CN117431234A - 用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明的发明名称为用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒。本发明涉及可用于稳定化和/或递送一种或多种基因组编辑***分子(如蛋白质和/或核酸，例如CRISPR蛋白和/或核酸)的含肽复合物/纳米颗粒。
Description
本申请是分案申请，原申请的申请日是2017年05月26日，申请号为2017800458543(PCT/US2017/034862)，发明名称为“用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒”。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月27日提交的美国临时申请号62/342,823、2016年9月13日提交的美国临时申请号62/394,140、和2017年3月27日提交的美国临时申请号62/477,357的优先权，其整体全部特此通过引用被并入。
发明领域
本发明涉及可用于稳定化和/或向细胞内递送一种或多种基因组编辑***分子如CRISPR相关蛋白质和核酸的含肽复合物/纳米颗粒。
以ASCII文本文件提交序列表
下列以ASCII文本文件提交的内容其整体通过引用被并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：737372000840SeqList.txt，记录日期：2017年5月26日，大小：48KB)。
背景技术
CRISPR介入技术具有巨大的潜在用途，包括改变人类、动物和其它生物体的种系，和修饰食品作物的基因。通过向细胞内递送CRISPR相关核酸酶如Cas9或Cpf1和适当的指导RNA，生物体的基因组可在几乎任何期望的位置处被切割(Ledford,H.(2015).Nature.522(7554)；Zetsche et al.,(2015).Cell.163(3):759–771)。CRISPR已与特定核酸内切酶结合被用于多个不同物种的基因组编辑和基因调节(Mali et al.,(2013).NatureMethods.10(10):957–63)。CRISPR工具已被用于各种基因组修饰，包括双链断裂形成——非同源末端接合(NHEJ)介导的诱变(Wang et al.,(2013).Cell.153:910–918)、切口形成——NHEJ介导的诱变(Cheng et al.(2014).FEBS Lett.588:3954–3958)、敲入——同源依赖性修复(HDR)(Inui et al.(2014).Sci.Rep.4:5396)、和基因组-重排(Maddalo etal.(2014)Nature.516:423–427)，并且适用于抑制或激活基因表达的方法。核酸酶缺陷型Cas核酸酶可被用于阻断转录激活因子的结合——为阻断特定基因的表达，递送转录激活因子从而刺激特定基因的表达，或递送外遗传修饰剂至靶序列以改变组蛋白甲基化或乙酰化(Ledford,H.(2016).Nature.531:156-159)。
本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开专利申请的公开内容其整体特此通过引用被并入本文。
发明内容
本申请提供复合物和纳米颗粒，其包括可用于稳定化和/或向细胞内递送一种或多种基因组编辑***分子如CRISPR相关蛋白质和核酸的细胞穿透肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括与RGEN/gRNA复合物缔合(associated)的细胞穿透肽，该RGEN/gRNA复合物包括RNA指导的核酸内切酶(RGEN)和指导RNA(gRNA)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽和靶向靶多核苷酸的一种或多种基因组编辑***分子，其中细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子选自：a)RNA指导的核酸内切酶(RGEN)和指导RNA(gRNA)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列；b)DNA指导的核酸内切酶(DGEN)和指导DNA(gDNA)，其中gDNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列；c)锌指蛋白(ZFP)，其中ZFP识别靶多核苷酸中的靶序列；d)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，其中TALEN识别靶多核苷酸中的靶序列；e)归巢核酸内切酶，其中归巢核酸内切酶识别靶多核苷酸中的靶序列；和f)整合酶，其中整合酶识别靶多核苷酸中的重组位点。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，细胞穿透肽是VEPEP-3肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：1-14的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NO：75或76的氨基酸序列。
在一些实施方式中，细胞穿透肽是VEPEP-6肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：15-40的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NO：77的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，细胞穿透肽是VEPEP-9肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：41-52的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NO：78的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，细胞穿透肽是ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：53-70的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NO：79或80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，细胞穿透肽进一步包括共价连接至细胞穿透肽N端的一个或多个部分，并且其中所述一个或多个部分选自乙酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括共价连接至其N端的乙酰基基团。在一些实施方式中，细胞穿透肽进一步包括共价连接至细胞穿透肽C端的一个或多个部分，并且其中所述一个或多个部分选自半胱酰胺、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选地被取代的次氮基三乙酸、羧基、任选地被取代的线性或分支C1-C6烷基、伯胺或仲胺、糖苷(osidic)衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括共价连接至其C端的半胱酰胺基团。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，基因组编辑复合物中至少一些细胞穿透肽通过键合(连接，linkage)连接至靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。
在一些实施方式中，根据任意上述包括gRNA的基因组编辑复合物，gRNA是单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，sgRNA包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的、决定特异性的(specificity-determining)CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方式中，gRNA是sgRNA，其包括指导序列、tracr配偶(mate)序列、tracr序列、和尾部序列。
在一些实施方式中，根据任意上述包括RGEN的基因组编辑复合物，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，根据任意上述包括RGEN和gRNA的基因组编辑复合物，RGEN与gRNA的摩尔比在约1：10和约10：1之间。
在一些实施方式中，根据任意上述包括RGEN的基因组编辑复合物，细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。
