CN117448376A - 用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球、制备方法及应用 - Google Patents

用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球、制备方法及应用，靶向性杂交外泌体包裹于透明质酸水凝胶微球中，即可得到所需润滑凝胶微球；包括以下步骤：S11：将透明质酸溶于缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐，调整pH值后，在设定温度条件下充分反应；S12：反应结束后透析，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酐改性的透明质酸HA‑MA；S13：将HA‑MA与靶向性杂交外泌体混合得到混合溶液，通过微流控法即可得到所需润滑凝胶微球；本发明开发了含有表面展示的软骨细胞亲和力肽CAP的软骨细胞靶向杂交外泌体；将CAP/FGF18‑hyEXO整合到可注射生物活性透明质酸水凝胶微球得到需要的透明质酸微球，具有润滑的作用，并且可注射，减少了关节的摩擦，可用于骨关节治疗领域。

Description

用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球、制备方法及应用。
背景技术
骨关节炎OA是最常见的关节慢性疾病，是一种以软骨进行性退变为特征的退行性和令人衰弱的关节疾病。目前尚无治愈方法或有效的缓解疾病的治疗方法来预防或抑制OA的发展。关节软骨是一种高度分化的组织，缺乏提供营养的血管，导致内在修复能力有限。在健康生理状态下，软骨细胞可通过合成细胞外基质ECM维持软骨稳态，从而维持软骨结构和功能的完整性。然而，在异常的机械应力刺激和急性炎症下，软骨细胞失去了维持软骨完整性和生存的能力，转化为分泌基质降解酶的分解代谢细胞，导致OA发展过程中基质代谢失衡的关键细胞事件。在此过程中，一些基因的异常表达也会导致一系列生物学事件，如基质降解酶、促炎细胞因子、衰老等。因此，纠正异常基因表达，从而阻断基质代谢失衡的关键细胞或生物事件，保存强健的软骨细胞，从而促进ECM的合成，以维持软骨稳态和局部微环境，是有希望的OA根治性治疗策略。
MMP13、Adamts5、FGF18等在OA发生发展中起关键作用的关键基因与关节软骨稳态和软骨形成及OA密切相关。成纤维细胞生长因子18(FGF18)基因是FGF家族的一员，与软骨形成和OA密切相关，其中已被广泛报道。参与FGF18的FGF信号调控与关节软骨形成和OA发展密切相关。FGF18信号的异常沉默可导致关节发育不良和骨关节炎的发生。同时，在一系列的小动物和大动物模型研究中，FGF18可以抑制OA的发展和促进软骨损伤的愈合，表明FGF18在OA中具有保护作用，但其机制尚不清楚。迄今为止，人重组FGF18(也称为sprifermin)在关节中的应用是唯一一种基于FGF18的临床试验药物。然而，sprifermin作为一种蛋白质类药物半衰期较短，其治疗效果受到给药效率的限制。因此，寻找一种高效的方法从根本上改变FGF18基因的异常表达以及细胞和组织的异常代谢和生理状态至关重要。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球、制备方法及应用。
本发明采用的技术方案是：
一种靶向软骨细胞的杂交外泌体制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将基因编辑器对应质粒转染HEK293细胞，加入对应抗生素筛选稳定表达质粒的细胞；培养质粒-HEK293细胞，在不含外泌体的培养基中培养，并收集培养培养后的上清液提取该HEK293细胞产生的外泌体；
步骤2：将基因编辑器相对应质粒电穿孔进入脂质体载体，得到具有基因的脂质体载体；将步骤1得到的外泌体与具有基因的脂质体载体混合孵育，加入软骨细胞培养基中，即可得到靶向软骨细胞且含有基因编辑工具的杂交外泌体。
进一步的，所述基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种；
若基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器，则步骤1中将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器和具有特定基因激活功能的部分基因编辑器Cas9的两种质粒分别转染HEK293细胞；步骤2中，将具有特定基因激活功能的部分Cas9基因编辑器相对应另一部分的基因编辑器sgRNA电穿孔进入脂质体载体；
若基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种，则步骤1中将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒转染HEK293细胞；步骤2中将具有特定基因激活功能的部分Cas9基因编辑器相对应另一部分的基因编辑器sgRNA电穿孔进入脂质体载体。
上述两种技术路径均可以实现本发明之目的：
(1)一种通过外泌体载Cas9，脂质体载sgRNA——适用于CRISPR/Cas9基因编辑器
(2)脂质体载Cas9和sgRNA——适用于CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种。
第一种技术路径，可以提升杂化外泌体中的CRISPR/Cas9基因编辑器的含量。
一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
靶向性杂交外泌体包裹于透明质酸水凝胶微球中，即可得到所需润滑凝胶微球。
进一步的，具体过程如下：
S11：将透明质酸溶于缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐，调整pH值为8～9，在设定温度条件下充分反应；
S12：反应结束后透析，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酐改性的透明质酸HA-MA；
S13：将HA-MA与靶向性杂交外泌体混合得到混合溶液，通过微流控法即可得到所需润滑凝胶微球；其中，HA-MA的干重与靶向性杂交外泌体中蛋白的质量比为400:1～100:1。
进一步的，反应温度为4℃，反应时间为4～72小时。
进一步的，所述微流控法制备润滑凝胶微球过程如下：
将混合溶液作为水相，与油相和乳化剂充分混合，通过微流控装置的流聚交界处形成预凝胶液滴；然后进行交联形成微球，进行水洗即可得到所需润滑凝胶微球，其直径为25～250μm。
一种靶向软骨细胞的杂交外泌体。
一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球，所述润滑凝胶微球透明质酸与靶向性杂交外泌体通过静电作用结合，由缠结的高分子链形成交联的网络结构。
一种靶向软骨细胞的杂交外泌体的应用，所述靶向软骨细胞的杂交外泌体在药物载体中的应用。
