CN117479837A - RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法 - Google Patents

RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117479837A
CN117479837A CN202280022643.9A CN202280022643A CN117479837A CN 117479837 A CN117479837 A CN 117479837A CN 202280022643 A CN202280022643 A CN 202280022643A CN 117479837 A CN117479837 A CN 117479837A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanoparticle
plant
virus
polynucleotide
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280022643.9A
Other languages
English (en)
Inventor
O·肖塞约夫
A·施罗德
A·阿维塔尔
N·萨多特穆兹卡
Z·L·佩斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technion Research and Development Foundation Ltd
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Original Assignee
Technion Research and Development Foundation Ltd
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technion Research and Development Foundation Ltd, Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem filed Critical Technion Research and Development Foundation Ltd
Publication of CN117479837A publication Critical patent/CN117479837A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/60—Isolated nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/12—Powders or granules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/26—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests in coated particulate form
    • A01N25/28—Microcapsules or nanocapsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明提供了一种纳米颗粒，其包括:(a)两亲性共聚物，所述两亲性共聚物包括共价结合到疏水结构域的可电离聚合物；和包括60至500个核碱基的多核苷酸。进一步提供了包括本发明的纳米颗粒的组合物以及其使用方法。

Description

RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月21日提交的标题为“RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法(RNAI NANOPARTICLES AND METHODS OF USING SAME IN AGRICULTURE)”的美国临时专利申请号63/139,904的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明属于农业组合物领域，特别是用于递送农业活性剂如基因沉默多核苷酸的制剂。
技术背景
RNA干扰(RNAi)是一种基因调控机制，也称为植物转录后基因沉默(PTGS)。这种机制是序列特异性的，因为它依赖于双链RNA(dsRNA)前体来触发该过程。在植物中，RNaseIII样酶(Dicer样(DCL)蛋白)将dsRNA加工成21-24个碱基对(bp)的短干扰RNA(siRNA)，其指导转录物识别和下游降解。与哺乳动物细胞不同，DCL蛋白优选加工长的dsRNA前体，然后通过胞间连丝在植物细胞之间进行明显的siRNA迁移，因此，RNAi被认为可能成功地将***抗性应用于植物病毒。为了利用RNAi，dsRNA需要通过递送途径进入细胞的细胞质。裸dsRNA的叶面施用(foliar application，叶面施肥)危及其稳定性并导致短的沉默期，而标准递送方法(例如，农杆菌属和/或DNA载体)具有其自身的局限性，例如抑制脱靶基因。
病毒性葡萄卷叶病(viral grapevine leafroll disease，GLD)是需要用于递送基因沉默多核苷酸的农业上可接受的组合物的非限制性实例。古代和现代的葡萄酒产业在很大程度上依赖于健康的藤和优质的葡萄。近几十年来，GLD通过降低作物产量和阻碍浆果质量指标(如簇大小、pH、糖水平和颜色)对全球葡萄酒生产构成重大威胁，从而导致重大经济影响。在与GLD相关的各种病毒中，葡萄卷叶相关病毒3(grapevine leafrollassociated virus3，GLRaV-3)是最普遍和最严重的菌株，其引起强烈的疾病症状，并降低植物活力和寿命。在新西兰，GLRaV-3强烈延迟了长相思浆果(Sauvignon blanc berries)的成熟的开始，并降低了其可滴定酸度。在美国密歇根州本顿港(Benton Harbor,Michigan,USA)，与健康藤相比，受感染的品丽珠品种(Cabernet Franc cultivar)的每藤葡萄产量和可溶性固体含量受到损害。GLRaV-3属于葡萄卷叶病毒属(Ampelovirusgenus)，由螺旋单部分(monopartite)、正义、单链RNA基因组组成，大小近18.5kb。它包括12个开放阅读框，分别编码复制和结构相关蛋白，如RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)和外壳蛋白(CP)，以及其它必需蛋白。尽管实施了管理GLD的实际策略，通过控制粉蚧媒介(mealybugvector)以及上至提供经认证的种植材料来记录、绘制和根除受感染的藤，但考虑到控制病毒传播和分布的挑战，大多数策略均无效。
仍然非常需要新的技术方法来以农业上可接受的形式递送多核苷酸(例如，基因沉默多核苷酸)。
发明内容
在一些实施方式中，本发明涉及用于基于聚阳离子纳米颗粒(NP)的长dsRNA的递送平台。
本发明部分地基于以下发现：本文所述的dsRNA-PEI NP在叶面施用后的连续田间试验中实现了病原体(致病因子，pathogenic agent)(例如GLRaV-3)的敲低。
本发明还部分地基于以下发现：本文所述NP的合成是容易、快速和可扩展的，从而在环境条件下产生稳定的NP。
本发明还部分地基于以下发现：本文提供的NP提供了通过叶(例如，葡萄藤叶)运输***的被动递送以及防止核酸酶降解的序列保护。
因此，在一些实施方式中，本发明公开了基于脂质修饰的聚乙烯亚胺(lmPEI)NP的长dsRNA的递送平台，用于有效***治疗病毒感染，包括但不限于由GLRaV-3诱导的GLD。
根据第一方面，提供了纳米颗粒，包括:(a)两亲性共聚物，其包括共价结合至疏水结构域的可电离聚合物；和(b)包括60至500个核碱基(nucleobases)的多核苷酸；
其中可电离聚合物包括胺基；其中纳米颗粒内的氮与磷酸根(phosphate)(N:P)摩尔比的范围为2:1至7:1，其中多核苷酸与可电离聚合物非共价结合，并且其中疏水结构域包括烷基链，其长度足以使纳米颗粒在水溶液中稳定至少1小时的时间段。
根据另一方面，提供了包括本文公开的多个纳米颗粒和农业上可接受的载体的组合物。
根据另一方面，提供了将多核苷酸引入植物的方法，该方法包括将植物或其部分与治疗有效量的以下物质接触:(a)本文公开的纳米颗粒；或(b)本文公开的组合物，从而将多核苷酸引入植物。
根据另一方面，提供了用于预防或治疗植物中病毒性传染病的方法，该方法包括将植物或其部分与治疗有效量的以下物质接触:(a)本文公开的纳米颗粒；或(b)本文公开的组合物，从而预防或治疗植物中的病毒性传染病。
在一些实施方式中，烷基链包括10至14个碳原子。
在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸(颗粒大小，粒径，particle size)在100nm和500nm之间。
在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸在150nm和350nm之间。
在一些实施方式中，胺基是伯胺基、仲胺基、叔胺基或其任何组合中的任何一种。
在一些实施方式中，可电离聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。
在一些实施方式中，PEI包括分枝PEI。
在一些实施方式中，分枝PEI包括分枝烷基化PEI。
在一些实施方式中，分枝烷基化PEI包括至多12个碳原子的烷基链。
在一些实施方式中，纳米颗粒还包括生物活性剂。
在一些实施方式中，非共价结合是静电结合。
在一些实施方式中，多核苷酸包括100至350个核碱基。
在一些实施方式中，多核苷酸包括多种多核苷酸类型。
在一些实施方式中，多核苷酸包括RNA。
在一些实施方式中，RNA包括双链RNA(dsRNA)。
在一些实施方式中，RNA与以下任一种具有至少70％的互补性：(i)源自病原体的至少一种RNA分子；和(ii)源自植物细胞的至少一种RNA分子。
在一些实施方式中，病原体是植物病原体。
在一些实施方式中，病原体是病毒。
在一些实施方式中，多个纳米颗粒的特征在于多分散指数(PDI)范围为1至1.5。
在一些实施方式中，多个纳米颗粒的特征在于平均ζ电位的范围为-5mV至40mV。
在一些实施方式中，载体选自：溶剂、表面活性剂、分散剂、粘接剂、铺展剂(spreading agent)、增效剂、渗透剂、相容剂、缓冲液、消泡剂、增稠剂、抗漂移剂及其任何组合。
在一些实施方式中，通过喷洒、浸润、浸渍、浸泡、注射或其任何组合来配制组合物以供施用。
在一些实施方式中，病毒性传染病包括葡萄卷叶病(grapevine leafrolldisease)(GLD)。
在一些实施方式中，病毒性疾病由属于葡萄卷叶病毒属的病毒诱导。
在一些实施方式中，病毒性疾病由选自葡萄卷叶相关病毒(GLRaV)的病毒诱导。
在一些实施方式中，病毒性疾病由病毒GLRaV-3诱导。
在一些实施方式中，治疗包括降低在植物或其部分中诱导病毒性传染病的病毒的滴度。
在一些实施方式中，治疗包括降低植物卷曲叶子的数量、植物叶子向下卷曲或呈杯状(cupping)的比率及其组合中的任何一种。
在一些实施方式中，接触包括对植物或其部分进行喷洒、浸润、浸渍、浸泡、注射或其任何组合。
在一些实施方式中，植物部分包括植物的叶。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可以在本发明实施方式的实践或测试中使用与本文所述类似或等效的方法和材料，但下面描述示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，不一定是限制性的。
从下文给出的详细描述中，本发明的进一步实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应该理解的是，虽然指示本发明的优选实施方式，但详细描述和具体实例仅通过示例给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将从该详细描述中变得显而易见。
附图说明
图1A-1F包括显示dsRNA-lmPEI纳米颗粒的显微照片和图。(1A)纳米颗粒合成的说明图示，包括脂质化的(lapidated)尾部缀合物和制剂。(1B)呈现具有内部有序结构域的dsRNA-lmPEI纳米颗粒的cryoTEM图像及其从dsRNA质心到另一个质心的纤维间间距(7.3±2mm)的相关快速傅立叶变换测量。(1C)显示纳米颗粒在不同N:P比例下的ζ电位(N＝3)的图。(1D)在不同N:P比例下dsRNA结合的凝胶电泳检查(2％琼脂糖，100V，35分钟)的显微照片。(1E)通过动态光散射测量的强度显示纳米颗粒尺寸分布的图。(1F)显示纳米颗粒在室温、25mM乙酸钠、pH＝5.2下超过40天的稳定性的图。
图2A-2D包括显示颗粒穿透和生物分布的图像、显微照片和图。(2A)通过喷洒或浸没施用2h后，藤叶内Cy5标记颗粒的分布(比例尺-1mm)。(2A)2h后在叶脉内观察到颗粒积累，在中上部插图中用箭头标记(比例尺-500μm)。(2B)藤叶的HR-SEM图像显示叶表面上的多个气孔(右图，箭头强调；比例尺＝40μm)。打开气孔尺寸测量为6.105μm宽，16.14μm长，是dsRNA-lmPEI颗粒渗透到植物中的可能途径(左图；比例尺＝5μm)。(2C)将藤苗叶浸入Gd缀合颗粒的水溶液中72h。在施用点以上或以下的植物组织中定量钆浓度。(2D)在施用给表达质膜定位GFP的转基因拟南芥的根后3h记录脂质化颗粒的摄取和积累(左图)。与缺乏脂质尾部的颗粒相比，脂质化颗粒的颗粒摄取增加了7.35倍，表明制剂中脂质存在的作用促进了植物细胞的摄取(N＝4，右图)。结果显示为平均值±SD。普通双因素ANOVA检验用于(D)的统计分析。ns-不显著，****p<0.0001。
