CN117467725B - 一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺 - Google Patents
一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,属于微生物技术领域。本发明针对蝙蝠蛾拟青霉发酵产品核苷的含量相对较低,发酵周期长,发酵工艺复杂特点,开发一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,本发明工艺步骤具体包括:菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理。本发明所得产品,腺苷含量可到0.4%,腺苷、鸟苷以及尿苷总量可到1.72%,核苷含量有效提升,远高于市售产品。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺。
背景技术
冬虫夏草仅仅是我国190多种虫草中的一种,主产于青藏高原上,又简称"虫草"。虫草是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,主要活性成分为虫草素、虫草酸、虫草多糖等有益于人体吸收的物质,冬虫夏草是我国传统的名贵药膳滋补品,它性平味甘,具有补肺肾、止咳嗽、益虚损、养精气之功能。冬虫夏草具有养肺阴,补肾阳、止咳化痰、抗癌防老的功效,为平补阴阳之品,诸无所忌。冬虫夏草可用于肺痨咳血,阳痿遗精等症;其药理药效的不可替代作用、生态环境恶劣等使其珍贵而稀少,随着人类生活水平的不断提高,人们对冬虫夏草的需求量越来越大,而资源量却越来越少,供求矛盾越来越突出。为了解决这一问题,近几年,我国生物医学界的研究人员先后分离出多株虫草真菌菌株,试图利用人工发酵方式生产虫草菌丝体,用以代替天然冬虫夏草。经过不懈的努力,有几家已生产出在药理、毒理及功效成分等方面与天然虫草相似的产品,并能实现现代化条件下的大规模生产。
例如,蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)是从新鲜冬虫夏草中分离所得的隶属丛梗孢科(Moniliaceae)瓶梗青霉属(Paecilomyces Bain)虫生真菌。1982年,中国医学科学院药物研究所的研究人员从青海化隆采集的新鲜冬虫夏草中分离得到了Cs-4菌株,经鉴定可知,该Cs-4菌株是蝙蝠蛾拟青霉(戴如琴,李晓明,邵爱娟,等.蝙蝠蛾拟青霉名称的合格化[J].菌物学报,2008(5):641-644),蝙蝠蛾拟青霉菌丝体是利用蝙蝠蛾拟青霉通过人工深层发酵培养所得,已作为冬虫夏草的代用品在中成药和保健食品中广泛使用。
发酵培养虫草菌株是制备虫草产品的前提,传统的虫草菌株发酵工艺存在发酵得率低、发酵时间长的问题。因此,出现了静置发酵、间歇发酵和补料分批发酵等工艺,但这些发酵工艺仍存在各种问题,比如染菌率高、发酵周期长、操作工艺复杂和发酵产物中的活性成分含量低等。特别的,传统发酵工艺所得产品,其典型活性成分核苷含量仍然处于较低的水平,因此,如何优化发酵工艺,得到一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体,是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有发酵技术中,蝙蝠蛾拟青霉发酵产品核苷的含量相对较低,发酵周期长,发酵工艺复杂特点,开发一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,所得产品核苷含量大幅提升。
为实现上述技术目的,本发明所采用的技术方案为:
一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,工艺步骤包括:菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理。
进一步的,本发明的工艺步骤具体为:
(1)菌株斜面接种培养:将购买的菌株接种到斜面培养基MM中,经23-25℃培养7-8天至菌丝长满斜面,长好的斜面注明菌种名称、制备日期,用牛皮纸包扎好,置于4℃保存;
(2)一级摇瓶种子培养:将250mL一级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灼烧灭菌的接种钩挑取步骤(1)所得带菌琼脂块3块接入,纱布封口,23-25℃,130-180r/min培养4-7d,得到一级摇瓶种子液;
(3)二级摇瓶种子培养:将250mL二级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灭菌枪头吸取10mL一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基,23-25℃,130-180r/min培养4-7d,得到二级摇瓶种子液;
(4)种子罐培养:将二级摇瓶种子液按照质量比1:80-160接入种子罐培养基中,通气量1.0-1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度20-25℃,pH自然,溶氧自然,发酵时间2-3天,得到种子罐发酵液;
