位所示。
在另一优选例中，所述的胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中第19-48位所示。
在另一优选例中，所述的跨膜域为来自DAP10、CD8a、或CD28的跨膜域。
在另一优选例中，所述的跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中第49-69位所示。
在另一优选例中，所述的胞内信号域中的DAP10胞内结构域的氨基酸序列如SEQID NO: 1中第70-92位所示。
在另一优选例中，所述的胞内信号域中CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中第93-206位所示。
在另一优选例中，所述的胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中第70-206位所示。
在另一优选例中，所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
在另一优选例中，所述融合多肽具有选自下组的一个或多个性能：
(a) 所述融合蛋白具有与NKG2D结合的功能；
(b) 激活T细胞(TIL细胞)；
(c) 激活NK细胞。
在另一优选例中，所述激活为自激活(即表达该膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白的免疫细胞被激活)。
在另一优选例中，所述激活的免疫细胞(T细胞、NK细胞)，可通过NKG2D-NKG2DLs的相互作用对靶细胞进行有效杀伤。
在本发明的第三方面，提供了一种滞留型融合蛋白，所述滞留型融合蛋白包括：NKG2D胞外区和KDEL序列。
在另一优选例中，所述滞留型融合蛋白的所述KDEL序列位于NKG2D胞外区的C端。
在另一优选例中，所述滞留型融合蛋白中，NKG2D胞外区如SEQ ID NO: 2中第22-156位所示。
在另一优选例中，所述NKG2D胞外区和KDEL序列直接相连或通过连接肽连接；较佳地，所述连接肽的长度为1-15aa，更佳地1-10aa，最佳地1-5aa。
在另一优选例中，所述KDEL序列位于SEQ ID NO: 2中第157-160位。
在另一优选例中，所述滞留型融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
在另一优选例中，所述滞留型融合蛋白还进一步包括信号肽；优选地为CD8a信号肽；更优选地所述信号肽如SEQ ID NO: 3所示。
在另一优选例中，所述滞留型融合蛋白的可与内源的NKG2DL结合，使内源NKG2DL滞留在细胞内。
在本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第二方面所述的激活型融合蛋白和/或本发明第三方面所述的滞留型融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第二方面所述的激活型融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第三方面所述的滞留型融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第二方面所述的激活型融合蛋白和本发明第三方面所述的滞留型融合蛋白。
在另一优选例中，所述激活型融合蛋白和滞留型融合蛋白之间通过可断裂连接肽相连。
在另一优选例中，所述可断裂连接肽为自剪切肽；优选的自剪切肽选自下组：T2A肽，P2A肽，或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物包含第一表达盒，所述第一表达盒包含本发明第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的第一表达盒还含有启动子。
在另一优选例中，所述启动子与所述多核苷酸操作性连接。
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、诱导型启动子或其组合。
在另一优选例中，所述启动子包括缺氧响应型启动子。
在另一优选例中，所述缺氧响应型启动子为包含n个缺氧反应元件HRE的启动子，即含n×HRE元件的启动子，n为选自1～20的整数。
在另一优选例中，n为选自2～9的整数；更佳地，n为选自2～4的整数；最佳地，n为3。
在另一优选例中，所述缺氧响应型启动子选自下组：含n×HRE元件的TK-mini启动子、含n×HRE元件的CMV-mini启动子、含n×HRE元件的IL2-mini启动子。
在另一优选例中，所述缺氧响应型启动子为3×HRE TK-mini启动子。
在另一优选例中，所述核酸构建物进一步包含分子开关元件序列，所述分子开关元件选自下组：hEGFRt、BCMA、CD20。
在另一优选例中，所述分子开关元件为hEGFRt。
在另一优选例中，所述分子开关元件通过可断裂连接肽序列与第一表达盒相连。
在另一优选例中，所述可断裂连接肽为自剪切2A肽；优选地为T2A肽。
在另一优选例中，所述核酸构建物包含第二表达盒，所述第二表达盒包含第二启动子和分子开关元件编码序列。
在另一优选例中，所述第二启动子为SFFV启动子。
在本发明的第六方面，提供了一种载体，所述载体包含如本发明第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体包括：慢病毒载体、腺病毒载体、黄热病毒载体。
在另一优选例中，所述载体为质粒。
在本发明的第七方面，提供了一种组合物，所述组合物包含本发明第一方面所述的工程化TIL细胞、本发明第二方面所述的激活型融合蛋白、本发明第三方面所述的滞留型融合蛋白、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的核酸构建物、和/或本发明第六方面所述的载体，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物包含本发明第一方面所述的工程化TIL细胞和药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的工程化TIL细胞、本发明第二方面所述的激活型融合蛋白、本发明第三方面所述的滞留型融合蛋白、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的核酸构建物、本发明第六方面所述的载体、和/或本发明第七方面所述的组合物。