图3A-3G包括与颗粒功效相关的显微照片、图示和垂直柱状图。(3A)凝胶图像意味着lmPEI载体可以保护dsRNA免受RNase A活性的影响(2％琼脂糖，100mV，35分钟)。当裸露时，RNA序列被RNase A降解(左侧第三个孔)，而不是与颗粒形式的lmPEI复合时保持其完整性(箭头)。此外，dsRNA从络合物中释放在有和没有RNase A活性和抑制的情况下都是相同的(右侧第二个和第四个孔)。(3B)整个2020年田间试验的感染严重程度评分显示，与单剂量相比，多剂量治疗的藤的GLD症状延迟。(3C)葡萄卷叶相关病毒3开放阅读框与转录和结构RNAi靶标(虚线)的图示。(3D)与未经治疗的感染藤相比，在2018年田间试验中单次施用颗粒后，GLRaV3表达降低。敲低效应在远离浸没治疗点的枝条组织内是明显的。(3E)分别将施用方改变为法冠层喷洒，在治疗后(PT)三周设法保持病毒下调。(3F-3G)2020年收获后获得的白利糖度(Brix)(3F)和浆果重量(3G)的葡萄品质参数值表明，在恢复治疗的藤浆果中，多次治疗优于单一治疗，并表明可能需要多次施用来完全恢复浆果品质。结果显示为平均值±SD。普通单因素ANOVA检验用于3D、3F和3G的统计分析。ns-不显著，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。
图4包括显示dsRNA-lmPEI包封效率的垂直柱状图。
图5包括显示肝素释放测定的凝胶电泳分析的显微照片。
图6包括显示2019年试验中治疗后(PT)3、5和8周的浆果pH的垂直柱状图。
图7包括显示2019年试验中治疗后(PT)3、5和8周的浆果单宁指数的垂直柱状图。
图8包括显示2019年试验中治疗后(PT)3、5和8周的浆果总酸含量的垂直柱状图。
图9包括显示2019年试验中治疗后(PT)3、5和8周的浆果颜色密度的垂直柱状图。
图10包括显示2019年试验中治疗后(PT)3、5和8周的浆果柔软度比的垂直柱状图。
图11A-11B包括显示两个样本的快速傅立叶变换(FFT)和径向积分的显微照片和图；样品(11A)和样品2(11B)。
图12包括显示浸没或喷洒的叶子中的游离Cy5生物分布的荧光显微照片。比例尺＝1mm。
图13包括显示2019年田间试验中GLRaV3相对表达的垂直柱状图。
图14包括显示整个2020年田间试验中GLRaV3相对表达的垂直柱状图。
图15包括显示感染严重程度评分的表格。
图16A-16B包括显示田间试验施用方法的描述的图像：2018年枝条浸没(16A)和2019年冠层喷洒(16B)。
图17包括显示使用Imaris软件用Cy5标记的dsRNA-lmPEI浸没2h后颗粒平均强度和数量的荧光定量的垂直柱状图。
图18包括显示本文公开的纳米颗粒的部分能量最小化分子力学模型的图示。
图19A-19B包括荧光显微照片，显示在时间零点(t＝0；19A)和3小时后(t＝3；19B)表达质膜定位GFP的转基因拟南芥的根。将根在非脂质化颗粒(2D的阴性对照)存在下培养。比例尺＝50μm。
图20A-20D包括显示脂质尾部与分枝PEI缀合的1HNMR验证的图和表格。(20A)净分枝EPI；(20B)净环氧化物；(20C)纯化的ImPEI。(20D)表总结了20A-20C中列出的官能团、1HNMR化学位移(ppm)和标记。
图21包括显示改变分枝PEI批号(batch LOT number)时N:P比例测定变化的显微照片。
图22包括显示脂质链长度对Cy5/GFP比例(相当于颗粒摄取)的影响的垂直柱状图。
图23A-23B包括显示在三个温度下测试14天时间段的平均直径(23A)和ζ电位(23B)的图。
具体实施方式
纳米颗粒
根据一些实施方式，提供了包括两亲性共聚物的纳米颗粒。在一些实施方式中，两亲性共聚物包括共价结合到疏水结构域的可电离聚合物。在一些实施方式中，两亲性共聚物是或包括接枝共聚物。在一些实施方式中，可电离聚合物包括胺基。
在一些实施方式中，两亲性共聚物的疏水结构域的长度基本上预先确定了本发明纳米颗粒的尺寸，其中尺寸如本文所述。在一些实施方式中，疏水结构域和可电离聚合物之间的重量比预先确定了本发明纳米颗粒的尺寸、多核苷酸负载和/或稳定性。在一些实施方式中，疏水结构域具有足以稳定纳米颗粒的长度。在一些实施方式中，两亲性共聚物的疏水结构域具有足够的长度以产生稳定的纳米颗粒。在一些实施方式中，稳定的纳米颗粒是指本发明纳米颗粒的物理或化学稳定性。在一些实施方式中，稳定的纳米颗粒基本上没有崩解。在一些实施方式中，稳定的纳米颗粒基本上没有多核苷酸从其泄漏。在一些实施方式中，稳定的纳米颗粒在溶液(例如水溶液)中基本上没有崩解。在一些实施方式中，稳定的纳米颗粒基本上没有聚集。
在一些实施方式中，当按重量计至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的颗粒保持至少90％的颗粒尺寸(包括其间的任何范围)时，本发明的纳米颗粒被称为稳定的。在一些实施方式中，当按重量计至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的颗粒在溶液(例如，水溶液)中保持至少90％的颗粒尺寸至少1小时、至少3小时、至少5小时、至少10小时、至少24小时、至少2天、至少10天、至少20天、至少1月、至少6月、至少1年的时间段(包括其间的任何值和范围)时，本发明的纳米颗粒被称为稳定的。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，当按重量计至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的颗粒保持至少80％的初始多核苷酸含量时，本发明的纳米颗粒被称为稳定的。
在一些实施方式中，当按重量计至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的纳米颗粒稳定地包封其中的多核苷酸时，本发明的纳米颗粒被称为稳定的。
在一些实施方式中，疏水结构域包括烷基(分枝或线性)。在一些实施方式中，烷基是烷基链，其包括10个至27个、10个至12个、12个至13个、13个至14个、14个至15个、15个至16个、16个至17个、17个至19个、10个至20个、12个至25个、15个至22个、17个至24个、19个至25个、或25个至27个碳原子(包括其间任何范围)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
本领域技术人员将了解，烷基链(或烷基)中碳原子的确切数量可以根据可电离聚合物的化学组成和分子量而变化。
在一些实施方式中，可电离聚合物包括伯胺基、仲胺基、叔胺基或其任何组合。在一些实施方式中，可电离聚合物能够在pH值低于可电离聚合物胺基pKa值的溶液中进行电离(正电离)。在一些实施方式中，可电离聚合物能够在pH值低于可电离聚合物胺基pKa值的溶液中进行质子化。在一些实施方式中，至少50重量％的可电离聚合物在pH值低于可电离聚合物胺基pKa值的溶液中带正电荷(或质子化)。在一些实施方式中，可电离聚合物是聚阳离子聚合物。在一些实施方式中，可电离聚合物在溶液中经历多次质子化，其中溶液如本文所述。
在一些实施方式中，可电离聚合物包括聚阳离子。在一些实施方式中，可电离聚合物包括聚胺。在一些实施方式中，可电离聚合物包括聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、壳聚糖和聚乙烯亚胺(PEI)中的任何一种或其任何组合。
在一些实施方式中，可电离聚合物包括聚乙烯亚胺(PEI)。
在一些实施方式中，PEI包括线性PEI。在一些实施方式中，PEI包括分枝PEI。在一些实施方式中，PEI包括缀合的PEI。在一些实施方式中，PEI包括分枝和烷基化PEI。在一些实施方式中，分枝烷基化PEI由数均摩尔质量(Mn)为约600g/mol(PEI600)的分枝PEI制备。
在一些实施方式中，本发明的两亲性共聚物包括分枝烷基化PEI。在一些实施方式中，分枝烷基化PEI包括具有12至16个碳原子的烷基链。在一些实施方式中，分枝烷基化PEI包括至多具有14个碳原子的烷基链。在一些实施方式中，提供了包括分枝缀合PEI600的纳米颗粒。
在一些实施方式中，PEI包括或是脂质修饰的PEI(lmPEI)。
术语“PEI”和“lmPEI”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“聚合物”是指包括至少5个重复单元(或单体)的分子，其中重复单元可以相同或不同(例如相同或不同的氨基酸)。
在一些实施方式中，分枝烷基化PEI包括至多14个碳原子、至多13个碳原子、至多12个碳原子、至多11个碳原子、至多10个碳原子、至多9个碳原子、至多8个碳原子、至多7个碳原子、至多6个碳原子、至多5个碳原子、至多4个碳原子、至多3个碳原子或至多2个碳原子(或其间的任何值和范围)的烷基链。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，烷基链与PEI共价结合。在一些实施方式中，烷基链通过C-N键与PEI共价结合。在一些实施方式中，烷基链通过酰胺键与PEI共价结合。在一些实施方式中，烷基链与PEI的氮原子共价结合。在一些实施方式中，烷基链与PEI的氨基共价结合。在一些实施方式中，烷基链与PEI的氨基共价结合，其中氨基包括伯胺、仲胺、叔胺或其组合。在一些实施方式中，烷基链与伯胺、仲胺或两者共价结合。在一些实施方式中，烷基链包括羟基取代基。
在一些实施方式中，PEI内的至少部分胺被烷基链取代(或共价结合至烷基链)，其中烷基链如本文所述。
在一些实施方式中，氨基的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少90％、至少95％(包括其间的任何范围)是烷基取代的，其中氨基包括伯胺、仲胺、叔胺或其组合。
在一些实施方式中，烷基化PEI通过使未取代(或处于原始状态)PEI与带有反应基团的烷基反应来合成，其中反应基团能够与PEI的氨基进行反应(如亲核加成或亲核取代反应)。在一些实施方式中，反应基团包括环氧(epoxy)、卤(halo)、羰基、酯、活化酯(如NHS酯)中任一种或其任何组合。能够与PEI的氨基反应以形成稳定的共价键的其它反应基团在本领域是周知的。
如本文所用，“烷基”或“烷基化的”是指具有1至14个碳原子的直链或分枝饱和烃基团的自由基(“C1-14烷基”)。在一些实施方式中，“烷基”或“烷基化的”是指具有1至28个碳原子的直链或分枝饱和烃基团的自由基(“C1-28烷基”)。在一些实施方式中，烷基具有C5-26烷基、C6-27烷基、C7-19烷基、C8-24烷基、C9-22烷基、C10-26烷基、C11-27烷基、C12-26烷基、C13-25烷基、C14-23烷基、C15-20烷基、C1-23烷基、C1-21烷基、C1-19烷基、C1-17烷基、C1-16烷基、C1-15烷基、C1-13烷基、C1-9烷基、C1-8烷基、C1-7烷基、C1-6烷基、C1-5烷基、C1-4烷基、C1-3烷基或C1-2烷基。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，烷基链由14个碳原子组成。在一些实施方式中，纳米颗粒包括由14个碳组成的烷基链。
在一些实施方式中，烷基化PEI中烷基化胺和非烷基化胺之间的摩尔比在100:1至1:3之间、在100:1至90:1之间、在90:1至80:1之间、在80:1至70:1之间、在70:1至60:1之间、在60:1至40:1之间、在40:1至20:1之间、在20:1至10:1之间、在10:1至5:1之间、在5:1至3:1之间、在3:1至1:1之间、在1:1至1:3之间、在1:1至1:2之间、在1:2到1:3之间，包括其间的任何值。
在一些实施方式中，烷基化PEI中烷基链与未修饰PEI之间的摩尔比为50:1和1:10之间、50:1和40:1之间、40:1和30:1之间、30:1和20:1之间、20:1和15:1之间、15:1和10:1之间、10:1和8:1之间、8:1和5:1之间、5:1和4:1之间、4:1和3:1之间、3:1和2:1之间、2:1和1:1之间、1:1和1:2之间、1:2和1:3之间、1:3和1:4之间、1:4和1:5之间、1:5和1:7之间、1:7和1:10之间，包括其间的任何值。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括氮与磷酸盐(N:P)的摩尔比，其范围为1:1至9:1、1:1至8:1、1:1至7:1、1:1至6:1、1:1至5:1、1:1至4:1、1:1至3:1、1:1至2:1、1:1至15:1、1:1至13:1、1:1至12:1或1:1至10:1。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒不含甾醇。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒不包括甾醇。在一些实施方式中，甾醇是或包括胆固醇。
在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸在100nm和500nm、150nm和500nm、200nm和475nm、150nm和350nm、175nm和400nm或200nm和390nm之间。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸在100nm和300nm之间。
在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸为至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少475nm或至少500nm。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸为至多100nm、至多150nm、至多200nm、至多250nm、至多300nm、至多350nm、至多400nm、至多450nm、至多475nm、或至多500nm。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，“颗粒尺寸”包括颗粒的直径。在一些实施方式中，直径包括纳米颗粒群的平均直径。
在一些实施方式中，纳米颗粒是聚阳离子纳米颗粒。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括单个薄片。在一些实施方式中，颗粒包括多个薄片。在一些实施方式中，纳米颗粒是单层(unilamellar)或多层(multilamellar)纳米颗粒。
在一些实施方式中，多核苷酸与纳米颗粒结合。在一些实施方式中，多核苷酸与多层纳米颗粒的多个薄片结合。在一些实施方式中，多核苷酸与多层纳米颗粒的至少2个薄片结合。在一些实施方式中，通过静电相互作用进行结合。在一些实施方式中，结合是静电结合。