在一些实施方式中，根据任意上述包括gRNA的基因组编辑复合物，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的包括不同指导序列的gRNA。在一些实施方式中，靶序列存在于靶基因中，并且所述一种或多种另外的gRNA各自包括与靶基因中的序列互补的指导序列。在一些实施方式中，靶序列存在于第一靶基因中，其所述一种或多种另外的gRNA各自包括与一种或多种另外的靶基因中存在的序列互补的指导序列。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，一种或多种基因组编辑***分子包括ZFP。在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，一种或多种基因组编辑***分子包括TALEN。在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，一种或多种基因组编辑***分子包括归巢核酸内切酶。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，基因组编辑复合物进一步包括用于将修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，该供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列。在一些实施方式中，修饰是一种或多种核苷酸在靶多核苷酸中的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，其中供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是包括侧接5’同源臂和3’同源臂的异源核酸的双链DNA，并且其中5’同源臂和3’同源臂与靶多核苷酸待修饰区域侧接的序列同源。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的供体核酸，用于将修饰引入一种或多种另外的靶多核苷酸。在一些实施方式中，一种或多种另外的供体核酸的每一种均包括与所述一种或多种另外的靶多核苷酸中的一种的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，一种或多种基因组编辑***分子包括整合酶。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括用于***靶多核苷酸的供体核酸，其中整合酶识别供体核酸中的重组位点，并且能够介导靶多核苷酸中的重组位点与供体核酸中的重组位点之间的重组，以将供体核酸***靶多核苷酸。
在一些实施方式中，根据任意上述基因组编辑复合物，基因组编辑复合物的平均直径在约10nm和约300nm之间。
在一些实施方式中，提供了纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物。在一些实施方式中，核芯进一步包括一种或多种另外的根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物。在一些实施方式中，核芯进一步包括用于将修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，该供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，其中供体核酸与第二细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，第二细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。在一些实施方式中，第二细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：1-70和75-80的氨基酸序列。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一种或多种核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是包括侧接5’同源臂和3’同源臂的异源核酸的双链DNA，并且其中5’同源臂和3’同源臂与靶多核苷酸待修饰区域侧接的序列同源。在一些实施方式中，核芯进一步包括一种或多种另外的供体核酸，用于将修饰引入一种或多种另外的靶多核苷酸，其中所述一种或多种另外的供体核酸每一种均包括与所述一种或多种另外的靶多核苷酸中的一种的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且其中所述一种或多种另外的供体核酸的每一种均与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，纳米颗粒中至少一些细胞穿透肽通过键合连接至靶向部分。在一些实施方式中，核芯被包覆以外壳，该外壳包括外周细胞穿透肽。在一些实施方式中，外壳中至少一些外周细胞穿透肽通过键合连接至靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，外周细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。在一些实施方式中，外周细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：1-70和75-80的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径在约10nm和约400nm之间。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径在约50nm和约300nm之间。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径在约80nm和约200nm之间。
在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包括根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物或根据上述实施方式中的任一者所述的纳米颗粒、和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物被配制用于静脉内、肿瘤内、动脉内、局部、眼内(intraocular)、眼科(ophthalmic)、门静脉、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服给予。在一些实施方式中，药物组合物是冻干的。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括表达复合物，该表达复合物包括第三细胞穿透肽和编码外源蛋白质的核酸分子。在一些实施方式中，外源蛋白质是能够在细胞表面上被表达的重组受体。在一些实施方式中，重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，第三细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。在一些实施方式中，第三细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：1-70和75-80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了制备根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物的方法，包括组合细胞穿透肽与RGEN/gRNA复合物，从而形成基因组编辑复合物。在一些实施方式中，细胞穿透肽与RGEN/gRNA复合物以约1：1至约80：1的比例组合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与RGEN/gRNA复合物以约5：1至约20：1的比例组合。
在一些实施方式中，提供了制备根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物的方法，包括组合细胞穿透肽与一种或多种基因组编辑***分子，从而形成基因组编辑复合物。在一些实施方式中，基因组编辑***分子包括RGEN和gRNA，并且细胞穿透肽和RGEN分别以约1：1至约80：1的比例组合，并且RGEN和gRNA分别以约10：1至约1：10的比例组合。在一些实施方式中，细胞穿透肽和RGEN分别以约5：1至约20：1的比例组合。在一些实施方式中，RGEN和gRNA以约1：1的比例组合。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到细胞中的方法，包括使细胞接触根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物或根据上述实施方式中的任一者所述的纳米颗粒，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子。在一些实施方式中，细胞与基因组编辑复合物纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，细胞与基因组编辑复合物纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，细胞与基因组编辑复合物纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，细胞是粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、天然杀伤细胞、成纤维细胞、或肝细胞。