一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球，所述润滑凝胶微球在治疗软骨缺损和骨关节药物制备中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明得到的润滑凝胶微球，由具有靶向软骨细胞的杂交外泌体，以及负载于杂交外泌体里的基因编辑***和透明质酸微球作为杂交外泌体的递送载体组成；杂交外泌体由HEK293细胞的外泌体和阳离子脂质体融合组成，基因编辑***是针对骨关节炎的特异性基因涉及，可以逆转骨关节炎的发展；
(2)本发明通过基因工程和杂化膜融合构建的杂化外泌体，其尺寸大小与外泌体相似，约为150～220nm，有利于细胞包吞内化；膜融合杂交构成的凝胶微球，保留了EXOs的特异性膜蛋白，保留了外泌体的优异的内源性功能，有利于功能性的核酸类成分进入细胞，发挥作用；
(3)本发明将基因编辑***负载于杂交外泌体以及透明质酸微球作为杂交外泌体的递送载体，能实现对软骨细胞的特异性靶向的在体的有效基因编辑，能产生具有直接的稳定的FGF18基因上调效果，以及相比现有半衰期较短的蛋白类、基因类药物，其治疗效果不会受到给药效率的限制；
(4)本发明得到的凝胶微球带有一定的正电荷性，有助于其与带负电荷的软骨细胞表面和软骨组织内的糖胺聚糖链的结合，体现出OA治疗的优势；并且外泌体具有优异的软骨靶向能力，更多会被软骨细胞内化富集，能避免如不良的脱靶细胞毒性和蓄积等问题；
(5)本发明的润滑凝胶微球具有润滑的作用，可注射减少了关节的摩擦；并且在体外具有对OA软骨细胞自我更新和ECM重塑能力的治疗效果，没有明显的细胞毒性并能促进细胞增殖，具有良好的生物相容性，在骨关节炎治疗领域具有良好的效果。
附图说明
图1为实施例1得到的脂质体、外泌体和杂交外泌体的TEM图和WB测试结果，A为不同步骤得到的外泌体的TEM图，B为WB结果。
图2为实施例1得到的脂质体、外泌体和杂交外泌体的粒径分布图以及粒径对比图，A为脂质体，B为外泌体，C为杂交外泌体，D为粒径对比图。
图3为实施例1中的脂质体、外泌体和不同负载率的杂交外泌体的电位测试结果图。
图4为CAP、FGF18-sgRNA和Cas9的质粒图谱，A为CAP质粒图谱，B为FGF18-sgRNA质粒图谱，C为Cas9质粒图谱。
图5为本发明实施例1中的脂质体、外泌体和杂交外泌体的不同时间点的粒径测试结果。
图6为本发明实施例1中的外泌体、靶向外泌体和靶向性杂交外泌体的体内外靶向测试结果。
图7为本发明实施例1中的改性透明质酸HA-MA的核磁氢谱。
图8为本发明实施例1得到的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微球的光学照片A和B，荧光图像C和SEM图D。
图9为本发明实施例1中得到的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微球的粒径分布图A，B为负载不同基因含量的微球的粒径对比示意图。
图10为不同微球的降解曲线A和释放曲线B。
图11为不同微球的COF随测试时间的变化和COF统计图。
图12为本发明实施例1得到的微球与细胞体外共培养不同时间后的细胞增殖示意图。
图13为本发明实施例1得到的微球与细胞体外共培养不同时间后的FDA/PI染色结果。
图14为本发明实施例1得到的微球与细胞体外共培养不同时间后的鬼笔环肽/DAPI染色结果。
图15为本发明实施例1得到的微球与细胞体外共培养不同时间后染色和半定量结果，A为番茄红染色结果，B为半定量结果，C为TB染色结果，D为TB染色半定量结果。
图16为本发明实施例1得到的微球与细胞体外共培养不同时间后Sox9和Col2荧光染色结果。
图17为本发明实施例1得到的微球与细胞体外共培养不同时间后的PCR基因表达结果。
图18为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠骨关节模型8到12周后的关节修复情况示意图，A为Micro-CT的三维重建结果，B为TB染色结果，C为HE染色结果，D为天狼猩红染色结果。
图19为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠关节炎模型8周后的转录组学分析，A为CAP/++FGF18-hyEXO@HMs VS CAP/no FGF18-hyEXO@HMs的火山图，B为CAP/no FGF18-hyEXO@HMs VS HMs的火山图。
图20为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠关节炎模型8周后的GO分析结果。
图21为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠关节炎模型8周后的KEGG分析。
图22为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠关节炎模型8周后的GO分析结果。
图23为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠关节炎模型8周后的KEGG分析。
图24为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠关节炎模型8周后的转录组学分析，A、B为热图分析，C为CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的蛋白互作网络图，D为CAP/no FGF18-hyEXO@HMs的蛋白互作网络图。
图25为本发明实施例1得到的微球与其他对比材料注射到大鼠关节炎模型12周后的PCR基因表达结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种靶向软骨细胞的杂交外泌体制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒转染HEK293细胞，加入对应抗生素筛选稳定表达质粒的细胞；培养质粒-HEK293细胞，在不含外泌体的培养基中培养，并收集培养培养后的上清液提取该HEK293细胞产生的外泌体；
基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种。
若基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器，则步骤1中将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器和具有特定基因激活功能的部分基因编辑器Cas9的两种质粒分别转染HEK293细胞；加入对应抗生素筛选稳定表达这两种质粒的细胞(CAP-Cas9-HEK293)，即可同时稳定表达靶向软骨细胞的特异性靶向肽和特定基因的Cas9基因编辑器的HEK293细胞；培养CAP-Cas9-HEK293细胞，在无外泌体的细胞培养基中培养，收集培养基提取即可得到CAP-Cas9-HEK293细胞产生的外泌体。