在一些实施方式中，多核苷酸与多个薄片结合，以在颗粒内形成多个内部结构域。在一些实施方式中，多个薄片与多核苷酸结合，使得相邻薄片之间的距离范围为1至20nm、1至5nm、5至7nm、7至9nm、9至15nm、15至20nm、或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，多核苷酸与多个薄片结合以形成复合物(多聚物，polyplex)，其中该复合物如本文所述。在一些实施方式中，颗粒内相邻内部结构域(或复合物)之间的距离范围为1至20nm、1至5nm、5至7nm、7至9nm、9至15nm、15至20nm、或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，多核苷酸分层在纳米颗粒的脂质之上或之间。在一些实施方式中，多核苷酸被纳米颗粒的脂质覆盖或包裹。在一些实施方式中，纳米颗粒的脂质以螺旋形覆盖或包裹多核苷酸。
在一些实施方式中，颗粒内相邻内部结构域(或复合物)之间的距离在5至9nm之间(包括其间的任何范围)。
在一些实施方式中，多核苷酸包括60至500个核碱基、60至450个核碱基、60至400个核碱基、60至350个核碱基、60至250个核碱基、90至500个核碱基、90至375个核碱基、100至500个核碱基、100至350个核碱基或150至450个核碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，多核苷酸包括或由100至350个核碱基组成。
在一些实施方式中，多核苷酸包括至少60个核碱基、至少100个核碱基、至少200个核碱基、至少250个核碱基、至少300个核碱基、至少350个核碱基、至少400个核碱基、至少450个核碱基、至少475个核碱基或至少500个核碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，多核苷酸包括至多70个核碱基、至多100个核碱基、至多200个核碱基、至多250个核碱基、至多300个核碱基、至多375个核碱基、至多425个核碱基、至多475个核碱基、至多500个核碱基、至多750个核碱基、至多1000个核碱基、至多1250个核碱基、至多1750个核碱基、或至多2500个核核碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，多核苷酸包括多种多核苷酸类型。在一些实施方式中，纳米颗粒包括多种多核苷酸类型。在一些实施方式中，组合物包括多种纳米颗粒类型，每种类型的纳米颗粒包括具体的多核苷酸。
在一些实施方式中，具体的多核苷酸包括具有相同或同一核酸序列的多个多核苷酸分子。在一些实施方式中，具体的多核苷酸包括具有基本相同核酸序列的多个多核苷酸分子。
如本文所用，术语“复数”包括等于或大于2的任何整数。在一些实施方式中，复数包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10、或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
如本文所用，术语“多核苷酸类型”是指多种多核苷酸，每种多核苷酸包含的核酸序列与多种多核苷酸中的任何一个其它多核苷酸的不同之处为至少1个核碱基、至少1个核碱基、至少1个核碱基、至少1个核碱基、至少1个核碱基、或至少10个核碱基、或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，多核苷酸包括RNA、DNA、RNA的合成类似物、DNA的合成类似物、DNA/RNA杂化物或其任何组合。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括选自以下的多核苷酸：RNA、DNA、RNA的合成类似物、DNA的合成类似物、DNA/RNA杂化物或其任何组合。
在一些实施方式中，多核苷酸包括RNA或由RNA组成。
在一些实施方式中，多核苷酸包括抑制性核酸。在一些实施方式中，多核苷酸包括反义寡核苷酸。
如本文所用，“反义寡核苷酸”是指与DNA或RNA序列相反和互补的核酸序列。
如本文所述，“相反和互补核酸序列”是能够与由互补核苷酸碱基组成的另一个核酸序列杂交的核酸序列。“杂交”是指在适当的严格条件下在互补核苷酸碱基之间形成双链分子(例如，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)(或在RNA的情况下与尿嘧啶(U))形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对)。(参见例如Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。为了本方法的目的，抑制性核酸不需要与整个序列互补，其仅足以提供特异性抑制；例如，在一些实施方式中，序列与microRNA本身(例如‘种子序列’)5'端的至少核苷酸(nts)2-7或2-8(例如nts 2-7或20)100％互补。
在一些实施方式中，抑制性核酸具有一个或多个对主链或侧链的化学修饰。在一些实施方式中，抑制性核酸具有至少一个锁定的核苷酸，和/或具有硫代磷酸酯主链。
根据本文公开的发明有用的抑制性核酸的非限制性实例包括但不限于：反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物，如siRNA化合物、修饰的碱基/锁定核酸(LNA)、antagomirs、肽核酸(PNA)和其它寡聚化合物或寡核苷酸模拟物——其与靶核酸的至少部分杂交并调节其功能。在一些实施方式中，抑制性核酸包括反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包括修饰连接的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其组合。
在一些实施方式中，抑制性核酸是RNA干扰分子(RNAi)。在一些实施方式中，RNAi是或包括双链RNA(dsRNA)。
如本文所用，“干扰RNA”是指任何双链或单链RNA序列，其能够通过介导RNA干扰直接或间接(即转化后)抑制或下调基因表达。干扰RNA包括但不限于小干扰RNA(“siRNA”)和小发夹RNA(“shRNA”)。“RNA干扰”是指序列兼容的信使RNA转录物的选择性降解。
在一些实施方式中，多核苷酸被化学修饰。在一些实施方式中，化学修饰是多核苷酸主链的修饰。在一些实施方式中，化学修饰是多核苷酸的糖的修饰。在一些实施方式中，化学修饰是多核苷酸的核碱基的修饰。在一些实施方式中，化学修饰增加了多核苷酸在细胞中的稳定性。在一些实施方式中，化学修饰增加了多核苷酸在体内的稳定性。在一些实施方式中，化学修饰增加了多核苷酸在体外(如在露天、野外、暴露于空气的表面等)的稳定性。在一些实施方式中，化学修饰增加了多核苷酸诱导靶基因或序列(包括但不限于本文所述的源自病原体的RNA分子或源自植物细胞的RNA)沉默的能力。在一些实施方式中，化学修饰选自：磷酸核糖主链、磷酸脱氧核糖主链、硫代磷酸酯脱氧核糖主链、2'-O-甲基硫代磷酸酯主链、磷酸二酰胺吗啉代(phosphorodiamidate morpholino)主链、肽核酸主链、2-甲氧基乙基硫代磷酸酯主链、受限乙基主链、交替锁定的核酸主链、硫代磷酸酯主链、N3'-P5'氨基磷酸盐/酯(phosphoroamidates)、2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸、环己烯核酸主链核酸、三环DNA(tcDNA)核酸主链、配体缀合的反义及其组合。
在一些实施方式中，RNA与源自病原体的至少一种RNA分子具有至少70％的互补性、至少80％的互补性、至少90％的互补性、至少95％的互补性、至少97％的互补性、至少99％的互补性、或者100％互补性(或其之间的任何值和范围)。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，RNA与源自病原体的至少一种RNA分子具有70-95％的互补性、80-100％的互补性或75-99％的互补性。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。
在一些实施方式中，RNA与靶序列上的任何位置互补。在一些实施方式中，RNA与靶序列的3'端互补。在一些实施方式中，RNA与靶序列的3'非翻译区内的序列互补。在一些实施方式中，靶序列是基因或其转录物。在一些实施方式中，转录物包括前mRNA、成熟mRNA、选择性剪接的mRNA或其任何组合。
在一些实施方式中，RNA与源自植物细胞的至少一种RNA分子具有至少70％互补性、至少80％互补性、至少90％互补性、至少95％互补性、至少97％互补性、至少99％互补性或100％互补性(或其之间的任何值和范围)。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，RNA与源自植物细胞的至少一种至少一种RNA分子具有70-95％的互补性、80-100％的互补性或75-99％的互补性。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括或是复合物。在一些实施方式中，复合物包括与两亲性共聚物接触或结合的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸通过非共价键与两亲性共聚物结合。在一些实施方式中，多核苷酸通过静电相互作用与两亲性共聚物结合。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒还包括生物活性剂。
如本文所用，术语“生物活性剂”是指能够在细胞或生物体中引发直接生理反应的任何化合物。
在一些实施方式中，生物活性剂是抗生素化合物。在一些实施方式中，生物活性剂是抗真菌化合物。
在一些实施方式中，纳米颗粒内生物活性剂的w/w比在0.1和20％之间、在0.1和1％之间、在1和5％之间、在5和10％之间或在10和20％之间(包括之间的任何范围)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，纳米颗粒内生物活性剂和多核苷酸的w/w比在0.1和20％之间、在0.1和1％之间、在1和5％之间、在5和10％之间或在10和20％之间(包括之间的任何范围)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
组合物
根据一些实施方式，提供了包括本发明纳米颗粒和农业上可接受的载体的组合物。在一些实施方式中，本发明的组合物包括多个纳米颗粒。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括本发明的多个纳米颗粒和农业上可接受的载体。
在一些实施方式中，提供了包括本发明的纳米颗粒和可接受载体的农业组合物。在一些实施方式中，提供了农业组合物，其包括农业上有效量的本发明的纳米颗粒。在一些实施方式中，提供了农业组合物，其包括农业上有效量的本发明的多核苷酸。在一些实施方式中，农业上有效量包括治疗有效量。在一些实施方式中，治疗有效量针对农业生物体或作物。在一些实施方式中，敏感生物体或作物包括植物。
在一些实施方式中，载体是农业上可接受的载体。在一些实施方式中，农业上可接受的载体包括环境上可接受的载体。此类载体可以是待处理的动物、植物或环境能够耐受的任何材料。在一些实施方式中，载体包括任何材料，所述材料可以添加到本发明颗粒或包括该颗粒的组合物中，而不引起或不对环境或病原体以外的任何物种或生物体产生不利影响。此外，载体必须使得纳米颗粒或包括其的组合物对于将多核苷酸引入植物和/或预防或治疗植物中的病毒性传染病保持有效。
在一些实施方式中，农业上可接受的载体选自：溶剂、表面活性剂、分散剂、粘接剂、铺展剂、增效剂、渗透剂、相容剂、缓冲液、消泡剂、增稠剂、抗漂移剂或其任何组合。
在一些实施方式中，农业上可接受的载体是或包括表面活性剂。
在一些实施方式中，组合物中农业上可接受的载体的w/w浓度在0.1和99％之间、在0.1和1％之间、在1和10％之间、在10和20％之间、在20和30％之间、在30和50％之间、在50和60％之间、在60和80％之间、或在80和90％之间(包括之间任何范围)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，载体是液体载体。在一些实施方式中，载体被配置为喷洒和/或气溶胶应用。
在一些实施方式中，本发明的任何一种纳米颗粒或包括其的组合物的特征在于具有范围为1mV至10mV、1mV至20mV、1mV至30mV、1mV至40mV、5mV至25mV或5mV至35mV的平均ζ电位。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，本发明的多个纳米颗粒的特征在于多分散指数(PDI)在1和1.5之间(包括其间的任何值和范围)。在一些实施方式中，本发明组合物中的多个纳米颗粒中的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％不含颗粒尺寸小于100nm(或其之间的任何值和范围)的颗粒。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述多个纳米颗粒中的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％不含颗粒尺寸大于500nm(或其之间的任何值和范围)的颗粒。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，配制组合物用于通过喷洒施用。在一些实施方式中，配制组合物用于作为喷洒或气溶胶施用。在一些实施方式中，通过喷洒、浸润、浸渍、浸泡或注射来配制组合物以供施用。
使用方法
根据一些实施方式，提供了将多核苷酸引入植物的方法。
在一些实施方式中，该方法利用如本文所公开的纳米颗粒或包括其的组合物。
害虫防治
农业害虫在世界范围内造成重大产量和经济损失。害虫对化学杀虫剂的抗性并且繁殖策略的发展速度快于可以设计的，因此迫切需要害虫管理策略的替代方案。
开发由纳米颗粒载体递送的RNAi生物杀虫剂，其然后由植物摄取并递送给害虫，可以替代基于广谱化学的害虫和病原体控制措施，这些害虫和病原体将替代地以最小的脱靶效应被准确地且特异性地靶向。快速变化的病原体如真菌、细菌和病毒可以快速表征、测序并包括在RNAi生物杀虫剂中——这与当今标准的害虫防治实践相比具有明显的优势，后者需要几年的时间才能培育抗性或设计化学防护。
根据一些实施方式，本文公开的纳米颗粒及其使用方法针对病原体或害虫控制。在一些实施方式中，病原体是植物病原体。根据一些实施方式，提供了用于预防或治疗植物中病毒性传染病的方法。
害虫的非限制性实例包括但不限于昆虫、螨、蜱(和其它节肢动物)、小鼠、大鼠和其它啮齿动物、蛞蝓、蜗牛、线虫、绦虫(和其它寄生虫)、杂草、真菌、细菌、病毒和其它病原体。