在一些实施方式中，细胞是T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，细胞是肺祖细胞。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，基因组编辑***靶向选自PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CTLA-4、TIGIT、4-1BB、OX40、CD27、TIM-1、CD28、HVEM、GITR、和ICOS的基因中的序列。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触包括第四细胞穿透肽和编码外源蛋白质的核酸分子的表达复合物。在一些实施方式中，外源蛋白质是能够在细胞表面上被表达的重组受体。在一些实施方式中，重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，第四细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。在一些实施方式中，第四细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：1-70和75-80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了修饰细胞中的靶多核苷酸的方法，包括使细胞接触根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物或根据上述实施方式中的任一者所述的纳米颗粒，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括靶向靶多核苷酸中的序列的、一种或多种基因组编辑***分子。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的疾病的方法，包括给予个体有效量的根据上述实施方式中的任一者所述的药物组合物。在一些实施方式中，该疾病选自癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、肝病、肺病、肾病、和老化和退化性疾病。在一些实施方式中，该疾病是癌症。在一些实施方式中，该癌症是实体肿瘤，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子，该蛋白质选自生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调谐子、蛋白质表达和修饰调节子、和凋亡和转移调节子。在一些实施方式中，癌症是肝、肺、或肾的癌症。在一些实施方式中，癌症是血液***恶性肿瘤(hematological malignancy)，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子，该蛋白质选自生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调谐子、蛋白质表达和修饰调节子、和凋亡和转移调节子。
在一些实施方式中，根据上述疾病治疗方法中的任一者，疾病是病毒感染疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节涉及病毒感染疾病发生和/或发展的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子。
在一些实施方式中，根据上述疾病治疗方法中的任一者，疾病是遗传性疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节涉及遗传性疾病发生和/或发展的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子。
在一些实施方式中，根据上述疾病治疗方法中的任一者，疾病是老化或退化性疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节涉及老化或退化性疾病发生和/或发展的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子。
在一些实施方式中，根据上述疾病治疗方法中的任一者，疾病是纤维化或炎性疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节涉及纤维化或炎性疾病发生和/或发展的两种或更多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子。
在一些实施方式中，根据上述疾病治疗方法中的任一者，个体是人。
在一些实施方式中，提供了试剂盒(套组，kit)，其包括包含根据上述实施方式中的任一者所述的基因组编辑复合物和/或根据上述实施方式中的任一者所述的纳米颗粒的组合物。
附图说明
图1A显示通过CY-5荧光监测的CAS9与CPP结合滴定曲线。通过增加VEPEP-3b(SEQID NO：76)、VEPEP-6(SEQ ID NO：77)、VEPEP-9(SEQ ID NO：78)、CADY(SEQ ID NO：81)和ADGN-100b(SEQ ID NO：80)肽的浓度，滴定固定浓度5nM的荧光标记的CAS9。由利用二次方程拟合的数据计算解离常数。
图1B显示通过CY-5荧光监测的CAS9：gRNA与CPP结合滴定曲线。通过增加VEPEP-3b(SEQ ID NO：76)、VEPEP-6(SEQ ID NO：77)、VEPEP-9(SEQ ID NO：78)、CADY(SEQ ID NO：81)和ADGN-100b(SEQ ID NO：80)肽的浓度，滴定固定浓度5nM的荧光标记的CAS9：gRNA。由利用二次方程拟合的数据计算解离常数。
图2A显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、U2OS细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：5缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图2B显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、U2OS细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：10缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图2C显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、U2OS细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：20缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图2D显示利用不同肽的、U2OS中EGFP报告基因的基因中断频率的剂量响应。Lipofectamine 2000和RNAiMAX用作对照。括号中的数值表示肽与CAS9：gRNA复合物的摩尔比。
图3A显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、HEK细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：5缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图3B显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、HEK细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：10缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图3C显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、HEK细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：20缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图3D显示利用不同肽的、HEK细胞中EGFP报告基因的基因中断频率的剂量响应。Lipofectamine 2000和RNAiMAX用作对照。括号中的数值表示肽与CAS9：gRNA复合物的摩尔比。
