CN117479839A - 来自黑葡萄穗霉的农用化学品佐剂 - Google Patents

Abstract

一种新的农药制剂，包括选自苯螺补身烷及其衍生物的佐剂和农药活性物质。还提供了适用于形成该制剂的浓缩物。苯螺补身烷在浓缩物和农用化学品配方中提供佐剂。还提供了一种制备该制剂的方法，并且还提供了所述苯螺补身烷作为佐剂在农业化学制剂中的用途。还描述了从黑葡萄穗霉RKDO1264菌株的培养中获得二酮哌嗪的方法。提取的苯螺补身烷体可用于处理植物以控制害虫的制剂或种子包衣。或者，菌株RKDO1264本身可以用于种子包衣或用于处理植物以控制害虫的制剂中。

Description

来自黑葡萄穗霉的农用化学品佐剂

本发明一般涉及可从生物体中获得的用于农业化学活性制剂的佐剂，以及在包含上述佐剂和一种或多种农业化学活性物质的农业化学制剂中提供佐剂增效的方法。本发明还包括用所述制剂处理作物。

佐剂通常定义为能够提高农药活性物质的生物活性或功效的化学品或化学品混合物。佐剂本身不能防治或灭除害虫。相反，这些添加剂可能与目标生物体内的分子目标(例如细胞壁、离子通道、结构蛋白、酶等)相互作用，或改变农业化学制剂的某些性质(例如扩散、滞留、渗透、液滴大小)，从而提高农药活性物质对生物体的生物活性。用作佐剂的典型化合物类型可能包括小分子、表面活性剂、乳化剂、油和盐。佐剂通常不会抑制处理过的植物中活性物质的转移。此外，佐剂不应对植物产生有害的植物毒性作用。

真菌在陆地环境中分布广泛，对农业产生力构成重大挑战。未经检查的真菌感染可能导致收获前和收获后作物损失超过80％。为了帮助减少这种损失并满足日益增长的粮食需求，使用杀菌剂防治真菌农业病虫害是，并将继续是农业病虫害管理***的一个重要组成部分。

有必要开发新的战略来防治农业病虫害，特别是真菌病害。一项战略是开发安全无毒的化学佐剂，提高已批准用于田间和温室作物的现有杀菌剂的功效，以防止或减少真菌病虫害对农业产生力的影响。这些佐剂可以改善田间或收获后病虫害的防治，从而提高产生力。它们还可以减少达到所需病害防治水平所需的杀菌剂的量，从而有助于实现可持续产生力提高的目标。

本发明寻求提供在农业化学制剂中与农业化学活性物质结合使用的化合物，其中化合物可提供所需的佐剂增效，包括改善活性物质的功效。本发明还寻求提供包含所述佐剂的农业化学浓缩物和稀释制剂的用途。

本发明还寻求提供农业化学制剂中的化合物，其中该化合物可提供与现有佐剂类似或改进的佐剂性能。

本发明还寻求提供化合物作为佐剂的用途，以及包含所述化合物的制剂，用于在农业化学制剂中提供佐剂性能。

根据本发明的第一方面，提供了一种农业化学制剂，其包括：；

i)佐剂，所述佐剂选自根据式(I)

其中：

R₁独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基或胺；

R₂独立地表示氢、C₁-C₆烷基、苯基、取代的苯基、烷基苯基或取代的烷基苯基(alkyl substituted phenyl)；

R₃和R₄独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

或根据式(II)的苯螺补身烷(Phenylspirodrimane)；

R₁₀独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羧基；

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢或C₁-C₄烷基；和

ii)至少一种农用化学活性物质。

根据本发明的第二方面，提供了一种适用于制备根据第一方面的农业化学制剂的浓缩物制剂，所述浓缩物包括；

i)佐剂，所述佐剂选自根据式(I)；

其中：

R₁独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基或胺；

R₂独立地表示氢、C₁-C₆烷基、苯基、取代的苯基、烷基苯基或取代的烷基苯基；

R₃和R₄独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

或根据式(II)的苯螺补身烷；

R₁₀独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羧基；

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢或C₁-C₄烷基；和

ii)至少一种农用化学活性物质。

根据本发明的第三方面，提供了选自根据式(I)

其中：

R₁独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基或胺；

R₂独立地表示氢、C₁-C₆烷基、苯基、取代的苯基、烷基苯基或取代的烷基苯基；

R₃和R₄独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

或根据式(II)的苯螺补身烷的化合物；

R₁₀独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羧基；

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

作为包含至少一种农用化学活性物质的农业化学制剂中的佐剂的用途。

根据本发明的第四方面，提供了一种处理植物以控制害虫的方法，该方法包括将根据第一方面的制剂或稀释的根据第二方面的浓缩制剂应用于所述植物或所述植物的直接环境。

根据本发明的第五方面，提供了一种获得根据第一方面的佐剂的方法，包括以下步骤：

在促进根据第一方面的佐剂的代谢合成的条件下，在培养基中培养黑葡萄穗霉RKDO1264，以及

从培养基中纯化合成的佐剂。

根据本发明的第六个方面，提供了一种由农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登记号NRRL-67988的黑葡萄穗霉菌株RKDO1264组成的生物体。

根据本发明的第七方面，提供了一种从由农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登记号NRRL-67988的黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)菌株RKDO1264组成的生物体中获得的提取物，所述提取物包含根据第一方面的苯螺补身烷。

根据本发明的第八方面，提供了一种处理植物以控制害虫的方法，该方法包括将根据第六方面的生物体应用于所述植物或所述植物的直接环境。

根据本发明的第九方面，提供了一种种子包衣组合物，其包含根据第一方面的佐剂或根据第六方面的生物体。

已经发现，本文定义的化合物在用于具有至少一种农用化学活性物质的农用化学制剂中时提供所需的佐剂性质。重要的是，已鉴定的苯螺补身烷类化合物没有显示出固有的杀有害生物活性。

如本文所用，术语“例如”或“包括”意在引入进一步阐明更一般主题的示例。除非另有说明，否则提供这些示例只是为了帮助理解本发明中所示的应用，并不意味着以任何方式进行限制。

应当理解，当描述一个取代基(如“C₁至C₄烷基”)中的碳原子数时，该数是指取代基中存在的碳原子总数，包括任何支链基团中存在的任何碳原子。此外，当描述例如脂肪酸中的碳原子数时，它是指碳原子的总数，包括羧酸上的碳原子和任何支链基团中存在的任何碳原子。

本发明的佐剂选自具有式(I)结构；

其中：

R₁独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基或胺；

R₂独立地表示氢、C₁-C₆烷基、苯基、取代的苯基、烷基苯基或取代的烷基苯基；

R₃和R₄独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

或式(II)的结构的苯螺补身烷；

其中：

R₁₀独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羧基；

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢或C₁-C₄烷基。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“C₁至C₄烷基”是指含有1至4个碳原子的直链或支链饱和烃基。当R中的任何一个表示C₁至C₄烷基时，所述烷基可以独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。优选地，甲基、乙基、正丁基或异丁基。更优选甲基或异丁基。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“C₁至C₆烷基”是指含有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基。当R中的任何一个表示C₁至C₆烷基时，所述烷基可以独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基丁基、戊基、己基、环己基等。优选甲基或乙基。更优选甲基。

