CN117448441A - 一种基于RNase HⅡ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增的单核苷酸多态性等温分型方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种恒温条件下的单基因多态性基因分型技术，利用RNase HⅡ酶特异性水解DNA‑RNA杂合链中的RNA，分别设计针对野生型和突变型的RNA/DNA杂合型引物，辅以对应的锁核酸‑阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基识别和扩增能力，确保体系的保真性。在无阻滞探针结合情况下，RNA/DNA杂合引物在与目标DNA碱基序列互补时，引物的RNA一侧才能被RNase HⅡ降解，从而获得延伸能力，在链置环活性Bst‑Taq聚合酶作用下催化新链合成，同时环引物的延伸能够显著提高LAMP的扩增效率，短时间内实现核酸大量扩增，通过荧光信号监测实时扩增。基于RNase HⅡ酶依赖‑锁核酸‑阻滞探针‑环介导恒温扩增荧光技术建立1555A>G基因分型检测体系，能在确保特异性的前提下，短时间内实现1555A>G的基因分型。

Description

一种基于RNase HⅡ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩 增的单核苷酸多态性等温分型方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及单核苷酸多态性的等温检测与分型，具体涉及基于RNase HⅡ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增荧光技术(LAMP-LNA-Blocker-RNase HⅡ-Eve Green,LAMP-LBR-Eve)的单核苷酸多态性基因分型检测体系的方法。

背景技术

耳聋是由遗传或环境因素引起，其中遗传因素占50％。按其遗传方式可分为常染色体显性遗传、常染色体隐形遗传、X连锁遗传和线粒体遗传等。在遗传致聋因素中，线粒体DNA(Mitochondrion DNA,mt DNA)突变与药物性耳聋及非综合征型耳聋的发病密切相关。国内外大量、***的研究表明：线粒体DNA 1555A>G和1494C>T突变为母系遗传药物性耳聋发生的遗传基础，氨基糖甙类抗生素是其致聋的主要诱因。

线粒体是存在于大多数真核细胞中的一类具有双层膜结构的半自主细胞器，拥有独立的遗传物质即mt DNA。mt DNA突变在全世界不同地区存在差异，1555A>G突变，在普通人群的发生率为0.08％～0.7％，耳聋人群中的发生率为0.42％～17％，而1494C>T突变则分别为0.01％～0.25％和0.18％～0.7％。1555A>G和1494C>T的突变，改变了线粒体12SrRNA高度保守区域结构，使得其转录后的rRNA结构与细菌16S rRNA结构相似，从而易于与氨基糖甙类抗生素结合。氨基糖甙类抗生素，如链霉素、庆大霉素等，能够与突变后的线粒体12S rRNA相结合，使得线粒体核糖体空间构象发生变化，影响线粒体蛋白质的翻译，进而使得线粒体氧化磷酸化功能障碍，ATP产生不足，影响内耳内、外毛细胞的能量产生及利用，造成毛细胞的损伤，且毛细胞的损伤是不可逆的，两者共同导致耳聋的发生。

