CN117467573A - 曼尼普尔链霉菌Sm-28及其对大豆细菌性斑疹病的防效和促生作用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物生物防治领域，本发明提供一种曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm‑28，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023906。本发明还同时提供了曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm‑28在大豆细菌性斑疹病防治和促进幼苗生长中的应用。

Description

曼尼普尔链霉菌Sm-28及其对大豆细菌性斑疹病的防效和促 生作用
技术领域
本发明属于微生物生物防治领域，涉及拮抗大豆斑疹病菌的曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株及其在植物病害防治和促生中的应用。
背景技术
大豆(Glycine max)是重要的油料作物和植物蛋白来源，由于种子中的高营养成分(蛋白质、糖、油、脂肪酸和氨基酸等)，大豆在全球被用作食品、饲料和燃料。作为重要的农作物，大豆在世界范围内被广泛使用，在人类和动物的营养中发挥着至关重要的作用，其经济重要性快速增长，全球产量约为3.065亿吨，收获面积为1.175亿公顷。大豆在全球范围内有着重要地位，同时在我国的农业生产和社会发展中也发挥着重要作用。中国是大豆主要生产国之一，主要产区集中在东北三省、黄淮海平原以及长江中下游地区，常年种植面积占粮食耕地面积的8％～10％，在国民经济中占有重要的地位.。
叶部病害影响大豆生长发育，往往导致大豆产量和品质下降。由黄单胞菌(Xanthomonas)引起的细菌性斑疹病，假单胞菌(Pseudomonas)引起的细菌性斑点病是影响大豆生产的主要细菌性病害。这些细菌病害常发生于气候温暖潮湿的地区，细菌通过水或风吹的雨水通过气孔、伤口进入植物，从而达到疾病的传播。大豆细菌性斑疹病的病原菌为地毯黄单胞大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines，Xag)，感染Xag的大豆叶片过早脱落，因而光合作用效率显著下降，致使种子体积变小或产生不成熟的种子，同时种子数量也会减少，直接影响大豆产量。这种病害在生长季后期最流行，在任何种植大豆的地方都有发生，早期疾病阶段是叶片产生小的褪绿色斑点，周围环绕着不清晰的黄色晕圈，之后斑点变为不规则的病灶，病灶中心深棕色，表皮破裂。在疾病的最后阶段，一些病灶相互合并，演变为面积更大的病斑，叶片最终干燥坏死。由于光合作用活跃的叶片表面积减少，这些症状导致大豆极大减产。
从古至今，农业一直遭受许多病害的影响，如病原菌、杂草和昆虫等，导致产量急剧下降。随着化学农药的出现，这一危机在很大程度上得到了解决。但是对化学农药的过度依赖和不受限制的使用，使得土壤退化、地下水污染并导致土地营养失衡和贫瘠。农药残留超标还会引起消费者对食品安全的担忧，并对出口作物造成贸易障碍。因此，寻求环保的替代品是当务之急。
生物农药是使用广泛的有益微生物(细菌、真菌、病毒、原生动物或藻类)及其代谢产物，来抑制植物病原体的侵染，降低植物疾病发病率。近年来，与化学农药相比，生物农药因其生态友好的特性而受到越来越多的关注。生物农药不容易在目标病原体中产生耐受性，对其他有益微生物的危害较小，并由于其自然繁殖能力而表现出延长的持久性。
放线菌是一类广泛用于农业生产的重要生防微生物，含有丰富的GC线性基因组，具有强大的生物合成潜力，作为天然活性物质(包括三分之二的已知抗生素以及许多抗癌、抗真菌和免疫抑制剂)的生产者，这些细菌对人类健康、农业和生物技术发展至关重要。高嫚妮等(2019年)从银杏树林土壤中分离放线菌，并用生长速率法测得其对苹果腐烂病菌和苹果斑点落叶病菌的抑制率达到了98％以上，对苹果褐斑病菌、小麦赤霉病菌、稻瘟病等其它病原菌的抑制率均大于60％。张艳军等(2014年)从不同环境中分离纯化得到的88株菌株中，筛选得到了对水稻白叶枯病菌具有明显拮抗作用的12号菌株，其抑菌圈直径为60.9mm，将其作为微生物农药具有一定的应用价值和开发前景。
曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)目前已知的用途为如下：