除非另有说明，否则本文中使用的术语“羟基”是指包含一个氧和一个氢原子的羟基基团，其结构为-O-H，并通过氧与相邻的基团结合。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“苯基”是指通过去除一个氢而衍生自苯芳烃的C₆H₅有机基团。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“取代苯基”是指被甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或卤素取代的苯基。所述取代可以在芳环上的任何位置，优选邻位或对位。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“烷基苯基”是指具有烷基(优选甲基或乙基，更优选甲基)的苯基，通过该烷基与相邻基团结合。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“取代的烷基苯基”是指包含本文所述烷基苯基和取代苯基特征的苯基。

当R₂基团是含苯基的基团时，可以优选苯基或烷基苯基。特别地，烷基苯基可以是优选的。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“甲氧基”和“乙氧基”是指与氧连接的甲基和乙基，它们形成具有-O-Me和-O-Et结构的烷氧基，并通过氧与相邻的基团结合。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“胺”是指具有结构-NR₁₅R₁₆R₁₇的伯胺、仲胺或叔胺的胺基团，并且通过氮与相邻的基团结合。R₁₅、R₁₆和R₁₇中的每一个表示氢，或如本文所定义的C₁-C₄烷基。

除非另有定义，否则本文中使用的术语“羧基”是指具有结构-C(＝O)-O–H的羧基基团，并且通过碳与相邻的基团结合。

当所述苯螺补身烷具有式(I)的结构时，优选R₁表示羟基、甲氧基、乙氧基或胺。更优选羟基、甲氧基或胺。进一步优选羟基。

优选地，R₂表示C₁至C₄烷基、苯基或烷基苯基。更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、苯基、甲基苯基或乙基苯基。优选地，正丁基、异丁基、苯基或甲基苯基。更优选异丁基或甲基苯基。

优选地，R₃和R₄独立地表示氢、甲基或乙基。更优选氢。

当所述苯螺补身烷具有式(II)的结构时，优选R₁₀表示氢、羟基、甲氧基或羧基。更优选地，氢、甲氧基或羧基。进一步优选羧基。

优选地，R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢、甲基或乙基。更优选氢。

式(I)和(II)的化合物可以围绕手性碳具有光学异构化。应理解的是，R和S异构体都包括在所述式(I)的苯螺补身烷的定义中。

特别地，可以优选选自以下的苯螺补身烷：

用于发酵的生物体是属于葡萄穗霉属(Stachybotrys)的丝状真菌。已经发现，黑葡萄穗霉RKDO1264的某些菌株在生产所述新型佐剂方面特别有用，并且根据《布达佩斯条约》，该菌株已被存放在美国伊利诺伊州皮奥里亚市农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)：

在提供本发明的佐剂活性中NRRL-67988是特别优选的。

优选地，提供了根据第五方面的用于获得式(I)或(II)的苯螺补身烷佐剂的方法。

苯螺补身烷可以各自从黑葡萄穗霉培养物，特别是RKDO1264中形成和提取。所需化合物可以通过通常用于收集微生物代谢物的任何手段从培养液或真菌生物质中提取和纯化。实例包括用吸附剂如各种离子交换树脂、非离子吸附树脂、凝胶过滤色谱法、活性炭、氧化铝和硅胶的色谱法，或通过使用高效液相色谱法的分离方法，或结晶、减压浓缩或冻干，这些手段可以单独使用或以其适当组合使用或重复使用。

黑葡萄穗霉RKDO1264的培养物可从自然来源或培养物保藏处(例如农业研究机构培养物保藏中心(NRRL))获得。黑葡萄穗霉RKDO1264的分离菌可以通过真菌学领域中已知的方法进行培养。

作为产生本发明化合物的一种方法，只要生产生物体适当含有碳源、氮源和无机盐，就可以在任何合适的合成培养基或自然培养基上生长。如有必要，培养基可适当补充维生素和其他营养物质。

一般碳源的示例包括(但不限于)糖，例如葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖和淀粉，醇，例如甘油和甘露醇，氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和天冬酰胺，以及油和脂肪，例如大豆油和橄榄油。氮源的示例包括有机含氮化合物，例如大豆粉、玉米浆、牛肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸混合物和鱼粉，以及无机氮化合物，例如铵盐和硝酸盐。此外，还可以使用无机盐形式的微量营养素，例如碳酸钙、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化锰、硫酸锌、氯化钴和各种磷酸盐。

该生物体可以在允许微生物生长和有效生产本发明化合物的范围内的适当培养温度下生长。优选的培养温度为10℃至32℃，更优选为20℃至25℃。培养开始时的pH优选为约6至8。栽培期一般为一天至数周左右。

当本发明化合物的产生量达到适合收集的量时，优选当其达到最大量时，可终止培养。作为培养方法，只要该方法通常使用，任何方法都可以适当地使用，例如固态培养和常规搅拌培养。

例如，可以将黑葡萄穗霉RKDO1264的分离株涂到含有营养物质(例如YM(酵母麦芽提取物))的琼脂上，并在室温下孵育几天，直到出现可观察到的菌落。琼脂上的单个黑葡萄穗霉RKDO1264菌落可用于测定苯螺补身烷的产生。

产生所需分子的那些菌落可用于接种肉汤培养基(例如YM肉汤培养基)，其可在适当条件下培养(例如在室温下摇动几天)以产生种子接种物。种子接种物可用于启动较大的液体培养基(例如马铃薯葡萄糖肉汤)，该液体培养基可在室温下培养数天(例如4-28天)以扩增黑葡萄穗霉培养物。

发现苯螺补身烷被***到液体培养基(例如YES肉汤)中。苯螺补身烷可以通过以下方法从发酵液中分离出来,使用包括乙酸乙酯和水的液：液萃取，以及将化合物结合到吸附树脂(例如Diaion^TM HP20)上，用水洗涤树脂，然后使用适当的溶剂(例如甲醇或乙醇)洗脱二酮哌嗪类化合物。由于苯螺补身烷的极性不同，可以使用色谱法(如快速色谱法)和反相固定相(如C-18)分离单个化合物。

所得到的提取的苯螺补身烷可以被纯化并用作单独的均质化合物。在一个替代实施方案中，提取的材料可以是根据第一方面的苯螺补身烷的组合，并且可以在农业化学制剂中组合使用。

在其他实施方案中，苯螺补身烷可以从其他可用资源(通常是其他真菌)获得。

苯螺补身烷也可以通过合成技术制备。苯螺补身烷及其衍生物可以由有机化学领域的技术人员使用科学文献中描述的市售材料和合成方法通过化学合成来生产。

佐剂本身的性质应理解为为包含所述佐剂的农业化学制剂提供相同的优点。因此，当包含本发明的佐剂时，提供了一种农用化学制剂，其具有佐剂本身的性质的优点。

农业化学活性化合物，包括杀虫剂和杀菌剂，需要允许植物/目标生物体吸收活性化合物的制剂。

本文使用的术语“农业化学制剂”是指包括活性农业化学品的组合物，并且意在包括所有形式的组合物(包括浓缩物和喷雾制剂)。如果没有特别说明，本发明的农业化学制剂可以是浓缩物、经稀释的浓缩物或可喷雾制剂的形式。