(5)发酵罐发酵:将种子罐发酵液转入发酵罐培养基中进行发酵,转种体积比例1:(7-15),通气量1.0-1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度20-25℃,pH自然,溶氧自然,发酵周期3-4天,pH值稳定或略有上升,发酵时间65-72h、残糖0.9-1.2%左右,下发酵罐;
(6)菌丝后处理:将步骤(5)所得物料用400-500目纱布过滤,65-75℃下干燥40-48h,控制物料含水量低于7%,研磨,过80目筛后得到终产品。
进一步的,步骤(1)所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali),购自中国普通微生物菌种保藏中心,菌种编号为CGMCC No.3.14870。本发明所用菌株可通过中国普通微生物菌种保藏中心公开购买,无需重复保藏。
进一步的,步骤(1)斜面培养基MM的组成为:KH2PO4 1.0 g,(NH4)2HPO4 1.5 g,MgSO4·7H2O 0.6g,Thiamine HCl500µg,琼脂粉15g,加水蒸馏水至1L灭菌倒平板。
进一步的,步骤(2)一级摇瓶种子培养基的组成为:葡萄糖2-3%、蛋白胨1-1.5%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.03%,余量为水,pH自然,按质量百分比计。
进一步的,步骤(3)二级摇瓶种子培养基的组成为:麦麸提取液30-60%,葡萄糖2-3%,蛋白胨0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO40.03%,pH值自然,按质量百分比计。
进一步的,步骤(4)种子罐培养基的组成为:麦麸提取液30-60%,葡萄糖2-3%,氮源2-3.5%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O 0.04%,二甲硅油0.2-0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
更进一步的,所述麦麸提取液的制备方法为:将麦麸和水按照质量比1:(30-50)混合后进行超声波提取,超声频率为40-60kHz,超声时间为40-60min,超声温度为70-80℃,超声完成后用400-500目纱布过滤后得到。
进一步的,步骤(5)发酵罐培养基的组成为:葡萄糖2-3%,氮源2-3.5%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O0.04%,二甲硅油0.2-0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
进一步的,步骤(6)研磨时使用小钢磨,转速24000r/min。
有益效果:(1)本发明对于购买的菌株首先使用斜面培养基MM进行活化培养,使用MM培养基,养分含量相对贫瘠,能够更好的保证菌种不发生变异;
(2)一级摇瓶种子培养过程中,使用培养基成分全部为水溶性成分,在固体培养基转接液体培养基过程中,便于直观的观察染菌情况,可以及时做出相应处理;
(3)本发明在二级摇瓶培养基和种子罐培养基中加入适量的麦麸提取液,麦麸提取液有利于种子液中菌量的快速增殖,缩短发酵周期,并有利于活性物质的积累;
(4)在发酵培养中采用较高的通气量,可以增强菌种的代谢能力,增加活性物质的积累,同时添加相对较多的二甲硅油消泡剂,有效抑制发酵产过程中产生的起泡现象;
(5)本发明所得产品,腺苷含量可到0.4%,腺苷、鸟苷以及尿苷总量可到1.72%,核苷含量有效提升,远高于市售产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但不限于此。
实施例1:一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,工艺步骤包括:菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理。
本实施例的工艺步骤具体为:
(1)菌株斜面接种培养:将购买的菌株接种到斜面培养基MM中,经23℃培养7-8天至菌丝长满斜面,长好的斜面注明菌种名称、制备日期,用牛皮纸包扎好,置于4℃保存;
(2)一级摇瓶种子培养:将250mL一级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灼烧灭菌的接种钩挑取步骤(1)所得带菌琼脂块3块接入,纱布封口,23℃,130r/min培养7d,得到一级摇瓶种子液;
(3)二级摇瓶种子培养:将250mL二级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灭菌枪头吸取10mL一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基,23℃,130r/min培养7d;得到二级摇瓶种子液;
(4)种子罐培养:将二级摇瓶种子液按照质量比1:160接入种子罐培养基中,通气量1.04vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度20℃,pH自然,溶氧自然,发酵时间3天,得到种子罐发酵液;