在一些实施方式中，病原体选自：病毒、细菌、真菌、原生动物(例如但不限于动孢子原生动物(zoosporic protozoa))、线虫或节肢动物。
如本文所用，术语“病原体”和“害虫”是可互换的。
在一些实施方式中，病原体是病毒。在一些实施方式中，病原体是节肢动物。在一些实施方式中，病原体是线虫。在一些实施方式中，病原体是原生动物。在一些实施方式中，病毒通过节肢动物、线虫、原生动物中的任何一种传播。
在一些实施方式中，节肢动物包括昆虫或蛛形纲动物(arachnid)，包括其任何发育阶段，例如幼虫、若虫等。
在一些实施方式中，病毒包括由隐秘或管状粉蚧(obscure or tubber mealybug)(例如，暗色粉蚧(Pseudococcus viburni))传播的病毒。
植物病原体和/或害虫是常见的，并且对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
在一些实施方式中，病毒包括包含DNA、RNA或其杂化物的基因组。在一些实施方式中，病毒包括单链基因组(例如，基因组物质——由单链核酸分子组成)。在一些实施方式中，病毒包括双链基因组(例如，基因组物质——由两个彼此杂交的反平行核酸分子组成)。
在一些实施方式中，病毒属于葡萄卷叶病毒属。
植物代谢控制
水果的采后处理和控制对于减少供应链浪费、提高水果质量、农业盈利能力以及任何给定时间内的整体水果可用性都至关重要。通过纳米颗粒载体的RNAi靶向技术可用于植物基因的代谢控制，以提高农业粮食作物的价值。
根据一些实施方式，本文公开的纳米颗粒及其使用方法针对植物代谢控制。
采后场所(postharvest arena)问题的一个实例是香蕉褐变，这是由于冷害和物理应力引起的，导致其商业价值显著下降。褐变的发生主要是由于多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶的产生增加。RNAi诱导的负责PPO和PAL酶基因的沉默可以确保整个供应链的安全网。在一个实施方式中，本发明的纳米颗粒包括RNA多核苷酸，其与源自植物细胞的编码PPO、PAL或其组合的RNA分子具有至少70％互补性。果实采后控制的另一个感兴趣的领域是番茄成熟和储存适应性。已显示出番茄红素快速积累，与红色值和番茄硬度显著相关。番茄红素由萜类前体产生，并由番茄红素环化酶不断分解成β-胡萝卜素。在成熟之前，番茄红素环化酶抑制番茄红素积累，因此番茄保持绿色。由于番茄红素环化酶在成熟过程中受到抑制，番茄变得更红更软。因此，RNAi诱导的番茄红素环化酶沉默可能影响番茄红素的积累并引发番茄的成熟。在一个实施方式中，本发明的纳米颗粒包括RNA多核苷酸，其与编码源自植物细胞的番茄红素环化酶的RNA分子具有至少70％互补性。
RNAi技术还可以影响植物在农业生长周期中的代谢。使用RNAi有效靶向基因组并改变产生的表型而不对植物进行基因修饰是一种具有无限潜力以应对诸如气候变化、市场需求或监管障碍的日益重要的问题的策略。主动沉默植物基因的一个此类实例是直接降低负责作物中某些不需要的代谢物的产生和积累的某些基因的活性。例如，在种植作物是为了替代***素、纤维、谷物或芳香萜烯的情况下，***种植过程中积累的四氢***酚(THC)作为“***(hemp)”是一种不需要的副产品。选择性RNAi沉默***素合酶如四氢***酚酸合酶(tetrahydrocannabinolic acid synthase，THCAS)和环萜酚酸合酶(cannabichromenicacid synthase，CBCAS)，或甚至沉默负责总***素产生的酶如产生***帖酚(CBG)的芳香异戊烯基转移酶(PT)，可以导致较低THC或不含***素的***的生长，这些***可以在严格的监管种植指南内保持合规，并用于替代和更有效地生产萜烯、纤维、谷物和次要***素(minor cannabinoids)。在一个实施方式中，本发明的纳米颗粒包括RNA多核苷酸，其与编码源自植物细胞的THCAS、CBCAS、PT或其任何组合的RNA分子具有至少70％互补性。在一个实施方式中，本发明的纳米颗粒包括RNA多核苷酸，其与编码源自植物细胞的***素生成(cannabinoidogenesis)相关基因的RNA分子具有至少70％互补性。另一个实例使RNAi技术的利用并非用于直接沉默产生某些化合物的植物基因，而是沉默生物合成途径内的副反应，以便积极重定向碳通量并“上调”其它途径。例如，Patatin是一种马铃薯块茎蛋白，由于其在替代肉类溶液中用作非动物基食品调质剂(texturizer)和凝固剂，因此在全球范围内面临着越来越多的需求。RNAi沉默诸如乙酰辅酶A羧化酶或酮酰基ACP合酶(参与产生如同脂质的副产物的反应)的靶标，可潜在地导致碳通量向所需基因靶标和酶(如PEPC)上调，从而驱动有利产物的代谢积累，并导致Patatin或其它蛋白质含量按重量增加。这些解决方案对于利用商品的现有生产能力和允许更有效地生产理想产品至关重要。在一个实施方式中，本发明的纳米颗粒包括RNA多核苷酸，其与编码源自植物细胞的乙酰辅酶A羧化酶、酮酰基ACP合酶或其组合的RNA分子具有至少70％互补性。
在一些实施方式中，如本文所述，方法包括将植物或其部分与治疗有效量的本发明的纳米颗粒或包括其的组合物接触。
在一些实施方式中，将引入植物或其部分的多核苷酸引入植物的至少一个细胞中。在一些实施方式中，引入植物的至少一个细胞中的多核苷酸能够诱导或活化至少一个细胞中的RNA表达修饰酶或络合物。在一些实施方式中，RNA表达修饰酶或络合物包括RNA诱导的沉默络合物(RISC)或其任何功能类似物。
在一些实施方式中，引入植物或其部分的多核苷酸能够诱导植物内源基因的沉默。引入植物或其部分的多核苷酸能够诱导源自病原体的RNA分子的沉默和/或降解，该病原体感染、留存在植物(例如，植物的至少一个细胞)内、喂养植物、或其任何组合。
如本文所用，术语“RISC类似物”是指能够响应外源RNA(包括包含内源基因或序列的核酸序列的双链RNA)的存在而抑制RNA翻译、降低RNA稳定性、增加RNA降解的任何肽或蛋白质。
在一些实施方式中，病毒性传染病包括葡萄卷叶病(GLD)。
在一些实施方式中，病毒性传染病由下文表1中列出的病毒诱导或涉及下文表1中列出的病毒。
表1.已知植物病毒列表
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
在一些实施方式中，病毒性传染病由选自以下的病毒诱导或涉及选自以下的病毒：微小RNA病毒目伴生豇豆病毒科(Picornavirales Secoviridae)、豇豆花叶病毒属豇豆花叶病毒(Comovirus Cowpea mosaic virus)、蚕豆病毒属蚕豆萎蔫病毒1(FabavirusBroad bean wilt virus 1)、线虫传多面体病毒属烟草轮斑病毒(Nepovirus Tobaccoringspot virus)、樱桃锉叶病毒属樱桃锉叶病毒(Cheravirus Cherry rasp leafvirus)、温州蜜柑矮缩病毒属Satsuma矮缩病毒(Sadwavirus Satsuma dwarf virus)、随伴病毒属欧洲防风草变黄斑点病毒(Sequivirus Parsnip yellow fleck virus)、灼烧病毒属番茄烧灼病毒(Torradovirus Tomato torrado virus)、矮化病毒属水稻东格鲁球状病毒(Waikavirus Rice tungro spherical virus)、未归类黑树莓坏死病毒(UnassignedBlack raspberry necrosis virus)、未归类巧克力百合病毒A(Unassigned Chocolatelily virus A)、未归类薯蓣花叶相关病毒(Unassigned Dioscorea mosaic associatedvirus)、未归类草莓潜隐轮斑病毒(Unassigned Strawberry latent ringspot virus)、未归类草莓斑点病毒(Unassigned Strawberry mottle virus)、芜菁黄化花叶病毒目甲型线形病毒科葱属X病毒属青葱病毒X(Tymovirales Alphaflexiviridae AllexivirusShallot virus X)、Lolavirus黑麦草潜隐病毒(Lolavirus Lolium latent virus)、柑橘病毒属印度柑橘轮斑病毒(Mandarivirus Indian citrus ringspot virus)、Platypuvirus驴兰无症状病毒(Platypuvirus Donkey orchid symptomless virus)、马铃薯X病毒属马铃薯病毒X(Potexvirus Potato virus X)、芜菁黄化花叶病毒目乙型线形病毒科香石竹潜隐病毒属麝香石竹潜隐病毒(Tymovirales Betaflexiviridae CarlavirusCarnation latent virus)、凹陷病毒属苹果茎痘病毒(Foveavirus Apple stem pittingvirus)、Robigovirus樱桃坏死锈斑病毒(Robigovirus Cherry necrotic rusty mottlevirus)、未归类香蕉轻型花叶病毒(Unassigned Banana mild mosaic virus)、未归类香蕉病毒X(Unassigned Banana virus X)、未归类甘蔗条纹花叶相关病毒(Sugarcane striatemosaic associated virus)、毛状病毒属苹果茎沟病毒(Capillovirus Apple stemgrooving virus)、Chordovirus胡萝卜Ch病毒1(Chordovirus Carrot Ch virus 1)、柑橘病毒属柑橘叶疱病毒(Citrivirus Citrus leaf blotch virus)、Divavirus Diuris病毒A(Divavirus Diuris virus A)、Prunevirus杏脉清相关病毒(Prunevirus Apricot veinclearing associated virus)、Tepovirus马铃薯病毒T(Tepovirus Potato virus T)、发状病毒属苹果褪绿叶斑病毒(Trichovirus Apple chlorotic leaf spot virus)、葡萄病毒属葡萄藤病毒A(Vitivirus Grapevine virus A)、Wamavirus西瓜病毒A(WamavirusWatermelon virus A)、芜菁黄化花叶病毒目芜菁变黄镶嵌病毒科葡萄斑点病毒属葡萄藤斑点病毒(Tymovirales Tymoviridae Maculavirus Grapevine fleck virus)、玉米雷亚朵非纳病毒属玉米雷亚朵非纳病毒(Marafivirus Maize rayado fino virus)、芜菁黄化花叶病毒组芜菁黄花叶病毒(Tymovirus Turnip yellow mosaic virus)、未归类一品红花叶病毒(Unassigned Poinsettia mosaic virus)、未归类甜菜坏死黄脉病毒科甜菜坏死黄脉病毒属甜菜坏死黄脉病毒(Unassigned Benyviridae Benyvirus Beet necroticyellow vein virus)、未归类博图欧尔密病毒科欧尔密病毒属欧尔密甜瓜病毒(Unassigned Botourmiaviridae Ourmiavirus Ourmia melon virus)、未归类雀麦花叶病毒科苜蓿花叶病毒属苜蓿花叶病毒(Unassigned Bromoviridae Alfamovirus Alfalfamosaic virus)、Anulavirus天竺葵带斑病毒(Anulavirus Pelargonium zonate spotvirus)、雀麦花叶病毒属雀麦花叶病毒(Bromovirus Brome mosaic virus)、黄瓜花叶病毒属黄瓜花叶病毒(Cucumovirus Cucumber mosaic virus)、等轴不稳环斑病毒属烟草线条病毒(Ilarvirus Tobacco streak virus)或油橄榄病毒属橄榄潜隐病毒2(OleavirusOlive latent virus 2)。
在一些实施方式中，病毒性疾病由属于葡萄卷叶病毒属的病毒诱导或涉及该病毒。
在一些实施方式中，病毒性疾病由选自葡萄卷叶相关病毒(GLRaV)的病毒诱导。
在一些实施方式中，病毒是：GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4或GLRaV-7。
在一些实施方式中，疾病由病毒GLRaV-3诱导。
在一些实施方式中，预防或治疗疾病包括使植物或其部分与本发明的纳米颗粒或包括其的组合物接触，所述纳米颗粒包括多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被配置为杂交和/或沉默源自病毒GLRaV-3的核酸分子的表达。
在一些实施方式中，预防或治疗疾病包括使植物或其部分与本发明的纳米颗粒或包括其的组合物接触，所述纳米颗粒包括多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被配置为杂交和/或沉默编码源自病毒GLRaV-3的RdRp(SEQ ID NO:13)的核酸分子的表达。
在一些实施方式中，预防或治疗疾病包括使植物或其部分与本发明的纳米颗粒或包括其的组合物接触，所述纳米颗粒包括多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被配置为杂交和/或沉默编码源自病毒GLRaV-3的CP(SEQ ID NO:14)的核酸分子的表达。
在一些实施方式中，预防或治疗疾病包括使植物或其部分与本发明的纳米颗粒或包括其的组合物接触，所述纳米颗粒包括多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被配置为杂交和/或沉默编码源自病毒GLRaV-3的p19.7 RNA沉默抑制因子的核酸分子的表达。
