CN117431258B - 使用含有Tet1基因的重编程因子诱导人体细胞重编程的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种使用含有Tet1基因的重编程因子诱导人体细胞重编程的方法，制备含有Tet1基因重编程因子的环状RNA，使用电转染的方法将环状RNA导入人体细胞。本发明提供的含有Tet1基因的重编程因子方法，通过利用环状RNA作为重编程因子的递送载体，成功实现了在人外周血单个核细胞中重编程iPSC的突破，有效降低了基因转染载体的质量和大小，再通过优化电转参数及因子组合，成功实现了Tet1用于人外周血单个核细胞的重编程，可以高效地制备人诱导多能干细胞；使用环状RNA而不是质粒或者mRNA来重编程，避免了基因组整合和细胞毒性的缺陷，因此，本发明可以更加高效、安全地制备人诱导多能干细胞。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与细胞技术领域，主要涉及一种使用含有Tet1基因的重编程因子诱导人体细胞重编程的方法。
背景技术
诱导多能干细胞（iPSC）最初是日本京都大学山中伸弥团队通过将外源的4个基因（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）导入到小鼠的成纤维细胞中，成功得到的一种性质与胚胎干细胞类似的多能性干细胞，最经典的重编程因子就是上述的4个基因，也被称为OSKM因子。在那之后，大量生物学家开始对重编程因子进行研究和改进，以提高重编程的诱导效率，在一项关于表观遗传对重编程效率影响的研究中，实验人员发现，在小鼠胚胎成纤维细胞中表达DNA羟甲基化酶1（Tet1）蛋白可以提高重编程效率，并且可以取代部分OSKM因子从而建立小鼠iPSC细胞系。
传统的iPSC诱导方法是采用病毒介导的重编程，造成了人类基因组中外源基因的***，容易诱发癌症，不利于iPSC的应用。目前，人iPSC的诱导方式已从最初的逆转录病毒或慢病毒诱导法，逐步转向了非病毒介导的、无外源基因***的非整合型诱导方式，然而，其中大部分诱导方法存在着种种缺陷,例如，游离型载体存在着转导困难、重编程诱导效率低、基因组整合等问题，基于mRNA的重编程也存在着易降解和细胞毒性问题。
DNA的甲基化与去甲基化在胚胎干细胞的全能性中发挥非常重要的作用，本发明利用DNA羟甲基化酶Tet1对DNA的活性作用，加速多能基因调控区域的去甲基化进程，激活多能性基因的表达，从而促进细胞多能性的建立，提高了诱导型重编程的速率和效率。已有通过慢病毒的方式利用Tet1基因取代了Oct4并与Sox2、Klf4和c-Myc在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中成功建立了重编程***的报道，相比较于传统的四因子，重编程效率有了很大的提高，MEF细胞基因组整体甲基化水平较低，也是行业内公认的容易进行重编程的细胞系。但是，想要将相同的实验结果在人类体细胞中重现，还需解决很多问题。
发明内容
为了找到一种可以替代OSKM因子后具有相同或者更好诱导效率的重编程方法，以及克服传统诱导方法的缺陷，本发明提供了如下技术方案：
一种使用含有Tet1基因的重编程因子诱导人体细胞重编程的方法，其特征在于，制备含有Tet1基因重编程因子的环状RNA，使用电转染的方法将环状RNA导入人体细胞。
如上所述的一种使用含有Tet1基因的重编程因子诱导人体细胞重编程的方法，其中，所述重编程因子包含Tet1基因及其他基因，其他基因选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的一种或几种的组合。
如上所述的一种使用含有Tet1基因的重编程因子诱导人体细胞重编程的方法，其中，所述环状RNA包含如SEQ ID NO：7所示的核酸序列以及如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15所示的核酸序列，或与以上序列至少90%或至少95%相同的序列。
如上所述的一种使用含有Tet1基因的重编程因子诱导人体细胞重编程的方法，其特征在于，用于制备所述环状RNA的前体RNA序列，包含如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16所示的核酸序列，或与以上序列至少90%或至少95%相同的序列。
本发明的有益效果：本发明通过利用环状RNA作为重编程因子的递送载体，成功实现了在人外周血单个核细胞中重编程iPSC的突破，有效降低了基因转染载体的质量和大小，再通过优化电转参数及因子组合，成功实现了Tet1用于人外周血单个核细胞的重编程。本发明的使用含有Tet1基因的重编程因子的诱导方法可以更高效率地重编程iPSC。
附图说明
图1为Tet1基因不同转染方式的蛋白表达量对比图；
图2为 环状RNA得率图；
图3为 由OSKM因子与OT、TSKM因子诱导人体细胞重编程至iPSC，得到的细胞克隆照片；