(5)发酵罐发酵:将种子罐发酵液转入发酵罐培养基中进行发酵,转种体积比例1:15,通气量1.04vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度20℃,pH自然,溶氧自然,发酵至第3天,pH值稳定或略有上升,发酵时间72h,残糖0.9%,下发酵罐;
(6)菌丝后处理:将步骤(5)所得物料用400-500目纱布过滤,65℃下干燥48h,控制物料含水量低于7%,研磨,过80目筛后得到终产品。
步骤(1)所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali),购自中国普通微生物菌种保藏中心,菌种编号为CGMCC No.3.14870。本发明所用菌株可通过中国普通微生物菌种保藏中心公开购买,无需重复保藏。
步骤(1)斜面培养基MM的组成为:KH2PO4 1.0 g,(NH4)2HPO4 1.5 g,MgSO4·7H2O0.6g,Thiamine HCl500µg,琼脂粉15g,加水蒸馏水至1L灭菌倒平板。
步骤(2)一级摇瓶种子培养基的组成为:葡萄糖2%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.03%,余量为水,pH自然,按质量百分比计。
步骤(3)二级摇瓶种子培养基的组成为:麦麸提取液30%,葡萄糖2%,蛋白胨0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO40.03%,pH值自然,按质量百分比计。
步骤(4)种子罐培养基的组成为:麦麸提取液30%,葡萄糖2%,氮源2%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O 0.04%,二甲硅油0.2%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
所述麦麸提取液的制备方法为:将麦麸和水按照质量比1:50混合后进行超声波提取,超声频率为40kHz,超声时间为40min,超声温度为70℃,超声完成后用400-500目纱布过滤后得到。
步骤(5)发酵罐培养基的组成为:葡萄糖2%,氮源2%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O0.04%,二甲硅油0.2%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
步骤(6)研磨时使用小钢磨,转速24000r/min。
实施例2:一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,工艺步骤包括:菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理。
本实施例的工艺步骤具体为:
(1)菌株斜面接种培养:将购买的菌株接种到斜面培养基MM中,经25℃培养7-8天至菌丝长满斜面,长好的斜面注明菌种名称、制备日期,用牛皮纸包扎好,置于4℃保存;
(2)一级摇瓶种子培养:将250mL一级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灼烧灭菌的接种钩挑取步骤(1)所得带菌琼脂块3块接入,纱布封口,25℃,180r/min培养4d,得到一级摇瓶种子液;
(3)二级摇瓶种子培养:将250mL二级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灭菌枪头吸取10mL一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基,25℃,180r/min培养4d;得到二级摇瓶种子液;
(4)种子罐培养:将二级摇瓶种子液按照质量比1:160接入种子罐培养基中,通气量1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度25℃,pH自然,溶氧自然,发酵时间3天,得到种子罐发酵液;
(5)发酵罐发酵:将种子罐发酵液转入发酵罐培养基中进行发酵,转种体积比例1:10,通气量1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度25℃,pH自然,溶氧自然,发酵至第3天,pH值稳定或略有上升,发酵时间70h,残糖1.0%,下发酵罐;
(6)菌丝后处理:将步骤(5)所得物料用400-500目纱布过滤,75℃下干燥48h,控制物料含水量低于7%,研磨,过80目筛后得到终产品。
步骤(1)所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali),购自中国普通微生物菌种保藏中心,菌种编号为CGMCC No.3.14870。本发明所用菌株可通过中国普通微生物菌种保藏中心公开购买,无需重复保藏。
步骤(1)斜面培养基MM的组成为:KH2PO4 1.0 g,(NH4)2HPO4 1.5 g,MgSO4·7H2O0.6g,Thiamine HCl500µg,琼脂粉15g,加水蒸馏水至1L灭菌倒平板。