1、CN115380922A提供一种具有促生作用的微生物植物生长调节剂，以重量份数计，包括：菠萝叶1-20份，木薯渣1-50份，地衣芽孢杆菌0.1-3份，曼尼普尔链霉菌s-1(streptomyces manipurensis s-1)0.5-5份；所述的曼尼普尔链霉菌s-1保藏编号为CCTCCNo：M2017261。
2、CN108102944B提供了提供一种放线菌，其为曼尼普尔链霉菌s-1(streptomycesmanipurensis s-1)，保藏编号为CCTCC No：M2017261。对香蕉枯萎病菌1号和4号小种均有拮抗作用，尤其是对香蕉枯萎病菌4号拮抗作用显著，在香蕉枯萎病的防治中具有广阔的发展空间。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种曼尼普尔链霉菌Sm-28及其对大豆细菌性斑疹病的防效和促生作用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种曼尼普尔链霉菌(Streptomycesmanipurensis)Sm-28，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023906。
本发明还同时提供了上述曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28的用途，：对植物病原细菌、植物病原真菌具有抑制作用。
所述植物病原细菌为：菜豆普通细菌性疫病病菌(Xanthomonas axonopodispv.phaseoli)、大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)；
植物病原真菌为：杨树枯萎病菌(Fusarium solani)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.momordicae)、假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)。
本发明还同时提供了曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28的另一用途：对大豆细菌性斑疹病具有防效。
本发明还同时提供了曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28的另一用途：对植物(植物幼苗)具有促生作用。所述植物为大豆。所述促生包括增加大豆幼苗的株高、根长、茎粗、重量(包括鲜重、干重)。
本发明是针对大豆细菌性斑疹病的农药防治日益暴露出来的问题，利用微生物及其次级代谢产物进行大豆细菌性斑疹病的生物防治成为研究方向。本发明旨在提供1株对大豆斑疹病菌具有高拮抗作用的曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株。
本发明从不同生境土壤中分离得到98株放线菌，经初筛和复筛获得1株对大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines，Xag)具有较强抑制作用的拮抗Sm-28菌株，该菌株筛选自浙江嘉兴柳州公园植被下土壤。以期为大豆细菌性斑疹病的生物防治提供新的拮抗放线菌资源。
Sm-28菌株的保藏信息如下：
保藏名称：曼尼普尔链霉菌Sm-28 Streptomyces manipurensis Sm-28，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2023906，保藏日期：2023年06月05日。
本发明所涉及Sm-28菌株筛选自浙江嘉兴柳州公园植被下土壤。依据形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)。
曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株发酵滤液对大豆斑疹病菌有显著抑制作用，可以用来防治大豆细菌性斑疹病等。Sm-28菌株在高氏1号液体培养基中发酵7d(温度为28℃)，0.22μm滤膜过滤得到发酵滤液，牛津杯法测定其对大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines，Xag)的抑制作用，抑菌圈直径可达34.0±0.26mm(图5)。抗菌谱试验结果表明：Sm-28菌株发酵滤液对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)和水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)有较强的抑制作用(表3，图7)；对6种植物病原真菌菌丝的生长也有较好的抑制效果，其中对假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)和番茄早疫病菌(Alternaria solani)的菌丝抑制率分别达到了68.57±2.86％和66.33±3.36％(表4，图8)。盆栽防效试验表明：Sm-28菌株发酵滤液对大豆细菌性斑疹病的相对防效可达88.14％(见表5，图9)；实验还表明，Sm-28菌株发酵滤液稀释液对大豆幼苗的多个生长指标有明显的促生作用(见表6)。Sm-28菌株可为微生物源农药开发提供优良的菌株，在大豆等作物生物防治上有较好的应用前景。