目前耳聋基因遗传学检测技术包括下一代测序技术、多重连接探针扩增技术、变性高效液相色谱、微阵列基因芯片检测技术、实时荧光检测技术、片段分析技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、高分辨率熔解曲线分析技术、Sanger测序等。但相关技术存在检测环境要求高、实验操作复杂、设备相对昂贵、时间长等缺点，难以在基层医院和社区诊所普及。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)在恒温条件下，能快速、高效、特异地扩增DNA。该技术的原理是针对靶基因的6～8个特定区域设计6～8种引物，利用一种链置活性的DNA聚合酶在恒温条件下催化新链的合成，在短时间内可以实现核酸扩增。LAMP可以在15～60min内扩增出10⁹靶序列拷贝。LAMP引物的设计是该技术的核心。LAMP引物设计主要靶定在靶序列上的6个序列区间，分别标记为F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，根据这6个区间共设计4条引物FIP、BIP、F3、B3。正向内引物FIP由F1c序列和F2序列组成，反向内引物BIP由B1c序列和B2序列组成，F3为正向外引物(与F3c序列互补)，B3为反向外引物(与B3c序列互补)。FIP、BIP、F3、B3引物为必需引物，为了提高LAMP反应速度，常在反应体系中添加两条环引物，即LF引物与LB引物。内引物与靶基因的响应区域杂交结合后，在Bst聚合酶的作用下开始链的合成，由此触发LAMP反应。接下来，外引物F3/B3分别与F3c和B3c结合，各自合成出一条单链进而置换出内引物合成的两条单链。由于这两条链的5'端各自有互补的区域，因此各自会形成一个环状结构。随后在另一条外引物的作用下，另一端也形成一个环状结构，由此形成了LAMP反应的初始哑铃结构。以自身结构为模板，3'端的F1区域作为起点，内引物的F1c区域与哑铃结构的F1区域结合，F2区域和F2c区域结合，由此触发循环链置换放大扩增反应；同样BIP与哑铃结构的另一端茎环结构的B2c区域互补，启动下一轮放大扩增。由此周而复始，至LAMP反应结束，扩增体系里产生了大量由相同特异性序列的反向重复片段组成的DNA片段混合物。但LAMP容易形成气溶胶，加上Bst聚合酶缺乏保真性，特异性低，且反应体系中存在多对引物，容易产生假阳性。

锁核酸(Locked nucleic acid,LNA)是一种含有桥接双环糖基的合成核酸类似物。在2'-O-和4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖“锁定”为3'-内构象。LNA:DNA杂交体与其对应的DNA:DNA相比，其退火温度会大幅度升高。DNA引物中每掺入一个LNA核苷酸可使Tm值增加3～8℃。掺入LNA核苷酸后，由于LNA在错配位点形成Watson-Crick碱基对的倾向更强，导致探针通过单核苷酸多态性区分等位基因的能力大大增强。

Blocker探针为人工合成的一段单链核苷酸序列，Blocker探针与引物最大的区别在于其3′-OH端以3′-Spacer C3或3′-Phosphat进行修饰。由于其3′-OH被封闭，因此，其不能参与PCR的延伸反应。在PCR退火阶段，野生型Blocker序列与野生型模板完全互补配对，阻碍突变型PCR引物与野生型模板结合；而突变型Blocker序列与突变型模板配对，阻碍野生型引物与突变型模板结合。由于LNA的作用，LNA-Blocker将优先与模板结合，从而增加检测体系的特异性。

RNase HⅡ是一种来源于极端耐热菌株的内源性核酸内切酶，它识别RNA/DNA杂交链并切割RNA链，其对单链RNA切割活性极低，且对dsDNA、ssDNA无切割活性。因此只有当互补靶DNA碱基存在时，RNase HⅡ才能消化DNA-RNA杂交链，使DNA-RNA杂交链在RNA碱基的5′侧发生裂解，留下具有3′-OH的DNA寡核苷酸，该3′-OH DNA寡核苷酸能够起到引物的作用，从而允许引物延伸。由于仅在与互补靶序列紧密结合时才发生RNA化引物的裂解切割，故极大地提高了反应的准确性。RNase HⅡ的应用需要配合专一的特殊引物。该引物含有一个RNA残基和一个3′端封闭部分。在引物与目标DNA杂交后，RNA碱基的5′端，被RNase HⅡ酶识别并切割，得到的3′-OH，从而获得延伸的能力。

发明内容

本申请提供了一种恒温条件下的单基因多态性基因分型技术。该技术利用RNaseHⅡ酶特异性水解DNA-RNA杂合链中的RNA，但不水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不消化单链或双链DNA或RNA的特点，分别设计针对野生型和突变型的RNA/DNA杂合型引物，辅以对应的锁核酸-阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基识别和扩增能力，确保体系的保真性。只有在无阻滞探针结合的情况下、RNA/DNA杂合引物在与目标DNA碱基序列互补时，引物的RNA一侧才能被RNase HⅡ降解，从而获得延伸能力，在链置环活性Bst-Taq聚合酶作用下催化新链合成，同时而环引物的延伸能够显著提高LAMP的扩增效率，短时间内实现核酸大量扩增，通过检测荧光信号对实时扩增进行监测。据此建立基于RNaseHⅡ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增荧光技术的耳聋基因1555A>G基因分型检测体系，能在确保特异性的前提下，短时间内实现1555A>G的基因分型。