图4A显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、JURKAT T细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：50缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图4B显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、JURKAT T细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：10缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图4C显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、JURKAT T细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与不同的肽分别以摩尔比1：20缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图4D显示利用不同肽的、JURKAT T细胞中EGFP报告基因的基因中断频率的剂量响应。Lipofectamine 2000和RNAiMAX用作对照。括号中的数值表示肽与CAS9：gRNA复合物的摩尔比。
图5A显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、U2OS细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与VEPEP-3和ADGN-100的变体序列分别以摩尔比1：20缔合。RNAiMAX用作对照递送***。
图5B显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、JURKAT T细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。10nM、25nM和50nM的CAS9：gRNA复合物与VEPEP-3和ADGN-100的变体序列分别以摩尔比1：20缔合。RNAiMAX用作对照递送***。
图6A显示通过MTT分析测量的、在U2OS细胞上进行的ADGN-100a/CAS9/gRNA和VEPEP-3b/CAS9/gRNA复合物毒性评价。肽与复合Lipofectamine 2000和RNAiMAX的CAS9/gRNA进行比较。括号中的数值表示肽与CAS9：gRNA复合物的摩尔比。
图6B显示通过MTT分析测量的、在HEK细胞上进行的ADGN-100a/CAS9/gRNA和VEPEP-3b/CAS9/gRNA复合物毒性评价。肽与Lipofectamine 2000和RNAiMAX进行比较。括号中的数值表示肽与CAS9：gRNA复合物的摩尔比。
图6C显示通过MTT分析测量的、在JURKAT细胞上进行的ADGN-100a/CAS9/gRNA和VEPEP-3b/CAS9/gRNA复合物毒性评价。肽与Lipofectamine 2000和RNAiMAX进行比较。括号中的数值表示肽与CAS9：gRNA复合物的摩尔比。
图7A显示U2OS细胞中的EMX1基因编辑。细胞被与VEPEP-3b、ADGN-100a、VEPEP-9、或RNAiMAX缔合的25nM CAS9/gRNA转染。通过T7EI法分析细胞样品，并且***缺失(indel)结果通过利用片段分析***(Fragment Analyzer System)定量未切割vs切割DNA量来确定并报告在表3中。
图7B显示K562细胞中的EMX1基因编辑。细胞被与VEPEP-b3、ADGN-100a、VEPEP-9、或RNAiMAX缔合的25nM CAS9/gRNA转染。通过T7EI法分析细胞样品，并且***缺失结果通过利用片段分析***定量未切割vs切割DNA量来确定并报告在表3中。
图7C显示JURKAT细胞中的EMX1基因编辑。细胞被与VEPEP-3b、ADGN-100a、VEPEP-9、或RNAiMAX缔合的25nM CAS9/gRNA转染。通过T7EI法分析细胞样品，并且***缺失结果通过利用片段分析***定量未切割vs切割DNA量来确定并报告在表3中。
图8A显示EGFP-U2OS细胞中的EMX1基因编辑。细胞被与VEPEP-3b、ADGN-100a、VEPEP-9、或RNAiMAX缔合的25nM CAS9/gRNA转染。通过T7EI法分析细胞样品，并且***缺失结果通过利用片段分析***定量未切割vs切割DNA量来确定并报告在表4中。
图8B显示EGFP-JURKAT细胞中的EMX1基因编辑。细胞被与VEPEP-3b、ADGN-100a、VEPEP-9、或RNAiMAX缔合的25nM CAS9/gRNA转染。通过T7EI法分析细胞样品，并且***缺失结果通过利用片段分析***定量未切割vs切割DNA量来确定并报告在表4中。
图8C显示通过流式细胞术定量的、CAS9：sgRNA递送带来的、U2OS和JURKAT T细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。25nM的CAS9：gRNA复合物与VEPEP-3b、VEPEP-9和ADGN-100a分别以摩尔比1：20缔合，以及与lipofectamine 2000和RNAiMAX缔合。
图9A显示U2OS细胞的EMX1基因中的HindIII和NheI限制酶位点的HDR***效率分析。利用RFLP分析，通过EMXIPCR扩增子的NheI消化(消解，digestion)，计算HDR编辑百分比。
图9B显示JURKAT细胞的EMX1基因中的HindIII和NheI限制酶位点的HDR***效率分析。利用RFLP分析，通过EMXIPCR扩增子的NheI消化，计算HDR编辑百分比。
图10显示利用ADGN-100a肽的CAS9表达质粒和sgRNA共同递送带来的、U2OS细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。CAS9表达质粒和sgRNA与ADGN-100a以ADGN-100a与CAS9表达质粒和sgRNA每一种10：1或20：1的摩尔比(通过括号中的数值表示)缔合，以及与lipofectamine 2000缔合。
图11显示ADGN-100a/质粒复合物的转染效率。原代T细胞被包含2种浓度(2μg和5μg)的抗CD19 CAR编码质粒的ADGN-100a颗粒转染。在第4天，通过流式细胞术，利用蛋白L分析，评价抗CD19-CAR的表达。数据被相对于未被转染的细胞标准化，并与与游离质粒一起培育的细胞进行比较。
图12显示被ADGN-100a/质粒复合物转染后原代T细胞的存活率。原代T细胞被包含2种浓度(2μg和5μg)的抗CD19 CAR编码质粒的ADGN-100a颗粒转染。在第4天，利用7-AAD，通过流式细胞术定量细胞存活率。数据被相对于未被转染的细胞标准化并与与游离质粒一起培育T细胞进行比较。
图13显示与肽/RGEN/gRNA复合物组合使用的ADGN-100a/质粒复合物的转染效率。原代T细胞被包含抗CD19 CAR编码质粒(5μg)的ADGN-100a颗粒和包含gRNA/CAS9复合物的肽颗粒转染。在第6天，利用蛋白L分析，通过流式细胞术评价抗CD19-CAR的表达。数据被相对于未被转染的细胞标准化并与与游离质粒一起培育细胞进行比较。
图14显示通过MTT分析测量的、在JURKAT和K562细胞上进行的ADGN-100a/CAS9/gRNA和VEPEP-3a/CAS9/gRNA复合物毒性评价。通过RNAiMAX递送CAS9/gRNA复合物被包括在内，用于比较。
图15显示被包含CAS9/gRNA复合物的ADGN-100a或VEPEP-3a颗粒转染后原代T细胞的存活率。T细胞被包含2种浓度(5μg/10μg CAS9/gRNA和2.5μg/5μg CAS9/gRNA)的CAS9/gRNA颗粒的ADGN-100a或VEPEP-3a颗粒转染。在48h后，利用7-AAD，通过流式细胞术定量细胞存活率。数据被相对于未被转染的细胞标准化并与与游离CAS9/gRNA一起培育的T细胞进行比较。
图16A和16B显示通过T7E1分析定量的、通过CAS9/gRNA介导的原代人成纤维细胞(图16A)或原代人肝细胞(图16B)中的EMX1和HPRT内源基因的基因中断频率。CAS9/gRNA复合物(10nM、20nM、或50nM)通过ADGN-100a(肽与复合物的摩尔比为20：1)或通过RNAiMAX来递送。
图17A和17B显示通过MTT分析测量的、在人原代成纤维细胞(图17A)或人原代肝细胞(图17B)上进行的ADGN-100a/CAS9/gRNA复合物毒性评价。肽介导的递送与通过RNAiMAX的递送进行比较。
图18显示利用ADGN-100a或Lipofectamine 2000、被CSA9 mRNA(0.2μg或0.5μg)转染的U2OS细胞中的CAS9蛋白表达的免疫印迹(western blot)分析和定量。
图19显示通过流式细胞术定量的、ADGN-100a介导的CAS9/gRNA或CAS9mRNA/gRNA递送导致的U2OS细胞中EGFP报告基因的基因中断频率。CAS9/gRNA(2.5μM/5μM)或CAS9mRNA/gRNA(0.5μg/5μg)复合物与ADGN-100a以20：1(肽/复合物)的摩尔比缔合进行肽介导的递送，并与通过lipofectamine 2000或RNAiMAX的递送进行比较。
图20A和20B显示在体内给予与ADGN-100a肽以20：1的肽/mRNA摩尔比缔合的CAS9mRNA(10μg)后，在不同组织中CAS9蛋白表达通过免疫印迹(图20A)或ELISA(图20B)的定量。组织被均质化，并且利用抗CRISPR/Cas9抗体、通过蛋白质提取物的免疫印迹或ELISA来分析CAS9表达。