若基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种，则步骤1中将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒转染HEK293细胞。加入对应抗生素筛选稳定表达质粒的细胞；培养质粒-HEK293细胞，在不含外泌体的培养基中培养，并收集培养培养后的上清液提取该HEK293细胞产生的外泌体。
离心分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，具体步骤为：
收集细胞上清液，300g，离心10分钟，保留上清液，去除死细胞及细胞碎片；
收集上清液，10000g，4℃，离心30分钟；
收集上清液，120000g，4℃，离心70分钟；
保留沉淀，用PBS重悬，120000g，4℃，离心70分钟；
保留沉淀，100μL PBS重悬，即得到外泌体液体。
步骤2：将基因编辑器对应质粒电穿孔进入脂质体载体，得到具有基因的脂质体载体；将步骤1得到的外泌体与具有基因的脂质体载体混合孵育，加入软骨细胞培养基中，即可得到靶向软骨细胞且含有基因编辑工具的杂交外泌体。
将具有特定基因激活功能的部分Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器相对应另一部分的基因编辑器sgRNA电穿孔进入脂质体载体，得到负载该SgRNA的脂质体；将步骤1得到的外泌体与负载该sgRNA的脂质体混合孵育，加入软骨细胞培养基中，即可得到靶向软骨细胞且含有特定基因编辑工具的杂交外泌体。
靶向性杂交外泌体包裹于透明质酸水凝胶微球中，即可得到所需润滑凝胶微球。
具体过程如下：
S11：将透明质酸溶于缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐，调整pH值为8～9，在设定温度条件下充分反应；反应温度为4℃，反应时间为4～72小时；
S12：反应结束后透析，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酐改性的透明质酸HA-MA；
S13：将HA-MA与靶向性杂交外泌体混合得到混合溶液，通过微流控法即可得到所需润滑凝胶微球；其中，HA-MA的干重与靶向性杂交外泌体中蛋白的质量比为400:1～100:1。
微流控法制备润滑凝胶微球过程如下：
将混合溶液作为水相，与油相和乳化剂充分混合，通过微流控装置的流聚交界处形成预凝胶液滴；然后进行交联形成微球，进行水洗即可得到所需润滑凝胶微球。
实施例1
一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
首先制备靶向软骨细胞的杂交外泌体：
步骤1：将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒CAP转染HEK293细胞，加入对应的抗生素筛选稳定表达质粒的细胞，即细胞表面稳定表达靶向软骨细胞的特异性靶向肽的HEK293细胞。
将基因编辑器CRISPR/Cas9对应质粒Cas9转染稳定表达靶向软骨细胞的特异性靶向肽的HEK293细胞，转染48小时后，加入Blasticidin抗生素筛选稳定表达质粒的细胞系；在无外泌体增养基和条件下培养Cas9-HEK293细胞，收集培养基，离心即可得到HEK293细胞产生的具有靶向软骨细胞的特异性靶向肽和Cas9基因编辑器的外泌体(CAP-EXO)。
步骤2：将基因编辑器对应FGF18基因的sgRNA电穿孔进入脂质体载体(图1中的Liposome)；将步骤1得到的外泌体与具有基因的脂质体载体混合孵育6h，加入MSC和骨关节炎的软骨细胞培养基中，即可得到靶向性杂交外泌体(CAP-hyEXO)。记作CAP/FGF18-hyEXOs(FGF18前面+是为了表示sgRNA的负载量，后面有详细说明)。为了对比采用不具有基因的脂质体载体与步骤1中的外泌体混合孵育(其余步骤均相同)，记为CAP/no FGF18-hyEXO。
步骤3：靶向性杂交外泌体包裹于透明质酸水凝胶微球中，即可得到所需润滑凝胶微球。
S11：将分子量为100万KD的透明质酸溶于缓冲溶液PBS中，透明质酸的浓度为100mg/mL，逐滴加入甲基丙烯酸酐，调整pH值为8，在设定温度条件下充分反应；反应温度为4℃，反应时间为8小时；
S12：反应结束后用截留分子量为8000KD的透析袋进行透析，透析5天，冷冻干燥48即可小时，得到多孔海绵状的甲基丙烯酸酐改性的透明质酸HA-MA；将其保存于-20℃环境中备用。制备得到的HA-MA进行1H NMR表征，结果如图7所示。从图中可以看出，HM的核磁氢谱中在6ppm附近出现了甲基丙烯酸酐的特征氢谱，说明HM制备成功，通过积分结果测得HM中甲基丙烯酸酐的接枝率约为34.6％。
S13：将浓度为20mg/mL的HA-MA溶液与靶向性杂交外泌体(CAP/FGF18-hyEXO溶液或CAP/no FGF18-hyEXO溶液的蛋白浓度为60mg/mL)混合得到混合溶液，HA-MA与靶向性杂交外泌体的质量比为500:3；在4℃环境下，将HM溶液和CAP/++FGF18-hyEXO溶液或CAP/noFGF18-hyEXO溶液在搅拌条件充分混合，然后在搅拌条件下向所得混合液中加入光引发剂LAP，使LAP在混合溶液中的浓度为5mg/mL。
通过微流控法即可得到所需润滑凝胶微球：
将混有可编辑上调FGF18的CAP/FGF18-hyEXO的2wt％HA-MA水溶液或者不具备编辑上调FGF18的CAP/no FGF18-hyEXO的2wt％HA-MA水溶液或者纯的2wt％HA-MA水溶液作为水相，搅拌混合均匀油相和乳化剂，在微流控装置的流体聚焦交界处形成预凝胶液滴。通过紫外线(UV)照射将产生的液滴交联。水凝胶微球进行大量的水洗，去掉表面残留的油相和乳化剂。分别记作：CAP/FGF18-hyEXO@HMs、CAP/no FGF18-hyEXO@HMs和HMs。
实施例2
一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
首先制备靶向软骨细胞的杂交外泌体：
步骤1：将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒CAP转染HEK293细胞，加入对应的抗生素筛选稳定表达质粒的细胞，即细胞表面稳定表达靶向软骨细胞的特异性靶向肽的HEK293细胞。
将基因编辑器CRISPR/Cas9对应质粒Cas9转染稳定表达靶向软骨细胞的特异性靶向肽的HEK293细胞，转染48小时后，加入Blasticidin抗生素筛选稳定表达质粒的细胞系；在无外泌体增养基和条件下培养Cas9-HEK293细胞，收集培养基，离心即可得到HEK293细胞产生的具有靶向软骨细胞的特异性靶向肽和Cas9基因编辑器的外泌体。
步骤2：将基因编辑器对应FGF18基因的sgRNA电穿孔进入脂质体载体；将步骤1得到的外泌体与具有基因的脂质体载体混合孵育6h，加入MSC和骨关节炎的软骨细胞培养基中，即可得到靶向性杂交外泌体。
步骤3：靶向性杂交外泌体包裹于透明质酸水凝胶微球中，即可得到所需润滑凝胶微球。