综上，本发明提供了1株拮抗大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodispv.glycines,Xag)的曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株，在大豆细菌性斑疹病防治和促进幼苗生长中的应用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为28株代表性放线菌纯菌株的菌落形态(高氏1号培养基，培养7d)；
图2为Sm-28菌株的菌落和显微形态特征(高氏1号培养基，7d)；
图3为Sm-28菌株生理生化部分实验结果；
图4为基于16S rDNA序列构建的Sm-28菌株进化树；
图5为Sm-28菌株发酵滤液对大豆斑疹病菌Xag生长的抑制作用(牛津杯法)；
图6为Sm-28菌株发酵滤液对大豆斑疹病菌Xag细胞影响的电镜照片；
图6中：
A：高氏1号液体培养基对照；B：Sm-28菌株发酵滤液处理；
图7为Sm-28菌株发酵滤液对5种植物病原细菌的抑制效果；
图8为Sm-28菌株发酵滤液对6种植物病原真菌的抑制效果；
图9为Sm-28菌株发酵滤液对大豆细菌性斑疹病的防效；
图9中：CK1：接种高氏1号培养液阴性对照；CK2：接种Xag阳性对照；T1：喷施Sm-28发酵滤液原液后，接种Xag；T2：喷施Sm-28发酵滤液4倍稀释液后，接种Xag；T3：喷施Sm-28发酵滤液8倍稀释液后，接种Xag；T4：接种Xag后，喷施Sm-28发酵滤液4倍稀释液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明涉及的各项培养基如下：
(1)高氏1号固体培养基：可溶性淀粉20g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂20g，水1000mL，pH7.2～7.4。
(2)高氏1号培养液(即，高氏1号液体培养基)：除了不加琼脂，其余配方同(1)。
(3)NA培养基(NA固体培养基)：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.2。
(4)NA培养液：除了不加琼脂，其余配方同(3)。
(5)PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000mL，pH 6.0～6.5。
实施例1、曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株的筛选和鉴定
1菌株
(1)放线菌菌株：自不同生境的土壤中分离、纯化、筛选和鉴定，保藏放线菌菌株。
(2)大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines，Xag，以下均缩写为Xag)为现有常规菌株，例如可选用中国科学院微生物所NEAU001菌。
2培养基
包括以下培养基：
高氏1号固体培养基，用于放线菌菌株的分离纯化和鉴定等。
高氏1号培养液，用于放线菌菌株的液体发酵培养等。
NA培养基，用于Xag病菌的培养。
NA培养液，用于Xag病菌的活化。
3实验方法
3.1放线菌菌株的分离纯化和保藏
用稀释涂布法从不同生境土壤样品中分离放线菌。称取5g土壤于锥形瓶中，加入45mL无菌水，摇床震荡培养0.5h，此时土壤悬液浓度为10-1，取该浓度悬液1mL于试管中并加入9mL无菌水，土壤悬液浓度为10-2，重复以上操作将土样稀释至10-5。取上述不同浓度悬液100μL均匀涂布于含重铬酸钾(50μg/mL)的高氏1号固体培养基平板(高氏1号固体培养基)上，28℃倒置培养，当观察到有放线菌特征的菌落出现时，用接种针挑取接种到新的高氏1号固体培养基平板上，重复以上转接操作，直至无杂菌生长。将纯化得到的放线菌菌株编号，并用25％甘油保存于-80℃冰箱中。
3.2拮抗Xag放线菌菌株的筛选
