CN117481145A - 几丁质结合蛋白BvCBP及其复配物在制备植物害螨杀螨剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物学技术领域，公开了几丁质结合蛋白BvCBP及其复配物在制备植物害螨杀螨剂中的应用。申请人将N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM和几丁质结合蛋白BvCBP的基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。BvCBP蛋白对二斑叶螨的LC50为25.963μg/mL，对朱砂叶螨的LC50为28.714μg/mL，对柑橘全爪螨的LC50为42.906μg/mL。将BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配后，制剂对二斑叶螨的最低LC50为20.611μg/mL，显示出协同效应，进一步提升了杀螨效果。本发明为新型植物螨害生防制剂的研发提供了新的选择性。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及几丁质结合蛋白BvCBP及其复配物在制备植物害螨杀螨剂中的应用。
背景技术
植物螨害是农作物生产中较为严重的害虫问题之一，叶螨以植物的汁液为食，造成叶片凋萎、叶片黄化、果实畸形等严重危害，导致农作物产量和品质大幅下降。传统的化学农药虽然在一定程度上能够控制螨害，但长期使用易导致螨虫的抗药性，并且对环境和生态***造成负面影响，因此急需寻找新型、高效且环境友好的害螨防治方法。
几丁质不仅是昆虫外骨骼的重要组成成分，还是中肠围食膜的主要组成成分。围食膜是昆虫体内的物理保护屏障，其结构的完整性和通透性可以防止营养物质的流失、抵御病原微生物的入侵。几丁质在昆虫体内的变化直接影响着昆虫的生长与形态发生，在昆虫发育过程中，一系列酶参与协调几丁质的合成与降解。其中，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类；几丁质结合蛋白不仅能够与多种几丁质结合，还可以结合多糖类物质和以N-乙酰葡糖氨或N-乙酰神经氨酸为单体的寡聚物。几丁质结合蛋白、几丁质酶和某些蛋白酶会破坏围食膜结构，进而对昆虫产生有害的生理效应。另一方面，干扰昆虫几丁质的新陈代谢也将导致昆虫发育异常甚至死亡。因此，在研发叶螨等害虫的绿色防控新技术领域中，几丁质代谢途径中的关键酶无疑是新型杀虫剂的理想功能蛋白。昆虫N-乙酰氨基葡萄糖苷酶以及I型几丁质结合蛋白AA10作为靶标基因被应用于RNAi介导的害虫防治方面。此外，几丁质结合蛋白CBP58、Bt-CBP以及β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1在植物病原真菌抑菌方面也显示出良好应用潜力。
本发明所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM与几丁质结合蛋白BvCBP，单独使用时对叶螨具有杀螨活性，两者复配后产生了良好的杀螨活性协同效应。这一发现对于植物害螨的防治具有重要的应用意义，有望为高效、低毒的绿色杀螨剂的开发提供新的思路和方向。
发明内容
本发明的目的是提供几丁质结合蛋白BvCBP在防治螨害中的应用，所述的几丁质结合蛋白BvCBP为SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一个目的在于提供了几丁质结合蛋白BvCBP复配物在防治螨害中的应用，所述的几丁质结合蛋白BvCBP复配物包括几丁质结合蛋白BvCBP和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM，所述的几丁质结合蛋白BvCBP为SEQ ID NO.1所示，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM为SEQ ID NO.2所示，。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
几丁质结合蛋白BvCBP在防治叶螨中的应用，所述蛋白为SEQ ID NO.1所示。优选的，其对应的基因为SEQ ID NO.3所示。
以上所述的应用中，包括以SEQ ID NO.1所示蛋白作为有效成分之一，或者唯一有效成分用于防治叶螨螨害。
几丁质结合蛋白BvCBP在制备防治叶螨药剂中的应用，所述蛋白为SEQ ID NO.1所示；
以上所述的应用中，包括以SEQ ID NO.1所示蛋白作为有效成分之一，或者唯一有效成分用于制备防治叶螨药剂。
以上所述的应用中，优选的，当SEQ ID NO.1所示蛋白作为有效成分之一时，其可以为含有SEQ ID NO.1所示蛋白的微生物发酵产物，或含有SEQ ID NO.1所示蛋白的复配制剂。
以上所述的应用中，优选的，所述的叶螨为二斑叶螨、朱砂叶螨和/或柑橘全爪螨。本发明的保护范围还包括：