S11：将分子量为100万KD的透明质酸溶于缓冲溶液PBS中，透明质酸的浓度为100mg/mL，逐滴加入甲基丙烯酸酐，调整pH值为8，在设定温度条件下充分反应；反应温度为4℃，反应时间为72小时；
S12：反应结束后用截留分子量为8000KD的透析袋进行透析，透析5天，冷冻干燥48即可小时，得到多孔海绵状的甲基丙烯酸酐改性的透明质酸HA-MA；将其保存于-20℃环境中备用。
S13：将浓度为20mg/mL的HA-MA溶液与靶向性杂交外泌体(溶液的蛋白浓度为60mg/mL)混合得到混合溶液，HA-MA与靶向性杂交外泌体的质量比为400:1；在4℃环境下，搅拌条件充分混合，通过微流控法即可得到所需润滑凝胶微球。
实施例3
一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
首先制备靶向软骨细胞的杂交外泌体：
将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒CAP转染HEK293细胞，加入对应的抗生素筛选稳定表达质粒的细胞，即细胞表面稳定表达靶向软骨细胞的特异性靶向肽的HEK293细胞。
将基因编辑器CRISPR/Cas9对应质粒Cas9转染稳定表达靶向软骨细胞的特异性靶向肽的HEK293细胞，转染48小时后，加入Blasticidin抗生素筛选稳定表达质粒的细胞系；在无外泌体增养基和条件下培养Cas9-HEK293细胞，收集培养基，离心即可得到HEK293细胞产生的具有靶向软骨细胞的特异性靶向肽和Cas9基因编辑器的外泌体。
步骤2：将基因编辑器对应FGF18基因的sgRNA电穿孔进入脂质体载体；将步骤1得到的外泌体与具有基因的脂质体载体混合孵育6h，加入MSC和骨关节炎的软骨细胞培养基中，即可得到靶向性杂交外泌体。
步骤3：靶向性杂交外泌体包裹于透明质酸水凝胶微球中，即可得到所需润滑凝胶微球。
S11：将分子量为100万KD的透明质酸溶于缓冲溶液PBS中，透明质酸的浓度为100mg/mL，逐滴加入甲基丙烯酸酐，调整pH值为8，在设定温度条件下充分反应；反应温度为4℃，反应时间为4小时；
S12：反应结束后用截留分子量为8000KD的透析袋进行透析，透析5天，冷冻干燥48即可小时，得到多孔海绵状的甲基丙烯酸酐改性的透明质酸HA-MA；将其保存于-20℃环境中备用。
S13：将浓度为20mg/mL的HA-MA溶液与靶向性杂交外泌体(溶液的蛋白浓度为60mg/mL)混合得到混合溶液，HA-MA与靶向性杂交外泌体的质量比为100:1；在4℃环境下，搅拌条件充分混合，通过微流控法即可得到所需润滑凝胶微球。
图1为本发明实施例1中得到的脂质体、外泌体和杂交外泌体的TEM图和WB图。图中CAP-EXO为外泌体的TEM图。从图中可以看出，脂质体CAP-EXO和CAP-hyEXO样品的球形囊泡形态和纳米级特征。通过Western blot检测各种外泌体蛋白标志物(CD9、CD63和TGS101)，外泌体标志蛋白在CAP-EXO和CAP-hyEXO的表达，如B所示。
HEK293细胞来源的外泌体(EXO)、CAP-EXO和CAP-hyEXO中缺乏线粒体标志物Tomm20，可以证明CAP-hyEXO的成功构建。
图2为实施例1得到的脂质体、外泌体和杂交外泌体的粒径分布图以及粒径对比图。从图中可以看出脂质体、CAP-EXO、CAP-hyEXO的平均粒径分别为145.71nm、122.42nm、220.19nm：脂质体与CAP-EXO的膜融合之后制备的CAP-hyEXO尺寸更大。
为了优化负载效率，将不同投入量(0、2、5μg)的SgRNA载体质粒与脂质体(1mg/mL、10μl)在Opti-MEM培养基中通过电转(Gene Pulser Xcell,Bio-Rad)在室温下混合。因此，制备了3种不同装载量的脂质体SgRNA质粒。然后将Cas9-CAP/外泌体(即步骤1得到的外泌体)与3种负载质粒的脂质体(0、2μg或5μg)的混合物在37℃孵育12h。分别命名为CAP/noFGF18-hyEXO、CAP/+FGF18-hyEXO和CAP/++FGF18-hyEXO，并保存在-80℃，用于后续实验。
图3为实施例1中的脂质体、外泌体和不同负载率的杂交外泌体的电位测试结果图。从图中可以看出CAP/no FGF18-hyEXO、CAP/+FGF18-hyEXO和CAP/++FGF18-hyEXO的表面zeta电位分别为(5.74±0.13)mV、(4.61±0.05)mV和(3.57±0.11)mV,CAP-EXO的负电荷为(-26.9±0.41)mV，脂质体的正电荷为(32.4±1.0)mV。与CAP-EXOs相比，CAP-hyEXOs(CAP/no FGF18-hyEXO、CAP/+FGF18-hyEXO和CAP/++FGF18-hyEXO)具有良好的阳离子表面和稳定性，这可能有助于其与带负电荷的软骨细胞表面和软骨组织中的糖胺聚糖链结合，并在体内复杂的动态环境中保持更长时间。
图5为本发明实施例1中的脂质体、外泌体和杂交外泌体的不同时间点的粒径测试结果。从图中可以看出杂交的CAP-hyEXO(CAP/no FGF18-hyEXO，CAP/+FGF18-hyEXO，CAP/++FGF18-hyEXO)比EXO和脂质体显示出更好的稳定性，因为它们的大小至少保持不变28天，而EXO在第6天之后逐渐聚集。
图6为本发明实施例1中的外泌体、靶向外泌体和靶向性杂交外泌体的体内外靶向测试结果。(A)体外靶向性测试流程示意图，(B)荧光结果图，红色标记细胞，绿色标记外泌体，(C)荧光半定量结果。(D)体内靶向性测试流程示意图，(E)不同时间点的活体成像荧光图像，(F)不同材料注射关节腔48小时后，解剖学分析荧光标记的材料的不同脏器的富集程度，(G)对于(E)的荧光图像定量结果。(H)48小时后，解剖学分析荧光标记的材料在关节表面和截面的富集和靶向程度，(I)对于(H)荧光图像的半定量结果。
从图6中B可以看出将DIO标记的天然EXO或杂交的CAP-hyEXOs与软骨细胞或MSCs在体外孵育6小时后，可以观察到CAP-hyEXO组软骨细胞内(红色染色)的绿色荧光信号比天然EXO组更多，表明更多的CAP-hyEXO被软骨细胞摄取。从图C中可以看出，当与MSCs孵育时，自然组EXO和CAP-hyEXO组显示出相当水平的绿色荧光。平均光密度的半定量分析也显示了相同的趋势：CAP-hyEXO组的软骨细胞摄取显著较高，但所有组的MSCs摄取相似。综上所述，这些结果证明了CAP-hyEXOs在体外对软骨细胞的特异性靶向作用增强。