步骤(2)一级摇瓶种子培养基的组成为:葡萄糖3%、蛋白胨1.5%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.03%,余量为水,pH自然,按质量百分比计。
步骤(3)二级摇瓶种子培养基的组成为:麦麸提取液60%,葡萄糖3%,蛋白胨0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO40.03%,pH值自然,按质量百分比计。
步骤(4)种子罐培养基的组成为:麦麸提取液60%,葡萄糖3%,氮源3.5%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O 0.04%,二甲硅油0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
所述麦麸提取液的制备方法为:将麦麸和水按照质量比1:30混合后进行超声波提取,超声频率为60kHz,超声时间为60min,超声温度为80℃,超声完成后用400-500目纱布过滤后得到。
步骤(5)发酵罐培养基的组成为:葡萄糖3%,氮源3.5%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O0.04%,二甲硅油0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
步骤(6)研磨时使用小钢磨,转速24000r/min。
实施例3:一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,工艺步骤包括:菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理。
本实施例的工艺步骤具体为:
(1)菌株斜面接种培养:将购买的菌株接种到斜面培养基MM中,经25℃培养7-8天至菌丝长满斜面,长好的斜面注明菌种名称、制备日期,用牛皮纸包扎好,置于4℃保存;
(2)一级摇瓶种子培养:将250mL一级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灼烧灭菌的接种钩挑取步骤(1)所得带菌琼脂块3块接入,纱布封口,25℃,150r/min培养5d,得到一级摇瓶种子液;
(3)二级摇瓶种子培养:将250mL二级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灭菌枪头吸取10mL一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基,25℃,150r/min培养5d;得到二级摇瓶种子液;
(4)种子罐培养:将二级摇瓶种子液按照质量比1:80接入种子罐培养基中,通气量1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度23℃,pH自然,溶氧自然,发酵时间3天,得到种子罐发酵液;
(5)发酵罐发酵:将种子罐发酵液转入发酵罐培养基中进行发酵,转种体积比例1:7,通气量1.2vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度23℃,pH自然,溶氧自然,发酵周期4天,pH值稳定或略有上升,发酵时间65h,残糖1.2%,下发酵罐;
(6)菌丝后处理:将步骤(5)所得物料用400-500目纱布过滤,70℃下干燥48h,控制物料含水量低于7%,研磨,过80目筛后得到终产品。
步骤(1)所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali),购自中国普通微生物菌种保藏中心,菌种编号为CGMCC No.3.14870。本发明所用菌株可通过中国普通微生物菌种保藏中心公开购买,无需重复保藏。
步骤(1)斜面培养基MM的组成为:KH2PO4 1.0 g,(NH4)2HPO4 1.5 g,MgSO4·7H2O0.6g,Thiamine HCl500µg,琼脂粉15g,加水蒸馏水至1L灭菌倒平板。
步骤(2)一级摇瓶种子培养基的组成为:葡萄糖3%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.03%,余量为水,pH自然,按质量百分比计。
步骤(3)二级摇瓶种子培养基的组成为:麦麸提取液60%,葡萄糖3%,蛋白胨0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO40.03%,pH值自然,按质量百分比计。
步骤(4)种子罐培养基的组成为:麦麸提取液50%,葡萄糖3%,氮源3%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O 0.04%,二甲硅油0.2%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
所述麦麸提取液的制备方法为:将麦麸和水按照质量比1:30混合后进行超声波提取,超声频率为50kHz,超声时间为50min,超声温度为75℃,超声完成后用400-500目纱布过滤后得到。
步骤(5)发酵罐培养基的组成为:葡萄糖3%,氮源2%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O0.04%,二甲硅油0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