3.2.1共培养法初筛
将保存于-80℃冰箱的放线菌接种于高氏1号平板上，28℃恒温培养进行2次活化，当菌落生长至7d时，用于初筛；切取直径6mm旺盛生长的放线菌菌饼。
取1mL OD600＝0.6的Xag菌液加入到99mL NA固体培养基中，混匀后倒平板。将放线菌菌饼倒置于含病原菌平板中央。28℃恒温培养2～3d，观察有无抑菌圈出现，初步筛选获得拮抗放线菌。
3.2.2牛津杯法复筛
(1)放线菌菌株的发酵培养：将有拮抗作用的放线菌接种到高氏1号固体培养基平板中，28℃培养3d，用直径6mm的无菌打孔器在放线菌平板上打孔取菌块，接种至装有100mL高氏1号培养液的250mL三角瓶中，于160r/min、28℃摇床培养7d后，将发酵液10000r/min离心3min后，过0.22μm滤膜，获得发酵滤液备用。
(2)Xag的培养：将Xag接种于NA培养液中，摇床活化培养(160r/min、28℃)，当菌密度达到OD600＝0.6时，取1mL的Xag菌液加入到99mL融化的NA培养基中混匀倒板，待凝固后，将灭菌的牛津杯放置于平板中央，加入200μL发酵滤液，28℃恒温培养3d，用十字交叉法测量抑菌圈大小，每组实验设置3个重复。根据抑菌圈大小选择出拮抗作用较强的放线菌菌株。
3.2.3目标菌株发酵滤液处理后Xag细胞形态变化的扫描电镜观察
(1)Xag的培养：将Xag接种于NA培养液中，摇床活化培养(160r/min、28℃)至菌密度为OD600＝0.6。
(2)放线菌菌株的发酵培养：用3.2.2(1)的方法获得有拮抗作用放线菌的发酵滤液。
(3)扫描电镜观察：将5mL Xag菌液离心得到菌体后，加入5mL发酵滤液稀释液(等体积的发酵滤液和高氏1号培养液混合制成)共同摇床培养4h(160r/min、28℃)，以加高氏1号培养液处理的Xag菌液为对照组，培养4h后10000r/min离心5min收集菌体。将收集的菌体用磷酸缓冲液轻轻冲洗3次，用2.5％戊二醛于4℃冰箱中固定过夜后，再用磷酸缓冲液浸泡清洗三次，每次10分钟；用30％、50％、70％、80％、90％、95％乙醇梯度脱水各一次，100％乙醇脱水2次，每次各15min；用叔丁醇浸泡三次，每次10分钟，然后放入真空冷冻干燥仪中抽真空干燥；样品喷金后进行扫描电镜观察。
3.3Sm-28菌株的鉴定
3.3.1形态特征观察
取Sm-28菌株1菌饼(直径6mm)，接于高氏1号培养基平板上活化培养3d；用接种针转接于新的高氏1号培养基平板上，28℃培养7d，观察菌落大小、形态、质地、表面、色泽等特征。光学显微镜下观察Sm-28菌株的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝等形态特征。
3.3.2生理生化特征实验
对Sm-28菌株进行酶学特性、碳源氮源的利用等生理生化试验。
3.3.3 16S rDNA序列分析
提取Sm-28菌株的基因组DNA，扩增16S rDNA序列，送上海生物工程公司测序。将测序得到的16S rDNA序列提交至GenBank并利用BLAST比对后进行分析，采用MEGA-X软件中Neighbor-Joining法构建***发育树确定所属的放线菌种类。
4 实验结果
4.1 放线菌纯菌株的获得
通过分离纯化从不同生境土壤样品中分离纯化共获98株放线菌纯菌株，28株代表性放线菌纯菌株在高氏1号培养基培养7d的菌落如图1所示。
4.2拮抗Xag放线菌菌株的筛选
利用共培养法和牛津杯法对98株放线菌菌株进行Xag抑制效果的初筛和复筛，不同放线菌菌株抑制Xag作用存在较大差异。经筛选获得1株拮抗作用较强的放线菌菌株，编号为Sm-28菌株，牛津杯法测定的抑菌圈直径达34.0±0.26mm(图5)，Sm-28菌株分离自浙江嘉兴柳州公园植被下土壤。
将Sm-28菌株进行了保藏，保藏信息如下：
保藏名称：曼尼普尔链霉菌Sm-28 Streptomyces manipurensis Sm-28，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2023906，保藏日期：2023年06月05日。
4.3Sm-28菌株发酵滤液处理后Xag细胞形态的变化
扫描电镜观察结果表明：Sm-28菌株发酵滤液处理Xag细胞后，Xag细胞内含物外漏，菌体皱缩溶解，进一步表明Sm-28菌株发酵滤液对Xag细胞有强烈的致死作用(图6)。
4.4Sm-28菌株的鉴定结果
Sm-28菌株形态特征：高氏1号培养基上28℃培养，长势旺盛，生长速度较快，基内菌丝和气生菌丝初期呈白色，慢慢生长变为粉红色，后期红色加深。培养7d后形成粉色的丝绒菌落，中间***，菌体蓬松，菌落边缘不规则呈现绒毛状，不产生可溶性色素；气生菌丝较为疏松，有分支，成熟后断裂分化为孢子丝，孢子丝呈直链状和螺旋形，着生方式为一级轮生(图2)。