本发明的佐剂可与其它组分组合，以形成包含至少一种农药活性物质的农业化学制剂。

因此，农业化学活性化合物可配制为乳油(EC)、乳剂(EW)、悬浮剂(SC)、可溶液体(SL)、油基悬浮剂(OD)和/或悬乳剂(SE)。

在EC制剂和SL制剂中，活性化合物可以溶解形式存在，而在OD、SC、EW或SE制剂中，活性化合物可以固体或乳化液体形式存在。

设想本发明的佐剂将特别用于EC、EW、SC、SL、OD或SE制剂。

农业化学浓缩物是农业化学组合物，可为水性或非水性，其设计为用水(或水基液体)稀释以形成相应的喷雾制剂。所述组合物包括液体形式(如溶液、乳液或分散液)和固体形式(尤其是水分散固体形式)例如颗粒或粉末的组合物。

喷雾制剂是水性农业化学制剂，包括希望施用到植物或其环境的所有组分。喷雾制剂可以通过简单稀释含有所需组分(水除外)的浓缩液，或通过混合各个组分，或将浓缩液稀释并添加其他单个组分或组分混合物的组合来配制。通常，这种最终使用的混合在喷雾制剂的桶中进行，或者在填充喷雾桶的存储桶中进行。这种混合和混合物通常称为桶混合和桶混合物。

因此，可将佐剂加入农业化学活性化合物的制剂中(罐内/内置制剂)，或在喷雾液的浓缩制剂稀释后添加(桶混合物)。在农业化学产品的应用过程中，为了避免剂量错误和提高用户的安全性，在制剂中加入佐剂是有利的。这也避免了对桶混制剂产品不必要地使用额外的包装材料。

根据客户的需要，由此形成的浓缩物通常可包含高达95重量％的农药活性物质。可将所述浓缩物稀释以供使用，得到农业化学活性物质浓度约0.5重量％至约1重量％的稀释组合物。在所述稀释组合物(例如，喷雾制剂，其中喷雾施用率可为10至500l.ha^-1)中，农业化学活性物质浓度可为总喷雾制剂的约0.001重量％至约1重量％。

本发明佐剂的用量通常与制剂中活性农业化学品的用量成正比。在农业化学制剂浓缩物中，佐剂的比例取决于各组分在液体载体中的溶解度。通常，这种浓缩物中佐剂的浓度为1重量％至99重量％。优选地，为1重量％至70重量％。更优选地，为3重量％至50重量％。

在稀释形成例如喷雾制剂时，佐剂的浓度通常为喷雾制剂的0.01重量％至2重量％，更通常为0.03重量％至0.5重量％。进一步优选为喷雾制剂的0.12重量％至0.4重量％。

农业化学制剂中佐剂与活性农业化学品的比例优选为约1:40至约1:1。更优选地，为约1:20至约1:1。进一步优选，为约1:5至1约1:1。对于浓缩形式的制剂(例如，佐剂包含在可分散液体浓缩物或可分散固体颗粒制剂中)和在喷雾制剂中，该比例范围通常保持不变。

当浓缩物(固体或液体)用作活性农业化学品和/或佐剂的来源时，通常将浓缩物稀释以形成喷雾制剂。可以用水以1至10,000，特别是10至1,000倍浓缩物的总重量进行稀释，以形成喷雾制剂。

如果农药活性物质以固体颗粒的形式存在于水性最终使用的制剂中，则其通常主要以活性农业化学品颗粒的形式存在。然而，如果需要，活性农业化学品可以负载在固体载体上，例如二氧化硅或硅藻土，其可以是如上所述的固体载体、填料或稀释剂物质。

喷雾制剂的pH值通常为中等酸性(例如约3)至中等碱性(例如约10)，特别是接近中性(例如约5-8)。更浓的制剂具有相似的酸/碱度，但由于它们可能很大程度上不含水，pH值不一定是适当的度量标准。

农业化学制剂可以包括溶剂(除了水)，例如单丙二醇、可以是植物油或矿物油的油，例如喷雾油(作为非表面活性剂佐剂包含在喷雾制剂中的油)，与佐剂相关。可以包含此类溶剂作为佐剂的溶剂和/或作为保湿剂，例如特别是丙二醇。当使用时，此类溶剂的含量通常为佐剂重量的5重量％至500重量％，优选10重量％至100重量％。这样的组合还可以包括盐，例如氯化铵和/或苯甲酸钠，和/或尿素，特别是作为凝胶抑制助剂。

在替代实施方案中，本发明的佐剂或根据第六方面的生物体可包含在适用于种子的种子包衣组合物中。优选地，本发明的佐剂可包含在种子包衣组合物中。

基于组合物的总重量，佐剂在种子包衣组合物中的浓度适当为0.5至25重量％、优选2至18重量％、更优选5至15重量％、特别是8至12重量％，基于组合物的总重量。

包衣可包括膜包衣、造粒和包裹或本领域已知的那些技术的组合。设想本发明适用于所有所述包衣类型，优选适用于膜包衣。

本发明的种子包衣组合物可以以常规方式施用于种子。

可以对种子进行预处理或不进行未预处理(经过处理以提高发芽率，例如渗透激发、吸水促萌、基质预处理(matrix priming))。

在一个实施方案中，在施用本发明的种子包衣组合物之前，种子不具有人工层，例如包含粘合剂(例如聚合物)的底涂层。因此，种子包衣组合物优选直接施用在种子的自然外表面上。尽管如此，在施用种子包衣组合物之前，种子表面可能已经过表面处理。

优选地，种子包衣组合物以液体组合物和/或乳液和/或分散体和/或胶乳组合物的形式施用，然后固化(包括固化和/或干燥)以形成种子包衣。本申请中使用的术语“液体包衣组合物”意指包括悬浮液、乳液和/或分散液形式的包衣组合物，优选分散液。

可以采用常规的包衣方法来包衣种子。本领域技术人员可使用各种包衣机。一些众所周知的技术包括使用滚筒包衣机、流化床技术、旋转包衣机(带或不带集成干燥)和喷动床。适宜地，种子包衣组合物通过旋转包衣机、旋转干燥包衣机、盘式包衣机或连续处理器施用到种子上。

种子包衣组合物可例如通过膜包衣、喷涂、浸渍或刷涂种子包衣组合物施用。优选地，该方法包括施用种子包衣组合物以形成膜或种子包衣层。种子包衣通常包括在种子表面形成牢固粘附的、水分可透过的包衣。该方法通常包括在种植前将液体种子包衣组合物施用到种子上。

可任选地在本发明的包衣上施用额外的膜包衣层，以提供额外的益处，包括但不限于修饰、覆盖度、活性物质、营养物和加工改进，例如更快的干燥、种子流动性、耐久性等。

农业化学制剂或种子包衣组合物还可根据需要包含其它组分。那些其它组分可以选自包括以下的这些：

■粘合剂，特别是在高粘合剂浓度下易溶于水以提供低粘度溶液的粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；羧甲基纤维素；***树胶；糖如蔗糖或山梨醇；淀粉；乙烯-醋酸乙烯共聚物、蔗糖和藻酸盐；