为了评估CAP-hyEXO在体内的滞留情况，我们将EXO、CAP-EXO和CAP-hyEXO用DIR标记注射到膝关节内，并通过IVIS Spectrum***进行监测，流程如D所示。从图E中可以看出，关节内注射后，两组样本在关节内保留长达7天。虽然随着时间的推移，三组辐射信号逐渐降低，但CAP-EXO组和CAP-hyEXO组辐射信号的降低速率比EXO对照组慢。半定量分析结果G可以看出，保留的辐射信号密度依次为CAP-hyEXO>CAP-EXO>EXO。在关节腔内注射48h后解剖大鼠，收集不同器官包括心、肝、脾、肺和肾，用IVIS Spectrum***检测，结果如图F所示。从图中可以看出，EXO组肝脏明显出现大量荧光信号，表明DIR标记的EXO聚集。CAP-EXO组和CAP-hyEXO组均未见明显荧光信号。激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察关节面及横截面。从图H可以看出，在表面和切片图像上都表现出相似的趋势，CAP-hyEXO组的绿色荧光信号最强，CAP-EXO组次之，EXO组最少。半定量分析如图I所示，CAP-hyEXO组和CAP-EXO组的荧光密度分别是EXO组的近5倍和2倍。综上所述，CAP赋予的软骨细胞特异性靶向性，明显增强了CAP-EXOs和CAP-hyEXOs的软骨细胞特异性靶向性，从而延长了它们在关节腔内的滞留时间。然而，由于OA治疗通常需要长期的治疗效果，单独提高CAP-hyEXOs的保留时间仍不容乐观。
上述采用微流控方法包裹了CAP-hyEXOs的透明质酸水凝胶微球(HMs)是为了提供一种微创的OA治疗，使用可注射HMs延长CAP-hyEXOs的释放，同时提供更好的润滑以缓解关节磨损。用甲基丙烯酸酐对透明质酸进行改性，使其具有光固化性能。质子核磁共振(1HNMR)波谱证实甲基丙烯酸酯基团成功接枝，HAMA的甲基化程度为34.6％，如图7所示。
通过使用微流控装置产生的不同的CAP-hyEXOs和HAMA预凝胶液滴进行光聚合，形成了三种包含HMs的CAP-hyEXOs(CAP/no FGF18-hyEXO@HMs，CAP/+FGF18-hyEXO@HMs和CAP/++FGF18-hyEXO@HMs)。为确定CAP-hyEXO的成功掺入，利用CLSM对含有DIO标记的CAP-hyEXO的HMs进行检测。图8为本发明实施例1得到的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微球的光学照片A和B，荧光图像C和SEM图D。
从图8中A和B可以看出，微流控CAP-hyEXO@HMs分散良好，形态特征完整。从图8C中可以看出荧光均匀分布在HMs内部，表明CAP-hyEXOs在HMs中成功封装。
图9为本发明实施例1中得到的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微球的粒径分布图A，B为负载不同基因含量的微球的粒径对比示意图。从图9A中可以看出，CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微球的粒径为(189.82±19.53)μm，粒径分布较窄。有利于HMs在关节腔内滚动，缓解膝关节负重和磨损。从图9B中可以看出，三个CAP-hyEXO@HMs(CAP/no FGF18-hyEXO@HMs,CAP/+FGF18-hyEXO@HMs和CAP/++FGF18-hyEXO@HMs)微球比HMs具有更高的稳定性，它们的大小保持不变至少21天，而HMs逐渐膨胀并变得更大。
图10为不同微球的降解曲线A和释放曲线B。HMs为改性透明质酸微球，hyEXO@HMs为本发明实施例1得到的不同负载率的微球。不同CAP-hyEXO@HMs中CAP-hyEXOs的释放行为是通过包封材料在体内的降解实现的，因此HMs缓慢而稳定的降解速度不仅对延长其在体内的滞留时间至关重要，而且对FGF18基因表达的持续调控也至关重要。从图10中可以看出，在透明质酸酶存在的情况下，HMs稳步降解，在第15天完全降解。相比之下，三种CAP-hyEXO(CAP/no FGF18-hyEXO@HMs,CAP/+FGF18-hyEXO@HMs和CAP/++FGF18-hyEXO@HMs)包裹的HMs降解率明显较低，在第25天达到完全降解。HMs与3种CAP-hyEXO@HMs的不同降解速率可能是由于降解过程中HMs外表面暴露了CAP-hyEXOs所致。并且在CAP-hyEXO@HMs形成的水化层可作为对抗透明质酸酶的物理屏障，从而延缓降解过程。在药物释放实验中，杂化CAP-EXO@HMs载蛋白药物的累积释放谱表现出相似的释放趋势，呈现出初始快速释放期(3d)，随后缓慢释放期。此外，EXO@HMs在第15天完全释放，而CAP/++FGF18-hyEXO@HMs在第15天释放约62％，药物释放速度较慢(图10B)，表明CAP-hyEXO@HMs可以作为一种高效的药物释放***进行控释。
为了说明CAP-hyEXO@HMs和HMs的润滑性能，在高频往复摩擦磨损试验机上进行了800s摩擦测试。结果如图11所示。图11可以看出HMs和CAP-hyEXO@HMs的初始COF值均略大于0.20。然而，随着试验的进行，HMs组的COF值逐渐增加到0.45，而CAP-hyEXO@HMs组仅略微增加于到0.25，这得益于脂质体润滑机制。与磨损的HMs无法保持润滑表面相比，磨损的CAP-EXO@HMs可以作为CAP-hyEXO储层，使外表面的CAP-hyEXO不断暴露，以形成自我再生的水合层，以响应摩擦磨损，在摩擦期间提供有效的润滑。因此，HMs的COF值显著高于CAP-EXO@HMs，在测试结束时几乎翻了一倍。
通过体外细胞实验测试实施例1得到的CAP-hyEXO@HMs水凝胶微球的生物活性。
CAP-hyEXO@HMs水凝胶微球浸没于transwell小室上部并整个放置于孔板内中，在孔板底部接种IL-1β刺激过的软骨细胞(OA软骨细胞)，将孔板置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养，培养期间每隔2天更换一次培养基。
所述培养基是在DMEM基础培养基的基础上加入质量浓度为1％青霉素和链霉素混合液、92μg/mL的抗坏血酸以及质量浓度为10％的胎牛血清得到，本实施例中青霉素和链霉素混合液由HyClone公司提供。
在培养1天、3天和7天后，使用CCK-8测试其中细胞的增殖情况，增殖情况如图12所示。
在培养1天、3天和7天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后用含有FDA和PI的PBS缓冲液中染色1min，通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察细胞的生长状态和分布情况，FDA/PI染色结果如图13所示。
在培养3天、7天和14天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后用含有鬼笔环肽溶液对细胞染色4h，再通过含有DAPI的染液染色30s，通过CLSM观察其中的细胞的生长状态和分布情况，鬼笔环肽/DAPI染色结果如图14所示。
在培养3天和7天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后用4％多聚甲醛固定细胞，用番红染液和TB染液对细胞染色，通过光学显微镜观察其中的细胞的软骨相关基质分泌的情况，染色结果如图15所示。
在培养7天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后用4％多聚甲醛固定细胞，用Col2和Sox9对细胞染色，再通过含有DAPI的染液染色30s，通过CLSM观察其中的细胞的软骨相关基质分泌的情况，染色结果如图16所示。