步骤(6)研磨时使用小钢磨,转速24000r/min。
实施例4:一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,工艺步骤包括:菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理。
本实施例的工艺步骤具体为:
(1)菌株斜面接种培养:将购买的菌株接种到斜面培养基MM中,经25℃培养7-8天至菌丝长满斜面,长好的斜面注明菌种名称、制备日期,用牛皮纸包扎好,置于4℃保存;
(2)一级摇瓶种子培养:将250mL一级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灼烧灭菌的接种钩挑取步骤(1)所得带菌琼脂块3块接入,纱布封口,25℃,130r/min培养7d,得到一级摇瓶种子液;
(3)二级摇瓶种子培养:将250mL二级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灭菌枪头吸取10mL一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基,25℃,150r/min培养6d;得到二级摇瓶种子液;
(4)种子罐培养:将二级摇瓶种子液按照质量比1:100接入种子罐培养基中,通气量1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度23℃,pH自然,溶氧自然,发酵时间2天,得到种子罐发酵液;
(5)发酵罐发酵:将种子罐发酵液转入发酵罐培养基中进行发酵,转种体积比例1:8,通气量1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度23℃,pH自然,溶氧自然,发酵至第3天,pH值稳定或略有上升,发酵时间71h,残糖1.0%,下发酵罐;
(6)菌丝后处理:将步骤(5)所得物料用400-500目纱布过滤,65℃下干燥40h,控制物料含水量低于7%,研磨,过80目筛后得到终产品。
步骤(1)所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali),购自中国普通微生物菌种保藏中心,菌种编号为CGMCC No.3.14870。本发明所用菌株可通过中国普通微生物菌种保藏中心公开购买,无需重复保藏。
步骤(1)斜面培养基MM的组成为:KH2PO4 1.0 g,(NH4)2HPO4 1.5 g,MgSO4·7H2O0.6g,Thiamine HCl500µg,琼脂粉15g,加水蒸馏水至1L灭菌倒平板。
步骤(2)一级摇瓶种子培养基的组成为:葡萄糖3%、蛋白胨1.5%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.03%,余量为水,pH自然,按质量百分比计。
步骤(3)二级摇瓶种子培养基的组成为:麦麸提取液40%,葡萄糖3%,蛋白胨0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO40.03%,pH值自然,按质量百分比计。
步骤(4)种子罐培养基的组成为:麦麸提取液50%,葡萄糖2.5%,氮源3%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O 0.04%,二甲硅油0.2%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
所述麦麸提取液的制备方法为:将麦麸和水按照质量比1:40混合后进行超声波提取,超声频率为45kHz,超声时间为50min,超声温度为80℃,超声完成后用400-500目纱布过滤后得到。
步骤(5)发酵罐培养基的组成为:葡萄糖2.5%,氮源2.5%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O0.04%,二甲硅油0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
步骤(6)研磨时使用小钢磨,转速24000r/min。
对比例1:发酵虫草菌粉(CS-4)对照药材,中国食品药品检定研究院。
对比例2:蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉,江苏神华药业有限公司。
对比例3:市售发酵虫草菌粉(CS-4)原料药,江西国药有限责任公司。
对比例4:市售胶囊制剂(金水宝胶囊)。
对比例5:本对比例除在步骤(3)、步骤(4)二级摇瓶培养基和种子罐培养基中不添加麦麸提取液外,其余原料和工艺步骤均同实施例4。即:
步骤(3)二级摇瓶种子培养基的组成为:葡萄糖3%,蛋白胨0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO40.03%,余量为水,pH值自然,按质量百分比计。
步骤(4)种子罐培养基的组成为:葡萄糖2.5%,氮源3%,KH2PO40.06%、MgSO4·7H2O0.04%,二甲硅油0.2%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