生理生化试验结果表明：Sm-28菌株能产生淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶(脂酶)、脲酶、明胶酶及硫化氢和黑色素(表1、图3)；可利用多种碳源，利用效果较佳的是甘油和淀粉(表2)；可利用多种氮源，较佳氮源是蛋白胨和酵母粉。
表1Sm-28菌株生理生化试验结果
注：+++表示能力强，++表示能力中，+表示能力较弱，-表示无
表2Sm-28菌株碳源、氮源利用试验结果
注：+++表示生长旺盛，++表示生长良好，+表示生长一般，-表示不生长
16S rDNA序列分析核苷酸序列如序列表的SEQ ID NO:1。
与曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)的进化距离最近(图4)。根据Sm-28菌株的形态特征、生理生化试验结果和16S rDNA序列分析，结合链霉菌属(Streptomyces)分种检索表和进化树分析，将Sm-28菌株鉴定为曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)。
说明：上述背景技术所述的曼尼普尔链霉菌s-1(streptomyces manipurensis s-1)按照上文的牛津杯法测定对Xag的抑菌圈直径小于10mm，基本无抑制作用。
实施例2曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株抗菌谱测定
1菌株
(1)曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株。
(2)5种代表性植物病原细菌：菜豆普通细菌性疫病病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.phaseoli)、大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)，用于Sm-28菌株发酵滤液抗细菌谱测定。
(3)6种代表性植物病原真菌：杨树枯萎病菌(Fusarium solani)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.momordicae)、假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)，用于Sm-28菌株发酵滤液抗真菌谱测定。
2培养基
NA培养基(NA固体培养基)、NA培养液：用于植物病原细菌的培养；
高氏1号培养液(即，高氏1号液体培养基)：用于Sm-28菌株的发酵液培养。
PDA固体培养基：用于植物病原真菌的培养。
3实验方法
3.1Sm-28菌株的培养和发酵滤液的制备
用打孔器取Sm-28菌株3个菌饼(直径6mm)，接种于高氏1号培养液中，装液量100/250mL，160r/min，28℃恒温摇床培养7d。将发酵液置于50mL离心管中10000r/min离心3min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去残余孢子，得到发酵滤液，备用。
3.2植物病原细菌的活化
将保藏于4℃的5种病原细菌分别接种于NA培养基中，于28℃活化培养2d，然后转接于新的NA培养基上于28℃培养2d，用于细菌抗菌谱测定。
3.3Sm-28菌株抗细菌谱的测定
将已经活化培养的5种植物病原细菌分别接种于NA培养液中，摇床培养(160r/min、28℃)，当菌密度达到OD600＝0.6时，分别取1mL的病原菌菌液加入到99mL融化的NA培养基中混匀倒板，待凝固后，将灭菌的牛津杯放置于平板中央，加入200μL发酵滤液，以空白高氏1号培养液为对照，28℃恒温培养3d，用十字交叉法测量抑菌圈大小，每组实验设置3个重复。
3.4Sm-28菌株抗真菌谱的测定
用无菌镊子夹取6种植物病原真菌活化于PDA固体培养基，28℃培养7d，备用。用打孔器切取植物病原真菌菌饼(直径6mm)4个置于PDA平板的4个对角，在平板中央倒扣放置目标菌株的菌饼(直径6mm)，以同直径的高氏1号固体培养基作为对照，待对照组病原菌菌丝长满整个平板时，记录各组的病原菌菌落直径，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径。实验重复3次。
4实验结果
4.1Sm-28菌株发酵滤液对5种植物病原细菌的抑制效果