本发明的技术内容如下：

第一方面，本发明提供了一种基于恒温扩增的检测药物性耳聋基因1555A>G突变的引物组合物。包含内引物、外引物以及环引物，即F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3以及LF和LB。其中F1c和F2组成FIP，B1c和B2组成BIP。

本发明中所涉及的Blocker探针为人工合成的一段单链核苷酸序列，长度为15～40个碱基，其3′-OH端以3′-Spacer C3或3′-Phosphat进行修饰。在PCR退火阶段，野生型Blocker探针与野生型模板完全互补配对，阻碍突变型PCR引物与野生型模板结合，而突变型Blocker探针与突变型模板配对，阻碍野生型引物与突变型模板结合。

本发明中所涉及的Blocker探针的碱基被锁核酸LNA修饰，每2～4个碱基修饰一个LNA。

本发明所涉及的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括第一引物组和第二引物组，两个引物组都包括5条共同引物和两条基因特异性引物；所述第一引物探针组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、FIP引物以及一条1555A的下游等位基因特异性BIP引物和一条1555G下游等位基因特异性Blocker探针；所述第二引物探针组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、FIP引物以及一条1555G的下游等位基因特异性BIP引物和一条1555A下游等位基因特异性Blocker探针。其中BIP引物中，存在RNA修饰碱基，其中RNA碱基上游有至少3～15个碱基，在该RNA碱基下游有3～10个碱基。

第二方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因1555A>G的体系，所述体系包括第一方面所述的引物探针组合物。

本发明所涉及的反应体系中包括LAMP引物、RNA修饰的BIP引物、LNA修饰的Blocker探针、dNTP、缓冲液Bst聚合酶、RNase HII、石蜡油、甜菜碱和ddH₂O等。

本发明中所涉及的DNA聚合酶Bst Taq是既不具有5'→3'外切酶活性，也不具有3'→5'的外切酶活性，能够满足引物与模板结合并延伸、扩增的工作条件即可。

本发明中所涉及的RNase HⅡ是一种来源于极端耐热菌株的内源性核酸内切酶，它识别RNA/DNA杂交链并切割RNA链，其对单链RNA切割活性极低，且对dsDNA、ssDNA无切割活性，浓度为5U/μL，使用体积0.01μL～1.0μL。

本发明中所涉及的反应体系中，使用Eve-Green作为荧光染料。

在本发明中，对SNP进行分型，需要设置两组反应体系，对同一个样本进行扩增。分别设计针对野生型和突变型的RNA/DNA杂合型引物，辅以对应的锁核酸-阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基识别和扩增能力，确保体系的保真性。只有在无阻滞探针结合的情况下、RNA/DNA杂合引物在与目标DNA碱基序列互补时，引物的RNA一侧才能被RNase HⅡ降解，从而获得延伸能力，在链置环活性Bst-Taq聚合酶作用下催化新链合成，同时环引物的延伸能够显著提高LAMP的扩增效率，短时间内实现核酸大量扩增，通过检测荧光信号对实时扩增进行监测。以相应的野生型质粒、突变型质粒DNA样本为模板，进行LAMP-LBR-Eve检测。反应体系如表1所示。

表1LAMP-LBR-Eve反应体系

本发明对SNP进行分型的过程中，代表SNP对应核苷酸类型的引物分别对相同的待测模板进行扩增。扩增反应与探针的杂交不需要分管进行，可以实现一步检测。整个LAMP反应的温度一般在60℃至63℃，较高的反应温度有利于筛选Tm值合适的短链探针，从而降低非互补的探针产生的背景。