图21显示在注射游离ADGN-100a肽(2只动物/组)、游离CAS9 mRNA(2只动物/组)、或CAS9 mRNA/gRNA/ADGN-100a(3只动物/组)后72小时的荧光素酶表达的整体动物荧光成像。
图22显示通过荧光成像定量的、ADGN-100a介导的mRNA CAS9/sgRNA递送造成的肝中荧光素酶报告基因的体内基因中断频率。小鼠接受游离ADGN-100a肽、游离CAS9mRNA、或CAS9 mRNA/gRNA/ADGN-100a的单次静脉内注射。3只动物/组(标记为M1、M2、和M3)。
图23显示在体内给予与ADGN-100a肽以肽与mRNA/gRNA的20：1的摩尔比缔合的CAS9 mRNA/gRNA(10μg)后不同组织中的CAS9蛋白表达的ELISA分析。组织被均质化，并且利用抗CRISPR/Cas9抗体，通过蛋白质提取物的ELISA来分析CAS9表达。
图24显示T细胞中2微球蛋白基因编辑的FACS分析。T细胞被CAS9/gRNA(5μg/10μgCAS9/gRNA)转染——通过与ADGN-100a或VEPEP-3a缔合、或通过电穿孔。游离CAS9/gRNA和无处理状况被包括作为对照。在72小时后通过FACS评价2微球蛋白表达。
图25A和25B显示T细胞上的CPP/CAS9/gRNA复合物的毒性分析。PBMC分离的T细胞被与ADGN-100a或VEPEP-3b缔合的CAS9/gRNA复合物处理、或被CAS9/gRNA复合物电穿孔，并且在48小时后通过MTT分析(图25A)和在72小时后通过监测激活伤害引起的细胞死亡(DICD)(图25B)评估毒性。无处理、游离CAS9/gRNA、游离ADGN-100a、和游离VEPEP-3b状况被包括作为对照。
图26显示通过PCR凝胶分析定量的、VEPEP-3b和ADGN-100a介导的CAS9/gRNA递送导致的、未分化的和分化的小鼠肌肉成肌细胞(C2C12)中-联蛋白基因的基因中断。细胞被与CPP(+)或不与CPP(-)以20：1(肽/复合物)的摩尔比缔合的CAS9/gRNA(2.5μM/5μM)复合物转染，并与通过RNAiMAX的递送进行-联蛋白表达的比较。β-肌动蛋白表达被包括在内作为载荷对照(loading control)。
图27显示VEPEP-3b和ADGN-100a介导的CAS9/gRNA递送导致的、未分化的和分化的小鼠肌肉成肌细胞(C2C12)中HPRT基因的基因中断效率。通过T7EI法分析细胞样品和***缺失结果通过利用片段分析***定量未切割vs切割DNA量来确定。通过RNAiMAX的递送被包括作为对照。
图28A-28D显示利用ADGN-100a、VEPEP-6、VEPEP-9、或VEPEP-3a肽或RNAiMAX、被CAS9 mRNA(0.5μg)转染的不同细胞类型中通过ELISA进行的CAS9蛋白表达的定量。图28A显示U2OS细胞的结果。图28B显示HEPG2细胞的结果。图28C显示原代人成纤维细胞的结果。图28D显示K562细胞的结果。
图29A-29D显示通过T7E1分析定量的、CAS9 mRNA/gRNA介导的、U2OS细胞(图29A)、HEPG2细胞(图29B)、原代人成纤维细胞(图29C)、或K562细胞(图29D)中内源EMX1基因的基因中断频率。通过ADGN-100a、VEPEP-6、VEPEP-9、或VEPEP-3a肽(CPP与货物(负荷物，cargo)的摩尔比为20：1)或通过RNAiMAX递送CAS9mRNA/gRNA(0.5μg/2.5μg)。
图30显示通过MTT分析测量的、U2OS、HEPG2、和K562细胞系和人原代成纤维细胞上的CPP/CAS9 mRNA/gRNA复合物的毒性评价。肽介导的递送与通过RNAiMAX的递送进行比较。
图31A-31D显示通过T7E1分析定量的、CAS9蛋白/gRNA介导的、U2OS细胞(图31A)、HEPG2细胞(图31B)、原代人成纤维细胞(图31C)、或K562细胞(图31D)中内源EMX1基因的基因中断频率。预载(preloaded)CAS9/gRNA复合物(2.5μg/5μgCAS9/gRNA)与CPP肽以20：1的CPP与CAS9/gRNA复合物摩尔比混合进行肽介导的递送，并与通过lipofectamine 2000或RNAiMAX的递送进行比较。
图32A-32C显示利用ADGN-100a、VEPEP-6、VEPEP-9、或VEPEP-3a肽、或利用lipofectamine 2000、被CAS9表达质粒(0.5μg)转染的不同细胞类型中通过ELISA进行的CAS9蛋白表达的定量。图32A显示U2OS细胞的结果。图32B显示HEPG2细胞的结果。图32C显示原代人成纤维细胞的结果。
图33A-33C显示通过T7E1分析定量的、CAS9-表达质粒和gRNA介导的、U2OS细胞(图33A)、HEPG2细胞(图33B)、或原代人成纤维细胞(图33C)中内源EMX1基因的基因中断频率。CAS9表达质粒(0.5μg)和gRNA(5μg)与CPP肽以20：1的CPP/核酸(质粒+gRNA)摩尔比混合。肽介导的CAS9表达质粒/gRNA递送与通过lipofectamine2000或RNAiMAX的递送进行比较。
图34显示缔合CPP/mRNA复合物体内给予的非特异性细胞因子诱导的评价。对小鼠注射CAS9 mRNA/ADGN-100a、CAS9 mRNA/VEPEP-6、或CAS9 mRNA/VEPEP-9的单次静脉内注射。利用细胞因子小鼠磁性20-Plex面板(Cytokine Mouse Magnetic 20-Plex Panel)在不同时间点评价血清细胞因子水平。对照包括给予LPS或游离mRNA。对于各时间点，条形从左至右分别相应于TNF-a、GM-CSF、IFN-γ、IL1α、IL2、IL5、IL6、IL10、IL12(p40/p70)、IL13、IL17、IL1β、VEGF、FGF、MIP-1a、和FGF。
图35A-35C显示体内给予与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/mRNA摩尔比缔合的CAS9 mRNA(5μg)后3天(图35A)、6天(图35B)、和10天(图35C)各种组织中通过ELISA进行的CAS9蛋白表达的定量。组织被均质化，并且利用抗CRISPR/Cas9抗体在蛋白质提取物上通过ELISA分析CAS9表达。
图36显示体内给予与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)摩尔比缔合的、靶向PCSK9外显子1的CAS9 mRNA(5μg)/gRNA后不同时间点的血清PCSK9蛋白水平的定量。PCSK9的血清水平用小鼠前蛋白转化酶9/PCSK9 Quantikine ELISA试剂盒(MPC-900，R&DSystems)、通过ELISA来确定。
图37显示体内给予与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)摩尔比缔合的、靶向PCSK9外显子1的CAS9 mRNA(5μg)/gRNA的后不同时间点的总血清胆固醇水平的定量。总血清胆固醇水平用无限胆固醇试剂(Infinity CholesterolReagent)(Thermo Fisher)来测量。
图38显示缔合VEPEP-3a/CAS9蛋白复合物体内给予的非特异性细胞因子诱导的评价。对小鼠注射CAS9/VEPEP-3a的单次静脉内注射。利用细胞因子小鼠磁性20-Plex面板在不同时间点评价血清细胞因子水平。对照包括给予游离CAS9蛋白或LPS。对于各时间点，条形从左至右分别相应于TNF-a、GM-CSF、IFN-γ、IL1α、IL2、IL5、IL6、IL10、IL12(p40/p70)、IL13、IL17、IL1β、VEGF、FGF、MIP-1a、和FGF。
图39A和39B显示原代人T细胞中通过ELISA确定的CAS9蛋白表达的定量。图39A相应于利用ADGN-100a、VEPEP-6、VEPEP-9、或VEPEP-3a肽、或RNAiMAX、被CAS9mRNA(0.5μg)转染的T细胞。图39B相应于利用ADGN-100a、VEPEP-6、VEPEP-9、或VEPEP-3a肽、或lipofectamine 2000、被CAS9表达质粒(0.5μg)转染的T细胞。
图40A-40D显示通过T7E1分析定量的、RGEN/gRNA介导的、人原代T细胞中内源EMX1基因的基因中断频率。图40A相应于利用ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9(CPP与货物的摩尔比为20：1)或通过RNAiMAX、被CAS9 mRNA/gRNA(0.5μg/2.5μg)转染的T细胞。图40B相应于被预载CAS9/gRNA复合物(2.5μg/5μg CAS9/gRNA)转染的T细胞。复合物与ADGN-100a、VEPEP-6、VEPEP-9、或VEPEP-3a(CPP与复合物的摩尔比为20：1)混合，并与通过RNAiMAX的递送进行比较。图40C相应于利用ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9(CPP与货物的摩尔比为20：1)或通过lipofectamine2000/RNAiMAX、被CAS9表达质粒(0.5μg)和gRNA(5μg)转染的T细胞。FIG40D相应于通过MTT分析测量的、人原代T细胞中缔合或不缔合gRNA的CAS9 mRNA、CAS9蛋白、或CAS9表达质粒(CAS9 pls)复合物中的CPP的毒性评价。肽介导的递送与通过RNAiMAX或Lipofectamine 2000的递送进行比较。