■稀释剂、吸收剂或载体，如炭黑；滑石；硅藻土；高岭土；硬脂酸铝、钙或镁；三聚磷酸钠；四硼酸钠；硫酸钠；钠、铝和混合的钠-铝硅酸盐；和苯甲酸钠；

■崩解剂，如表面活性剂、在水中溶胀的物质如羧甲基纤维素、棉胶、聚乙烯吡咯烷酮和微晶纤维素膨胀剂；盐如醋酸钠或钾、碳酸钠、碳酸氢钠或倍半碳酸钠、硫酸铵和磷酸氢二钾；

■润湿剂，如醇乙氧基化物和醇乙氧基化物/丙氧基化物润湿剂；

■分散剂，如磺化萘甲醛缩合物和丙烯酸共聚物，如在聚丙烯酸骨架上具有封端聚乙二醇侧链的梳状共聚物；

■乳化剂，如醇乙氧基化物、ABA嵌段共聚物或蓖麻油乙氧基化物；

■消泡剂，例如聚硅氧烷消泡剂，通常含量为制剂的0.005-10wt％；

■粘度调节剂，如市售的水溶性或混溶性胶，如黄原胶，和/或纤维素，如羧基-甲基、乙基或丙基纤维素；和/或

■防腐剂和/或抗菌剂，如有机酸或其酯或盐，如抗坏血酸如抗坏血酸的棕榈酸酯，山梨酸如山梨酸钾，苯甲酸如苯甲酸和4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸丙酯、丙酸如丙酸钠，酚如2-苯基酚钠、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮；或甲醛本身或多聚甲醛；或无机材料如亚硫酸及其盐，其含量通常为制剂的0.01-1wt％。

根据本发明的农业化学制剂或种子包衣组合物还可包含形成乳化剂体系一部分的组分，例如表面活性剂物质。所述表面活性剂可以包括表面活性剂分散剂。

不在本发明范围内的其他佐剂，例如表面活性剂佐剂，可包含在本发明的组合物和制剂中并用于本发明。实例包括烷基多糖(更恰当地称为烷基寡糖)；脂肪胺乙氧基化物，例如椰油烷基胺2EO；和烷(烯)基琥珀酸酐的衍生物，特别是在PCT申请WO 94/00508和WO96/16930中描述的那些。

制剂/组合物可包含一种或多种生物活性成分(包括植物增强剂，特别是植物保护产品(也称为PPP))。活性成分(特别是植物增强剂)的合适实例为杀真菌剂、杀细菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、灭螺剂、生物制剂、杀螨剂或杀螨药、杀虫剂和杀生物剂。其他可能的活性成分包括消毒剂、微生物、灭鼠剂、杀草剂(除草剂)、引诱剂、(鸟类)驱避剂、植物生长调节剂(如赤霉素、生长素或细胞***素)、营养素(如硝酸钾、硫酸镁、铁螯合物)、植物激素、矿物质、植物提取物、催芽剂、信息素、生物制剂等。

用于本发明的制剂或种子包衣组合物的合适农药活性物质是在室温下可以是固体或液体的所有农业化学活性化合物。设想本发明的佐剂将广泛适用于所有类型的农药活性物质。

农药活性物质是指杀生物剂，其在本发明的上下文中是植物保护剂，更特别是用于医药、农业、林业和蚊虫防治等领域能够灭除不同形式生物的化学物质。在该组杀生物剂中，还包括所谓的植物生长调节剂。

用于本发明农业化学制剂或种子包衣组合物的杀生物剂通常分为两个亚组：

■农药，包括杀真菌剂，除草剂，杀虫剂，杀藻剂，杀软体动物剂，杀螨剂和杀啮齿类剂，和

■抗微生物剂，包括杀菌剂，抗生素，抗细菌剂，抗病毒剂，抗真菌剂，抗原生动物剂和抗寄生物剂。

尤其是，选***虫剂、杀真菌剂或除草剂的杀生物剂可能是特别优选的。

术语‘农药’应理解为是指任意物质或物质的混合物，其期望用于预防、毁坏、驱避或缓和任何病虫害。农药可以是用于对抗病虫害的化学物质或生物学试剂(比如病毒或细菌)，所述病虫害包括与人类竞争食物、毁坏物品、传播病害或成为滋扰的昆虫、植物病原体、杂草、软体动物、鸟类、哺乳动物、鱼类、线虫(nematodes)(蛔虫(roundworms))和微生物。在下述实例中，提供了适于本发明农业化学组合物的农药。

杀真菌剂是对真菌的化学防治剂。杀真菌剂是用来预防真菌在园地和作物中蔓延的化合物。杀真菌剂也用来抗击真菌侵染。杀真菌剂可以是触杀性或内吸性的。触杀性真菌剂在与残留在叶片表面的杀菌剂接触时灭除真菌。内吸性杀菌剂被吸收到植物组织中，并在真菌试图入侵宿主时灭除真菌。