在另一优选例中，所述试剂盒，包含本发明第一方面所述的工程化TIL细胞，或用于制备本发明第一方面所述的工程化TIL细胞的试剂，其中，所述试剂选自下组：
(Y1) 一多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的激活型融合蛋白和所述的滞留型融合蛋白；或
(Y2) 一载体，所述载体包含：编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
在本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的工程化TIL细胞、本发明第二方面所述的激活型融合蛋白、本发明第三方面所述的滞留型融合蛋白、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的核酸构建物、本发明第六方面所述的载体、本发明第七方面所述的组合物、和/或本发明第八方面所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或***。
在另一优选例中，提供了本发明所述的工程化TIL细胞、或所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于***。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：肺癌，***，胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、和头颈癌。
在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明第一方面所述的细胞和/或本发明第七方面所述的组合物。
在另一优选例中，所述受试者为人或哺乳动物。
在另一优选例中，所述疾病为肿瘤或癌症。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：肺癌，***，胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、和头颈癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的工程化TIL杀伤肿瘤细胞的示意图。
图2显示了本发明的055、073、076和083构建物的结构示意图。
图3显示了用流式检测慢病毒感染TIL阳性率的检测结果，其中TIL mock为对照TIL。横坐标代表相对荧光强度，梯形表示阳性细胞的比例。
图4显示了各组TIL细胞增殖能力的检测结果，其中TIL-MOCK为对照TIL。
图5显示了各组TIL细胞活率的检测结果，其中TIL-MOCK为对照TIL。
图6显示了各组TIL细胞的干性细胞占比检测结果，其中TIL-MOCK为对照TIL。横纵坐标代表相对荧光强度，Q2区域表示CD45RA和CD62L双阳性细胞的比例，指征干性T细胞的比例。
图7显示了各组TIL细胞的IFN-γ分泌量检测结果，其中Ctr MOCK为对照TIL。
图8显示了各组TIL细胞与肿瘤细胞(HELA)按3:1比例共培养24小时后进行显微镜观察的图片，其中TIL-MOCK为对照TIL。
图9显示了各组TIL细胞对肿瘤细胞(HELA)的细胞杀伤实验结果，其中HELA only为仅有肿瘤细胞，TIL-MOCK为对照TIL。
图10显示了各组TIL细胞对肿瘤细胞(A-375 B2M KO)的细胞杀伤实验结果。
图11显示了本发明的分子开关的作用效果。横坐标代表相对荧光强度，(Q2+Q3)区域表示凋亡细胞的比例。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，本发明人首次提供了一种工程化TIL细胞，其细胞表面含有外源的膜结合型的DAP10-CD3ζ融合蛋白，其内质网或高尔基体中含有滞留型融合蛋白。本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白(激活型融合蛋白)在TIL细胞中表达，可出乎意料地有效启动TIL细胞的活化，从而对肿瘤细胞进行更有效杀伤。具体地，当本发明的工程化TIL细胞通过其表面的NKG2D识别肿瘤细胞表面的NKG2DL后，可以进一步地通过本发明的融合蛋白有效激活TIL细胞活化，从而使得TIL细胞对肿瘤细胞进行有效杀伤。实验表明，本发明的滞留型融合蛋白可有效地被内质网滞留，从而将TIL细胞内源表达的NKG2DL滞留在细胞内，避免了TIL细胞间的相互杀伤，防止TIL细胞培养过程中的脆性发生，从而显著提高TIL细胞的活力。本发明的工程化TIL细胞可用于***。在此基础上完成了本发明。
DAP10
DAP10广泛表达于免疫细胞，在进化过程中高度保守，并通过与NKG2D等细胞受体结合后发挥其独特的细胞内信号传导功能。DAP10通过其YINM基序传导细胞激活信号，在T细胞中提供共刺激信号。
人的DAP10的氨基酸序列登录号为GenBank: AAD46986.1，具有92个氨基酸，如SEQID NO: 1中第1-92位所示。DAP由信号肽(1-18位)、胞外域(19-48位)、跨膜域(49-69位)及胞内结构域(70-92位)等多部分组成，其中胞内结构域包含一个YINM基序。
哺乳动物(尤其是灵长动物)的DAP10的序列存在高度同源性，功能类似。人与非人灵长类DAP10同源性高达90-100%，人与啮齿类DAP10的同源性在约80%。
在本发明中，DAP10包括野生型和突变型的DAP10，只要突变型DAP10保留或基本保留野生型DAP10的功能，如保留≥50％(较佳地≥60％，≥70％，≥80％，≥90%，甚至≥100%(如100-200％))的野生型DAP10功能。应理解，本发明中，DAP10还包括突变的功能超过野生型DAP10的突变蛋白，例如具有≥100%(如100-200％)的野生型DAP10功能的突变型DAP10。
在本发明中，DAP10的突变可以是天然发生或人工引入的。
NKG2D和NKG2DL