具体实施方式
为使基因组编辑技术(如基于设计核酸酶(designer nuclease)的基因组修饰，例如，CRISPR)在治疗上适用，基因组编辑***分子(如CRISPR***分子)必须被有效地递送至其在细胞中的靶标。腺相关病毒颗粒已常被用作基因递送剂，但由于安全性问题和载荷能力限制，病毒载体是不理想的递送媒介(Swiech et al.,Nat.Biotechnol.33:102–106,2015)。递送基因组编辑***分子的非病毒手段包括脂质系载体、脂质纳米颗粒、聚合物载体、聚乙烯亚胺，和聚(L-赖氨酸)作为几例，尽管基因组编辑的体内应用(如通过利用CRISPR工具)因现用递送途径的限制仍存在挑战(Li et al.(2015).Human gene therapy,26(7):452-462；Wang et al.(2016).Proceedings of the National Academy ofSciences,113(11):2868-2873)。因此，需要改进的用于简单和有效递送基因组编辑***分子(如CRISPR***分子)的方法。
本申请提供了复合物和纳米颗粒，其包括细胞穿透肽(CPP)和一种或多种基因组编辑***分子，其中CPP适于稳定化和/或向细胞内递送一种或多种基因组编辑***分子。复合物和纳米颗粒可包括多个基因组编辑***分子，并且该多个基因组编辑***分子中的一些可以在与CPP缔合前处于预成形复合物中。复合物和纳米颗粒可包括完整基因组编辑***(例如，复合物和纳米颗粒可包括在被递送至细胞时足以对基因组编辑***被设计用于的基因组产生修饰的分子)。与病毒载体或化学转染相比，细胞穿透肽技术复杂性更低，毒性更低，并且更易应用。基因组编辑***分子意为包括编码基因组编辑***分子的核酸。例如，基因组编辑***分子可包括例如a)酶和RNA、b)RNA和编码该酶的核酸、c)酶和编码该RNA的核酸、或d)编码该酶和该RNA的核酸。在一些实施方式中，基因组编辑***包括设计核酸酶(或编码设计核酸酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶(如ARC核酸酶TM)或核酸指导的核酸内切酶(NGEN)，如RNA指导的核酸内切酶(RGEN，例如，Cas9)或DNA指导的核酸内切酶(DGEN)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括指导核酸(gNA)(或编码指导核酸的核酸，如mRNA或DNA质粒)，如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA)。在一些实施方式中，基因组编辑***是成簇的规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)***(包括，例如，CRISPR相关蛋白质和/或核酸、或编码一种或多种CRISPR相关蛋白质和/或核酸的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***包括ZFN。在一些实施方式中，基因组编辑***包括TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***包括归巢核酸内切酶。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。
因此，本申请在一方面中提供了新型基因组编辑复合物和纳米颗粒，其在下文中进一步被更详细地描述。
在另一方面中，提供了利用细胞穿透肽将基因组编辑***分子递送到细胞中的方法。
还提供了包括细胞穿透肽和一种或多种基因组编辑***分子(例如复合物和纳米颗粒形式)的药物组合物和其用于治疗疾病的应用。
定义
在本发明的方面中，术语“单指导RNA”或“sgRNA”指代包括指导序列、tracr序列和tracr配偶序列的多核苷酸序列。术语“指导序列”指代指导RNA中指定靶位点的约20bp序列。术语“tracr配偶序列”还可与术语“同向重复”互换使用。
如本文所用，术语“野生型”是技术人员理解的技术术语，并且意为生物体、菌种、基因或特性其存在于自然界时的一般形式，区别于突变或变异形式。
如本文所用，术语“变体”应用来意指呈现具有偏离自然界存在模式的模式的性质。
术语“非天然存在”或“工程化”被可互换地使用，并且表示涉及了人工。该术语在在谈及核酸分子或多肽时意为核酸分子或多肽至少基本上不具有在自然界中或在自然界中发现的与其天然缔合的至少一种其它组分。
“互补性”指代核酸与另一核酸序列通过传统Watson-Crick碱基配对或其它非传统类型形成氢键(一个或多个)的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10分之5、6、7、8、9、10是50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”意为核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数量的连续残基成氢键(hydrogen bonding)。本文所用的“基本上互补”指代在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或指代在严格条件下杂交的两个核酸。
如本文所用，杂交的“严格条件”指代与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交并且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件总体上是依赖序列的，并且取决于多种因素变化。总体上，序列越长，该序列与其靶序列特异性杂交时的温度越高。严格条件的非限制性实例被详细描述于Tijssen(1993).Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes，第I部分，第二章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assay”.Elsevier,N.Y.。
“杂交”指代这样的反应：其中一种或多种多核苷酸反应形成复合物，该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的成氢键被稳定化。成氢键可通过Watson Crick碱基配对、Hoogstein结合、或以任何其它序列特异性方式进行。复合物可包括形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单条自杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可构成更宽泛的过程中的一个步骤，如PCR的启动、或多核苷酸被酶切割。能够与给定序列杂交的序列被称为给定序列的“补体”。
如本文所用，“表达”指代从DNA模板转录多核苷酸(如转录成mRNA或其它RNA转录物)的过程和/或转录mRNA随后被翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和被编码多肽可被统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中被可互换地用于指代脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，鼠类、猿类、人类、农场动物、运动动物、和宠物。体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞和其后代也被包括在内。
术语“治疗剂”、“治疗活性剂”或“处理剂”被可互换地使用，并且指代在被给予对象后赋予一定有益效果的分子或化合物。有益效果包括实现诊断性判断；缓解疾病、症状、障碍、或病理状况；减少或预防疾病、症状、障碍或状况的发作；和总体上对抗疾病、症状、障碍或病理状况。
如本文所用，“处理”或“治疗”指代获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。治疗益处意为在处理(治疗)下一种或多种疾病、状况、或症状的任何治疗相关改进或对一种或多种疾病、状况、或症状的任何治疗相关效果。
术语“有效量”或“治疗有效量”指代足以产生有益或期望的结果的剂量。治疗有效量可取决于下列一种或多种而变化：被治疗的对象和疾病状况、对象的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式和类似因素——其可容易被本领域普通技术人员确定。该术语还是用于通过本文描述的任一种成像方法提供检测图像的药剂。特定药剂可取决于下列一种或多种而变化：选择的具体剂、遵照的用药方案、其是否与其它化合物被组合给予、给药时机、被成像的组织、和运载其的物理递送***。
如本文所用，单数形式“一”、“一个/种”、和“所述”包括复数指代，除非另有说明。