几丁质结合蛋白BvCBP复配物，包括几丁质结合蛋白BvCBP和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM，所述的几丁质结合蛋白BvCBP为SEQ ID NO.1所示，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM为SEQ ID NO.2所示(编码其的多核苷酸优选SEQ ID NO.4所示)。
以上所述的复配物，优选的，所述的为SEQ ID NO.1所示蛋白和SEQ ID NO.2所示蛋白以质量比为1:10～10:1。
同时含有几丁质结合蛋白BvCBP和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM的微生物发酵液，也为本发明的保护内容。
上述复配物或微生物发酵液在制备防治叶螨药剂中的应用；
以上所述的应用中，包括以复配物或微生物发酵液为有效成分之一，或者唯一有效成分用于制备防治叶螨药剂。
上述复配物或微生物发酵液在防治叶螨中的应用；
以上所述的应用中，包括以复配物或微生物发酵液为有效成分之一，或者唯一有效成分用于制备防治叶螨药剂。
以上所述的应用中，优选的，所述的叶螨为二斑叶螨(Tetranychus urticae)、朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)和/或柑橘全爪螨(Panonychus citri)。
以上所述的应用中，优选的，所述的蛋白均可利用本领域的常规方法制备，包括但不限于原核、真核表达，或是直接合成该蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
本发明首次报道了几丁质结合蛋白BvCBP与N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM分别具有独立的杀螨活性，为新型的植物叶螨生防制剂的制备提供了新的选择性。
由几丁质结合蛋白BvCBP与N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM制备的复合杀螨剂具有高效、低毒的优点，对多个危害严重的植物叶螨均有防效。
几丁质结合蛋白BvCBP与N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM复配后制备的杀叶螨药剂，其杀虫效果明显提升，产生了良好的杀螨活性协同效应。
附图说明
图1为杀螨蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳分析图；
其中：(A)几丁质结合蛋白BvCBP重组蛋白；(B)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM重组蛋白。
图2为几丁质结合蛋白BvCBP及其复配物对二斑叶螨的作用效果图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。所述试剂或材料，如未特别说明均为本领域的常规方案。
本发明涉及到的BvCBP蛋白和BvLysM蛋白，可用本领域的常规方式，例如原核表达、商业合成等方式得到。本发明以原核表达BvCBP蛋白和BvLysM蛋白为例，对单一蛋白和组合蛋白抑螨活性进行说明，其他方式获得的相关蛋白也能行使相同的功能。
实施例1：
杀螨蛋白BvCBP和BvLysM的获得
(1)构建重组表达质粒
按照SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的蛋白序列，采用大肠杆菌为表达体系，对BvCBP蛋白和BvLysM蛋白的基因片段bvcbp和bvlysm进行碱基优化和人工合成(北京擎科生物科技有限公司)，优化后的基因片段bvcbp和bvlysm分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。将目的基因片段分别克隆至大肠杆菌冷休克蛋白表达载体pColdII(氨苄青霉素抗性)中，得到重组质粒pColdII-bvcbp和pColdII-bvlysm。
(2)转化大肠杆菌
将重组质粒pColdII-bvcbp和pColdII-bvlysm分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选转化成功的菌落。经过验证，得到携带bvcbp和bvlysm基因的表达菌株BL21(DE3)/pColdII-bvcbp和BL21(DE3)/pColdII-bvlysm。
(3)表达及纯化蛋白BvCBP和BvLysM
挑取重组菌单克隆，接种于LB液体培养基中，添加氨苄青霉素至终浓度为100ng/μL，37℃、200rpm/min振荡培养至OD600达到0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)于20℃诱导培养16h。收集IPTG诱导培养物，离心收集菌体，重悬菌体后利用高压细胞破碎仪破碎细菌，离心收集细菌裂解液上清。利用0.22μm孔径的滤膜过滤去除杂质，通过His标签蛋白纯化柱纯化目标蛋白。