NKG2D是一种在NK细胞、NKT和CD8+T细胞表面表达的激活性受体，在天然免疫中发挥着重要的作用，参与多种免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。NKG2D 配体(NKG2DL)家族蛋白，主要包括六种巨细胞病毒UL16结合蛋白1-6和MHC I链相关分子A和B(MICA、MICB)。NKG2DL在正常细胞中基本不表达，在不同来源的各种肿瘤(包括但不限于结直肠癌、肝癌、脑胶质瘤等)细胞表面具有高水平的表达。
NKG2D是与DAP10相关的受体，该受体复合物是一个六聚体，由一个NKG2D同型二聚体和两个DAP10同型二聚体组成。
NKG2D与肿瘤细胞表面NKG2DL结合后，NKG2D同源二聚体跨膜区域的带电氨基酸残基通过两个盐桥连接到DAP10的TM残基上，形成六聚体结构，继而诱导细胞质中YINM 基序的磷酸化，然后激活下游磷酸肌醇3激酶(PI3K)信号通路，传递活化信号。NKG2D产生的信号可直接激活NK细胞发挥杀伤效应，并作为协同刺激信号促进αβT细胞和γδT细胞的活化并增强其杀伤效应。
NK、NKT细胞能通过NKG2D-NKG2DL结合对肿瘤细胞进行杀伤，CD8+T细胞可以通过NKG2D-NKG2DL识别不表达MHC-I类分子的肿瘤并对其进行杀伤。
然而，TIL细胞本身高表达NKG2D分子，但由于NKG2D下游分子DAP10在T细胞中仅仅起到共刺激信号作用，因此，TIL细胞通过NKG2D-NKG2DL识别肿瘤细胞后由于缺乏T细胞活化的第一信号无法对肿瘤细胞进行有效地杀伤。
在本发明中，提供了一种能通过NKG2D-NKG2DL途径被激活从而杀伤肿瘤细胞的工程化TIL细胞。
本发明的DAP10和CD3ζ融合蛋白
如本文所用，术语 “本发明的激活型融合蛋白”、“本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白”和“本发明的DAP10和CD3ζ融合蛋白”可互换使用，均指本发明所述的具有T细胞激活功能的DAP10和CD3ζ融合蛋白。本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白，具有来源于DAP10的胞外结构、跨膜域、胞内域和来源于CD3的胞内结构，如CD3ζ。
在本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白中，其跨膜区可以是来自DAP10的跨膜区、CD3的跨膜区、或来自于其他膜蛋白的跨膜区、或人工合成的跨膜区。
此外，在本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白中，其胞外结构与跨膜区之间可以含有或不含有绞链区或额外的连接区，其胞内结构(如CD3ζ)与跨膜区之间可以含有或不含有额外的连接区。
在一优选例中，本发明膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白的胞外结构和跨膜区均来自DAP10蛋白，优选来自人DAP10蛋白，如来自人DAP10蛋白的第1-69位氨基酸。
典型地，本发明的激活型融合蛋白包括以下元件：
(1) DAP10元件或其活性片段；和
(2) 胞内信号域，所述胞内信号域来源于DAP10胞内段和CD3ζ。
在另一优选例中，本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白包括从N端到C端串联的(1) 来源于DAP10元件或其活性片段的胞外结构、跨膜域及胞内结构域；和(2)来源于CD3ζ的胞内信号域。
在一个实施方案中，所述胞内信号域可选地进一步包括共刺激分子；所述共刺激分子选自下组：CD28、CD27、4-1BB、CD40、OX40。
本发明优选的激活型融合蛋白的氨基酸序列如下所示：
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQDGKVYINMPGRGMRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:1)；
其中，信号肽序列如SEQ ID NO: 1中第1-18位所示，胞外结构域的序列如SEQ IDNO: 1中第19-48位所示，跨膜域序列如SEQ ID NO: 1中第49-69位所示，DAP10胞内域序列如SEQ ID NO: 1中第70-92位所示，CD3ζ序列如SEQ ID NO: 1中第93-206位所示。
本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白，可作为TIL细胞活化的信号。具体地，在TIL细胞的NKG2D与肿瘤细胞表面的NKG2DL结合后，可高效地通过本发明膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白成功激活TIL细胞，使其能对肿瘤细胞进行杀伤。
本发明的滞留型融合蛋白(tNKG2D-KDEL)
NKG2D配体(NKG2DL)不仅在肿瘤细胞表面高表达，在活化的TIL细胞上也会短暂表达，使得活化的TIL细胞间会互相识别和杀伤。
在本发明中，提供一种结构独特的滞留型融合蛋白(简称为“本发明的滞留型融合蛋白”)，其包括串联在一起的NKG2D胞外区元件和KDEL元件。
本发明的滞留型融合蛋白可将T细胞(如TIL细胞)产生的内源性NKG2DL滞留在胞内，而减少出现在TIL细胞表面的NKG2DL，甚至消除出现在TIL细胞表面的NKG2DL。
在本发明中，KDEL是Lys-Asp-Glu-Leu(也称为KDEL信号序列)，通常位于蛋白的羧基端(C端)。KDEL序列在高尔基体的膜上有相应的受体，一旦进入高尔基体就会被高尔基体上的受体结合，形成回流小泡被运回内质网，将KDEL序列称为内质网滞留序列。
优选地，本发明提供了一种在TIL细胞内表达的滞留型融合蛋白，所述滞留型融合蛋白将NKG2D的胞外区与KDEL信号序列融合，形成tNKG2D-KDEL蛋白。
在TIL细胞激活后，短暂表达的内源NKG2DL，会与本发明滞留型融合蛋白中的NKG2D胞外区特异性结合，从而被滞留在内质网内，从而避免或消除所表达的内源NKG2DL出现在TIL细胞膜上。这样，可以有效防止TIL细胞间相互识别和杀伤，减少细胞脆性发生，从而提高TIL细胞活率。
本发明的一种代表性的滞留型融合蛋白的氨基酸序列如下所示：
MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVKDEL (SEQ ID NO: 2)；
其中，SEQ ID NO:2中第22位-第156位为NKG2D胞外区序列；第157位-第160位为KDEL序列。
优选地，本发明的滞留型融合蛋白还含有信号肽序列。优选的信号肽为CD8a信号肽，其序列为MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 3)。
本发明的核酸构建物
如本文所用，本发明的核酸构建物可表达本发明的融合蛋白和/或滞留型融合蛋白。本发明的核酸构建物包含编码本发明的融合蛋白和/或滞留型融合蛋白的序列，以及可选地包括缺氧响应型启动子。
本发明的缺氧响应型启动子为包含n个缺氧响应型元件HRE的启动子，即n×HRE启动子。缺氧是实体瘤的标志性特征，可利用这种独特的环境信号进行癌症靶向治疗，使目的基因在肿瘤微环境中高表达而在正常组织中不表达或低表达，最大限度发挥外源基因的功能同时降低可能带来的副作用。本发明在构建表达本发明的融合蛋白的核酸分子时，采用了缺氧响应型启动子，以在缺氧的环境下表达本发明的融合蛋白。构建本发明的缺氧响应型启动子的启动子种类无特别限制，优选地，本发明采用的是含n×HRE的TK mini启动子。
优选地，本发明采用的是3×HRE-TK-mini启动子。
在一个实施方式中，本发明的核酸构建物还包含分子开关元件(又称免疫刹车元件)。当表达的核酸构建物的细胞出现安全风险时，所述分子开关元件可作为靶点，利用相应的药物将有风险的细胞清除。
在一个实施方式中，本发明的分子开关元件可通过可断裂连接肽与第一表达盒连接；优选地，所述可断裂连接肽为自剪切肽；优选地，所述自剪切肽选自：T2A、P2A、或其组合。
在一个实施方式中，本发明的分子开关元件位于第二表达盒，通过第二启动子控制分子开关元件的表达。在一个实施方式中，所述第二启动子为SFFV启动子，SFFV是组成型启动子，可稳定且高水平地启动分子开关元件的表达。在一个实施方式中，所述第二表达盒中包含第二信号肽。
在一个实施方式中，本发明的分子开关或免疫刹车元件为hEGFRt。当含有本发明的核酸构建物的细胞出现安全风险，可注射hEGFRt治疗性单抗西妥昔单抗，通过ADCC、CDC作用清除目标细胞，进一步提高了安全性；同时也可以利用hEGFRt分子的流式检测，指示目的基因整合的细胞阳性率。
膜结合型IL-15
在本发明的核酸构建物中，优选地还含有第三表达盒，所述第三表达盒表达膜结合型IL-15(mIL-15)，即包含IL-15、跨膜域和胞内域的融合蛋白。在另一优选例中，所述膜结合型IL-15也通过可断裂连接肽与第一表达盒连接。
白细胞介素IL-15是一种促生存细胞因子，它能维持长寿命CD8+记忆T细胞稳态、抑制活化诱导的细胞死亡(AICD)、增强体内抗肿瘤活性并逆转T细胞无能。单体IL-15是一种小的不稳定蛋白，具有较短的血清半衰期，需要超生理给药才能获得体内反应。在本发明中，将IL-15与跨膜域和胞内域连接，获得膜结合的IL-15，具有维持记忆干细胞表型的长期持久性的功能。优选的所述胞内域为CD86胞内域，优选的所述跨膜域为CD86跨膜域。
所述膜结合型IL-15能提高干性T细胞的比例，减少T细胞耗竭分子的表达。
所述膜结合型IL-15可进一步包括铰链区、信号肽和/或连接子。优选地，所述膜结合型IL-15的结构式如式(I)所示：
X-IL-15-L-H-TM-Cyto (I)
其中，
“-”各自独立地为无或连接肽；
X为无或信号肽；
IL-15为白细胞介素15；
L为无或连接子；
H为铰链区；优选的铰链区为CD86铰链区；
TM为跨膜域；优选的跨膜域为CD86跨膜域；
Cyto为胞内域，优选的胞内域为CD86胞内域。
本发明的载体
在本发明中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指其他DNA区段可以连接入其中的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中其他DNA区段可以连接入病毒基因组。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制，如不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链中由DNA和RNA构成的多核苷酸、聚-赖氨酸-偶联的DNA或RNA、肽-偶联的DNA或RNA、脂质体-偶联的DNA等。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。这类载体在本发明中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
如本文所用，“本发明的载体”是指含有本发明的核酸构建物的载体。优选地，本发明的载体为质粒。
本发明的工程化TIL细胞
如本文所用，术语“本发明的工程化TIL细胞”或“本发明的TIL细胞”可互换使用，均指能表达本发明的融合蛋白的TIL细胞和/或含有本发明的载体的TIL细胞。本发明的TIL细胞识别和杀伤肿瘤细胞的示意图如图1所示。
本发明的工程化TIL细胞表达作为活化信号的本发明的DAP10和CD3ζ融合蛋白。本发明的工程化TIL细胞的NKG2D与肿瘤细胞表面的NKG2DL结合后，可被DAP10和CD3ζ融合蛋白成功激活，以对肿瘤细胞进行杀伤。
在一个实施方案中，本发明的工程化TIL细胞进一步表达本发明的NKG2D的胞外区与KDEL序列融合的滞留型融合蛋白，TIL细胞表面激活后短暂表达的内源NKG2DL与滞留型融合蛋白中的NKG2D区特异性结合，从而被滞留在内质网内，而不是表达在TIL细胞膜上，防止TIL细胞间相互识别和杀伤，减少细胞脆性发生，提高细胞活率。
在一个实施方案中，本发明的工程化TIL细胞进一步表达本发明的膜结合型IL-15。
在一个实施方案中，本发明的工程化TIL细胞进一步表达本发明的分子开关元件。当本发明的工程化TIL细胞出现安全风险时，所述分子开关元件可作为靶点，利用相应的药物将有风险的细胞清除。本发明的分子开关元件选自下组：hEGFRt、BCMA、CD20。优选地，本发明的分子开关元件为hEGFRt。
本发明的药物组合物