本文中对“约”某一个数值或参数的提及包括(并且描述了)指定该数值或参数本身的实施方式。例如，提及约X”的描述包括“X”的描述。
本发明的组合物和方法可包括下列、由下列组成或主要由下列组成：本文描述的本发明的必需元素和限定，以及本文描述的或其它有用的任何另外的或任选的成分、组分、或限定。
除非另有说明，技术术语按照常规用法使用。
复合物和纳米颗粒
在一些方面中，本发明提供了包括细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，用于向细胞内递送一种或多种基因组编辑***分子。在一些实施方式中，细胞穿透肽与基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)复合。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN(例如，Cas9)、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是核酸指导型核酸酶(例如，RGEN或DGEN)，并且细胞穿透肽与组合(如，复合)指导序列(或编码指导序列的核酸)的核酸指导型核酸酶(或编码核酸指导型核酸酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽和ZFN或TALEN、或者编码ZFN或TALEN的核酸。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽、RGEN或编码RGEN的核酸、和指导RNA(gRNA)或编码gRNA的核酸。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽、DGEN或编码DGEN的核酸、和指导DNA(gDNA)或编码gDNA的核酸。在一些实施方式中，细胞穿透肽和基因组编辑核酸酶被共价附接。在一些实施方式中，RGEN和gRNA或DGEN和gDNA在与细胞穿透肽缔合形成基因组编辑复合物前处于预成形复合物中。在一些实施方式中，细胞穿透肽与基因组编辑整合酶(或编码基因组编辑整合酶的核酸)复合。在一些实施方式中，基因组编辑整合酶是噬菌体整合酶。在一些实施方式中，细胞穿透肽与组合(如，复合)供体核酸(其包括被整合酶识别的重组位点)的基因组编辑整合酶(或编码基因组编辑整合酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。细胞穿透肽能够与基因组编辑***分子(例如，Cas核酸酶和/或指导RNA、或编码Cas核酸酶和/或指导RNA的核酸)形成稳定的复合物和纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整基因组编辑***(例如，基因组编辑复合物或纳米颗粒中的分子向细胞内的递送足以引起细胞中的基因组编辑)。
在一些方面中，本发明提供了包括细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，用于将ZFP或ZFN递送至宿主细胞。在一些实施方式中，细胞穿透肽与ZFP或ZFN(或者编码ZFP或ZFN的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。细胞穿透肽能够与ZFP或ZFN或者编码ZFP或ZFN的核酸形成稳定的复合物和纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽和ZFP或ZFN或者编码ZFP或ZFN的核酸。在一些实施方式中，细胞穿透肽和ZFP或ZFN被共价附接。
在一些方面中，本发明提供了包括细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，用于将TALE或TALEN递送至宿主细胞。在一些实施方式中，细胞穿透肽与TALE或TALEN(或者编码TALE或TALEN的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。细胞穿透肽能够与TALE或TALEN或者编码TALE或TALEN的核酸形成稳定的复合物和纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽和TALE或TALEN或者编码TALE或TALEN的核酸。在一些实施方式中，细胞穿透肽和TALE或TALEN被共价附接。
在一些方面中，本发明提供了包括细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，用于将一种或多种CRISPR***分子递送至宿主细胞。在一些实施方式中，细胞穿透肽与CRISPR核酸酶(例如，Cas9)或编码CRISPR核酸酶的核酸——任选地组合(如，复合)指导序列(或编码指导序列的核酸)——复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。细胞穿透肽能够与CRISPR***分子(例如，Cas核酸酶和/或指导RNA)和/或编码一种或多种CRISPR***分子的核酸形成稳定的复合物和纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽以及a)RGEN(例如，Cas9)或编码RGEN的核酸和/或b)gRNA或编码gRNA的核酸。在一些实施方式中，细胞穿透肽和RGEN被共价附接。在一些实施方式中，RGEN和gRNA在与细胞穿透肽缔合形成基因组编辑复合物或纳米颗粒前处于预成形复合物中。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整CRISPR***。例如，在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽、RGEN(例如，Cas9)或编码RGEN的核酸、和gRNA或编码gRNA的核酸。
在一些方面中，本发明提供了包括细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，用于将一种或多种DGEN***分子递送至宿主细胞，如Gao et al.(2016).Nature biotechnology中描述的***——该***利用了包括格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)和指导DNA(gDNA)的DNA指导基因组编辑***。在一些实施方式中，细胞穿透肽与组合(如，复合)指导序列(或编码指导序列的核酸)的DGEN(或编码DGEN的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。细胞穿透肽能够与DGEN***分子(例如，NgAgo核酸酶和/或指导DNA)和/或编码一种或多种DGEN***分子的核酸形成稳定的复合物和纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽、DGEN或编码DGEN的核酸、和gDNA或编码gDNA的核酸。在一些实施方式中，细胞穿透肽和DGEN被共价附接。在一些实施方式中，DGEN和gDNA在与细胞穿透肽缔合形成基因组编辑复合物前处于预成形复合物中。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整DGEN***。例如，在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽、DGEN或编码DGEN的核酸、和gDNA或编码gDNA的核酸。
在一些方面中，本发明提供了包括细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，用于将整合酶递送至宿主细胞。在一些实施方式中，细胞穿透肽与整合酶(或编码整合酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，细胞穿透肽与组合(如，复合)供体核酸(其包括被整合酶识别的重组位点)的整合酶(或编码整合酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。细胞穿透肽能够与整合酶或编码整合酶的核酸形成稳定的复合物和纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽和整合酶或编码整合酶的核酸。在一些实施方式中，细胞穿透肽和整合酶被共价附接。在一些实施方式中，整合酶和供体核酸在与细胞穿透肽缔合形成基因组编辑复合物或纳米颗粒前处于预成形复合物中。
细胞穿透肽