在一些实施方式中，p.19.7沉默阻抑物由包括以下序列的或由以下序列组成的核酸编码：ATGGACCTATCGTTTATTATTGTGCAGATCCTTTCCGCCTCGTACAATAATGACGTGACAGCACTTTACACTTTGATTAACGCGTATAATAGCGTTGATGATACGACGCGCTGGGCAGCGATAAACGATCCGCAAGCTGAGGTTAACGTCGTGAAGGCTTACGTAGCTACTACAGCGACGACTGAGCTGCATAGAACAATTCTCATTGACAGTATAGACTCCGCCTTCGCTTATGACCAAGTGGGGTGTTTGGTGGGCATAGCTAGAGGTTTGCTTAGACATTCGGAAGATGTTCTGGAGGTCATCAAGTCGATGGAGTTATTCGAAGTGTGTCGTGGAAAGAGGGGAAGCAAAAGATATCTTGGATACTTAAGTGATCAATGCACTAACAAATACATGATGCTAACTCAGGCCGGACTGGCCGCAGTTGAAGGAGCAGACATACTACGAACGAATCATCTAGTCAGTGGTAATAAGTTCTCTCCAAATTTCGGGATCGCTAGGATGTTGCTCTTGACGCTTTGTTGCGGAGCACTATAA(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方式中，预防或治疗包括降低：植物或其部分的循环、植物细胞或其组合中的病毒滴度；植物或其部分的循环、植物细胞或其组合中的病毒颗粒数量；编码病毒肽(如但不限于RdRp、CP或两者)的RNA分子的数量和/或稳定性；编码病毒肽(如但不限于RdRp、CP或两者)的RNA分子在植物或其部分的循环、植物细胞或其组合中的表达水平；病毒肽(如但不限于RdRp、CP或两者)在植物或其部分的循环、植物细胞或其组合中的量。
在一些实施方式中，预防或治疗包括降低病原体的存活。在一些实施方式中，预防或治疗包括降低病原体的复制率。在一些实施方式中，预防或治疗包括降低病原体对标准疗法和/或预防剂的耐受性。在一些实施方式中，预防或治疗包括增加病原体对标准疗法和/或预防剂的易感性和/或易损性(vulnerability)。
在一些实施方式中，预防或治疗包括降低：植物卷曲叶子的数量、植物叶子向下卷曲或呈杯状的比例、或其任何组合。
确定植物患有GLD的方法是常见的，并且对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
在一些实施方式中，接触包括喷洒植物或其部分。在一些实施方式中，接触包括在植物或其部分附近喷洒。在一些实施方式中，接触包括喷洒包括植物的生长基质。在一些实施方式中，生长基质包括土壤。
在一些实施方式中，附近为10cm至50cm、1cm至100cm、10cm至1m、0.5m至2.5m、1m至50m、0.1m至30m的距离。每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。
在一些实施方式中，植物部分包括植物的至少一片叶子。在一些实施方式中，植物部分包括植物的一片或多片叶子。在一些实施方式中，植物部分包括植物叶的至少部分。在一些实施方式中，植物部分包括植物的叶。
如本文所用，疾病、紊乱或状况的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括缓解其至少一种症状，降低其严重程度或抑制其进展。治疗不一定意味着疾病、紊乱或状况完全治愈。为了成为有效的治疗方法，本文中的有用组合物仅需要降低疾病，紊乱或状况的严重程度，降低与之相关的症状的严重程度，或改善患者或受试者的生活质量。在一些实施方式中，减轻了疾病、紊乱或状况的症状。
如本文所用，术语“预防”疾病、紊乱或状况包括延迟、预防、抑制或阻止疾病、紊乱或状况的发作。如根据本发明所述主题所使用的，术语“预防”涉及预防(prophylaxis)过程，其中受试者在疾病/紊乱过程的诱导或发作之前暴露于本发明所述组合物(一种或多种)。术语“抑制”用于描述疾病/紊乱过程已经开始但尚未实现该状况的明显症状的情况。因此，个体的细胞可能患有该疾病/紊乱，但临床上尚未发现该疾病/紊乱的外部迹象。在任何一种情况下，术语预防都可适用于涵盖预防和抑制。相反，术语“治疗”是指活性剂的临床应用，以对抗已经存在的状况——其临床表现已经在患者中实现。
如本文所用，“治疗”包括改善和/或预防。
在一些实施方式中，改善包括减轻与本文所述疾病相关的至少一种症状。
概述
如果提供了一个值范围，则可以理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限与该范围内的任何其它规定或中间值之间的每个中间值(下限单位的十分之一)都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明中，但受所述范围内任何明确排除的限制的限制。如果所述范围包括一个或两个限制，则不包括其中一个或两个限制的范围也包括在本发明中。
如本文所用，当与值组合时，术语“约”是指参考值的正负10％。例如，约1000纳米(nm)的长度是指1000nm±100nm的长度。
注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指称。因此，例如，提及“多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸，提及“多肽”包括提及一种或多种本领域技术人员已知的多肽及其等同物，等等。还应当指出，权利要求书可以被起草以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为在陈述权利要求要素或使用“负面”限制时使用“单独”、“仅”等专有术语的先行依据。
在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的情况下，一般来说，这种构造的目的是让本领域技术人员理解惯例(例如，“具有A、B和C中至少一个的***”将包括但不限于具有A单独、B单独、C单独、A和B在一起、A和C在一起、B和C在一起和/或A、B和C在一起等的***)。本领域技术人员将进一步理解实际上，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，任何呈现两个或多个可选术语的析取词和/或短语都应该被理解为考虑包括其中一个术语、其中一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方式的所有组合都被本发明具体地包括，并且在本文中被公开，就像每个和每一个组合都被单独和明确地公开一样。另外，各种实施方式及其元件的所有子组合也被本发明具体地包括，并且在本文中公开，就像每个和每一个这样的子组合在本文中被单独和明确地公开一样。
本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域的普通技术人员来说，在检查以下实例后将变得显而易见，这些实例并不旨在限制本发明。另外，如上文所述以及如下面的权利要求部分所述的本发明的各个实施方式和方面中的每一个在以下实例中找到了实验支持。
如上所述以及在下面的权利要求部分中所要求保护的本发明的各个实施方式和方面在以下实例中找到了实验支持。
实施例
通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中得到了彻底的解释。例如，参见"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"第I-III卷Ausubel,R.M.编辑(1994)；Ausubel等,"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等(编辑)"GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series",第1-4卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法学；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",第I-III卷Cellis,J.E.编辑(1994)；"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique",Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"Current Protocols in Immunology"第I-III卷Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等(编辑),"Basic and Clinical Immunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑),"Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHLPress(1996)；所有这些都通过引用并入。本文件中还提供了其它一般对比文件。
材料和方法
改性分枝聚乙烯亚胺的合成
将分枝聚乙烯亚胺(Mw＝800gr/mol，Sigma-Aldrich-Merck)与1,2-环氧十四烷(Tokyo chemical industry co.)缀合，以制备14碳脂质缀合的分枝PEI。通过环氧化物开环反应进行缀合，保持3：1摩尔比(环氧化物：bPEI)混合物。简而言之，将4.75gr的bPEI溶解在150mL纯乙醇中，并加热至均匀溶液。接下来，将预先计算的环氧化物体积加入到溶液中，同时保持剧烈混合。将混合物温育4h，同时保持恒定加热(90℃)并使用热电偶混合(600rpm)。反应完成后，通过将2μl的20倍稀释的反应产物加载到二氧化硅涂覆的薄层色谱板(Biotage)上，以氯仿：正己烷体积/体积(v/v)比为1:1作为流动相，验证成功的反应。
dsRNA-lmPEI络合(complexation)
通过应用乙醇注射技术进行dsRNA和lmPEI之间基于静电相互作用的络合。N:P比例定义为带正电荷的胺基与带负电荷的磷酸根基团之间的比例，在络合计算中起着重要作用。通常，将预热的dsRNA和lmPEI以1:1v/v的比例添加到25mM乙酸钠缓冲液(pH＝5.2)中，保持2:1N:P的摩尔比。在剧烈混合溶液时发生lmPEI注射。随后，将混合物在Eppendorf振荡器中于40℃和1000rpm下温育20分钟。通过使用Nano ZSP(Malvern，United Kingdom)的动态光散射在室温下进一步确定纳米颗粒的特征，如尺寸分布、稳定性和平均直径以及电荷。
dsRNA保留和释放
使用肝素释放测定法评估dsRNA络合及其释放的评价。肝素是一种强带负电的分子，可以与dsRNA竞争静电相互作用，从而将其从NPs中释放出来。NPs形成后，将1μl来自猪肠粘膜的稀释肝素钠盐(Sigma-Aldrich)添加到约250ng的络合的dsRNA中，并在35℃下温育20分钟。随后，在100V下运行35分钟后，在UV光下可视化含有溴化乙锭(Hy-labs)的TAE(×1)中的2％凝胶琼脂糖(Hy-Labs)。
核糖核酸酶(Rnase)测定
使用核糖核酸酶(Rnase)A(Thermo Scientific，目录号EN0531)和RiboLock核糖核酸酶(Rnase)抑制剂(Thermo Scientific，目录号EO0381)检查了纳米颗粒保护dsRNA免于降解的能力。简而言之，在通过在37℃与RiboLock核糖核酸酶抑制剂(每70ng络合的dsRNA 20个单位)温育1h使酶失活后，将20μl dsRNA-lmPEI NPs(约700ng dsRNA)与2ng核糖核酸酶(Rnase)A在37℃温育2h。接下来，将溶液与稀释的肝素在37℃下再温育20分钟，以从NP释放dsRNA。在100V下，将溶液与适当的对照一起施加到2％琼脂糖凝胶电泳中35分钟。
低温TEM成像和快速傅立叶变换分析
低温透射电子显微镜(cryo-TEM)成像是在软质电子显微镜技术中心(TechnionCenter for Electron Microscopy of Soft Matter(TCEMSM))，在配备FEG的ThermoFisher Talos F200C高分辨率TEM上进行的，在200kV下操作。将样品转移到Gatan 626.6低温支架中，并在-170℃以下平衡。显微照片由Thermo-Fisher Falcon III直接检测器相机以4k×4k分辨率记录。使用volta相位板在TEM纳米探针模式下检查样品以增强对比度。成像是在低剂量工作模式下进行的，以最大程度地减少成像区域对电子的曝光。使用TEM成像与采集(Imaging and Acquisition)(TIA)软件采集图像。通过对相关获得的图像进行FFT径向积分，推导出纤维间间距。积分是使用Paul Baggethun的FIJI软件插件(2009版)完成的。
Cy5 lmPEI标记
为了在显微镜仪器下观察NPs，将胺反应性红色发光荧光染料花青(Cyanine)5NHS酯(Ex/Em:646/662，Abcam)与lmPEI缀合，然后使用NHS作为偶联剂通过碳二亚胺反应进行dsRNA络合。在如前所述的环氧化物开环反应后，将Cy5 NHS酯和lmPEI以1：4(Cy5:NH2)摩尔比反应，并在37℃和600rpm下温育90分钟以产生Cy5-lmPEI。使用G-10Sephadex珠(Sigma-Aldrich)进行一步尺寸排阻程序，以从原料反应物和其它副产物中分离出所需产物。使用薄层色谱(TLC)以氯仿：甲醇1：1v/v作为流动相验证该过程的每个步骤。
荧光显微镜
为了研究喷洒和浸没施用途径后藤叶对纳米颗粒的摄取，如上所述合成并络合了Cy5标记的dsRNA-lmPEI。另外，游离Cy5的处理与待施用的标记NPs相同，以作为对照。将藤叶如下分为五个处理组(每组N＝5)：(i)25mM乙酸钠缓冲液(pH-5.2)，(ii)喷洒NP，(iii)喷洒对照，(iv)浸没NP，和(v)浸没对照。将浸没叶子的叶柄***600μl渗透处理中，而喷洒的叶子进行喷洒处理以达到渗透(～10mL)。每组在不同的时间点(0、20、50和120分钟)成像，并且在每个叶子内选择六个不同的位置以最佳平均总图像信号。将样品暴露400ms，并使用配备有DP72 CCD相机的Olympus SZX16荧光双目望远镜，结合×1.6 0.3NA物镜和OlympusmCherry滤光片(激发：542-582，发射：603-678)获得图像。
纳米颗粒生物分布