在培养3天和7天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取细胞中的总RNA，使用iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)进行逆转录。采用CFX96RT-PCR检测***(Bio-Rad CFX Manager Real-Time PCR system)检测其中的细胞的软骨相关基因的表达情况，结果如图17所示。
从图12～17可以看出，随着培养时间的增加，经CAP/++FGF18-hyEXO@HMs干预后的OA软骨细胞的增殖情况明显，并且OA软骨细胞保持良好的软骨细胞的圆形形态。CAP/++FGF18-hyEXO@HMs激活FGF18基因表达，恢复软骨细胞活力、形态和迁移，促进软骨ECM的合成和质量，上调软骨特异性和抗炎基因，减少促炎基因。PI3K/AKT信号通路的激活被确定为这些治疗效果的主要机制。PI3K是FGF18在PI3K/AKT信号通路中的关键下游成分，PI3K基因的表达受到抑制后，与ECM调控、炎症和基质降解相关的特定基因发生了显著改变。这些发现证实了本发明的CAP-hyEXO@HMs对OA软骨细胞的治疗益处。
对大鼠进行ACLT术势构建OA关节模型，并在特定时间点进行关节腔内注射不同的材料，进行OA治疗实验。
选取雄性SD大鼠进行膝关节前交叉韧带的横断手术，并在不限制大鼠活动4周之后，即成功构建了大鼠OA模型。设置实验组、对照组、空白组和天然组。实验组在大鼠关节腔内注射实施例1制备的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs，对照组在大鼠关节腔内注射制备的HMs和支架CAP/no FGF18-hyEXO@HMs，空白组在关节腔内注射PBS，天然组为正常关节组(Sham组)，不进行任何手术操作。在8周和12周后取材进行Micro-CT扫描，结果如图18所示。骨赘被认为是OA的另一种特征性表现，是对关节损伤的一种补偿。如图18A所示，三维Micro-CT图像显示PBS组、HMs组、CAP/no FGF18-hyEXO@HMs组和CAP/++FGF18-hyEXO@HMs组有骨赘形成，而sham组无骨赘形成。然而，PBS组骨赘体积明显大于其他组，而CAP/++FGF18-hyEXO@HMs在四组中最小，提示CAP/++FGF18-hyEXO@HMs可以减少骨赘形成，缓解OA进展。
对实验组、对照组和空白组的大鼠膝关节组织进行取样，依次进行脱钙、石蜡包埋和切片，随后进行H&E、TB和天狼猩红组织化学染色分别观察关节软骨的结构、蛋白多糖和胶原沉积，结果如图18所示。由图18B-C可知，PBS组的表面侵蚀、结构紊乱和蛋白聚糖丢失最严重。12周时sham组和CAP/++FGF18-hyEXO@HMs组关节软骨表面光滑，细胞排列整齐，结构正常。甲苯胺蓝染色深度呈sham组趋势；CAP/++FGF18-hyEXO@HMs group＞CAP/noFGF18-hyEXO@HMs组＞HMs组，表明CAP/++FGF18-hyEXO@HMs组在改善OA软骨基质降解方面效果最好。天狼星红染色比较胶原沉积和组织结构。如图18D所示，12周时CAP/++FGF18-hyEXO@HMs组的胶原纤维组织结构和ⅱ型胶原含量与Sham组最接近。PBS组、HMs组和CAP/noFGF18-hyEXO@HMs组以ⅰ型胶原为主，胶原组织形态不规则。综上所述，随着OA的进展，本发明的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs可以有效地减轻OA的结构和成分损伤。
采用转录组学分析揭示++FGF18-hyEXO@HMs影响8周时ECM合成和软骨再生的潜在机制(图19～22)。证实了CAP/++FGF18-hyEXO@HMs在促进细胞黏附、ECM合成、炎症调节和软骨蛋白多糖分泌方面发挥积极作用，CAP/no FGF18-hyEXO@HMs在加速细胞信号传导、细胞黏附和炎症调节方面发挥重要作用。我们推测CAP/no FGF18-hyEXO@HMs的润滑特性有助于缓解关节磨损，从而促进和调节细胞信号传导、细胞黏附和炎症。此外，我们推测CAP/++FGF18-hyEXO@HMs促进和调节软骨细胞黏附，增殖和基质分泌的潜在机制。其机制是细胞因子-细胞因子受体相互作用，CAP/++FGF18-hyEXO@HMs首先可以促进细胞黏附分子。接下来，在良好的微环境中，蛋白质分子和细胞因子可以促进ECM相互作用和软骨蛋白多糖的分泌。
使用RT-qPCR分析了与软骨ECM蛋白、炎症、基质降解和PI3K信号通路相关的特定基因的表达。如图25所示，与软骨ECM蛋白相关的3个基因Sox9,Col2a1和ACAN在HMs,CAP/noFGF18-hyEXO@HMs和CAP/++FGF18-hyEXO@HMs处理下表达上调，其中后者的表达水平显著高于其他组。相反，两个基因，Col1a和Col10，分别表示不需要的纤维软骨和肥大标记，显著降低到与假样本相似的水平。此外，CAP/no FGF18-hyEXO@HMs组和CAP/++FGF18-hyEXO@HMs组基质降解基因(ADAMTS5和MMP13)和促炎基因(TNF-α和IL-1β)均显著下调，且后者的下调效果更显著。此外，抗炎基因IL-10表现出与促炎基因相反的趋势，进一步证明CAP/++FGF18-hyEXO@HMs在所有治疗组中具有最佳的抗炎效果。进一步检测PI3K/AKT信号通路中关键基因PI3K、mTOR和AKT的表达水平。结果表明，cas9-sgfgf18诱导的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs中FGF18的激活显著上调了FGF18及其下游基因PI3K，mTOR和AKT，进一步证实了其治疗作用可能是通过PI3K/AKT信号通路实现的。
现有研究中通过递送CRISPR/Cas9***来调节与软骨细胞稳态维持相关的FGF18基因，以延缓OA进展。然而，核酸物质在体内外的不稳定性、非特异性分布以及脱靶效应限制了治疗性基因治疗的临床应用。为了提高基因治疗的效率，各种载体如病毒、脂质体、阳离子聚合物和工程外泌体被开发用于基因递送。传统的慢病毒或腺相关病毒载体用于CRISPR/Cas9***治疗存在一定风险，通过外泌体与脂质体膜融合制备的稳定杂交外泌体可能是一种更安全的替代方案。杂合型外泌体因其合成容易、免疫应答低、在血液中的半衰期较外泌体长而受到关注。