本发明的药物组合物可以包含本发明的融合蛋白或者本发明的免疫效应细胞(如本发明的工程化TIL细胞)和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂。这些组合物可以适合在本文所述的治疗性适应症的治疗中使用。
所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂或粉末，并且可以和药学上可接受的载体配制。所述组合物可以使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。“药学上可接受的载体”是指不会干扰活性成分的生物活性的有效性并且不对所述宿主或者受试者产生毒性的载体基质或者媒介物(vehicle)。
融合蛋白或免疫效应细胞可以和药学上可接受的媒介物一起输送。在一个实施例中，媒介物可以增强稳定性和/或输送性质。媒介物如人造膜囊泡(包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊(noisome)、纳米微脂囊等)、微粒或者微胶囊、或者包含药学可接受的聚合物的胶体制剂。
包含一种或者多种融合蛋白或免疫效应细胞的药物组合物可以根据本领域已知的方法并且使用适当的一种或者多种分散试剂或润湿试剂和/或悬浮试剂配制成无菌可注射水性或者油质悬浮液。所述无菌可注射制剂可以是在非毒性的亲本可接受的稀释剂或者溶剂中的无菌可注射溶液或者悬浮液。
在本发明中，术语“佐剂”通常是指辅助或调节药物作用的任何物质，包括但不仅限于免疫学佐剂，它使对抗原的免疫反应增强或免疫反应多样化。
在本发明中，术语“受试者”可以是需要治疗的哺乳动物，如人类或兽医学患者(例如，啮齿类动物， 如小鼠或者大鼠、猫、狗、奶牛、马、绵羊、山羊，或其他牲畜)。在一些实施方式中，“受试者” 可以是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等等。所述受试者可能被怀疑患有以细胞增殖为特征的疾病或者具有患上以细胞增殖为特征的疾病、被诊断为患有以细胞增殖为特征的疾病、或者是被证实不患有以细胞增殖为特征的疾病的对照受试者，如本文所述，用于以细胞增殖为特征的疾病的诊断方法和这种诊断的临床划分对于本领域技术人员是已知的。
本发明的药物组合物可用于***。在本发明中，术语“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。肿瘤的例子包括但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌和黑素瘤。“肿瘤细胞”进一步可以包括“实体瘤”，其指的是选自下组的肿瘤：胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、***癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、以及头颈癌。
本发明的主要优点包括：
(1) 本发明的工程化TIL细胞表面的NKG2D识别肿瘤细胞表面的NKG2DL后，可被本发明的DAP10和CD3ζ的融合蛋白有效地激活，从而使TIL细胞能对肿瘤细胞进行有效杀伤。
(2) 本发明的工程化TIL细胞激活时表达的内源NKG2DL可被本发明的滞留型融合蛋白滞留在细胞内，避免了TIL细胞间的相互杀伤，防止TIL细胞培养过程中的脆性发生，提高TIL细胞的活率。
(3) 本发明的工程化TIL细胞不仅可以通过TCR识别肿瘤细胞MHC-I分子递呈抗原肽对肿瘤细胞杀伤，还可以通过NKG2D-NKG2DL途径对肿瘤进行杀伤，增加了传统TIL细胞对肿瘤细胞的广谱识别能力，从而增强TIL细胞的杀伤能力，并有效防止实体肿瘤的免疫逃逸和复发。
(4) 本发明的工程化TIL细胞还可表达构建了含CD86胞内域的膜结合的IL-15的融合蛋白，使得TIL细胞的干性、杀伤持久性显著提升。
(5) 本发明的工程化TIL细胞可通过缺氧响应型启动子在实体瘤标志性的缺氧环境下诱导表达本发明的融合蛋白。
(6) 本发明的工程化TIL细胞还可表达免疫分子开关，如hEGFRt，避免了外源蛋白持续表达的潜在毒性，提高了临床治疗的安全性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数是重量百分比和重量分数。
下述实施例中涉及的序列信息如表A所示：
表A 各元件的核苷酸或氨基酸序列
实施例1：制备含目的基因的TIL细胞
1. 质粒构建
在NCBI上获得IL-15、DAP10、NKG2D、CD3ζ及EGFR胞外段第三和第四结构域的CDS序列，并对部分序列进行密码子优化。
如图2所示，分别构建055、073、076、083四种构建物。各构建物的分子序列由金斯瑞公司全基因合成，合成的基因序列克隆到基础载体pLV-EF1a-c-MYC-IRES-EGFP(购自武汉淼灵)中，得到055、073、076、083质粒。
2. 转化与质粒提取
Trans109感受态细胞从-80℃拿出，迅速***冰中，待融化后，加入目的质粒(055、073，076，083)并混匀，冰中静置25分钟。42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟。加入700 μl不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃、200 rpm复苏70分钟。5000 rpm离心1分钟收集菌体，并涂布到含相应抗生素的LB培养基上，放于37℃培养箱过夜。挑取单克隆加入到1ml含有抗生素的LB培养液中，37℃、200 rpm，2小时。将上述培养液扩大培养过夜。150ml过夜培养的菌液，在5,000 g离心力下离心10分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。用14ml溶液P1重悬菌体沉淀至彻底悬浮。加14 ml的溶液P2，使菌体充***解。加14 ml预冷的溶液P3至出现黄色絮状沉淀，离心5分钟。收集过滤液，在过滤液中加入14ml质粒DNA结合液，混匀。离心2分钟，去混合液。加入10ml质粒洗涤液，离心2分钟，弃废液。加入10ml质粒DNA洗涤液2(添加无水乙醇)，离心2分钟，弃掉废液。重复上一步。去除残留乙醇，洗脱质粒DNA。通过内毒素去除柱，离心1分钟洗脱无内毒素的质粒DNA。将得到的质粒转移到1.5ml离心管。