根据本发明，合适的杀真菌剂的实例包括以下品种：溴化(3-乙氧基丙基)汞，氯化2-甲氧基乙基汞，2-苯基苯酚，硫酸8-羟基喹啉，8-苯基汞羟喹啉，活化酸(acibenzolar)，酰基氨基酸杀真菌剂，acypetacs，aldimorph，脂族氮杀真菌剂，烯丙醇，酰胺杀真菌剂，ampropylfos，敌菌灵，酰基苯胺杀真菌剂，抗生素杀真菌剂，芳族杀真菌剂，金色制霉素(aureofungin)，氧环唑，氧化福美双(azithiram)，嘧菌酯，多硫化钡，精苯霜灵，麦锈灵，苯菌灵，醌肟腙，bentaluron，苯噻菌胺(benthiavalicarb)，苯扎氯铵，benzamacril，苯甲酰胺杀真菌剂，benzamorf，苯甲酰苯胺杀真菌剂，苯并咪唑杀真菌剂，苯并咪唑前体杀真菌剂，苯并咪唑基氨基甲酸酯杀真菌剂，苯甲羟肟酸，苯并噻唑杀真菌剂，bethoxazin，乐杀螨，联苯，联苯***醇，硫氯酚，灭瘟素，波尔多液，啶酰菌胺，桥连二苯基杀真菌剂，糠菌唑，乙嘧酚磺酸酯，苏打波尔多液，丁硫啶，丁胺，多硫化钙，敌菌丹，克菌丹，氨基甲酸酯杀真菌剂，吗菌威，苯氨基甲酸盐/酯杀真菌剂，多菌灵，萎锈灵，环丙酰菌胺，香芹酮，Cheshunt混合物，灭螨猛，chlobenthiazone，chloraniformethan，四氯对醌，chlorfenazole，氯二硝基萘，氯苯甲醚，氯化苦，百菌清，四氯喹喔啉，乙菌利，环己吡酮(ciclopirox)，咪菌酮，克霉唑，康唑(conazole)杀真菌剂，康唑(conazole)杀真菌剂(咪唑)，康唑(conazole)杀真菌剂(***类)，乙酸铜(II)，碱式碳酸铜(II)，铜杀真菌剂，氢氧化铜，环烷酸铜，油酸铜，王铜，硫酸铜(II)，碱式硫酸铜，铬酸铜锌，甲酚，硫杂灵(cufraneb)，cuprobam，氧化亚铜，氰霜唑，环菌胺，环状二硫代氨基甲酸盐/酯杀真菌剂，放线菌酮，环氟苄酰胺，霜脲氰，氰菌灵，环丙唑醇，嘧菌环胺，棉隆，二溴氯丙烷，咪菌威，癸磷锡(decafentin)，保果鲜(dehydroacetic acid)，二甲酰亚胺杀真菌剂，苯氟磺胺，二氯萘醌，双氯酚，二氯苯基(dichlorophenyl)，二甲酰亚胺杀真菌剂，菌核利，苄氯***醇，双氯氰菌胺，哒菌酮，氯硝胺，乙霉威，焦碳酸二乙基酯，苯醚甲环唑，氟嘧菌胺，二甲嘧酚，烯酰吗啉，二甲苯氧菌胺，烯唑醇，二硝基酚杀真菌剂，消螨通，二硝基巴豆酸酯，敌菌死(dinocton)，硝戊酯(dinopenton)，硝辛酯(dinosulphon)，硝丁酯(dinoterbon)，二苯胺，双硫氧吡啶(dipyrithione)，双硫仑，灭菌磷，二氰蒽醌，二硫代氨基甲酸盐/酯杀真菌剂，二硝酚，十二环吗啉，多地辛，多果定，DONATODINE，肼菌酮，敌瘟磷，氟环唑，乙环唑，代森硫，噻唑菌胺，乙嘧酚，乙氧喹啉，2,3-二羟基丙基硫醇乙基汞，乙酸乙基汞，溴化乙基汞，氯化乙基汞，磷酸乙基汞，土菌灵，噁唑菌酮，咪唑菌酮，敌磺钠，咪菌腈，氯苯嘧啶醇，腈苯唑，甲呋酰胺，环酰菌胺，种衣酯，稻瘟酰胺，拌种咯，苯锈啶，丁苯吗啉，三苯锡，福美铁，嘧菌腙，氟啶胺，咯菌腈，氟酰菌胺，氟吡菌胺，氟氯菌核利，三氟苯唑，氟嘧菌酯，氟喹唑，氟硅唑，磺菌胺，氟酰胺，粉唑醇，灭菌丹，甲醛，乙膦酸，麦穗宁，呋霜灵，呋吡菌胺，糠酰胺杀真菌剂，呋酰胺(furanilide)杀真菌剂，二甲呋酰胺，呋菌唑，呋醚唑，糠醛，拌种胺，呋甲硫菌灵，果绿啶，灰黄霉素，双胍辛，丙烯酸喹啉酯，六氯苯，六氯丁二烯，毒菌酚，己唑醇，环菌磷(hexylthiofos)，汞加芬，噁霉灵，抑霉唑，亚胺唑，咪唑杀真菌剂，双胍辛胺，无机杀真菌剂，无机汞杀真菌剂，碘甲烷，种菌唑，异稻瘟净，异菌脲，缬霉威，稻瘟灵，isovaledione，春雷霉素，醚菌酯，石硫合剂，代森锰铜，代森锰锌，代森锰，邻酰胺，甲威苯咪(mecarbinzid)，嘧菌胺，灭锈胺，氯化汞，***，氯化亚汞，汞杀真菌剂，甲霜灵，精甲霜灵，百亩酸(metam)，metazoxolon，叶菌唑，磺菌威，呋菌胺，溴甲烷，异硫氰酸甲酯，苯甲酸甲基汞盐，双氰胺化甲基汞(methylmercury dicyandiamide)，五氯苯酚甲基汞盐，代森联，苯氧菌胺，苯菌酮(metrafenone)，噻菌胺，代森环，吗啉杀真菌剂，腈菌唑，甲菌利，N-(乙基汞)-对-甲苯磺酰基苯胺，代森钠，那他霉素(natamycin)，硝基苯乙烯，酞菌酯，氟苯嘧啶醇，OCH，辛噻酮，呋酰胺，有机汞杀真菌剂，有机磷杀真菌剂，有机锡杀真菌剂，肟醚菌胺，噁霜灵，氧杂硫杂环己二烯杀真菌剂，噁唑杀真菌剂，喹啉铜，噁咪唑(oxpoconazole)，氧化萎锈灵，稻瘟酯，戊菌唑，戊菌隆，五氯苯酚，吡噻菌胺(penthiopyrad)，苯基汞脲，乙酸苯汞，氯化苯汞，邻苯二酚苯基汞衍生物，苯基汞硝酸盐，苯基汞水杨酸盐，苯基磺酰胺杀真菌剂，氯瘟磷，四氯苯酞，邻苯二甲酰亚胺杀真菌剂，啶氧菌酯，哌丙灵，代森福美锌，聚合物二硫代氨基甲酸盐/酯杀真菌剂，多抗霉素，polyoxorim，聚硫醚杀真菌剂，叠氮化钾，钾聚硫醚，硫***，烯丙苯噻唑，咪鲜胺，腐霉利，霜霉威，丙环唑，丙森锌，丙氧喹啉，硫菌威，丙硫菌唑，吡喃灵，吡唑醚菌酯，吡唑杀真菌剂，吡菌磷，吡啶杀真菌剂，啶菌腈，啶斑肟，嘧霉胺，嘧啶杀真菌剂，咯喹酮，甲氧氯吡啶(pyroxychlor)，氯吡呋醚，吡咯杀真菌剂，羟基喹啉基乙酮(quinacetol)，醌菌腙(quinazamid)，quinconazole，喹啉杀真菌剂，醌杀真菌剂，喹喔啉杀真菌剂，苯氧喹啉(quinoxyfen)，五氯硝基苯，rabenzazole，防霉胺(salicylanilide)，硅噻菌胺，硅氟唑，叠氮化钠，邻苯基苯酚钠，五氯苯酚钠，多硫化钠，螺环菌胺，链霉素，嗜球果伞素类(strobilurin)杀真菌剂，磺酰基苯胺杀真菌剂，硫，戊苯砜(sultropen)，TCMTB，戊唑醇，叶枯酞，四氯硝基苯，tecoram，四氟醚唑，噻菌灵，thiadifluor，噻唑杀真菌剂，噻菌腈，噻氟菌胺，硫代氨基甲酸盐/酯杀真菌剂，thiochlorfenphim，硫柳汞，硫菌灵，甲基硫菌灵，噻吩杀真菌剂，克杀螨，福美双，噻唑菌酰胺，tioxymid，tivedo，甲基立枯磷，托萘酯，甲苯氟磺胺，甲苯基汞乙酸盐(tolylmercury acetate)，***酮，***醇，威菌磷，嘧菌醇(triarimol)，叶锈特，三嗪杀真菌剂，***杀真菌剂，咪唑嗪，三丁基锡氧化物，水杨菌胺，三环唑，肟菌酯，氟菌唑，嗪氨灵，灭菌唑，未分类的杀真菌剂，十一烯酸，烯效唑，尿素杀真菌剂，有效霉素，缬氨酰胺(valinamide)杀真菌剂，乙烯菌核利，氰菌胺，环烷酸锌，代森锌，福美锌，苯酰菌胺及其混合物。