实验结果表明：Sm-28菌株发酵滤液对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)抑制作用最强；其次是对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)和水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)；对菜豆普通细菌性疫病菌(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)和大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringaepv.glycinea)的抑制作用较弱(见表3，图7)。
表3Sm-28菌株发酵滤液对5种植物病原细菌的抑制效果
注：不同小写字母表示在P<0.05水平存在显著差异
4.2Sm-28菌株发酵滤液对6种植物病原真菌的抑制效果
菌丝抑制率法测定Sm-28菌株发酵滤液对6种植物病原真菌的抑制效果如表4和图8所示。对假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)和番茄早疫病菌(Alternariasolani)的抑制作用最强，菌丝抑制率分别达到了68.57±2.86％和66.33±3.36％，其次是对水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌丝抑制率为52.33±2.31％。
表4Sm-28菌株发酵滤液对6种植物病原真菌的抑制效果
注：不同小写字母表示处理间差异显著，P<0.05
实施例3Sm-28菌株发酵滤液对大豆细菌性斑疹病的防效和促生作用
1菌种和大豆品种
(1)用于防效和促生的放线菌：曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28菌株。
(2)病原菌：大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines，Xag)。
(3)大豆品种：选取周豆25号作为实验材料。
2培养基
高氏1号培养液(即，高氏1号液体培养基)：用于Sm-28菌株的培养发酵滤液制备。
NA培养基、NA培养液：用于Xag病菌的培养。
3 实验方法
3.1 大豆的培育
选取颗粒饱满的大豆种子，播种于育苗盘中，待大豆出苗后移栽于单独的小盆中，将大豆置于光照培养箱中培育，光照18h，黑暗6h，昼夜温度为26℃和23℃。待大豆真叶完全展开时备用。
3.2Xag病菌的培养
将保藏于4℃的Xag病菌接种于NA培养基平板上，于28℃活化培养3d；挑取单菌落接种于装有100mL NA培养液的锥形瓶(规格为250mL)中，28℃、160r/min条件下摇床培养至OD600＝0.6。
3.3Sm-28菌株发酵滤液的制备
用打孔器取Sm-28菌株3个菌饼(直径6mm)，接种于高氏1号培养液中，装液量100/250mL，160r/min，28℃恒温摇床培养7d。将发酵液置于50mL离心管中10000r/min离心3min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去残余孢子，得到发酵滤液，备用。
发酵滤液用3体积倍的无菌水进行稀释，从而获得发酵滤液4倍稀释液。
发酵滤液用7体积倍的无菌水进行稀释，从而获得发酵滤液8倍稀释液。
3.4盆栽防效初步研究
(1)阴性对照组(CK1)：用无菌刷子蘸取空白的高氏1号培养液，均匀刷抹在叶片正背面，保湿24h。
(2)阳性对照组(CK2)：用无菌刷子蘸取Xag菌液，均匀刷抹在叶片正背面，保湿24h。
(3)处理组1(T1)：用喷壶将Sm-28的发酵滤液均匀喷洒至大豆叶片的正背面(100μL/cm2)，每0.5h喷洒一次，共6次；最后一次喷洒12h后，同CK2处理方法接种Xag并保湿。
(4)处理组2(T2)：按照T1所述方法将Sm-28的发酵滤液4倍稀释液均匀喷洒至大豆叶片的正背面，并在最后一次喷洒12h后，同CK2处理方法接种Xag并保湿。
(5)处理组3(T3)：按照T1所述方法将Sm-28的发酵滤液8倍稀释液均匀喷洒至大豆叶片的正背面，并在最后一次喷洒12h后，同CK2处理方法接种Xag并保湿。
(6)处理组4(T4)：同CK2方法先接种Xag，保湿，并于接种12h后按照T1所述方法将Sm-28的发酵滤液4倍稀释液均匀喷洒至大豆叶片的正背面，每0.5h喷洒一次，共6次。
处理完毕后将大豆继续置于光照培养箱中培养，待发病后记录发病情况，并计算病情指数和防治效果。每组5株大豆，整个实验重复3次。