图4为由OSKM和OT因子诱导得到的iPSC中内源性细胞多能性标志物的表达水平对比图；
图5为由OSKM和TSKM因子诱导得到的iPSC多能性标志物的流式分析图；
图6为OSKM因子与OT、TSKM因子诱导人体细胞重编程效率对比图。
具体实施方式
本发明使用的人体细胞基因组的甲基化程度较高，相较于MEF细胞，重编程难度大，效率低。Tet1要在人体细胞的重编程过程中起到提高效率的作用，需要Tet1可以在人体细胞中稳定高表达，该表达水平的要求要高于在MEF中的表达水平。
本发明在如何提高人体细胞中Tet1的表达进行了大量尝试。
首先，本发明使用慢病毒进行转染，虽然获得了稳定表达Tet1蛋白的细胞株，但是稳转效率较低，表达的Tet1不足以实现人体细胞重编程。
其次，由于人类Tet1蛋白共有2136个氨基酸残基，无法通过腺相关病毒或仙台病毒进行转染。
再次，利用常用的质粒转染方式，同样由于Tet1本身序列较长，构建的质粒较大。虽然经过质粒结构优化设计，减少不必要的序列，但是转染后的表达水平还是不能够有效提高重编程的成功率。
第四，利用信使RNA（mRNA）技术转染，虽然可以提高Tet1的表达量，但是由于mRNA降解较快，不能够稳定持续维持高水平表达，也不能达到提高重编程效率的目的。
最后，本发明利用合成或者体外转录的环状RNA。环状RNA由于其特殊的封闭结构，不受RNA外切酶影响，在生物体细胞内极其稳定，因此，非常适合作为将重编程因子导入体细胞的载体。由于环状RNA的无整合性、可降解性及低免疫原性，因此可以获得比使用整合病毒载体更加安全的“无足迹”iPSC，克服了现有技术人类基因组中外源基因***，诱发癌症等重大缺陷。但同样由于Tet1基因序列较长，其成环效率低，因此本发明使用SIRI2算法对Tet1序列的成环效率进行预测，对预测得到的序列进行试验后，优化出可以使用的环状RNA序列。
实施例1：Tet1基因不同转染方式的蛋白表达量对比
分别设计Tet1基因的慢病毒、游离型质粒、信使RNA、环状RNA实验方案。慢病毒载体骨架选择获取自Addgene的pLVX质粒，通过分子克隆方法将Tet1基因CDS区序列***pLVX质粒表达盒内，相应载体序列信息如SEQ ID NO：1所示，然后与包装质粒、包膜质粒共转染HEK293T细胞，培养两天后收集病毒并测定滴度；真核表达载体骨架选择获取自Addgene的pCDNA质粒，通过分子克隆方法将Tet1基因CDS区序列***pCDNA质粒表达盒内，相应载体序列信息如SEQ ID NO：2所示；信使RNA使用真核表达载体上的T7启动子，利用体外转录试剂盒转录后纯化获得；环状RNA需制备前体载体，先在上述真核表达载体CDS区两侧添加置换核酶序列，相应前体载体序列信息如SEQ ID NO：3所示，然后经体外转录、RNA环化、RNA纯化后获得。
按照常规实验操作，分别将上述慢病毒、游离型质粒、信使RNA及环状RNA转染至相同细胞量的HEK293T细胞中，持续培养，分别在第4天、8天、12天、16天、20天收集部分细胞，通过WB方法检测各组细胞内Tet1蛋白表达量，如图1所示，转染环状RNA组可以在较长时间内维持稳定且高水平的蛋白表达量。
实施例2：环状RNA序列的优化
在实施例1中的Tet1基因不同转染方式的蛋白表达量对比中，利用信使RNA进行转染，虽然可以长期维持较稳定的高水平表达，但环状RNA成环效率较低，需进行大量反应才能获得满足实验所需的环状RNA，因此，需对环状RNA结构进行优化。
在简并密码子原理的基础上，使用SIRI2算法对环状RNA二级结构进行预测，筛选利于环化反应的环状RNA序列，重新设计了三组环状RNA前体载体，相应前体载体序列信息如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示，然后使用相同质粒量的上述载体作为起始模板，经体外制备前体RNA，体外环化及纯化后得到环状RNA，测量环状RNA浓度，比较各组环化成功率，结果如图2所示，SEQ ID NO：4组环状RNA序列环化得率较高，因此，后续重编程实验采用SEQ ID NO：4序列。
实施例3：人外周血单个核细胞的分离与扩增
使用密度梯度介质从血样中分离外周血单个核细胞，然后按照5 × 106cell/well的密度接种于六孔板中，在37℃培养箱中静置培养7天，每两天换一次培养基，其中，培养基成分为基础培养基添加了20%的KSR、50 ug/mL Ascorbic Acid、100 ng/mL SCF、10ng/mL IL-3、2 U/mL EPO、40 ng/mL IGF、1 uM Dexamethasone、100 nM Hydrocortisone。
实施例4：重编程因子环状RNA的制备