为了证明NP在藤中的分布，将稀土金属EuCl3(12-20ppm)包封在95±25nm大小的脂质体中，并将藤叶***渗透溶液中72h。从距离应用点不同距离的处理过的和未处理过的藤中取出叶子，并在烘箱(BIFA Electro-therm MS8多级实验室炉,Middlesex,UK)中于105℃脱水2h。将干物质称重并在550℃下焚烧5h。将灰分样品溶解在1％ HNO3中，收集到10mL管中，过滤(0.45μm过滤器)，并使用用Eu ICP标准(Sigma-Aldrich)获得的预先制备的校准曲线通过ICP-OES仪器分析铕的存在。
RNA提取和cDNA产生
修剪随机枝条，处理叶子，并使用暴露内部组织的手术刀剥离周皮。接下来，剥离木质部，保留绿色韧皮部，立即转移至-80℃。使用研钵和研杵将一百五十(150)mg冷冻韧皮部在液氮中粉碎成粉末状物质。将九百(900)μl十六烷基三甲基溴化铵(CTAB-SigmaAldrich-Merck)混合物加热至65℃，并加入β-巯基乙醇至终浓度2％。将混合物加入到粉碎的枝条中，并在65℃的浴器中浸泡10分钟。将另外900μl氯仿：异戊醇(24：1)(Sigma-Aldrich-Merck)加入管中，并用手剧烈混合。将管在4℃下以11,000g离心10分钟。从管中收集上层。重复该步骤一次，加入氯仿：异戊醇(24：1)并收集上层。加入三分之一(1/3)混合物体积的LiCl 10M，并在冰上孵育30分钟，使RNA沉淀。沉淀后，将管在4℃下以21,000g离心20分钟，弃去上清液。将预热至65℃的一(1)ml SSTE缓冲液加入管中，然后强烈涡旋。另外加入1ml苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)(Sigma-Aldrich-Merck)，并将管在4℃下以11,000g离心10分钟。然后将上层收集到新管中，并测量体积。然后通过加入0.7当量体积的冰冷异丙醇沉淀RNA，将管倒置，并立即在4℃下以21,000g离心15分钟。除去异丙醇，用300μl 70％冷乙醇洗涤沉淀物，并再次以21,000g离心3分钟。使用加载尖端(loading tip)除去所有乙醇，并将管在冰上打开30分钟以挥发残留的乙醇。将沉淀物重悬于30μl焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma-Aldrich-Merck)处理的ddH2O中。从枝条中提取RNA后，按照制造商的规程，使用用于RT-qPCR的Maxima第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Ltd)产生总cDNA。
GLRaV识别
通过聚合酶链反应(PCR)，使用各种GLRaV株系的特异性引物(见下表2)扩增cDNA。使用2×PCRBIO Taq Mix Red(PCRBIOSYSTEMS)PCR试剂盒。PCR产物被送往HyLabs IL Ltd进行Sanger测序，无需进一步纯化。
表2.用于GLRaV株系鉴定的正向和反向引物
引物名称 序列5’->3’ SEQ ID NO:
GLRAV-1_F CTAGCGTTATATCTCAAAATGA 1
GLRAV-1_R CCCATCACTTCAGCACATAAA 2
GLRAV-2_F TTGACAGCAGCCGATTAAGCG 3
GLRAV-2_R CTGACATTATTGGTGCGACGG 4
GLRAV-3_F CGCTAGGGCTGTGGAAGTATT 5
GLRAV-3_R GTTGTCCCGGGTACCAGATAT 6
GLRAV-4_F ACATTCTCCACCTTGTGCTTT 7
GLRAV-4_R CATACAAGCGAGTGCAATTACA 8
GLRAV-7_F TATATCCCAACGGAGATGGC 9
GLRAV-7_R ATGTTCCTCCACCAAAATCG 10
GLRAV-9_F CGGCATAAGAAAAGATGGCAC 11
GLRAV-9_R TCATTCACCACTGCTTGAAC 12
田间试验
田间试验(2018-2019)在位于Israel的Carmi Yossef附近的“Bravdo”葡萄园进行。藤表现出与GLRaV3感染一致的各种症状，从叶子上的小红点到完全红色并向内卷曲的叶子。在第一个试验(2018年6月至9月)中，共选择28株藤，如下分为7个治疗组(N＝4):(1)未经治疗的健康藤；(2)未经治疗的受感染藤；(3)用25mM乙酸钠缓冲液治疗受感染的藤；(4)用lmPEI溶液治疗受感染的藤；(5)用裸RdRp序列治疗受感染的藤；(6)用RdRp-lmPEI NP治疗受感染的藤；(7)用RdRp-lmPEI和CP-lmPEI NP治疗的受感染藤。为了提高渗透摄取，采用了两种施用方法:(i)用5mL治疗溶液刷选择的叶子，以及(ii)将修剪过的枝条***20mL的治疗溶液中24h。分别在治疗后6、10和21天以及治疗后8和9周收获枝条和浆果用于进一步分析。第二年(2019年6月至9月)，使用的施用方法是冠层喷洒和枝条浸没。总共47株藤被分配以构建以下治疗组(N＝10，第4组除外，其中N＝7):(1)未经治疗的健康藤；(2)未经治疗的受感染藤；(3)喷洒lmPEI溶液的健康藤；(4)受感染藤的修剪枝条浸入RdRp-lmPEI和CP-lmPEI NP中；(5)用RdRp-lmPEI和CP-lmPEI NP喷洒受感染藤。枝条每两周取样一次，直到收获，而浆果采集在转熟(veraison)后进行三次。
序列设计
RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)序列设计包括以下核酸序列：GGTAGCGGTGATGATAGCCTTATATTTAGTCGGCAGCCGTTGGATATTGATACGTCGGTTCTGAGCGATAATTTTGGTTTTGACGTAAAGATTTTTAACCAAGCTGCTCCATATTTTTGTTCTAAGTTTTTAGTTCAAGTCGAGGATAGTCTCTTTTTTGTTCCCCGATCCACTTAAACTCTTCGTTAAGTTTGGAGCTTCCAAAACTTCAGATATCGACCTTTTACATGAGATTTTTCAATCTTTCGTCG(SEQ ID NO:13)。
外壳蛋白(CP)序列设计包括以下核酸序列：
CCAGCGCAAGTGGCGGAACCACAGGAAACCGATATAGGGTAGTGCCGGAATCTGAGACTCTCACACCAAATAAGTTGGTTTTCGAGAAAGATCCAGACAAGTTCTTGAAGACTATGGGCAAGGGAATAGCTTTGGACTTGGCGGGAGTTACCCACAAACCGAAAGTTATTAACGAGCCAGGGAAAGTATCAGTAGAGGTGGCAATGAAGATTAATGCCGCATTGATGGAGCTGTGTAAGAAGGTTATGG(SEQ ID NO:14)。
病毒滴度评估
使用对保守RNA依赖性RNA聚合酶和GLRaV-3的Hsp70样蛋白序列特异的引物(如下所示)，使用Power SYBRTMGreen PCR Master Mix(Thermo Fisher Ltd,AppliedBiosystemsTM)和qPCR BIO SyGreen Mix(PCRBIOSYSTEMS)进行实时RT-PCR，根据CorbettRotor-GeneTM6000PCR机中的制造商的说明实施。使用的特异性引物如下：
葡萄品质参数
测试浆果的白利糖度(糖)水平、重量、pH值、颜色密度、单宁指数和柔软度比。称重浆果，并计算达到132克(以计算平均浆果重量)所需的浆果数量。加入纯乙醇，压碎浆果。使用过滤器过滤混合物以测量白利糖度。为了测量酸度，取10mL相同的混合物，用0.1N NaOH滴定，直到pH达到8.15。所需的NaOH体积如下用于计算总酸含量：0.75×NaOH体积。进行酒石酸校正以模仿葡萄酒的自然酸度水平。沉淀48h后，测量颜色密度、单宁指数和柔软度比，如下所示。将混合物以1,500rpm离心10分钟，并稀释25倍。使用分光光度计在520nm和420nm处测量上清液的光密度(OD)。颜色密度计算如下：(25×OD420nm)+(25×OD520nm)。为了测量单宁指数(总酚)，将混合物稀释100倍，然后使用分光光度计在280nm下测量。单宁指数计算如下：100×OD280nm。最后，计算柔软度比：柔软度比＝10x(颜色密度/单宁指数)。
在2019年夏季收获期间，还测量了从每个藤收获的葡萄的总重量。
统计分析和图像采集
数据以平均值表示，误差棒表示SD。使用Prism软件(版本9.0)进行统计研究，如图2中的双尾配对t检验和图3中单因素ANOVA的多重比较。使用Fiji软件处理凝胶和双目望远镜图像。使用Imaris 9.1.2软件(Oxford，Bitplane)斑点模块识别颗粒，以将斑点检测为直径为0.2μm且质量阈值高于3的球形物体。
实施例1
dsRNA-lmPEI颗粒的制备和表征
发明人合成了lmPEI作为RNA载体，并测试了其对葡萄藤中GLRaV-3滴度的影响。简而言之，将14碳脂质以3:1(环氧化物尾部：PEI头部基团)摩尔比与分枝PEI缀合以形成lmPEI。使用多个相分离步骤纯化产物，1HNMR光谱显示在3.62ppm处的峰对应于羟基官能团，这证实了脂质尾部与PEI的成功缀合(图20)。接下来，在酸性条件下(pH＝5.2)，将250bpdsRNA与lmPEI络合，以在带负电荷的dsRNA和阳离子lmPEI之间建立静电相互作用，从而形成dsRNA-lmPEI颗粒，如图1A所示。为了靶向GLRaV-3的复制和组装能力，我们选择使用两个保守序列(分别为SEQ ID NO:13和14)敲低RNA依赖性RNA聚合酶和外壳蛋白基因。序列设计排除了GLRaV-3和葡萄酒葡萄藤(例如，葡萄(Vitis vinifera))基因组内的意外脱靶。优化dsRNA长度以在序列的不同位置触发切丁酶(dicer)样蛋白，以产生多个siRNA并增加敲低概率。
为了有效，dsRNA-lmPEI颗粒必须在靶位点处结合、保护和释放RNA。由于结合和释放依赖于lmPEI对dsRNA的静电亲和力，因此可以通过N:P比例来控制它们。在目前的研究中，N:P比例定义为lmPEI中存在的带正电荷的胺基与dsRNA主链上存在的带负电荷的磷酸根基团之间的摩尔比。为了确定该比例，将恒重的dsRNA转化为其当量的磷酸盐摩尔，并相应地缀合lmPEI以达到所需摩尔的质子化胺。增加的N:P比例提高颗粒的表面电荷(图1C)，而低于2的N:P比例(即0.01和0.1)，则不会形成颗粒，表明lmPEI不足以结合dsRNA(图1D)。因此，发明人使用N:P＝2的结合dsRNA的颗粒进行了下一个试验，这些颗粒带有弱正电荷(0.91±0.08mV)。dsRNA的包封率为92％(图4)，平均颗粒尺寸为220nm(图1E)，其中85％的颗粒在150-450nm范围内。dsRNA-lmPEI颗粒使用低温TEM成像。低对比度和高对比度图案表明纤维性高对比度聚集结构。一些结构域在颗粒内表现出局部有序性。分别地，高对比度特征对应于代表dsRNA的π堆叠***的sp2碳，低对比度代表lmPEI的sp3杂交原子。成像颗粒的快速傅立叶变换(FFT)的相关径向积分用于研究颗粒的内部结构(图1B)。先前的研究表明，DNA/PEI络合是高度动力学的。这是由于静电力(结合的主要驱动力)受到PEI中质子化基团百分比的影响。从FFT和灰度值分布测量中观察到，一个dsRNA质心与另一个dsRNA质心之间的纤维间间距为7.3±2nm(参见图1B中的插图；其它测量结果参见图11)。这种间距似乎是由于颗粒内存在脂质尾巴，并且它们从聚合主链中突出，从而能够与附接到dsRNA纤维其它部分的其它lmPEI分子相互作用。如在低温TEM图像和部分能量最小化的分子力学模型中观察到的，lmPEI烷基链的亲脂特性也有助于水生环境中的聚集体形成(图18)。与Ziebarth及其同事提出的模型类似，目前的发现也可显示lmPEI以螺旋方式包裹dsRNA的可能模型。最后，发明人测试了颗粒尺寸作为稳定性的量度，并且在40天的时间内没有注意到显著的变化(图1F)。
实施例2
纳米颗粒生物分布
发明人评估了dsRNA-lmPEI颗粒在藤中被摄取和分布的能力。lmPEI载体用花青5(Cy5)染料标记，以进一步与dsRNA复合。治疗组(每组N＝5片叶子)接受五种不同的治疗：(1)25mM乙酸钠缓冲液(对照)，游离Cy5-(2)喷洒和(3)浸没和Cy5标记的颗粒-(4)喷洒和(5)浸没。在荧光双目望远镜下在六个不同位置对叶子成像并量化信号后，对不同时间点进行治疗。如图2A所示，在初始时间观察到基础自发荧光，并且在2h治疗后喷洒和浸没施用中都存在Cy5信号(对照如图12所示)。与喷洒治疗相比，当叶柄浸入标记的颗粒中时，在叶子的中脉和二级脉内可视化颗粒积累。此外，随着时间的推移，信号的量化会导致平均强度和颗粒数量的显著增加(分别为P<0.05和P<0.001)(图17)。这些结果表明，喷洒后颗粒可以穿透气孔，并在浸没后进入并分布在叶脉内，最终达到相同的结果。
为了量化颗粒在植物组织中的生物分布，使用DOTA螯合剂基团将lmPEI颗粒与钆(GdCl3)共价缀合。然后，通过浸没72h将Gd标记的颗粒施用给藤叶。使用元素分析在位于应用点以上或以下的上至25厘米处的植物组织(叶、叶柄、茎和根)中定量Gd浓度(图2C)。有趣地，Gd浓度在应用点以上和以下相似，表明颗粒进入叶子并通过韧皮部维管途径在植物中转移。韧皮部是一种主要负责将光合作用产物从叶子运输到植物其余部分的组织，是藤中GLRaV-3病毒的主要藏匿组织。总体而言，定性显微镜和定量元素分析均表明lmPEI-dsRNA颗粒在藤中***性分布。
发明人进一步研究了脂质成分对颗粒摄取(uptake)到表达质膜定位融合蛋白GFP-LTI6b的转基因拟南芥根中以标记细胞表面的影响。脂质化和非脂质化的PEI与RNA络合形成纳米颗粒，然后在活体成像之前将其水培施用到根。通过将Cy5染料共价标记到PEI主链上，然后使用共聚焦显微镜对根随着时间进行成像来追踪颗粒的摄取。治疗组(每组N＝4)包括五种不同的治疗：1)Cy5标记的脂质化颗粒和2)非脂质化颗粒；3)未标记的脂质化和4)非脂质化颗粒和5)游离Cy5(对照)。将根置于半透性培养基下的光学板上，然后施用20μL治疗溶液。在初始时间和3h后对颗粒的积累进行成像和定量(分别为图2D左图和右图)。积累动力学表明，颗粒更好地穿透伸长区而不是分生组织区，从而从表皮向内产生信号梯度。这一观察结果可能归因于覆盖根尖(分生组织)的侧根冠细胞的低渗透性。通过测量归一化为植物GFP信号随时间的Cy5来量化颗粒吸收。与非脂质化颗粒相比，脂质化颗粒的摄取量显著增加了7.35倍(P<0.0001，图2D，右图)，在3h内保持相同的摄取率(图19)。这表明RNA载体中的脂质成分在与根表皮组织摄取的相互作用中起重要作用。