病情分级标准：0级，叶片无病斑；1级，病斑面积占叶面积的1/4以下；2级，病斑面积占叶面积的1/4～1/2左右；3级，病斑面积占叶面积的1/2～3/4，近一半叶片枯死；4级，病斑面积占叶面积的3/4以上，一半以上或全部叶片枯死。
发病率(％)＝发病叶片数/调查叶片总数×100％
病情指数＝∑(各级病株数×相应病级数)/(调查总株数×4)×100
相对防效(％)＝(阳性对照病情指数-处理组病情指数)/阳性对照病情指数×100％
3.5Sm-28菌株发酵滤液对大豆幼苗生长的影响
将出苗的大豆移栽于单独的小盆中，分组处理后测定大豆植株的各项生长指标。将大豆分为三组，每组10盆，分别为：对照组(CK)，灌根施加高氏1号培养液3次，每次20mL，间隔4d；处理组1(T1)，灌根施加Sm-28的发酵滤液50倍稀释液3次，每次20mL，间隔4d；处理组2(T2)，灌根施加Sm-28的发酵滤液100倍稀释液3次，每次20mL，间隔4d。全部处理完毕后，于第15d选取各组长势一致的大豆植株，测定其鲜重、干重、茎粗、株高、根长，并计算促生增幅。
4实验结果
4.1Sm-28菌株发酵滤液对大豆细菌性斑疹病的防效
实验结果如表5和图9所示：阳性对照组(CK2)的病情指数高达98.33，施加发酵液处理后会减缓病害的发生。使用Sm-28菌株发酵滤液进行预防处理(T1、T2和T3处理组)时，相对防效最高达到了88.14％，随着发酵液浓度的降低，发病率和病情指数都随之升高，当用稀释8倍的发酵滤液处理(T3)后，病情指数较原液处理组(T1)，相对防效降低至61.02％；用发酵滤液4倍稀释液进行预防处理(T2)，相对防效为74.58％，优于同浓度的发酵滤液治疗处理(T4，防效为52.54％)。防效试验表明，Sm-28菌株发酵滤液的防治效果与浓度呈现正相关，且对大豆细菌性斑疹病的预防效果优于治疗效果。
表5Sm-28菌株发酵滤液对大豆细菌性斑疹病的防效
注：不同小写字母表示在P<0.05水平存在显著差异
4.2Sm-28菌株发酵滤液对大豆幼苗生长的影响
通过测量大豆幼苗的鲜重、干重、茎粗、株高和根长5个生长指标，探讨Sm-28菌株发酵滤液对大豆幼苗生长的影响。结果如表6所示。除了根长和株高之外，大豆幼苗的其他生长指标均受到Sm-28菌株发酵滤液的促进生长作用。施加Sm-28菌株发酵滤液稀释液后，大豆幼苗的茎粗由3.00mm提升至3.45mm和3.94mm，促生增幅分别为15.1％和31.4％；100倍发酵滤液稀释液则促进鲜重增加了64.41％；大豆幼苗干重方面，分别增加了1.66倍和2倍。实验表明，Sm-28菌株发酵滤液稀释液对大豆幼苗的多个生长指标表现出了明显的促生作用，有利于大豆生物量的积累。
表6不同浓度Sm-28发酵滤液对大豆幼苗生长的影响
说明：上述背景技术所述的曼尼普尔链霉菌s-1(streptomyces manipurensis s-1)按照上文进行对大豆幼苗生长的促生效果的测定，发现其对大豆幼苗的生长几乎没有明显的促生作用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28，其特征是：保藏编号为CCTCCNO：M 2023906。
2.曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28的用途，其特征是：对植物病原细菌、植物病原真菌具有抑制作用。
3.根据权利要求2所述的Sm-28的用途，其特征是：
所述植物病原细菌为：菜豆普通细菌性疫病病菌(Xanthomonas axonopodispv.phaseoli)、大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)；
植物病原真菌为：杨树枯萎病菌(Fusarium solani)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.
momordicae)、假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)。
4.曼尼普尔链霉菌(Streptomyces manipurensis)Sm-28的用途，其特征是：对大豆细菌性斑疹病具有防效。
5.根据权利要求2～4任一所述的Sm-28的用途，其特征是：对植物具有促生作用。
6.根据权利要求5所述的Sm-28的用途，其特征是：所述植物为大豆。
7.根据权利要求6所述的Sm-28的用途，其特征是：所述促生包括增加大豆幼苗的株高、根长、茎粗、重量。
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