经大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白序列从N端至C端分别为翻译增强子、His标签以及目标蛋白序列：BvCBP序列(SEQ ID NO.1所示蛋白序列，理论分子量约为22.5kDa)，其理论蛋白质分子量约为23.9kDa；BvLysM序列(SEQ ID NO.2所示蛋白序列，理论分子量约为47.6kDa)，其理论蛋白质分子量约为49.0kDa。
对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图1所示，与预期重组蛋白分子量大小基本吻合，证明本发明的BvCBP蛋白和BvLysM蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。
实施例2：
BvLysM蛋白在制备叶螨杀螨剂中的应用，应用过程如下：
使用叶螨玻片浸渍法测定重组蛋白的杀叶螨活性。将双面胶带剪成2cm左右的方形，贴在载玻片的一端，用0号毛笔将具有一致大小、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨背部黏在双面胶上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)。在温度25℃、相对湿度85％的生化培养箱中放置2～3h后，镜检剔除死亡、受伤或不活泼的个体。将从实施例1中制备的重组蛋白悬液进行浓度稀释，得到5～7个浓度梯度。然后，将带螨玻片的一端浸于这些不同浓度的重组蛋白悬液和空白对照(PBS缓冲液)中轻轻振荡5s后取出，迅速吸去螨体及其周围的多余药液后，将玻片置于生化培养箱中24h。利用双目镜观察试验结果，通过轻触螨体来判断螨虫是否死亡，以螨足不动者为死亡。每组3次重复。
按照上述实验步骤，BvLysM蛋白悬液(实施例1制备的纯化的BvLysM蛋白)对二斑叶螨(Tetranychus urticae)的生测结果见表1所示。利用SPSS26.0数据处理软件计算获得，BvLysM杀虫蛋白的概率单位模型方程为PROBIT(P)＝-1.719+1.049X(变量X使用底数为10的对数进行转换)。通过Pearson模型拟合优度检验，结果显示卡方X2＝3.023，显著性P＝0.221，表明模型拟合良好。通过观察置信区间(见表2所示)，得到BvLysM蛋白处理二斑叶螨24h的LC50(半数致死浓度)为43.637μg/mL。
表1 BvLysM蛋白对二斑叶螨的杀螨活性测定实验数据
| 浓度(μg/mL) | 供试虫数(头) | 死亡虫数(头) |
| 200 | 89 | 67 |
| 100 | 131 | 90 |
| 50 | 117 | 54 |
| 12.5 | 108 | 33 |
| 0 | 112 | 13 |
表2 BvLysM蛋白处理下不同死亡概率所对应的浓度以及95％置信区间
按照上述实验步骤，统计BvLysM蛋白悬液对朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)和柑橘全爪螨(Panonychus citri)的生测结果，24h处理下BvLysM蛋白悬液对朱砂叶螨和柑橘全爪螨的LC50值分别为49.156μg/mL和67.529μg/mL。
实施例3：
BvCBP蛋白在制备叶螨杀螨剂中的应用，应用过程如下：
遵循实施例2中所述的叶螨玻片浸渍法，测定重组蛋白BvCBP(实施例1制备的纯化的BvCBP蛋白)的杀叶螨活性，生测结果见表3所示。利用SPSS26.0数据处理软件计算获得，BvCBP杀虫蛋白的概率单位模型方程为PROBIT(P)＝-1.683+1.190X(变量X使用底数为10的对数进行转换)。通过Pearson模型拟合优度检验，结果显示卡方X2＝3.409，显著性P＝0.182，表明模型拟合良好。通过观察置信区间(见表4所示)，得到BvCBP蛋白处理二斑叶螨24h的LC50值为25.963μg/mL。
表3 BvCBP蛋白对二斑叶螨的杀螨活性测定实验数据
| 浓度(μg/mL) | 供试虫数(头) | 死亡虫数(头) |
| 100.0 | 91 | 64 |
| 50.0 | 157 | 107 |
| 25.0 | 69 | 34 |
| 12.5 | 81 | 26 |
| 0 | 208 | 29 |
表4 BvCBP蛋白处理下不同死亡概率所对应的浓度以及95％置信区间
按照上述实验步骤，统计BvCBP蛋白悬液对朱砂叶螨和柑橘全爪螨的生测结果，24h处理下BvCBP蛋白悬液对朱砂叶螨和柑橘全爪螨的LC50值分别为28.714μg/mL和42.906μg/mL。
实验例4：
BvLysM蛋白复配BvCBP蛋白在制备杀二斑叶螨制剂中的应用，应用过程如下：
遵循实施例2中所述的叶螨玻片浸渍法，将256μg/mL的BvLysM蛋白(实施例1制备的纯化的BvLysM蛋白)和BvCBP蛋白(实施例1制备的纯化的BvCBP蛋白)以质量比为1:1复配成待测药剂，利用PBS缓冲液将复配溶液稀释至终浓度依次为128、64、32、16、4μg/mL，再将带螨玻片的一端浸于复配溶液中轻轻振荡5s后取出，迅速吸去螨体及其周围的多余药液后，将玻片置于生化培养箱中。24h后用双目镜观察试验结果，用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。每组3次重复，另以浸渍PBS缓冲液作为空白对照。
BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配溶液(质量比为1:1)对二斑叶螨的活性如表5所示，利用SPSS26.0数据处理软件计算获得，BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配溶液(质量比为1:1)的概率单位模型方程为PROBIT(P)＝-1.320+0.902X(变量X使用底数为10的对数进行转换)。通过Pearson模型拟合优度检验，结果显示卡方X2＝0.654，显著性P＝0.884，表明模型拟合良好。通过观察置信区间(见表6所示)，得到BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配溶液(质量比为1:1)处理二斑叶螨24h的LC50值为29.101μg/mL，鉴于理论LC50值为32.556μg/mL，因此两种蛋白复配后对二斑叶螨的杀螨活性表现为协同增效。
表5 BvLysM蛋白复配BvCBP蛋白对二斑叶螨的杀螨活性测定实验数据
| 浓度(μg/mL) | 供试虫数(头) | 死亡虫数(头) |
| 128 | 100 | 72 |
| 64 | 87 | 53 |
| 32 | 109 | 59 |
| 16 | 87 | 33 |
| 4 | 135 | 30 |
| 0 | 108 | 11 |
表6BvLysM蛋白和BvCBP蛋白的复配药剂处理下不同死亡概率所对应的浓度以及95％置信区间
按照上述方法，测得BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配溶液(质量比为5:1)对二斑叶螨的的LC50为32.133μg/mL，BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配溶液(质量比为1:5)对二斑叶螨的的LC50为20.611μg/mL，BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配溶液(质量比为10:1)对二斑叶螨的的LC50为21.522μg/mL，BvLysM蛋白和BvCBP蛋白复配溶液(质量比为1:10)对二斑叶螨的LC50为23.447μg/mL，两种物质按上述比例复配后对二斑叶螨的活性均表现为协同增效。
Claims (8)
1. 几丁质结合蛋白BvCBP或含有几丁质结合蛋白BvCBP的微生物发酵产物在防治叶螨中的应用，所述蛋白为SEQ ID NO.1所示。
2. 几丁质结合蛋白BvCBP或含有几丁质结合蛋白BvCBP的微生物发酵产物在制备防治叶螨药剂中的应用，所述蛋白为SEQ ID NO.1所示。
3. 一种几丁质结合蛋白BvCBP复配物，包括几丁质结合蛋白BvCBP和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM，所述的几丁质结合蛋白BvCBP为SEQ ID NO.1所示，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM为SEQ ID NO.2所示。
4. 根据权利要求3所述的复配物，其特征在于：SEQ ID NO.1所示蛋白和SEQ ID NO.2所示蛋白以质量比为1:10~10:1。
5.含有几丁质结合蛋白BvCBP和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BvLysM的微生物发酵液。
6.权利要求3所述的复配物或权利要求5所述的微生物发酵液在制备防治叶螨药剂中的应用。
7.权利要求3所述的复配物或权利要求5所述的微生物发酵液在防治叶螨中的应用。
8. 根据权利要求1、2、6或7所述的应用，其特征在于：所述的叶螨为二斑叶螨（Tetranychus urticae）、朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）和/或柑橘全爪螨（Panonychus citri）。
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|---|
| 陈珺君等: "两种蜘蛛毒素肽与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白的融合表达及杀虫活性", 中国生物防治学报, vol. 34, no. 6, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 838 - 847 * |
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