为了进一步了解进入植物的颗粒穿透途径，通过高分辨率扫描电子显微镜(HR-SEM)对受感染叶子的下(远轴)和上(近轴)侧进行成像。看到气孔散布在整个远轴表面表皮组织中(图2B)。气孔的尺寸测量显示6.105μm宽和16.14μm长的开口，这可以促进纳米颗粒的进入端口。除了气孔穿透外，先前的研究表明极性溶质通过“极性孔”扩散穿过植物角质层的证据。表明水分子吸附到角质膜上呈现的极性基团(例如羟基或酯基)，从而产生这些孔。由于亲脂性化合物可以通过与亲脂性结构域的相互作用扩散角质层，因此可能通过吸附到角质脂质来促进脂质化颗粒的进入。综上所述，尽管已知若干的叶穿透途径，并且正在进行大量工作以获得有关组织和细胞摄取机制的见解，但对纳米材料如何在植物内穿透和转移仍然知之甚少。
实施例3
加载序列稳定性和释放
为了促进有效的敲低，需要保护RNA有效载荷免于降解，直到到达目标部位。发明人测试了lmPEI载体保护dsRNA免于RNase-A(核糖核酸酶)降解的能力。更具体地，发明人评估了在从颗粒释放dsRNA之前和之后络合物针对RNase-A的保护能力，并证实与lmPEI的络合保护了RNA免于降解(图3A)。发明人使用肝素从络合物中释放RNA。肝素是一种高度带负电荷的分子，与dsRNA竞争静电相互作用，从而从lmPEI络合物中释放dsRNA(图5)。RdRp和CP序列免于对RNase降解的保护作用相似，表明针对核酸酶降解的颗粒保护作用与RNA序列无关(图3C)。在细胞中，表明“质子海绵(proton sponge)”效应负责从基于基于胺的RNA载体(如lmPEI)中释放RNA。此外，在哺乳动物细胞中记录了“质子海绵”效应，以触发纳米颗粒及其有效载荷向细胞质的内体逃逸。植物细胞分别含有类似于早期和晚期内体的反式高尔基体网络和多囊体。内体pH是影响阳离子聚合物缓冲能力的主要参数，在哺乳动物(pH＝6.3)和植物(pH＝6.2)细胞中都相似，因此表明两种细胞类型中都可能存在“质子海绵”效应。
实施例4
田间试验
发明人已经研究了dsRNA-lmPEI NP在受感染的藤中敲低GLRaV-3的能力。为了实现这一目标，在每个上述年份的整个夏季(6月至9月)，在位于以色列中部Judean山麓的一个葡萄园进行了两次田间试验(2018-2019)。试验在Cabernet Sauvignon地块(31°50’17”N，34°53’57”E，海拔140米)上进行，嫁接在种植于主要由粘土、沙子和淤泥组成的土壤中的Ruggeri砧木上。通过创建间隔块将藤随机分为治疗组，并将其均匀分布在每行。为了在整个试验过程中跟踪GLD症状，设计了感染严重程度评估表(图15)，每个治疗组的一半每周评分一次。在每个试验结束时，修剪枝条并通过实时RT-PCR分析进行分析，以评估韧皮组织内的GLRaV-3滴度。此外，在转熟后和收获后，测试浆果的葡萄质量参数。基本上，每年应用两种不同的施用方法。在2018年(N＝28)，为了尽可能多地渗透吸收，叶子被刷洗，切割枝条并浸入治疗渗透物中24小时(图16A)。2019年，藤(N＝47)主要通过冠层喷洒治疗(图16B)，仅有少数通过枝条浸没作为对照。2020年，藤(N＝80)仅通过单剂量或多剂量(五次治疗)的冠层喷洒进行治疗。在所有连续年份中，健康组和感染组之间以及感染组和NP治疗组之间的GLRaV-3滴度存在显著差异(2018年P<0.05，2019年P<0.0001；图3D-3E和13-14)。这些结果意味着dsRNA-lmPEI NP穿透并分布在藤内，从而诱导病毒敲低。此外，敲低动力学显示，单剂量施用后三周，病毒滴度降低(图3E)。与病毒表达相反，仅有在整个生长季节多次处理藤时，GLD症状才会延迟(图3B)。2019年试验治疗后不同时间点的浆果的白利糖度和重量值分别展示在图3F和3G中。类似地，测试了参数诸如pH、总酸、单宁指数、颜色密度和柔软度比(图6-10)。随着成熟的进行，pH水平升高，酸度水平降低，总的趋势是单宁指数升高。dsRNA-lmPEI施用不损害以下任一种的葡萄质量参数：健康的、受感染的和治疗的藤。这表明单次应用足以降低病毒滴度，但可能需要多次应用来恢复浆果质量。
实施例5
lm-PEI纳米颗粒的物理化学表征
发明人进一步表征了本发明的lm PEI NP的物理和化学特性。
当测试不同N:P比例对络合和RNA释放的影响时，方法如上所述，除了使用2:1的比例——其通过添加适量的lmPEI以达到不同的N:P比例而相应地获得。
如本文所述，使用两个分枝聚乙烯亚胺批次(LOT#MKCG7251和#MKCJ2767)合成lmPEI。
结果表明，分枝PEI的比例的范围在2:1-7:1之间是优选的(图21)，而不是1:1-9:1。
此外，发明人比较了不同长度的烷基链。
当测试不同脂质长度对颗粒摄取的影响时，合成方法如上所述，除了将1,2-环氧十四烷(C14)改变为以下烷基链：C10、C12、C16和C18。
共聚焦显微镜通过本文所述的步骤验证了颗粒摄取到eGFP转基因拟南芥根中。
结果表明，与例如C14、C16和C18相比，C12 lmPEI提供了显著更高的进入根的摄取率(图22)。
发明人进一步测试了本发明的lm PEI NP随时间和不同温度的稳定性。
发明人表明，本发明的lm PEI NP在各种温度(例如4℃，室温和54℃)下稳定约14天的时间段，如它们的平均直径(图23A)和平均ζ电位(图23B)所反映的。
发明人已经测试了以不同N:P比例为特征的颗粒的稳定性和络合方面。具体而言，当以低于2:1的N:P比例(并且特别使用1:1比例举例说明)形成络合物时，仅部分发生络合。对此，实际上仅有80％的dsRNA被整合到颗粒中，而其余20％被检测为裸dsRNA残留物。通过使用动态光散射(DLS)装置分析络合物样品，进一步验证了这一观察结果。显然，这种颗粒不太适合使用(甚至在应用前活性成分损失约20％)。
与之形成鲜明对比的是，当以更高的N:P比例(如7:1)形成络合物时，强烈的静电相互作用阻止了dsRNA(活性功能分子/成分)从络合物中完全释放。这一观察结果是使用凝胶电泳图像获得的，并进一步得到了ζ电位测量的支持，显示出高(+40mV)的表面电荷值。这种N:P比例范围(rage)(2:1至7:1)是重要且有利的，以便获得具有增加的承载能力和稳定性的颗粒，这是后续应用所需的。
总之，本文公开的发现表明dsRNA-lmPEI NP是能够在葡萄藤运输***中携带、保护和分布的稳定实体，因此为长dsRNA提供了有效的递送***。虽然GLRaV-3已知几十年，但它仍在继续感染和破坏新的葡萄园，目前还没有合适的解决方案。本文公开的研究提出dsRNA-lmPEI NP作为生物竞争者，通过在叶应用之后在受感染的藤中诱导GLRaV-3敲低来解决这个问题。这些发现也可以用于更广泛的平台，将任何多核苷酸引入植物细胞，例如来修饰内源基因表达、治疗任何植物中的病毒感染、或替代我们今天所知的害虫防治。
尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说，许多替代方案、修改和变体显然是显而易见的。因此，本发明旨在涵盖属于所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修改和变体。
序列表
<110> 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发有限公司
泰克年研究发展基金会公司
<120> RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法
<130> HUJI-TECH-P-068-PCT
<150> US 63/139,904
<151> 2021-01-21
<160> 21
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
ctagcgttat atctcaaaat ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
cccatcactt cagcacataa a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
ttgacagcag ccgattaagc g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
ctgacattat tggtgcgacg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
cgctagggct gtggaagtat t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
gttgtcccgg gtaccagata t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
acattctcca ccttgtgctt t 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
catacaagcg agtgcaatta ca 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
tatatcccaa cggagatggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
atgttcctcc accaaaatcg 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cggcataaga aaagatggca c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
tcattcacca ctgcttgaac 20
<210> 13
<211> 251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
ggtagcggtg atgatagcct tatatttagt cggcagccgt tggatattga tacgtcggtt 60
ctgagcgata attttggttt tgacgtaaag atttttaacc aagctgctcc atatttttgt 120
tctaagtttt tagttcaagt cgaggatagt ctcttttttg ttccccgatc cacttaaact 180
cttcgttaag tttggagctt ccaaaacttc agatatcgac cttttacatg agatttttca 240
atctttcgtc g 251
<210> 14
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
ccagcgcaag tggcggaacc acaggaaacc gatatagggt agtgccggaa tctgagactc 60
tcacaccaaa taagttggtt ttcgagaaag atccagacaa gttcttgaag actatgggca 120
agggaatagc tttggacttg gcgggagtta cccacaaacc gaaagttatt aacgagccag 180
ggaaagtatc agtagaggtg gcaatgaaga ttaatgccgc attgatggag ctgtgtaaga 240
aggttatgg 249
<210> 15
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
atggacctat cgtttattat tgtgcagatc ctttccgcct cgtacaataa tgacgtgaca 60
gcactttaca ctttgattaa cgcgtataat agcgttgatg atacgacgcg ctgggcagcg 120
ataaacgatc cgcaagctga ggttaacgtc gtgaaggctt acgtagctac tacagcgacg 180
actgagctgc atagaacaat tctcattgac agtatagact ccgccttcgc ttatgaccaa 240
gtggggtgtt tggtgggcat agctagaggt ttgcttagac attcggaaga tgttctggag 300
gtcatcaagt cgatggagtt attcgaagtg tgtcgtggaa agaggggaag caaaagatat 360
cttggatact taagtgatca atgcactaac aaatacatga tgctaactca ggccggactg 420
gccgcagttg aaggagcaga catactacga acgaatcatc tagtcagtgg taataagttc 480
tctccaaatt tcgggatcgc taggatgttg ctcttgacgc tttgttgcgg agcactataa 540
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
agtacgtaac ggggcagaat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
acctgcttca tgagagcact 20
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
aagtgctcta gttaaggtca ggagtga 27
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
gtattggact acctttcggg aaaat 25
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
tcctctggac aatggatgga 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
cttgcatccc tcagcacctt 20

Claims (33)

1.纳米颗粒，其包括:
a.两亲性共聚物，所述两亲性共聚物包括共价结合至疏水结构域的可电离聚合物；和
b.包括60至500个核碱基的多核苷酸；
其中所述可电离聚合物包括胺基；其中所述纳米颗粒内的氮与磷酸盐(N:P)摩尔比的范围为2:1至7:1，其中所述多核苷酸与所述可电离聚合物非共价结合，以及其中所述疏水结构域包括烷基链，所述烷基链的长度足以使所述纳米颗粒在水溶液中稳定至少1小时的时间段。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述烷基链包括10至14个碳原子。