3. 慢病毒制备
将步骤2中获得的含mIL-15基因的pLV-HRE-mIL-15(055、073、076、083)质粒、psPAX2载体和pMD2.G载体分别大提纯化质粒；质粒按比例使用Lipo3000混合后，转染汇合率约80%的HEK-293T细胞(100 mm皿培养)，转染体系配置如下：(1)离心管A：Opti-MEM 500μl+主质粒10 μg+pMD2.G 5 μg+psPAX2 5 μg+p3000 40 μl；(2)离心管B：OPti-MEM 500 μl+lipo3000 40 μl。将离心管B中的混合液缓慢滴入离心管A中，混合后室温静置15~20 min；
在HEK-293T细胞中加入转染体系，转染4 h后，弃上清，每皿加入10 ml DMEM完全培养基；放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养；48 h后，收集转染的293T细胞培养上清；400g离心5 min；用0.45 µm滤器过滤，获得的滤液即为重组慢病毒的原溶液；使用Utra-15离心过滤装置浓缩慢病毒，5000 rpm离心50 min；将浓缩后的慢病毒进行分装，置于-80℃冰箱保存，备用。
4. 慢病毒滴度测定
对清洗、消化后的HEK-293T细胞进行细胞计数。10倍梯度稀释(50×，500×，5000×，50000×)稀释慢病毒浓缩原液。取2.5×105个HEK-293T细胞加入到对应的离心管中，每个离心管为500 μl培养基-病毒-细胞混合液，混匀后转移至24孔板中；放入37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，更换培养基；48 h后，收集感染后HEK-293T细胞进行缺氧处理，使用流式细胞仪检测转基因表达阳性的细胞比例，计算病毒滴度。慢病毒滴度计算方式：病毒滴度= (m×2.5×105×稀释倍数)/转染的体积，其中m为转基因表达阳性的细胞比例。
5. TIL细胞的制备
将肿瘤块置于10 cm培养皿中，PBS清洗；用无菌的眼科剪或手术刀将肿瘤块上的坏死区和***去除，然后剪成1-3 mm3小块；将肿瘤块(如肺癌)放在含10%AB血清、1%谷氨酰胺、1%双抗、6000IU/mL IL-2的RPMI培养基中培养。在显微镜下观察细胞如无明显贴壁细胞，隔天进行换液；若淋巴细胞无逐渐增多或癌细胞无减少则继续换液；若淋巴细胞密度明显增多如有细胞团出现，则进行扩孔后置于37℃，5% CO2培养温箱继续培养；持续培养不超过10天，进行TIL细胞收集。收集的细胞悬液，使用40 µm滤网进行过滤，去除肿瘤块；1000rpm离心5 min，加入适量REP完全培养基重悬，备用。
6. 获得慢病毒感染后的TIL细胞
根据慢病毒的滴度，以MOI=10感染TIL细胞；将慢病毒(MOI=10)、Lentiboost(100×)、TIL细胞(3.5×105)加入REP培养基中，每个离心管为200 μl培养基-病毒-细胞混合液，混匀后转移至48孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养；感染24 h后，收集细胞，1000rpm离心，弃掉病毒液；加入适量REP(AIM V培养基:A1640培养基=1:1)完全培养基重悬，转移至24孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养，培养72 h后，收集细胞。
取1×106个上述细胞转移到新的24孔板，随后放入缺氧小室(氧浓度为1%)中进行缺氧处理(实验组)；剩余TIL细胞(作为未缺氧的对照组)转移到新的24孔板，置于37℃、5%CO2培养箱培养。包含055、073、076、083构建物的慢病毒分别感染得到的TIL细胞分别命名为055TIL、073TIL、076TIL和083TIL。
实施例2：流式检测慢病毒感染TIL阳性率
取实施例1中制备的各种细胞，每组分别分成两份：全阴性组和待检测组，每组细胞体积50μl，即2.5×105个细胞；向待检测组加入IL-15抗体(北京百新意生物科技有限公司，A09D21-9E)、室温孵育15min；孵育结束后，加入1 ml含2% FBS的PBS，400g离心5min；弃上清，向待检测组细胞中加入50 µl使用含2% FBS的PBS配制的FITC 山羊抗人IgG Fcγ抗体(BioLegend, 398006)抗体混合液，室温孵育10 min；加入1 ml含2% FBS的PBS，400g离心5 min；弃上清，向待检测组细胞中加入50 µl使用含2% FBS的PBS配制的7-AAD混合液，室温孵育7 min；向全阴性组和待检测组中加入1 ml含2% FBS的PBS，400g离心5 min；弃上清，加入200 µl含2% FBS的PBS重悬细胞，上机检测。
检测结果如图3所示。流式数据显示，055、073、076、083TIL的阳性率分别为：30.8%、24.5%、27.7%、32.7%，均呈现较高的阳性率，其中083TIL的阳性率(32.7%)出乎意料地高于其他TIL。
实施例3：检测各TIL细胞的增殖能力与活率
各组TIL细胞与滋养层细胞(IL-21 NK细胞扩增试剂，中赢生物，货号ZY-NKZ-0104)按照1:25培养，调整细胞密度为5×105个细胞/ml，用REP培养基(RPMI 1640:AIM-V=1:1)进行培养，6孔板，2ml/孔，每隔两天进行细胞计数；补充新鲜的培养基调整细胞密度为5×105个细胞/ml，连续培养14天，进行细胞计数、活率和干性测定。
增殖能力检测结果如图4所示。对照TIL、055TIL、073TIL、076TIL和083TIL培养14天的增殖倍数分别为220、203、57、167、198倍。055TIL和083TIL与对照TIL的增殖能力基本一致，076TIL增殖倍数稍微降低，而073TIL增殖倍数明显降低，远远低于其他组TIL增殖倍数。
细胞活率检测结果如图5所示。对照TIL、055TIL和083TIL的活率很高，分别为95%、94%、94%；076TIL活率略微降低85%；073TIL的活力明显降低，细胞扩增受到严重影响，活率只有71%。
实施例4：检测各TIL细胞的干性细胞占比