本发明所述SNP等温分型方法在引物设计、扩增反应体系、反应条件和仪器设备方面可依循普通环介导等温扩增。

第三方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因1555A>G的方法，

采用如第一方面所述的引物探针组合、如第二方面所述的体系对样本DNA进行荧光定量PCR，根据扩增曲线的有无对药物性耳聋基因1555A>G进行分型。

所述LAMP-LBR-Eve扩增过程为：

①将PCR八联管放入荧光PCR仪样本槽。

②荧光检测通道选择：FAM(Reporter:FAM，Quencher:None)。

③PCR程序参数按照表2进行设定：

表2LAMP-LBR-Eve扩增程序

④数据分析。

所述药物性耳聋基因1555A>G分型的依据为：

仅1555A检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的S形曲线，判断样本为野生型(1555A)。

仅1555G检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的S形曲线，判断样本存在1555A>G突变，为突变型(1555G)。

1555A检测体系和1555G检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，均呈现经典的S形曲线，判断样本存在1555A>G突变，为杂合型(1555A/G)。

本发明基于RNase HⅡ酶特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA，但不水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不消化单链或双链DNA或RNA的特点，分别设计针对野生型和突变型的RNA/DNA杂合型引物，在体系中增加对应的锁核酸-阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基的识别和扩增能力，确保体系的保真性。只有在未有阻滞探针结合的情况下，且RNA/DNA杂合引物与目标DNA碱基序列互补时，引物的RNA一侧才能被RNaseHⅡ降解，从而获得延伸的能力。然后在链置换活性Bst-Taq聚合酶的作用下催化新链的合成，在20分钟内实现核酸的大量扩增，通过荧光采集进行实时扩增监测。

第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的引物组合物、如第二方面所述的检测体系在药物性耳聋诊断中的应用。

(1)本发明设计5条共同引物和两条基因特异性引物，基于RNase HⅡ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增荧光技术，实现了对线粒体DNA 12S rRNA 1555A>G基因分型检测。

(2)本发明将RNase HⅡ酶和RNA/DNA引物的特异性和LAMP高效扩增的特点进行结合，在实时荧光定量PCR平台上实现对样本基因多态性的检测，其检测过程简单快捷，仅需20分钟即可完成所有检测；且在操作过程中可有效避免接触EB染料等强致癌物，减少了对操作人员的危害。

(3)本发明同时利用锁核酸-阻滞探针可增加检测特异性：锁核酸的存在使得锁核酸-阻滞探针的Tm值高于其它引物，探针可优先和互补的模板进行结合，起到屏蔽模板的作用。野生型Blocker序列与野生型模板完全互补配对，阻碍了突变型PCR引物进一步与野生型模板结合，而突变型Blocker序列与突变型模板配对，阻碍野生型引物与突变型模板结合。由于LNA的作用，LNA-Blocker将优先于对应的模板结合，从而增加检测体系的特异性。

(4)本发明的检测方法具有较好的特异性、灵敏度和重复性，可以作为耳聋基因临床检测的可选方法。

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。

“单核苷酸多态性”：全称Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和***，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看，根据核苷酸种类的不同，每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，主要包括转换(C→T)和颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。

“LAMP”：环介导的等温扩增。是一种体外等温扩增DNA特意片段的技术，扩增过程分为初始产物形成阶段以及循环扩增阶段，最终产生具有大量反向重复序列的DNA大分子片段，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

“环引物”：LAMP反应中引入的针对于其中间产物单链环上区别于内引物区的特异性引物，可以显著的增强LAMP反应的效率。

“锁核酸”：全称Locked nucleic acid，简称LNA，是一种含有桥接双环糖基的合成核酸类似物。

“Tm值”：DNA双链的熔解温度。双链DNA解链至一半时的温度，主要受到DNA链中碱基数量以及碱基组成的影响。

附图说明

图1两种质粒测序图。

图2两种质粒电泳图。

图3两个检测体系中质粒标准品扩增曲线。

图4两个检测体系中质粒标准品标准曲线。

图5两个检测体系中对不同型别质粒DNA的扩增曲线。

图6两个检测体系中对不同型别质粒特异性验证的扩增曲线Ct值。

图7两个检测体系中对不同突变负荷下的扩增曲线。

图8两个检测体系对干血片DNA梯度稀释样本的扩增曲线。

图9两个检测体系对干血片DNA系列稀释样本回归分析。

具体实施方式：

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明做进一步说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种基于RNase HⅡ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增的单核苷酸多态性等温分型方法。