除草剂是用来灭除不希望植物的农药。选择性的除草剂会灭除特定的靶标，而保留所要的作物相对不受损害。它们中的一些通过干扰杂草生长起作用并且通常基于植物激素。用来清除荒地的除草剂是非选择性的，会灭除所有与它们接触的植物材料。除草剂广泛用于农业和景观草坪管理。它们应用于公路和铁路维护的总体植物控制(TVC)计划。少量用于林业、牧场***和留作野生动物栖息地的区域的管理。

合适的除草剂可以选自包含下述的组：芳氧基羧酸类，例如2甲4氯，芳氧基苯氧基丙酸类，例如炔草酸(clodinafop)，环己烷二酮肟类，例如烯禾啶，羟基苄腈类，例如溴苯腈，磺酰脲类，例如烟嘧磺隆，***并嘧啶类，例如五氟磺草胺，三酮类，例如硝磺草酮，三嗪类除草剂，例如嗪草酮(metribuzin)，hexaxinone,莠去津；磺酰脲类除草剂，例如绿磺隆；尿嘧啶类，例如环草定，除草定或特草定；脲类除草剂，例如利谷隆，敌草隆，环草隆或草不隆；乙酰苯胺类除草剂，例如甲草胺或异丙甲草胺；硫代氨基甲酸酯类除草剂，例如杀草丹、野麦畏；恶二唑类除草剂，例如恶草酮，异恶唑类除草剂，苯氧乙酸；二苯醚除草剂，例如吡氟禾草灵，杂草焚，甲羧除草醚或乙氧氟草醚；二硝基苯胺除草剂，例如氟乐灵；有机膦酸酯除草剂，例如草丁膦盐和酯以及草甘膦盐和酯；和/或二卤代苯甲腈除草剂，例如溴苯腈或碘苯腈，苯甲酸除草剂，dipyridilium除草剂，例如百草枯；以及其他除草剂，例如广灭灵、***酮草酯、苯嘧磺草胺和pyroxasulphone。

特别优选的除草剂可选自2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，莠去津，麦草畏(苯甲酸类)，草甘膦，草铵膦，甲基咪草烟(咪唑啉酮类)，异丙甲草胺(氯乙酰胺类)，毒莠定，二氯吡啶酸，和绿草定(吡啶羧酸类或合成生长素)、它们各自的水溶性盐和酯及其混合物。

杀虫剂是用来对抗全部发育形式的昆虫的农药，并且包括用来对抗昆虫的卵和幼虫的杀卵剂和杀幼虫剂。杀虫剂用于农业、医药、工业和家居当中。

适宜的杀虫剂可以包括选自下述的这些：氯化的杀虫剂比如毒杀芬，滴滴涕，六氯-环己烷，γ-六氯环己烷，甲氧滴滴涕，五氯苯酚，TDE，艾氏剂，氯丹，开蓬，狄氏剂，硫丹，异狄氏剂，七氯，灭蚁灵及其混合物；有机磷化合物比如乙酰甲胺磷，保棉磷，地散磷，氯氧磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，二嗪磷，敌敌畏(DDVP)，百治磷，乐果，乙拌磷，灭克磷，苯线磷，杀螟硫磷，倍硫磷，噻唑磷，马拉硫磷，甲胺磷，杀扑磷，甲基-对硫磷，速灭磷，二溴磷，氧乐果，亚砜磷，对硫磷，甲拌磷，伏杀硫磷，亚胺硫磷，Phostebupirim，甲基嘧啶磷，丙溴磷，特丁硫磷，杀虫畏，Tribufos，敌百虫及其混合物；氨基甲酸酯类比如涕灭威，克百威，甲萘威，灭多威，2-(l-甲基丙基)苯基甲基氨基甲酸酯及其混合物；拟除虫菊酯比如烯丙菊酯，联苯菊酯，溴氰菊酯，氯菊酯，苄呋菊酯，苯醚菊酯(sumithrin)，胺菊酯，四溴菊酯，四氟苯菊酯及其混合物；植物毒素衍生的化合物比如鱼藤(鱼藤酮)，除虫菊，Neem(印楝素)，烟碱，咖啡因及其混合物；新烟碱类比如吡虫啉；阿维菌素例如甲氨基阿维菌素；噁二嗪类比如茚虫威；邻氨基苯甲酸二酰胺类比如氯虫苯甲酰胺(rynaxypyr)。

杀螨剂是杀死螨虫的杀虫剂。抗生素杀螨剂、氨基甲酸酯杀螨剂、甲脒杀螨剂、螨生长调节剂、有机氯、氯菊酯和有机磷杀螨剂均属于这一类。杀软体动物剂是用来防治软体动物比如蛾(moths)、蛞蝓和蜗牛的农药。这些物质包括四聚乙醛、甲硫威和硫酸铝。杀线虫剂是用于杀死寄生线虫(蠕虫门)的化学农药。

最优选地，存在于本发明的农业化学制剂或种子包衣组合物中的活性物质选自***类杀真菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂或其组合。特别是戊唑醇、粉唑醇、多菌灵、嘧菌酯、醚菌酯、环唑醇或唑菌胺酯。

除了农业化学活性物质或作为农业化学活性物质的替代物，还可以存在营养物质。在此类制剂中，营养物通常为干燥形式。

营养物可优选为固体营养物。固体营养物在本发明中应理解为是指熔点高于20℃(在标准压力下)的物质。固体营养物还将包括不溶性营养物成分，即在水中溶解度使得添加后浓缩物中存在显著固体含量的营养物成分。

营养物是指促进或改善植物生长所需或必需的化学元素和化合物。合适的营养物通常被描述为大量营养物或微量营养物。用于根据本发明的浓缩物的合适营养物是所有营养化合物。

微量营养物通常是指微量金属或微量元素，并且通常以较低剂量施用。合适的微量营养物包括选自锌、硼、氯、铜、铁、钼和锰的微量元素。微量营养物可以是可溶形式或作为不溶性固体包括在内，并且可以是盐或螯合的。

大量营养物通常是指包含氮、磷和钾的这些，并且包括诸如硫酸铵的肥料和水调节剂。合适的大量营养物包括肥料和其他含氮、磷、钾、钙、镁、硫的化合物和水调节剂。

合适的肥料包括提供营养物质如氮、磷、钾或硫的无机肥料。肥料可以以相对较低的浓度或作为更浓缩的溶液包含在稀释的制剂中，在非常高的水平下，可以包括固体肥料及溶液。

设想营养物的包含将会取决于特定营养物，并且微量营养物通常以较低浓度包含，而大量营养物通常以较高浓度包含。

生物刺激剂组分可添加到制剂或种子包衣组合物中以促进作物植物的生长。生物刺激剂组分可以包括或由一种或多种生物刺激剂组成。

有用的生物刺激剂的实例包括但不限于植物生长激素和植物生长调节剂，例如细胞***素、生长素、赤霉素、乙烯、脱落酸。其他生物刺激剂包括蛋白水解物衍生物、海藻提取物、氨基酸、植物提取物、壳聚糖衍生物、生物聚合物、无机化合物、腐殖质物质、微生物接种物和微生物产品或其混合物。

本发明的佐剂将为包含其的农业化学制剂提供佐剂(adjuvancy)，特别是可用于提供杀菌剂佐剂。

如本文所用，术语“佐剂”或“佐药”是指当添加到农业化学制剂中时将改善农业化学品预期效果的化合物。佐剂可通过其对活性物质性能的改善而影响稀释剂、混合物、活性物质或目标物。佐剂可用于将农药粘附在农药起作用的区域，改变叶表面表皮层允许农药进入，和/或使目标害虫对农业化学制剂中的活性农药敏感。