取实施例1中制备的各组细胞，每组分别分成两份：全阴性组和待检测组，每组细胞体积50μl，即2.5×105个细胞；向待检测组加入50 µl使用含2% FBS的PBS配制的AlexaFluor® 700 抗人CD45RA抗体(BioLegend, 304120)、APC 抗人CD62L抗体(BioLegend,304810)、抗体混合液，室温孵育8 min；向待检测组细胞中加入50 µl使用含2% FBS的PBS配制的7-AAD混合液，室温孵育7 min；向全阴性组和待检测组中加入1 ml含2% FBS的PBS，400g离心5 min；弃上清，加入200 µl含2% FBS的PBS重悬细胞，上机检测。
检测结果如图6所示。用CD45RA和CD62L双阳性细胞的比例指征干性T细胞比例，相对于未感染TIL细胞(对照TIL)，干性细胞比例从6.37%分别提高到11%(055TIL)、10.3%(076TIL)、9.71%(083TIL)。
这说明，本发明的膜结合型的IL-15构建物使TIL细胞中的干性T细胞的比例显著提升。此外，含有膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白时，对于干性T细胞的比例基本没有影响。
实施例5：检测各TIL细胞的IFN-γ分泌量
按照TIL:肿瘤细胞=3:1与高表达NKG2DL的CALU6、HELA、HCC827分别共培养18小时，收集上清，用IFN-γELISA检测试剂盒(人IFN-γ预制ELISA试剂盒，达科为，2307-3)，操作按试剂盒说明书进行检测：加样：加入稀释后的细胞因子标准品至标准品孔，100 µl/well，用稀释缓冲液R (1×)稀释样本，加入样本至样本孔，100µl/well。盖上封板膜，室温孵育2小时。洗板：扣去孔内液体，加入1×洗涤缓冲工作液，300 µl/well；停留1分钟后弃去孔内液体。重复3次，每一次在滤纸上扣干。加检测抗体：加入生物素化的抗体工作液，100 µl/well。盖上封板膜，室温孵育1小时。重复洗板。加酶：加入链霉亲和素-HRP工作液，100 µl/well。盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育30分钟。重复洗板。显色：加入TMB，100 µl/well，室温，避光孵育5-30分钟，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20分钟可以达到很好的效果。终止反应：迅速加入终止液，100 µl/well，终止反应。酶标仪450nm读取OD值。四参数法分析数据。
结果如图7、表1-3所示。076TIL和083TIL与多种肿瘤细胞共培养后IFN-γ的分泌量远远高于未感染对照TIL及055TIL。
表1 各组TIL分子与CALU6细胞共培养的IFN-γ分泌量(pg/ml)
表2 各组TIL分子与HELA细胞共培养的IFN-γ分泌量(pg/ml)
表3 各组TIL分子与HCC827细胞共培养的IFN-γ分泌量(pg/ml)
上述结果说明，与仅通过TCR识别肿瘤细胞的055TIL相比，本发明的表达膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白的076TIL和083TIL，不仅仅可以利用TCR识别肿瘤细胞，更能够更高效利用NKG2D-NKG2L途径激活TIL细胞。同时，083通过内质网滞留技术防止TIL的脆性，使083TIL的活率高于076TIL，在与靶细胞共培养的过程中更容易被激活，因此体现出更高的IFN-γ分泌量。
实施例6：各TIL的体外杀伤实验结果
取1×105个肿瘤细胞Calu-6(ATCC，HTB-56™)、HELA(ATCC， CRM-CCL-2™)、HCC827(CRL-2868)和A-375 B2M KO(广州源井，货号：YKO-H486)分别接种于24孔板。24h后稀释TIL细胞，使其密度为1.5×106/ml。吸弃24孔板原孔中的培养液。每孔加入1ml TIL细胞液。24小时后，吸走孔中培养液，离心后细胞上清用于ELISA检测。PBS清洗孔中细胞，CCK8法检测肿瘤细胞活性。
各组TIL与肿瘤细胞(HELA)按3:1比例共培养24小时后，进行显微镜观察、拍照。结果如图8所示：单独HELA、HELA与对照TIL共培养实验组，HELA细胞生长状态良好，细胞呈致密单层生长，HELA+055TIL实验组HELA细胞生长缓慢，未能长满细胞培养孔、部分细胞变圆、脱落；HELA+076TIL和083TIL实验组HELA细胞大面积变圆、脱落。
各组TIL对HELA肿瘤细胞在E:T=3:1时的杀伤活性的检测结果如图9和表4所示，与对照TIL及055TIL相比，076TIL和083TIL对肿瘤细胞的杀伤能力显著提高，约增高3倍。
表4 不同TIL对HELA细胞杀伤后靶细胞的活细胞比例(%)
各组TIL对A-375 B2M KO肿瘤细胞在E:T分别为1:1、3:1和5:1时的杀伤作用如图10和表5所示。改造后076、083TIL相对于055TIL和未经改造的对照TIL对黑色素瘤细胞系A375(B2M KO)有显著杀伤效果，且成剂量依赖的方式，在高效靶比的条件下，杀伤更为明显，细胞毒性在60%左右(100%减去活细胞比例)。
表5 不同TIL对A-375 B2MKO杀伤后靶细胞的活细胞比例(%)
实施例7：抗体依赖细胞毒性测定(ADCC)
ADCC(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)指抗体的Fab段结合靶细胞表面的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等)表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。EGFR是与西妥昔结合的，通过ADCC作用导致靶细胞死亡，利妥昔不与EGFR结合，不会由ADCC作用引起的细胞死亡，因此可做对照用，证明设计的特异性。