1.引物的设计与合成

根据NCBI GenBank中已公布的多种人线粒体DNA基因序列比对，选取1000bp～1700bp片段范围作为环介导恒温扩增引物设计的靶序列，易于设计保守性良好、稳定性强的引物。总共需要设计7条共同引物和2条RNA型BIP引物以及2条LNA-Blocker探针。引物的特异性是LAMP准确性的前提，每一条引物都需要具有良好的特异性。应用LAMP在线引物设计软件Primer ExplorerV5设计出若干套引物，经Oligo7.0对引物进行初筛选后，再利用BLAST筛选出几组候选的常规引物组。

常规引物设计好后，根据RNase HⅡ的特点，对两条RNA型BIP引物进行RNA修饰，将野生型引物1555位点上的T改成RNA碱基U(r)，突变型引物1555位点上的C改成RNA碱基C(r)，并把3'端换成错配碱基，修饰上C3 Spacer。

根据LNA-Blocker的特点，在常规探针的基础上，对探针序列中的C和T，进行3个LNA的修饰，并在3'端修饰Phosphat，以进行封闭处理。

以野生型质粒和突变型DNA为样本，用常规的LAMP体系对引物和LNA-Blocker进行测试，确定了以下的引物和探针序列。序列分别如下：

正向外侧引物F3：

5'-GTGGCAAGAAATGGGCTACAT'(SEQ ID No.1)；

反向外侧引物B3：

5'-TTCGTCCAAGTGCACTTTCC-3'(SEQ ID No.2)；

正向环引物LF：

5'-ACTCTACTCTTAGTTTAC-3'(SEQ ID No.3)；

反向环引物LB：

5'-ACTAAAACCCCTAC GCATT-3'(SEQ ID No.4)；

正向内侧引物FIP：

5'-TTCAGGGCCCTGTTCAACTAAGCTCGAAGGTGGATTTAGC-3'(SEQ ID No.5)；

野生型-反向内侧引物Wild-BIP：

5'-CCGTCACCCTCCTCAAGTATACTCACTTACCATGTTACGACTTGUCTCCG-3'

(SEQ ID No.6)；其中3'端方向倒数第6个碱基U为RNA修饰；

突变型Blocker探针：

5'-GTTACGACTTGCCTCCTC-3'(SEQ ID No.7)；其中5'端方向第5个碱基C、第12个碱基C、第16个碱基C为LNA修饰，3'端为磷酸基团修饰；

突变型-反向内侧引物Mutant-BIP：

5'-CCGTCACCCTCCTCAAGTATACTCACTTACCATGTTACGACTTGCCTCCG-3'(SE Q IDNo.8)；其中3'端方向倒数第6个碱基C为RNA修饰；

野生型Blocker探针：

5'-GTTACGACTTGTCTCCTC-3'(SEQ ID No.9)；其中5'端方向第5个碱基C、第12个碱基T、第16个碱基C为LNA修饰，3'端为磷酸基团修饰；

上述引物和探针合成均委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行。

2.构建1555A>G检测野生型和突变型质控体系

参照NCBI中公布的MT-RNR1(12S rRNA：ID4549)基因序列，选择1555A野生型和1555G突变型区域，将该区域分别连接到载体pUC57上，构建野生型和突变型两种质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。对构建的质粒样本测序和酶切验证，确定其准确性。其测序图如图1所示，酶切电泳图如图2所示。

3.按下述扩增反应体系和反应程序进行反应。

按表3的参数配制反应体系。

表3LAMP-LBR-Eve反应体系

核酸扩增检测：

①将PCR八联管放入荧光PCR仪样本槽。

②荧光检测通道选择：FAM(Reporter:FAM，Quencher:None)。

③按照表4参数进行PCR程序的设置。

表4LAMP-LBR-Eve扩增程序

④数据分析。

4.质粒标准曲线建立

用DEPC处理水将重组质粒梯度稀释为5.0×100copies/μL～5.0×10⁵copies/μL标准溶液，共6个梯度。以上述质粒标准品溶液为模板，构建标准曲线，具体检测步骤如上。每个浓度重复3次，取平均值，作标准曲线。