合成用于转录环状RNA的载体，其主要元件包括T7启动子、3’置换核酶序列（由3’内含子、3’外显子片段和侧接序列组成）、目标因子CDS区序列、5’置换核酶序列（由5’内含子、5’外显子片段和侧接序列组成）。将上述载体，按照体外转录试剂盒中步骤制备前体RNA或直接合成前体RNA，前体RNA序列信息如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16（分别包含Tet1、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的CDS区序列）的核酸序列所示，在37℃下孵育2至3小时，然后将DNA酶添加到反应中（以每μg模板DNA，4单位的DNA酶的比例添加DNA酶），混合，并在37℃下再孵育30分钟得到前体RNA，最后经体外环化及纯化后得到环状RNA，即可用于人体细胞重编程，环状RNA序列信息如序列表中SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15（分别包含Tet1、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的CDS区序列）的核酸序列所示。
实施例5：电转染环状RNA进行人体细胞重编程
进行实验，以比较使用传统重编程因子与OT、TSKM重编程因子的效率。第一组，携带传统重编程因子的环状RNA；第二组，携带OT重编程因子的环状RNA；第三组，携带TSKM重编程因子的环状RNA。
电转当天向12孔板中加入500 μL稀释过的基底膜基质（Matrigrl），放置于二氧化碳培养箱中进行包被。取出实施例3中扩增后的细胞，洗涤和计数后，将计数的外周血单个核细胞按1 × 106cell/well的密度进行离心，去除上清后按照电转仪器操作步骤加入缓冲液，与相应环状RNA混合后进行电转，随后立即加入外周血扩增培养基，重悬接种于包被过的六孔板中，放置在37℃二氧化碳培养箱中静置培养48小时，然后观察细胞贴壁情况，并更换人多能干细胞诱导培养基，培养10 - 14天，两天换一次液，观察克隆生长情况，持续至诱导性多能干细胞完全成熟，大约为电转后第14天或第15天，随后挑取克隆进行扩增。
实施例6：iPSC集落的表征
在培养的第十五天观察到大量类似于人胚胎干细胞的细胞样克隆，在显微镜下对克隆团进行拍照和计数。图3是由OSKM因子与OT、TSKM因子诱导人体细胞重编程至iPSC，得到的细胞克隆照片，如图3所示，在培养的第十五天观察到较亮且形态较好的类似于人胚胎干细胞样的细胞克隆。
通过qPCR检测由OSKM和OT因子诱导得到的iPSC中内源性细胞多能性标志物的mRNA表达水平，结果如图4所示，OT-iPSC中内源性细胞多能性标志物mRNA水平与OSKM因子诱导得到的iPSC中接近。
通过对细胞内多能性标志物OCT4、SOX2进行免疫荧光染色以及流式细胞术分析，结果如图5所示，证明了获得的细胞具有多能干细胞的特征。
对比由不同因子诱导人体细胞重编程的效率，结果如图6所示，含有Tet1基因的OT与TSKM组诱导人体细胞重编程效率显著高于传统的OSKM组。本发明利用环状RNA作为重编程因子的递送体系，成功实现了在人外周血单个核细胞中重编程iPSC的突破，为含有Tet1基因的诱导重编程体系用于产业转化奠定了基础。首先，由于小鼠胚胎成纤维细胞易于重编程，通常做为行业内基础研究最常用的模式细胞，而在干细胞治疗药物研发领域，最常用的重编程起始细胞为外周血单个核细胞，但是该类细胞重编程效率及成功率相较于成纤维细胞较低，能否实现对于外周血单个核细胞的高效重编程是该技术用于产业化的关键。本发明通过利用环状RNA作为重编程因子的递送载体，有效降低了基因转染载体的质量和大小，再通过优化电转参数及因子组合，成功实现了Tet1用于人外周血单个核细胞的重编程。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (3)
1.一种使用含有Tet1基因的重编程因子组合诱导人体细胞重编程的方法，其特征在于，制备含有Tet1基因重编程因子组合的环状RNA，使用电转染的方法将环状RNA导入人体细胞；
其中含有Tet1基因重编程因子的环状RNA序列如SEQ ID NO：7所示；
所述重编程因子组合为Tet1基因和Oct4基因的组合，或者Tet1基因和Sox2、Klf4、c-Myc基因的组合。
2. 根据权利要求1所述的一种使用含有Tet1基因的重编程因子组合诱导人体细胞重编程的方法，其特征在于，所述Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的环状RNA的核苷酸序列分别如SEQID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15所示。
3. 根据权利要求1所述的一种使用含有Tet1基因的重编程因子组合诱导人体细胞重编程的方法，其特征在于，用于制备所述环状RNA的前体RNA序列，包含如SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16所示的核酸序列。
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