特定的佐剂作用可包括表面活性剂、乳化剂(分散剂和悬浮剂)、油、乳化油、相容剂、缓冲剂和调节剂、消泡剂、沉积剂、漂移控制剂、增稠剂、展着剂(润湿剂)、粘着剂(增稠剂和扩展剂)、植物渗透剂、转位分子、土壤渗透剂、稳定剂(紫外线过滤器)和/或害虫对活性农药的致敏作用。

优选地，本发明的佐剂可在配制用于桶添加使用或直接配制成农药浓缩物的佐剂中用作唯一成分或主要功能剂。

作为佐剂活性与单独用杀菌剂(例如唑菌胺酯)对灰灰葡萄孢菌活性关系的量度，可以定义抑制率(佐剂和杀菌剂)除以抑制率(杀菌剂)的值，期望更高的值。因此，值为1表示佐剂/杀菌剂组合与单独用杀菌剂的活性相等，而值大于1表示佐剂/杀菌剂组合的活性高于单独用杀菌剂。本发明的活性值可大于1。优选地，大于1.5，最优选地大于2。

本文所述的所有特征可以以任何组合方式与任何上述方面组合。

实施例

为了可以更容易地理解本发明，现在将通过实施例的方式参考以下描述。

可以理解，列出的所有测试和物理特性都是在大气压和室温(即20-25℃)下测定的，除非本文另有说明，或除非在引用的测试方法和程序中另有说明。

形成和提取

生物测定指导下对真菌黑葡萄穗霉培养物提取物RKDO1264进行分级分离，分离出苯螺补身烷和stachybocin A。将分离物RKDO1264-在YM琼脂(w/v:1％麦芽提取物、0.2％酵母提取物、1％葡萄糖、2％琼脂)上培养，并在22℃下孵育14天。在无菌50mL试管中使用8个菌落外植体(约3mm³)接种15mL YM肉汤(w/v:1％麦芽提取物、0.2％酵母提取物、1％葡萄糖)，并在200RPM、22℃下摇动5天以产生种子接种物。种子培养物用于接种包含在锥形瓶中的发酵培养基(w/v:15％蔗糖、2％酵母提取物、0.05％七水硫酸镁和1％L-亮氨酸)。

在22℃、21天后，用1体积乙酸乙酯提取发酵物，并在175RPM下摇动60分钟。通过Whatman#3滤纸过滤澄清提取物，并在化学纯化之前真空除去溶剂。

RKDO1264发酵提取物在Siliasep C18快速色谱柱(43g C-18)上使用10％CH₃OH:90％H₂O至100％CH₃OH的梯度在Teledyne Nextgen 300⁺Combiflash上分离20分钟。级分在Thermo Scientific Accela UHPLC上进行分析，该UHPLC与带有SEDEX 80LT ELSD和Thermo光电二极管阵列(PDA)检测器的Thermo Exactive电喷雾质谱仪(ESI-MS)耦合。使用反相C-18HPLC(Kinetex 5μm C₁₈柱，10x250 mm)在Waters HPLC***上纯化含有苯螺补身烷和stachybocin A的级分，该***具有蒸发光散射检测器(Waters 2424)和质谱仪(Waters3100)。用流速为3mL/min的60％CH₃CN水溶液的等度洗脱进行苯螺补身烷和stachybocin A的初始纯化。

苯螺补身烷和stachybocin A的结构通过质谱和NMR分析联合鉴定。在BrukerAvance III 400MHz NMR光谱仪上记录NMR谱，对于¹H和¹³C，分别在400和150MHz下操作。光谱参考残留的未氘化的溶剂峰。

代谢产物的NMR分析与文献数据相匹配，并确认其结构为苯螺补身烷(Ia)、苯螺补身烷烷(Ib)和stachybocin A(IIa)。

佐剂实施例

参数“抑制率”和“倍数变化”应理解为表示如下计算：

抑制率-抑制率应理解为表示杀菌剂和/或佐剂在22℃下孵育48小时后相对于载体处理对照抑制可见的微生物生长的量。使用下式计算：

其中：

(即载体处理的对照)，以及

(即溶剂，如水C₂H₅OH、CH₃OH、CH₃CN、DMSO)中的杀菌剂和/或佐剂的琼脂上生长的菌落直径。

倍数变化-倍数变化是佐剂/杀菌剂组合与单独用杀菌剂相比抑制微生物的一种量度。这表明佐剂相对于单独用杀菌剂的性能如何。使用下式计算：

INH_AF/INH_F

其中：

INH_AF＝用杀菌剂和佐剂处理时对真菌生长的抑制率，和

INH_F＝单独用杀菌剂处理时对真菌生长的抑制率。

实施例-佐剂性

将灰葡萄孢菌(ATCC 90479)在Difco马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养7天，每天进行UV循环(12小时UV光和12小时黑暗)。在缓冲的无菌盐水溶液(w/v:0.9％NaCl和1％吐温80)中收获孢子并使用血细胞仪计数。将孢子悬浮液调节至8.5x10⁶孢子/mL的最终浓度，以形成标准化接种物。

为了制备用于佐剂试验的菌丝片段，在150x25mm的试管中使用8.5x10⁴孢子接种10mLDifco马铃薯葡萄糖肉汤。将试管在220RPM、22℃下孵育48小时。为了从培养物中产生菌丝片段，将培养物转移到含有约20个无菌5mm直径玻璃珠的50mL塑料锥形管中，并涡旋5分钟。涡旋后，将试管静置5分钟，使大菌丝团沉降，然后除去含有菌丝片段的顶层并用作生长抑制试验的接种物。

将杀菌剂和佐剂溶解在甲醇中并添加到熔融的PDA(～50℃)中，然后将琼脂分布在12孔多孔板(1mL/孔)的孔中。将平板冷却至室温，并向每个孔的中心添加10μL菌丝接种物。将平板在22℃下孵育48小时，然后使用数字卡尺测量菌落直径。生物生长对照由菌丝和载体(0.07％甲醇)组成，阴性对照为培养基和载体(0.07％甲醇)。

本发明的佐剂活性物质的结果显示在表1-3中。

表1佐剂对唑菌胺酯(Pyra)杀菌活性的影响。

表2.-佐剂对戊唑醇(Teb)杀菌活性的影响。

表3-佐剂(Ia)对烯酰吗啉、丙硫菌唑、代森锰锌、甲霜灵和嘧霉胺的杀菌活性的影响。

佐剂对杀菌活性的影响表现为生长抑制的倍数增加。值为1表示杀菌活性没有增加。值小于1表示杀菌活性降低，值大于1表示杀菌活性增加。

对于每种测试的化合物，观察到唑菌胺酯对灰葡萄球菌的佐剂活性，最显着的是苯螺补身烷(Ia)和苯螺补身烷(Ib)，与单独使用唑菌胺酯(0.1μg/mL)相比，其杀菌活性增加了33.83倍和17.87倍。