质粒核酸采用广州奕昕生物科技有限公司的质粒基因组核酸提取试剂盒提取。

分别用野生型反应体系和突变型反应体系对系列浓度质粒标准溶液进行扩增，结果如图3所示。在质粒浓度5.0×10³copies/μL至5.0×10⁵copies/μL范围内，扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的S形曲线；而当浓度低于5.0×10²copies/μL，则扩增曲线只出线，而未出现平台期。

以质粒浓度(c)的对数值为横坐标，扩增曲线Ct值的平均值(y)为纵坐标，进行线性回归分析，结果见图4，野生型检测线性回归方程为y＝-2.243lgc+22.813，R²＝0.9212，线性范围均为5.0×10¹copies/μL至5.0×10⁵copies/μL，最低检测限为50copies/μL。突变型检测线性回归方程为y＝-1.799lgc+20.056，R²＝0.9964。线性范围均为5.0×10¹copies/μL至5.0×10⁵copies/μL，最低检测限为50copies/μL。

实施例2

1.特异性检测

本实施例中针对1555A>G位点设计野生型组(1555A)、突变型组(1555G)、杂合型组(1555A/G)和阴性对照组(H₂O)4组进行LAMP-LBR-Eve检测。具体检测步骤同上述实施例1。

结果如图5、图6所示。野生型检测体系对1555A质粒和1555A/G杂合型质粒均能出现S型扩增曲线，Ct值在20以内；对1555G质粒和纯水均未出现扩增曲线，Ct值为No Ct。突变型检测体系对1555G质粒和1555A/G杂合型质粒均能出现S型扩增曲线，Ct值在20以内；而对1555A野生型质粒和纯水均未出现扩增曲线，Ct值为No Ct。显示药物性耳聋基因1555A/G引物探针组合检测1555A/G的特异性为100％，该结果表明本发明引物和探针的特异性好。

2.不同突变比例测试

用5.0×10⁵copies/μL浓度的野生型和突变型质粒，按照不同比例进行混合，分别构建不同负荷的系列标准品，用相应体系进行扩増。具体检测步骤同上述实施例1。

结果图7所示，随着负荷标准品浓度的降低，扩增曲线的Ct值会相应增大；当含量为0时，两对应扩增体系均未出现扩增曲线，Ct值为No Ct；同时野生型检测体系和突变型检测体系均能检出0.78％～100％对应的阳性标准品，表明除了能检测出基因纯合子外，LAMP-LBR-Eve检测方法还能满足低于0.78％异质性核酸样本的检测要求。

3.精密度测试

选取高、中、低三个不同浓度(即5.0×10⁴copies/μL、5.0×10³copies/μL、5.0×10²copies/μL)的野生型和突变型质粒标准品，用相应体系进行扩増，日内重复10次，评价检测体系的日内精密度；同时连续5天进行重复试验，每个浓度重复3次，评价检测体系的日间精密度。具体检测步骤同上述实施例1。

采用野生型检测体系，对高、中、低三种不同浓度野生型1555A质粒检测，其日内CV值分别为2.57％、2.78％、7.36％，日间CV值分别为8.44％、6.19％、8.83％；采用突变型检测体系，分别对高、中、低三种不同浓度突变型1555G质粒检测，其日内CV值分别为1.35％、2.14％、2.26％，日间CV值分别为5.84％、5.49％、6.70％，结果如表5所示，表明所建立的方法精密度良好。

表5方法精密度

实施例3

干血片DNA梯度稀释样本检测

用干血片基因组核酸提取试剂对1片干血片样本进行核酸提取，将核酸样本用DEPC处理水配制成10ng/μL，稀释0.1ng/μL～10ng/μL，共7个梯度。以上述稀释样本为模板，构建回归曲线，具体检测步骤如实施例1。每个浓度重复3次，取平均值，作回归曲线。