使用NK细胞培养试剂盒(购自福建三一造血技术有限公司，CT-001)按照说明书方法从健康志愿者外周血中分离，扩增获得NK细胞，并用CytoTell Blue标记。用培养基重悬靶细胞(感染076 LV的TIL)，调整细胞密度为5×105细胞/ml，分别取1ml加入到6孔板的3个孔内。分别加入西妥昔单抗(德国默克里昂制药公司)，利妥昔单抗(利妥昔单抗，罗氏诊断，GmbH，H0334)使其浓度为200μg/ml，相同体积PBS，混匀后室温孵育40分钟。用培养基重悬NK细胞，调整细胞密度为5×106/ml，分别取1ml加入到6孔板上述3个孔内，使效靶比达到10:1，同时体系中的西妥昔单抗、利妥昔单抗终浓度为100μg/ml，体系总体积为2mL。将该体系混匀后，置于培养箱内正常培养24小时。24小时后检测细胞凋亡水平(PE偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒，碧迪生物制药，559763)的变化。
结果如图11所示。076TIL加入NK细胞和同时加入利妥昔单抗(识别CD20)凋亡率在5.5~8.1%之间，处于一个比较低的水平，076TIL在NK细胞和西妥昔单抗(识别EGFR)共同存在的条件下，凋亡率在30%左右。实验结果说明hRGFRt能够起到特异性的分子开关作用，提高了临床使用的安全性。
讨论
本发明人首次提供了结构新颖独特的膜结合型的DAP10和CD3ζ的融合蛋白。本发明的膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白可出乎意料地有效启动TIL细胞的活化，从而对肿瘤细胞进行更有效杀伤。
在本发明中，工程化TIL细胞通过其表面的NKG2D识别肿瘤细胞表面的NKG2DL后，可以进一步地通过本发明的融合蛋白有效激活TIL细胞活化，从而使得TIL细胞对肿瘤细胞进行有效杀伤。
以083TIL为例，其利用低氧诱导启动子调控表达本发明的DAP10与CD3ζ融合蛋白。当TIL细胞到达肿瘤组织或其周围时，才表达本发明膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白，并通过NKG2D-NKG2DL识别肿瘤细胞后可以通过DAP10与CD3ζ功能元件启动T活化，对肿瘤细胞进行有效杀伤。
本发明的经改造的TIL细胞不仅仅可以通过TCR识别肿瘤细胞MHC-I分子递呈抗原肽对肿瘤细胞杀伤，也可以通过NKG2D-NKG2DL途径对肿瘤进行杀伤，可以有效防止实体肿瘤的免疫逃逸和复发。
此外，本发明还提供了一种结构新颖独特的滞留型融合蛋白，实验表明，本发明的滞留型融合蛋白可有效地被内质网滞留，从而将TIL细胞内源表达的NKG2DL滞留在细胞内，避免了TIL细胞间的相互杀伤，防止TIL细胞培养过程中的脆性发生，从而显著提高TIL细胞的活率。
另外，本发明的工程化TIL细胞还可进一步表达结构新颖独特的膜结合型的IL-15，从而进一步提高TIL细胞的干性。
另外，本发明的工程化TIL细胞还可进一步表达hEGFRt分子开关(如076TIL)，通过ADCC作用，可特异性的引起相关TIL凋亡，保证了TIL治疗的临床使用安全性，同时也可以利用西妥昔单抗进行流式检测，作为阳性率指标。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞表达选自下组的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滞留型融合蛋白、或其组合；
其中，所述激活型融合蛋白为膜结合型DAP10-CD3ζ融合蛋白；
所述滞留型融合蛋白包括：NKG2D胞外区和KDEL序列。
2. 如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述激活型融合蛋白包括：(1)胞外结构域，所述胞外结构域包含DAP10元件或其活性片段；
(2) 跨膜域；和
(3) 胞内信号域，所述胞内信号域包含DAP10胞内结构域和CD3ζ；
其中，所述胞外结构域和胞内信号域，通过所述跨膜域串联在一起。
3.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述的工程化TIL细胞的细胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化TIL细胞的内质网或高尔基体中具有所述的滞留型融合蛋白。
4.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的激活型融合蛋白和/或所述的滞留型融合蛋白。
5.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞含有一核酸构建物，所述核酸构建物包含第一表达盒，所述第一表达盒包含编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
6.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞含有一载体，所述载体包含：编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
7.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞还表达膜结合型IL-15融合蛋白，其包括以下元件：
(i) 白细胞介素15或其功能活性片段；
(ii) 跨膜域；和
(iii) 胞内域；
其中，所述胞内域为CD86胞内域。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的工程化TIL细胞和药学上可接受的载体。
9. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的工程化TIL细胞，或用于制备权利要求1所述的工程化TIL细胞的试剂，其中，所述试剂选自下组：
(Y1) 一多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的激活型融合蛋白和所述的滞留型融合蛋白；或
(Y2) 一载体，所述载体包含：编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
10.权利要求1所述的工程化TIL细胞、或权利要求9所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于***。
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