与外泌体相比，杂交外泌体通过与脂质体融合的方式，不仅弥补了脂质内源性功能的不足，而且具有良好的生物相容性和更高的安全性，加速了药物递送的发展。值得注意的是，杂交外泌体的靶向性将有助于CRISPR/Cas9***选择性递送到软骨细胞或关节软骨。一方面，本发明通过在HEK293细胞中对外泌体膜蛋白溶酶体相关膜蛋白2b(Lamp2b)进行基因工程改造，开发了含有表面展示的软骨细胞亲和力肽(CAP)的软骨细胞靶向杂交外泌体。由于Lamp-2b的n端延伸出外泌体膜，在这一端融合靶向肽不会影响外泌体的表达和功能。另一方面，混合外泌体具有轻微的正电荷，有利于负载和传递带负电荷的核酸，靶向软骨内带负电荷的糖胺聚糖链，并与带负电荷的细胞和关节软骨表面相互作用。对于改善进展性OA，除了维持细胞活力和促进ECM合成以维持软骨稳态外，提供良好的润滑关节腔微环境以减少软骨表面的磨损，对于抵抗OA进展性软骨损伤同样重要。液体注射疗法不能改善关节腔的润滑性能。可注射水凝胶具有良好的润滑性能，在修复关节软骨缺损的同时，能更好地保护关节免受磨损、缓解疼痛，因此备受关注。可注射生物材料中,透明质酸,ECM的主要组件之一，显示潜在的OA治疗，润滑的特点和软骨细胞的亲和力。因此，通过微流控技术制备的含有上调FGF18基因功能性CRISPR/Cas9质粒的亲和软骨细胞杂交外泌体包裹在透明质酸水凝胶微球(hyaluronic acid hydrogels microspheres，HMs)中，通过在HMs周围包裹杂交外泌体形成水合层，从而具有润滑作用，缓解关节磨损。通过使用软骨细胞靶向的杂交外泌体(CAP/FGF18-hyEXO)传递与发育和稳态相关的FGF18基因，从而抑制软骨基质的异常代谢，促进软骨缺损的修复，恢复软骨细胞活力和促进ECM合成。此外，将CAP/FGF18-hyEXO整合到可注射生物活性透明质酸水凝胶微球(CAP/FGF18-hyEXO@HMs)中，具有减轻关节磨损的润滑性能。
本发明中具有CRISPR/Cas9基因编辑***的靶向性杂交外泌体的透明质酸微球，具有优异的修复效果，阻止了骨关节炎的进一步发展。分子水平上探索CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的治疗效果，发现与软骨ECM蛋白相关的3个基因Sox9,Col2a1和ACAN的表达显著上调，炎症、基质降解相关的特定基因的表达显著抑制。通过探究PI3K信号通路相关的基因的表达，发现FGF18的激活显著上调了FGF18及其下游基因PI3K,mTOR和AKT，进一步证实了其治疗作用可能是通过PI3K/AKT信号通路实现的。通过转录组分析进一步发现许多DEGs与细胞黏附、迁移和分化以及ECM合成、炎症调节微环境稳态相关。进一步分析推测相关作用机制发现，CAP/++FGF18-hyEXO@HMs在促进细胞黏附、ECM合成、炎症调节和软骨蛋白多糖分泌方面发挥积极作用，而CAP/no FGF18-hyEXO@HMs在加速细胞信号传导、细胞黏附和炎症调节方面发挥重要作用。说明该CRISPR/Cas9基因编辑***的杂交外泌体为骨关节炎的治疗提供一种良好的策略，可用在骨关节炎修复领域。
本发明提供的具有CRISPR/Cas9基因编辑***的靶向性杂交外泌体的透明质酸微球，由具有靶向软骨细胞的杂交外泌体、以及负载于杂交外泌体里的CRISPR/Cas9基因编辑***，和透明质酸微球作为杂交外泌体的递送载体组成；杂交外泌体由HEK293细胞的外泌体和阳离子脂质体融合组成；CRISPR/Cas9基因编辑***是针对于骨关节炎的特异性基因FGF18而设计，旨在通过调控FGF18基因的上调表达，从而逆转骨关节炎的发展。通过基因工程和杂化膜融合的方式构建的杂化外泌体(CAP-FGF18-hyEXOs)，其尺寸大小与外泌体相似，约为150-220nm，这与文献报道的利于细胞包吞内化的尺寸相一致，另一方面，膜融合杂交的CAP-FGF18-hyEXOs，仍然保留了EXOs的特异性膜蛋白，保留了外泌体的优异的内源性功能，有利于功能性的核酸类成分进入细胞，发挥作用。与此同时，CAP-FGF18-hyEXOs相比于EXOs，具有更高的生物稳定性，具有很好的尺寸稳定性，这有利于内容物的稳定保留，体现了该种纳米类载体的优越性，并解决了核酸类药物稳定性低而需要反复重复给药的问题。CAP-FGF18-hyEXOs中递送的特异性基因编辑工具Cas9-SgFGF18，能够显著上调软骨细胞内的FGF18基因的表达，该基因编辑工具具有优异的基因调控效率，显示出对OA治疗的巨大潜力。此外，CAP-FGF18-hyEXOs带有一定的正电荷性，有助于其与带负电荷的软骨细胞表面和软骨组织内的糖胺聚糖链的结合，体现出OA治疗的优势。与此同时，通过基因工程的方式将软骨细胞亲和肽(CAP)修饰至杂交外泌体膜蛋白溶酶体相关膜蛋白2b上，使其具备优异的软骨靶向能力，更多会被软骨细胞内化富集，能避免如不良的脱靶细胞毒性和蓄积等问题。相对于不具备靶向能力的EXOs，CAP-FGF18-hyEXOs能实现Cas9-SgFGF18的有效高效递送，在注射至关节腔后7天，仍然具有很强的荧光信号，有效延长其在关节腔内的作用时间，减少在其他组织中的脱靶堆积，这为OA的基因治疗的提供了强力的生物安全性保障。
通过微流控技术和光聚合工艺，制备的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs水凝胶微球中，CAP-FGF18-hyEXOs有效均匀分布，并且负电荷的缠结透明质酸分子链与阳离子的CAP-FGF18-hyEXOs的非共价静电结合，能够有效延长CAP-FGF18-hyEXOs的长期生物活性和缓释时间，释放时间长，这有助于杂交外泌体在关节腔内的滞留，从而有效治疗OA等慢性疾病。通过关节腔内注射透明质酸微球，随着体内的降解和关节腔内的磨损，杂交外泌体不断进行释放，通过其靶向软骨细胞的多肽，靶向识别软骨细胞，进一步被软骨细胞内吞，可以克服现有靶向修饰的工程化外泌体的低效繁琐以及靶向性能欠佳的问题。其中的CRISPR/Cas9基因编辑***，对软骨细胞的基因进行调控，逆转软骨细胞的OA化，实现骨关节炎的治疗。另一方面，本发明通过在杂交外泌体中装载CRISPR/Cas9基因编辑***，形成了一个有效安全的基因编辑工具的递送***，可提高注射材料的生物活性和生物安全性。
具有CRISPR/Cas9基因编辑***的靶向性杂交外泌体的透明质酸微球，具有润滑的作用，并且可注射，减少了关节的摩擦，同时在应用过程中使用简单便捷、多样化，在骨关节炎领域有着广阔的应用前景。在摩擦学测试中发现，相比于HMs，制备的CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微球的COF显著地降低，并且能够稳定维持较低的COF，从而达到减轻关节磨损的效果。这一潜在的作用机制，可能由于CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的最外层表面因为摩擦而不断磨损，更多的杂交外泌体暴露出来，并通过高度水合的磷酸胆碱基团在CAP/++FGF18-hyEXO@HMs表面形成水合层，水合层通过不断地摩擦以及杂交外泌体不断地释放而稳定存在，从而达到润滑的效果。通过体外细胞实验评估了CAP-FGF18-hyEXO在体外对OA软骨细胞自我更新和ECM重塑能力的治疗效果。发现没有明显的细胞毒性并能促进细胞增殖，具有良好的生物相容性，能显著促进FGF18基因的上调表达，对于OA软骨细胞的活力恢复和稳态维持具有积极作用，逆转软骨细胞的OA化。同时，实验发现FGF18基因激活的治疗作用的一个可能机制涉及PI3K/AKT通路的激活，响应细胞外信号，促进代谢、增殖、软骨细胞细胞存活、生长来保护软骨。