干血片DNA采用广州奕昕生物科技有限公司的干血片基因组核酸提取试剂盒提取。

结果如图8。在5ng/μL至10ng/μL范围内，扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的S形曲线。而当浓度低于1ng/μL，则扩增曲线只出线，未出现平台期。

以核酸浓度(c)的对数值为横坐标，扩增曲线Ct值的平均值(y)为纵坐标，进行线性回归分析，结果见图9。野生型检测线性回归方程为y＝-2.0471gc+15.477，R²＝0.8863；线性范围均为0.1ng/μL～10ng/μL，最低检测限为0.1ng/μL。突变型检测线性回归方程为y＝-2.2542lgc+14.838，R²＝0.9778。线性范围均为0.1ng/μL～10ng/μL，最低检测限为0.1ng/μL。

有上述实施例的结果表明，本发明所提供的引物探针组合物结合LAMP-LBR-Eve检测方法，可高效检测药物性耳聋基因1555A/G，灵敏度高，特异性好，易于大范围推广应用，能作为耳聋基因恒温检测技术的验证方法，也可作为耳聋基因临床检测的可选方法。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种检测药物性耳聋基因的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测1555A位点的第一引物组和检测1555G位点的第二引物组，其中外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、FIP引物为共同的；

所述第一引物探针组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、FIP引物以及一条1555A的下游等位基因特异性BIP引物和一条1555G下游等位基因特异性Blocker探针；

所述第二引物探针组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、FIP引物以及一条1555G的下游等位基因特异性BIP引物和一条1555A下游等位基因特异性Blocker探针；

所述BIP引物为中存在RNA修饰碱基，其中RNA碱基上游有至少3～15个碱基，在该RNA碱基下游有3～10个碱基；

所述Blocker探针，长度为15～40个碱基，其3'OH修饰的基团为3'-Spacer C3、3'-Phosphat、3'-ddC、3'-Inverted End中的一种；

所述Blocker探针中存在LNA修饰，每隔3～6个碱基修饰一个LNA；

所述引物组的共同F3引物核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物组的共同B3引物核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物组的共同LF引物核酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述引物组的共同LB引物核酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述引物组的共同FIP引物核酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述引物组中针对1555A的下游等位基因特异性BIP引物核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述引物组中针对1555G的下游等位基因特异性Blocker探针核酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述引物组中针对1555G的下游等位基因特异性BIP引物核酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述引物组中针对1555A的下游等位基因特异性Blocker探针核酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.一种检测药物性耳聋基因的体系，其特征在于，所述体系包括如权利要求1所述的引物组合物。

3.根据权利要求2所述的体系，其特征包括LAMP引物、LNA修饰的Blocker探针、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、RNase HII、石蜡油、甜菜碱和ddH₂O。

4.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述DNA模板的用量为1～5μL。

5.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和RNase HⅡ酶。

6.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，荧光染料为SYTO 9，SYTO 13，SYTO 16，SYTO 24，SYTO 60，SYTO 62，SYTO 64，SYTO 82，SYBR Green I，SYBR Gold，YOPRO1，TOTO1，TOTO3，BOBO3，POPO3，TOPRO3，Eva Green，Eve Green，Boxto，Miami Green，MiamiYellow，Miami Orange，Pico 488，Nuclear Green DCS1中的一种。

7.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

8.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述检测包括以下步骤：

采用如权利要求1所述的引物组合物在野生型检测体系和突变型检测体系中分别对样本DNA进行荧光定量PCR，根据相应体系中扩增曲线的有无对药物性耳聋基因1555A>G分型。

9.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述药物性耳聋基因1555A>G突变的判断依据为：

仅1555A检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的S形曲线，判断样本为野生型(1555A)；

仅1555G检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的S形曲线，判断样本存在1555A>G突变，为突变型(1555G)；

1555A检测体系和1555G检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，均呈现经典的S形曲线，判断样本存在1555A>G突变，为杂合型(1555A/G)。

10.一种如权利要求1所述的引物探针组合物、如权利要求2–9任一项所述的体系在药物性耳聋基因诊断中的应用。