对比例6:本对比例除菌株选择菌种编号为CGMCC No.3.15540的蝙蝠蛾拟青霉外,其余原料和制备方法均同实施例4,即:
步骤(1)所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉,购自中国普通微生物菌种保藏中心,菌种编号为CGMCC No.3.15540。所用菌株可通过中国普通微生物菌种保藏中心公开购买,无需重复保藏。
相关活性成分检测:
按照金水宝胶囊:中国药典2020年版一部的相关方法对腺苷、鸟苷、尿苷进行含量检测其结果如下:
表1检测结果(质量百分比)
需要说明的是,上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例,而非全部实施例。显然,基于本发明的上述实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例,都应当属于本发明保护的范围。
Claims (2)
1.一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,其特征在于,工艺步骤包括:菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理;工艺步骤具体为:
(1)菌株斜面接种培养:将购买的菌株接种到斜面培养基中,经23-25℃培养7-8天至菌丝长满斜面,置于4℃保存;
(2)一级摇瓶种子培养:将250mL一级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灼烧灭菌的接种钩挑取步骤(1)所得带菌琼脂块3块接入,纱布封口,23-25℃,130-180r/min培养4-7d,得到一级摇瓶种子液;
(3)二级摇瓶种子培养:将250mL二级摇瓶种子培养基装入500mL三角烧瓶,纱布封口,121℃,灭菌20分钟,放凉备用,用灭菌枪头吸取10mL一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基,23-25℃,130-180r/min培养4-7d,得到二级摇瓶种子液;
(4)种子罐培养:将二级摇瓶种子液按照质量比1:80-160接入种子罐培养基中,通气量1.0-1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度20-25℃,pH自然,溶氧自然,发酵时间2-3天,得到种子罐发酵液;
(5)发酵罐发酵:将种子罐发酵液转入发酵罐培养基中进行发酵,转种体积比例1:(7-15),通气量1.0-1.3vvm,罐压0.02-0.05MPa,温度20-25℃,pH自然,溶氧自然,发酵周期3-4天,pH值稳定或略有上升,再持续发酵时间65-72h、残糖0.9-1.2%,下发酵罐;
(6)菌丝后处理:将步骤(5)所得物料用400-500目纱布过滤,65-75℃下干燥40-48h,控制物料含水量低于7%,研磨,过80目筛后得到终产品;
步骤(1)所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali),购自中国普通微生物菌种保藏中心,菌种编号为CGMCC No.3.14870;
步骤(1)斜面培养基的组成为:KH2PO4 1.0g,(NH4)2HPO4 1.5g,MgSO4·7H2O 0.6g,Thiamine HCl 500µg,琼脂粉15g,加水蒸馏水至1L灭菌倒平板;
步骤(3)二级摇瓶种子培养基的组成为:麦麸提取液30-60%,葡萄糖2-3%,蛋白胨0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.03%,pH值自然,按质量百分比计;
步骤(4)种子罐培养基的组成为:麦麸提取液30-60%,葡萄糖2-3%,氮源2-3.5%,KH2PO4 0.06%、MgSO4·7H2O 0.04%,二甲硅油0.2-0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5;
所述麦麸提取液的制备方法为:将麦麸和水按照质量比1:(30-50)混合后进行超声波提取,超声频率为40-60kHz,超声时间为40-60min,超声温度为70-80℃,超声完成后用400-500目纱布过滤后得到;
步骤(5)发酵罐培养基的组成为:葡萄糖2-3%,氮源2-3.5%,KH2PO4 0.06%、MgSO4·7H2O0.04%,二甲硅油0.2-0.3%,余量为水,pH自然,按质量百分比计;所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉,两者质量比为2:5。
2.根据权利要求1所述高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺,其特征在于,步骤(2)一级摇瓶种子培养基的组成为:葡萄糖2-3%、蛋白胨1-1.5%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.03%,余量为水,pH自然,按质量百分比计。
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