同时有效软骨基质降解相关基因(ADAMTS5和MMP13)的表达。因此，FGF18基因治疗是一种有效的OA干预措施，通过调控细胞增殖和代谢活性以及随之发生的基因转录变化。通过大鼠骨关节炎模型实验证实，使用CAP-FGF18-hyEXO@HM治疗后，OA膝关节恢复到与正常关节相当的水平，缺损和炎症减少，软骨完整性保持，软骨退变很少。分子水平上探索CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的治疗效果，发现与软骨ECM蛋白相关的3个基因Sox9,Col2a1和ACAN的表达显著上调，炎症、基质降解相关的特定基因的表达显著抑制。通过探究PI3K信号通路相关的基因的表达，发现FGF18的激活显著上调了FGF18及其下游基因PI3K,mTOR和AKT，进一步证实了其治疗作用可能是通过PI3K/AKT信号通路实现的。通过转录组分析进一步发现许多DEGs与细胞黏附、迁移和分化以及ECM合成、炎症调节微环境稳态相关。进一步分析推测相关作用机制发现，CAP/++FGF18-hyEXO@HMs在促进细胞黏附、ECM合成、炎症调节和软骨蛋白多糖分泌方面发挥积极作用，而CAP/no FGF18-hyEXO@HMs在加速细胞信号传导、细胞黏附和炎症调节方面发挥重要作用。说明本发明提供的具有CRISPR/Cas9基因编辑***的靶向性杂交外泌体的透明质酸微球(CAP/++FGF18-hyEXO@HMs)，在骨关节炎治疗领域应用时可产生良好的修复效果。
本发明通过对外泌体表面膜蛋白lamp2b进行改造，与CAP肽融合，使外泌体能靶向软骨细胞；该种靶向软骨细胞的杂交外泌体，用于基于FGF18基因的CRISPR/Cas9的递送(CAP-hyEXO)，通过递送FGF18基因至软骨细胞，上调软骨细胞FGF18基因表达，来恢复受损的软骨细胞的自我更新和ECM重塑能力，重塑再生微环境。由于CAP-hyEXO带有弱正电性，能与负电荷的透明质酸分子链通过非共价静电相互作用结合，利用微流控技术和光聚合工艺制备了具有生物活性的透明质酸水凝胶微球(HMs)来递送CAP-hyEXO(CAP-FGF18-hyEXO@HMs)，实现CAP-hyEXO在体内长效控释和维持良好生物稳定性。与此同时，CAP-FGF18-hyEXO@HMs在关节腔内注射之后，通过不断摩擦和降解并不断暴露CAP-hyEXO，暴露的杂交外泌体的高度水合的磷酸胆碱基团，在水凝胶微球表面形成水合层，使其具有润滑性能，减轻关节磨损。此外，带正电荷的CAP-hyEXO可以通过静电相互作用靶向带负电荷的软骨，并通过递送FGF18基因的CRISPR/Cas9来恢复软骨细胞的自我更新和重塑ECM能力来维持细胞稳态。

Claims (10)

1.一种靶向软骨细胞的杂交外泌体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将基因编辑器对应质粒转染HEK293细胞，加入对应抗生素筛选稳定表达质粒的细胞；培养质粒-HEK293细胞，在不含外泌体的培养基中培养，并收集培养培养后的上清液提取该HEK293细胞产生的外泌体；
步骤2：将基因编辑器相对应质粒电穿孔进入脂质体载体，得到具有基因的脂质体载体；将步骤1得到的外泌体与具有基因的脂质体载体混合孵育，加入软骨细胞培养基中，即可得到靶向软骨细胞且含有基因编辑工具的杂交外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种靶向软骨细胞的杂交外泌体制备方法，其特征在于，所述基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种；
若基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器，则步骤1中将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器和具有特定基因激活功能的部分基因编辑器Cas9的两种质粒分别转染HEK293细胞；步骤2中，将具有特定基因激活功能的部分Cas9基因编辑器相对应另一部分的基因编辑器sgRNA电穿孔进入脂质体载体；
若基因编辑器为CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种，则步骤1中将具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒转染HEK293细胞；步骤2中将具有特定基因激活功能的部分Cas9基因编辑器相对应另一部分的基因编辑器sgRNA电穿孔进入脂质体载体。
3.一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
靶向性杂交外泌体包裹于透明质酸水凝胶微球中，即可得到所需润滑凝胶微球。
4.根据权利要求3所述的一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，其特征在于，具体过程如下：
S11：将透明质酸溶于缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐，调整pH值为8～9，在设定温度条件下充分反应；
S12：反应结束后透析，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酐改性的透明质酸HA-MA；
S13：将HA-MA与靶向性杂交外泌体混合得到混合溶液，通过微流控法即可得到所需润滑凝胶微球；其中，HA-MA的干重与靶向性杂交外泌体中蛋白的质量比为400:1～100:1。
5.根据权利要求4所述的一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中反应温度为4℃，反应时间为4～72小时。
6.根据权利要求4所述的一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述微流控法制备润滑凝胶微球过程如下：
将混合溶液作为水相，与油相和乳化剂充分混合，通过微流控装置的流聚交界处形成预凝胶液滴；然后进行交联形成微球，进行水洗即可得到所需润滑凝胶微球。
7.如权利要求1～2任一所述制备方法得到的靶向软骨细胞的杂交外泌体。
8.如权利要求3～6任一所述制备方法得到的用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球，其特征在于，所述润滑凝胶微球透明质酸与靶向性杂交外泌体通过静电作用结合，由缠结的高分子链形成交联的网络结构，其直径为25～250μm。
9.如权利要求7所述的一种靶向软骨细胞的杂交外泌体的应用，其特征在于，所述靶向软骨细胞的杂交外泌体在药物载体中的应用。
10.如权利要求8所述一种用于递送基因编辑***的润滑凝胶微球，其特征在于，所述润滑凝胶微球在治疗软骨缺损和骨关节药物制备中的应用。
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