与单独使用戊唑醇(0.05μg/mL)相比，苯螺补身烷(Ia)显示杀菌活性提高了39.68倍。

与单独使用烯酰吗啉、丙硫菌唑、代森锰锌、甲霜灵和嘧霉胺相比，苯螺补身烷(Ia)和(Ib)以及stachybocin A(IIa)显示出增加的杀菌活性。

在任何测试浓度下，苯螺补身烷(Ia)和(Ib)以及stachybocin A(IIa)本身都没有表现出任何固有的杀菌活性。

实施例-细胞毒性

体外评估了苯螺补身烷和stachybocin A对非洲绿猴Vero肾细胞(ATCC CCL-81)的细胞毒性。在T75 cm²细胞培养瓶中，在补充有10％(v/v)胎牛血清(VWR)、100μU青霉素和0.1mg/mL链霉素的15mL伊格尔氏基本成分培养基(Sigma)中培养细胞。将细胞在37℃、5％CO₂的加湿气氛中孵育24小时。每2-3天更换一次培养基，不要让细胞融合度超过80％。

在80％融合时，将细胞计数、稀释并在90μL生长培养基中以每孔10000个细胞的细胞密度铺板于96孔平底细胞培养板(Corning)中。将平板在37℃、5％CO₂的加湿气氛中孵育24小时，以使细胞在处理前粘附在平板上。24小时后，将佐剂溶解在DMSO中，系列稀释并以1μg/mL至128μg/mL的最终浓度加入孔中。DMSO作为载体，在孔中的最终浓度为1％。

将平板在37℃、5％CO₂的加湿气氛中孵育24小时，然后将alamarBlue(Invitrogen)以10％的培养物体积添加到每个孔中。使用Thermo Scientific VarioskanFlash平板读数器在添加alamarBlue后的时间0和4小时以560/12激发、590nm发射监测荧光。从最终读数中减去时间零发射590nm测量值后，计算出相对于载体对照孔的细胞存活推断百分比。

在测试的最高浓度(128μg/mL)下，苯螺补身烷(Ia)和(Ib)以及stachybocin A(IIa)对Vero细胞没有表现出任何细胞毒性，这表明佐剂在测试的浓度下对哺乳动物细胞没有毒性。

实施例-植物毒性

在大豆和奶油生菜叶片上对苯螺补身烷(Ia)的植物毒性进行了评价。大豆种子接种慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，并播种在9cm²塑料盆中的LevingtonM3堆肥中。大豆植株用SON-T灯泡进行补充照明。使用生物防治来防止蓟马损害(Bioline–Amblyseius cucumeris)。温室温度设置为白天保持22℃±2，夜间保持19℃±2。以同样的方式种植生菜，不接种根瘤菌。通过LED灯泡提供补充照明。所有的植物都保持良好的浇水状态，并生长14天。

将试验化合物/提取物重悬于2％DMSO(0.10％，1.0g/L)中。Synperonic A11 LQ作为阳性对照，Atplus UEP-100作为阴性对照。以6个10μL液滴的形式在叶片表面进行处理。植物毒性组织损伤在处理后1天和7天进行评估，评分等级为0至3。结果如表4所示。

表4-佐剂对大豆和奶油生菜的植物毒性作用。

化合物/提取物在1g/L下的植物毒性作用表示为平均植物毒性坏死评分，其中0＝无坏死；1＝接种部位轻微点状坏死；2＝环状坏死；3＝扩展性坏死。

苯螺补身烷(Ia)在7天后对大豆或奶油生菜叶没有表现出任何植物毒性。RKDO1264粗提取物在7天后对大豆和奶油生菜表现出非常小的植物毒性(得分分别为0.4和0.2)。

应理解，本发明不限于上述实施例的细节，这些实施例仅以示例的方式描述。许多变化是可能的。

Claims (14)

1.一种农业化学制剂，其包括：

i)佐剂，所述佐剂选自根据式(I)的苯螺补身烷

其中：

R₁独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基或胺；

R₂独立地表示氢、C₁-C₆烷基、苯基、取代的苯基、烷基苯基或取代的烷基苯基；

R₃和R₄独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

或根据式(II)的苯螺补身烷；

R₁₀独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羧基；

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢或C₁-C₄烷基；和

ii)至少一种农用化学活性物质。

2.根据权利要求1的制剂，其中所述佐剂是根据式(I)的化合物并且其中；

R₁表示羟基、甲氧基或胺；

R₂表示正丁基、异丁基、苯基或甲基苯基；

以及R₃和R₄独立地表示氢、甲基或乙基。

3.根据权利要求1的制剂，其中所述佐剂是根据式(I)的化合物并且其中；

R₁表示羟基；

R₂表示异丁基或甲基苯基；

以及R₃和R₄独立地表示氢。

4.根据权利要求1的制剂，其中所述佐剂是根据式(II)的化合物并且其中；

R₁₀表示氢、羟基、甲氧基或羧基；以及

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢、甲基或乙基。

5.根据权利要求1的制剂，其中所述佐剂是根据式(II)的化合物并且其中；

R₁₀表示羧基；以及

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢。

6.根据任意前述权利要求的制剂，其中所述佐剂选自下面各式的苯螺补身烷：

7.一种适用于制备根据权利要求1的农业化学制剂的浓缩物制剂，所述浓缩物包括；

i)佐剂，所述佐剂选自根据式(I)的苯螺补身烷；

其中：

R₁独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基或胺；

R₂独立地表示氢、C₁-C₆烷基、苯基、取代的苯基、烷基苯基或取代的烷基苯基；

R₃和R₄独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

或根据式(II)的苯螺补身烷；

R₁₀独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羧基；

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢或C₁-C₄烷基；和

ii)至少一种农用化学活性物质。

8.选自根据式(I)

其中：

R₁独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基或胺；

R₂独立地表示氢、C₁-C₆烷基、苯基、取代的苯基、烷基苯基或取代的烷基苯基；

R₃和R₄独立地表示氢或C₁-C₄烷基；

或根据式(II)

R₁₀独立地表示氢、C₁-C₄烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羧基；

R₁₁、R₁₂、R₁₃和R₁₄各自独立地表示氢或C₁-C₄烷基；的苯螺补身烷的化合物作为包含至少一种农用化学活性物质的农业化学制剂中的佐剂的用途。

9.一种处理植物以控制害虫的方法，该方法包括将根据权利要求1的制剂或稀释的根据权利要求7的浓缩物制剂应用于所述植物或所述植物的直接环境。

10.一种获得根据权利要求1的佐剂的方法，包括以下步骤：

在促进黑葡萄穗霉中根据第一方面的佐剂的代谢合成的条件下，在培养基中培养黑葡萄穗霉RKDO1264，以及

从培养基中纯化合成的佐剂。

11.一种由农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登记号NRRL-67988的黑葡萄穗霉菌株RKDO1264组成的生物体。

12.一种从由农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登记号NRRL-67988的黑葡萄穗霉(Stachybotrys char tarum)菌株RKDO1264组成的生物体中获得的提取物，所述提取物包含根据权利要求1的苯螺补身烷。

13.一种处理植物以控制害虫的方法，该方法包括将根据权利要求11的生物体或根据权利要求12的提取物应用于所述植物或所述植物的直接环境。

14.一种种子包衣组合物，其包含根据权利要求1的佐剂或根据权利要求11的生物体。