3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，具有100nm和500nm之间的颗粒尺寸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米颗粒，具有150nm和350nm之间的颗粒尺寸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述胺基是伯胺基、仲胺基、叔胺基或其任何组合中的任何一种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述可电离聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。
7.根据权利要求6所述的纳米颗粒，其中所述PEI包括分枝PEI。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述分枝PEI包括分枝烷基化PEI。
9.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述分枝烷基化PEI包括至多12个碳原子的烷基链。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的纳米颗粒，进一步包括生物活性剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的纳米颗粒，其中所述非共价结合是静电结合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多核苷酸包括100至350个核碱基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多核苷酸包括多种多核苷酸类型。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多核苷酸包括RNA。
15.根据权利要求14所述的纳米颗粒，其中所述RNA包括双链RNA(dsRNA)。
16.根据权利要求14或15所述的纳米颗粒，其中所述RNA与以下任一项具有至少70％互补性：(i)源自病原体的至少一种RNA分子；和(ii)源自植物细胞的至少一种RNA分子。
17.根据权利要求16所述的纳米颗粒，其中所述病原体是植物病原体。
18.根据权利要求16或17所述的纳米颗粒，其中所述病原体是病毒。
19.一种组合物，其包括权利要求1至18中任一项所述的多个纳米颗粒和农业上可接受的载体。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述多个纳米颗粒的特征在于多分散指数(PDI)的范围为1至1.5。
21.根据权利要求19或20所述的组合物，其中所述多个纳米颗粒的特征在于平均ζ电位的范围为-5mV至40mV。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述载体选自：溶剂、表面活性剂、分散剂、粘接剂、铺展剂、增效剂、渗透剂、相容剂、缓冲剂、消泡剂、增稠剂、抗漂移剂及其任何组合。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的组合物，通过喷洒、浸润、浸渍、浸泡、注射或其任何组合配制用于施用。
24.将多核苷酸引入植物的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与治疗有效量的以下物质接触：
a.权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒；或
b.权利要求19至23中任一项所述的组合物，
从而将多核苷酸引入所述植物。
25.预防或治疗植物中的病毒性传染病的方法，所述方法包括将所述植物或其部分与治疗有效量的以下物质接触：
a.权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒；或
b.权利要求19至23中任一项所述的组合物，
从而预防或治疗所述植物中的病毒性传染病。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病毒性传染病包括葡萄卷叶病(GLD)。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述病毒性疾病由属于葡萄卷叶病毒属的病毒诱导。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述病毒性疾病由选自葡萄卷叶相关病毒(GLRaV)的病毒诱导。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述病毒性疾病由病毒GLRaV-3诱导。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述治疗包括降低在所述植物或其部分中诱导所述病毒性传染病的病毒的滴度。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述治疗包括降低以下中的任一个：所述植物的卷曲叶子的数量、所述植物的叶子向下卷曲或呈杯状的比率、及其组合。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述接触包括对所述植物或其所述部分进行喷洒、浸润、浸渍、浸泡、注射或其任何组合。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中所述植物部分包括所述植物的叶。
CN202280022643.9A 2021-01-21 2022-01-20 RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法 Pending CN117479837A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163139904P 2021-01-21 2021-01-21
US63/139,904 2021-01-21
PCT/IL2022/050086 WO2022157772A1 (en) 2021-01-21 2022-01-20 Rnai nanoparticles and methods of using same in agriculture

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117479837A true CN117479837A (zh) 2024-01-30

Family

ID=80786893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280022643.9A Pending CN117479837A (zh) 2021-01-21 2022-01-20 RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240090512A1 (zh)
EP (1) EP4280874A1 (zh)
CN (1) CN117479837A (zh)
BR (1) BR112023014676A2 (zh)
IL (1) IL304640A (zh)
MX (1) MX2023008604A (zh)
WO (1) WO2022157772A1 (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US20100285111A1 (en) * 2007-11-09 2010-11-11 Northeastern University Self-assembling micelle-like nanoparticles for systemic gene delivery
AU2009210508B2 (en) * 2008-01-31 2015-04-09 State Of Oregon, Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Closterovirus vectors and methods
WO2015065773A1 (en) * 2013-11-04 2015-05-07 Northeastern University System for co-delivery of polynucleotides and drugs into protease-expressing cells
WO2019173721A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for controlling plant viral infection

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023008604A (es) 2023-10-10
EP4280874A1 (en) 2023-11-29
WO2022157772A1 (en) 2022-07-28
BR112023014676A2 (pt) 2023-10-03
IL304640A (en) 2023-09-01
US20240090512A1 (en) 2024-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101889091B (zh) 基于纳米载体的植物转染和转导
EP3063300B1 (fr) Micropeptides et leur utilisation pour moduler l&#39;expression de gènes
CN102675438B (zh) 基于RNAi技术的抗虫制剂及方法
EA029482B1 (ru) Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений
US10435701B2 (en) Methods and compositions for plant pest control
UA118841C2 (uk) Спосіб формування рослини, яка має підвищену стійкість до комахи-шкідника
US20150247153A1 (en) Method for Improving Shelf Life by Regulating Expression of Polyphenol Oxidase
Avital et al. Foliar delivery of siRNA particles for treating viral infections in agricultural grapevines
Wang et al. Functionalized carbon dot‐delivered RNA nano fungicides as superior tools to control Phytophthora pathogens through plant RdRP1 mediated spray‐induced gene silencing
Wang et al. A promising approach to an environmentally friendly pest management solution: nanocarrier-delivered dsRNA towards controlling the destructive invasive pest Tuta absoluta
CN105543224B (zh) 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
JP2021523726A (ja) アブラムシに高致死性のＲＮＡｉ標的遺伝子およびその使用
Xu et al. Nanoparticle-dsRNA treatment of pollen and root systems of diseased plants effectively reduces the rate of tobacco mosaic virus in contemporary seeds
JP2009263362A (ja) 二本鎖ｒｎａを用いた害虫駆除剤
CN117479837A (zh) RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法
WO2015185861A1 (fr) Utilisation de micropeptides pour favoriser la croissance des plantes
CN116210716B (zh) 一种防治致病疫霉的多元纳米制剂及其制备方法
CN108024542B (zh) 组合物
CN112592922A (zh) 一种抑制细菌生物膜生长的dna四面体复合物
WO2022040354A2 (en) Use of fana antisense oligonucleotides for the prevention and management of huanglongbing and zebra chip diseases
US20230323373A1 (en) Sprayable cell-penetrating peptides for substance delivery in plants
WO2014091466A2 (en) A method for the control of nematodes in plants
US20240206478A1 (en) Composition targeting v-atpase for controlling frankliniella occidentalis and method of controlling frankliniella occidentalis using same
Dyer The Use of Reverse Genetics to Investigate Plant-parasite Interactions
CN118086301A (zh) 一种sRNA结合茎尖超低温疗法脱除啤酒花矮化类病毒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination