CN117487769A - 一种规模化鸡胚源病毒纯化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种规模化鸡胚源病毒纯化方法及其应用。该方法包括：向含有待纯化病毒的鸡胚液中加入病毒杂蛋白去除剂，调节pH值，静置，离心得到上清液，过滤所述上清液，取滤液使用中空纤维或超滤膜包纯化得到纯化病毒液，用病毒洗涤剂洗涤纯化病毒液，即得纯化的鸡胚源病毒。本发明中的纯化方法杂蛋白去除率高、病毒保留率高且纯化成本低，操作简单，能够用于大规模纯化作业。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种规模化鸡胚源病毒纯化方法及其应用。
背景技术
鸡胚是正在发育中的机体，多种动物病毒都能在鸡胚中增殖和传代，因此，可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。鸡胚的优点在于胚胎的组织分化程度低，且可选择不同的日龄和接种途径。在鸡胚中，病毒易于增殖，使得感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，从而容易采集和处理。而且鸡胚来源充足，所需的设备要求低且操作简便易行。
随着技术进步和市场发展，鸡胚胚液病毒(H9系列、H7系列、H5系列等)多联多价疫苗越来越受重视，这对胚液病毒纯化和浓缩技术提出新的更高要求。在胚液流感病毒纯化技术中，目前主要有两条技术路线，一是仅以中空纤维和膜包为代表，根据膜孔径和病毒颗粒大小，通过物理方法除去杂蛋白。二是以层析技术为代表，尤其是离子交换层析为代表，通过带电性质将带有病毒与填料结合，后通过强盐溶液将其置换下来。但这两种技术路线均具有一定弊端。通过中空纤维和膜包以物理方式去除杂蛋白，蛋白去除率低，纯化浓缩效果差。而阴离子交换层析虽然具有蛋白去除率高、纯化浓缩效果好的优势，但该技术受限于材料成本，其价格昂贵，不适用于大规模使用。因此，建立一种新的规模化鸡胚源病毒纯化方法，兼顾操作方便、低成本和杂蛋白去除率高的优势，将对于行业的发展具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种规模化鸡胚源病毒纯化方法及其应用，该方法能够兼具低成本和杂蛋白去除率高的优势，在不影响病毒保留率的情况下，以极简易的方式即可获得纯化的鸡胚源病毒。
本发明的第一个方面，提供一种鸡胚源病毒的规模化纯化方法，包括以下步骤：
向含有待纯化病毒的鸡胚液中加入病毒杂蛋白去除剂，调节pH值，静置，离心得到上清液，过滤所述上清液，取滤液使用中空纤维或超滤膜包纯化得到纯化病毒液，用病毒洗涤剂洗涤纯化病毒液，即得纯化的鸡胚源病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒杂蛋白去除剂由氯化钠、聚乙二醇和吐温组成。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒杂蛋白去除剂中，氯化钠、聚乙二醇和吐温的比例为4～5g：0.4～0.6g：8～12μL。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒杂蛋白去除剂由4.5g氯化钠、0.5g聚乙二醇和10μL吐温组成。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒杂蛋白去除剂在所述鸡胚液中的加入量，按照每100mL鸡胚液计，含有4～5g：0.4～0.6g：8～12μL的氯化钠、聚乙二醇和吐温。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒杂蛋白去除剂在所述鸡胚液中的加入量，按照每100mL鸡胚液计，含有4.5g：0.5g：10μL的氯化钠、聚乙二醇和吐温。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒包括禽流感病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述禽流感病毒包括本领域已知的各禽流感病毒亚型，包括但不限于H5N1、H7N9。
在本发明中，通过试验证实了本发明实施例中的方法在H5N1-Re11、H5N1-Re12、H7N9-Re3、H9N7-80、H9N7-83等不同禽流感病毒株的有效性，有效证明了其在各禽流感病毒纯化中的有效性。
在本发明的一些实施方式中，所述离心的条件为8000g/min，离心时间为5分钟。
在本发明的一些实施方式中，所述pH值为8.05～8.20。
在本发明的一些实施方式中，所述pH值为8.05。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒洗涤剂为含有吐温的PBS。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒洗涤剂为含有0.1‰吐温的PBS。
在本发明的一些实施方式中，所述中空纤维或超滤膜包孔径为700～800KD。
在本发明的一些实施方式中，所述中空纤维或超滤膜包孔径为750KD。
在本发明的一些实施方式中，所述超滤膜包包括聚醚砜超滤膜包。
在本发明的一些实施方式中，所述鸡胚源病毒的规模化纯化方法，包括以下步骤：
向含有待纯化病毒的鸡胚液中加入病毒杂蛋白去除剂，调节pH值至8.05～8.20，4～8℃静置20～24h，8000g/min离心得到上清液，使用滤袋过滤所述上清液，取滤液使用孔径为750KD的中空纤维或聚醚砜超滤膜包纯化得到纯化病毒液，用病毒洗涤剂洗涤纯化病毒液2次，即得纯化的鸡胚源病毒
在本发明的一些实施方式中，所述滤袋的滤径为0.6～0.7μm。
在本发明的一些实施方式中，所述滤袋的滤径为0.65μm。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法在病毒纯化中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒包括禽流感病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述禽流感病毒包括本领域已知的各禽流感病毒亚型，包括但不限于H5N1、H7N9。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒纯化中的待纯化样品量大于或等于400mL/批次。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒纯化中的待纯化样品量大于或等于20L/批次。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的鸡胚源病毒纯化方法对于鸡胚液中的杂蛋白去除效果好，对于不同的禽流感鸡胚源病毒H5N1-Re11、H5N1-Re12、H7N9-Re3、H9N7的纯化效果均很好，均能实现90％以上的杂蛋白去除率，比现有技术的去除率要高。
2.本发明中的鸡胚源病毒纯化方法操作简单，无需传统的层析的繁杂操作，本发明所用的病毒去除剂的原料来源简单，使用的滤袋以及膜包都是常用材料，可以降低纯化成本，提高经济效益。
3.本发明中的方法对于鸡胚源中的病毒保留率高，经过处理的病毒悬液病毒HA基本不变，并对于病毒杂蛋白的去除效果。
4.此外，本发明在中试试验中也能实现较高的杂蛋白去除率，从而具有极好的大规模应用前景。
附图说明
图1为H7N9-Re3病毒胚液和纯化之后的病毒悬液对比实物图。
图2为H5N1-Re12病毒胚液和纯化之后的病毒悬液对比实物图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
实施例1一种规模化鸡胚源病毒纯化方法
本实施例中的规模化鸡胚源病毒纯化方法包括如下步骤：
取含禽流感病毒鸡胚尿囊液，向其中加入病毒杂蛋白去除剂(每份由氯化钠4.5g、聚乙二醇0.5g、吐温10μL组成。每含禽流感病毒鸡胚尿囊液加入1份该含禽流感病毒鸡胚尿囊液)，然后调节溶液pH至8.05，4℃放置24小时。8000g/min离心5分钟，取上清液，使用0.65μm滤袋过滤除杂。使用750KD中空纤维(瑞普利金中空纤维滤柱，型号P/N：S04-E750-05-N)对滤液进行纯化，纯化步骤具体为：加入磷酸盐缓冲液平衡后，取上述过滤后的病毒液进行纯化浓缩，剪切力设置为3000-5000 1/s，TMP控制在3-7。纯化完成后，使用病毒洗涤剂(含有0.1‰的吐温的PBS)等体积洗涤2遍，然后将病毒液浓缩10倍后，用PBS将得到浓缩病毒液恢复至原体积得到纯化的病毒悬液。
在本实施中，分别使用含禽流感病毒H5N1-Re11、H5N1-Re12、H7N9-Re3和两种不同的H9N7毒株(H9N7毒株1和H9N7毒株2)的鸡胚尿囊液作为样品测试该方法的有效性。
测试要求按照标准操作流程(SOP)，各样品均进行一个批次(400mL)的测试。使用NanoDrop A280法直接测定纯化蛋白(表示为蛋白含量P)，使用HA值反映病毒浓度。
具体检测结果如表1所示，其中，部分代表性实物图如图1和图2所示。
表1规模化鸡胚源病毒纯化方法对不同病毒样品的纯化结果
上述结果表明，上述实施例中的规模化鸡胚源病毒纯化方法对于杂蛋白的去除率高，对禽流感鸡胚源病毒H5N1-Re11、H5N1-Re12、H7N9-Re3和两种不同的H9N7毒株的的纯化效果均能实现90％以上的杂蛋白去除效果，且在全过程中，病毒的HA没有发生变化，说明使用该方法纯化病毒不会损失病毒，具有极好的病毒保留率。
实施例2规模化鸡胚源病毒纯化方法在大批量纯化中的可行性
为了测试上述实施例中的规模化鸡胚源病毒纯化方法是否能够实现规模化或大批量病毒纯化效果，发明人以大批量样本(20L)作为测试样本，使用上述实施例中的方法进行病毒纯化。其中，含禽流感病毒鸡胚尿囊液具体为两种不同H9N7毒株(H9N7毒株3和H9N7毒株4)的鸡胚尿囊液。
测试要求按照标准操作流程(SOP)，各样品均进行一个批次(20L)的测试。使用NanoDrop A280法直接测定纯化蛋白(表示为蛋白含量P)，使用HA值反映病毒浓度。
具体检测结果如表2所示。
表2规模化鸡胚源病毒纯化方法对大批量样品的纯化结果
结果表明，上述实施例中的方法对于大批量样本(20L)的两种不同H9N7毒株均能实现95％以上的杂蛋白去除率，且数据证实上述方法即便在20L时也有较好的病毒保留率，说明上述实施例中的规模化鸡胚源病毒纯化方法能够适用于大规模工业化生产，具有极好的工业规模化应用前景。
实施例3pH对规模化鸡胚源病毒纯化方法的纯化效果的影响
pH对于上述实施例中的规模化鸡胚源病毒纯化方法的纯化效果影响巨大，为了充分说明这一点，发明人设置了不同pH条件进行纯化测试。
具体步骤为：
取含禽流感病毒(H9N7-83)鸡胚尿囊液，平均分为6组，向各组中加入病毒杂蛋白去除剂(每份由氯化钠4.5g、聚乙二醇0.5g、吐温10μL组成。每含禽流感病毒鸡胚尿囊液加入1份该含禽流感病毒鸡胚尿囊液)，然后分别调节溶液pH至7.5、8.0、8.05、8.10、8.15和8.20，4℃放置15小时。8000g/min离心5分钟，取上清液进行检测。
测试要求按照标准操作流程(SOP)进行一个批次的测试。使用NanoDrop A280法直接测定纯化蛋白(表示为蛋白含量P)，使用HA值反映病毒浓度。
结果如表3所示。
表3不同pH对规模化鸡胚源病毒纯化方法的影响
上述结果表明，当将规模化鸡胚源病毒纯化方法中的pH值调节为8.05-8.2时，杂质蛋白去除率高，其中，当调节pH值为8.05时，杂质蛋白去除率最高。而低于8.50时，其杂质蛋白去除率出现断崖式下降，从而会直接影响后续的纯化效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鸡胚源病毒的规模化纯化方法，包括以下步骤：
向含有待纯化病毒的鸡胚液中加入病毒杂蛋白去除剂，调节pH值，静置，离心得到上清液，过滤所述上清液，取滤液使用中空纤维或超滤膜包纯化得到纯化病毒液，用病毒洗涤剂洗涤纯化病毒液，即得纯化的鸡胚源病毒。
2.根据权利要求1所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法，其特征在于，所述病毒杂蛋白去除剂由氯化钠、聚乙二醇和吐温组成。
3.根据权利要求1所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法，其特征在于，所述病毒杂蛋白去除剂中，氯化钠、聚乙二醇和吐温的比例为4～5g：0.4～0.6g：8～12μL。
4.根据权利要求1所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法，其特征在于，所述病毒杂蛋白去除剂在所述鸡胚液中的加入量，按照每100mL鸡胚液计，含有4～5g：0.4～0.6g：8～12μL的氯化钠、聚乙二醇和吐温。
5.根据权利要求1所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法，其特征在于，所述病毒包括禽流感病毒。
6.根据权利要求1所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法，其特征在于，所述pH值为8.05～8.20。
7.根据权利要求1所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法，其特征在于，所述病毒洗涤剂为含有吐温的PBS。
8.根据权利要求1所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法，其特征在于，所述中空纤维或超滤膜包孔径为700～800KD。
9.权利要求1～8任一项所述的鸡胚源病毒的规模化纯化方法在病毒纯化中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病毒纯化中的待纯化样品量大于或等于400mL/批次，优选大于或等于20L/批次。
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