本发明的基因组编辑复合物或纳米颗粒中的细胞穿透肽能够与各种基因组编辑***分子如核酸酶(例如，ZFNs、TALENs、和CRISPR相关核酸酶(如Cas9和Cpf1))、整合酶(如噬菌体整合酶，例如，ΦC31)、和核酸(例如，指导RNAs、指导DNAs、和供体核酸)形成稳定的复合物和纳米颗粒。本文描述的任何基因组编辑复合物或纳米颗粒中的任何细胞穿透肽可包括本章节描述的任何细胞穿透肽序列，或由本章节描述的任何细胞穿透肽序列组成。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括选自CADY，PEP-1、MPG、VEPEP-3肽、VEPEP-4肽、VEPEP-5肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽的细胞穿透肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒核芯中存在的基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核芯中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN(例如，Cas9)、DGEN、或整合酶缔合。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与gRNA或gDNA缔合。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与RGEN/gRNA复合物或DGEN/gDNA复合物缔合。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与供体核酸缔合。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，细胞穿透肽连接至靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。WO2014/053879公开了VEPEP-3肽；WO2014/053881公开了VEPEP-4肽；WO2014/053882公开了VEPEP-5肽；WO2012/137150公开了VEPEP-6肽；WO2014/053880公开了VEPEP-9肽；WO 2016/102687公开了ADGN-100肽；US2010/0099626公开了CADY肽；并且美国专利号7,514,530公开了MPG肽；其公开内容整体通过引用被并入本文。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括VEPEP-3细胞穿透肽，该VEPEP-3细胞穿透肽包括氨基酸序列X1X2X3X4X5X2X3X4X6X7X3X8X9X10X11X12X13(SEQID NO：1)，其中X1是β-A或S，X2是K、R或L(彼此独立)，X3是F或W(彼此独立)，X4是F、W或Y(彼此独立)，X5是E、R或S，X6是R、T或S，X7是E、R、或S，X8为空白(不存在，none)、F或W，X9是P或R，X10是R或L，X11是K、W或R，X12是R或F，以及X13是R或K。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括氨基酸序列X1X2WX4EX2WX4X6X7X3PRX11RX13(SEQ ID NO：2)，其中X1是β-A或S，X2是K、R或L，X3是F或W，X4是F、W或Y，X5是E、R或S，X6是R、T或S，X7是E、R、或S，X8为空白、F或W，X9是P或R，X10是R或L，X11是K、W或R，X12是R或F，以及X13是R或K。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括氨基酸序列X1KWFERWFREWPRKRR(SEQ ID NO：3)、X1KWWERWWREWPRKRR(SEQ ID NO：4)、X1KWWERWWREWPRKRK(SEQ ID NO：5)、X1RWWEKWWTRWPRKRK(SEQ ID NO：6)、或X1RWYEKWYTEFPRRRR(SEQ ID NO：7)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-7中任一种的氨基酸序列，其中细胞穿透肽通过下列被修饰：第10位氨基酸被非天然氨基酸替换，第2位和第3位氨基酸之间添加非天然氨基酸，和在两个非天然氨基酸之间添加烃键合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括氨基酸序列X1KX14WWERWWRX14WPRKRK(SEQ ID NO：8)，其中X1是β-A或S，以及X14是非天然氨基酸，并且其中两个非天然氨基酸之间存在烃键合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括氨基酸序列X1X2X3WX5X10X3WX6X7WX8X9X10WX12R(SEQ ID NO：9)，其中X1是β-A或S，X2是K、R或L，X3是F或W，X5是R或S，X6是R或S，X7是R或S，X8是F或W，X9是R或P，X10是L或R，以及X12是R或F。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括氨基酸序列X1RWWRLWWRSWFRLWRR(SEQ ID NO：10)、X1LWWRRWWSRWWPRWRR(SEQ ID NO：11)、X1LWWSRWWRSWFRLWFR(SEQ ID NO：12)、或X1KFWSRFWRSWFRLWRR(SEQ ID NO：13)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1和9-13中任一种的氨基酸序列，其中细胞穿透肽通过下列被修饰：第5位和第12位的氨基酸被非天然氨基酸替换，和在两个非天然氨基酸之间添加烃键合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括氨基酸序列X1RWWX14LWWRSWX14RLWRR(SEQ ID NO：14)，其中X1是β-丙氨酸或丝氨酸，以及X14是非天然氨基酸，并且其中非天然氨基酸之间存在烃键合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒核芯中的基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的核芯中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN(例如，Cas9)、DGEN、或整合酶缔合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与gRNA或gDNA缔合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与RGEN/gRNA复合物或DGEN/gDNA复合物缔合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与供体核酸缔合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽连接至靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括VEPEP-6细胞穿透肽。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括选自X1LX2RALWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8(SEQ IDNO：15)、X1LX2LARWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8(SEQ ID NO：16)、和X1LX2ARLWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列，其中X1是β-A或S，X2是F或W，X3是L、W、C或I，X4是S、A、N或T，X5是L或W，X6是W或R，X7是K或R，X8是A或空白，以及X9是R或S。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括氨基酸序列X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6X7X8(SEQ IDNO：18)，其中X1是β-A或S，X2是F或W，X3是L、W、C或I，X4是S、A、N或T，X5是L或W，X6是W或R，X7是K或R，以及X8是A或空白。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括氨基酸序列X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6KX7(SEQ ID NO：19)，其中X1是β-A或S，X2是F或W，X3是L或W，X4是S、A或N，X5是L或W，X6是W或R，X7是A或空白。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括选自X1LFRALWRLLRX2LWRLLWX3(SEQ ID NO：20)，X1LWRALWRLWRX2LWRLLWX3A (SEQ ID NO： 21)、X1LWRALWRLX4RX2LWRLWRX3A (SEQ ID NO： 22)、X1LWRALWRLWRX2LWRLWRX3A (SEQ ID NO：23)、X1LWRALWRLX5RALWRLLWX3A(SEQ ID NO：24)、和X1LWRALWRLX4RNLWRLLWX3A(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列，其中X1是β-A或S，X2是S或T，X3是K或R，X4是L、C或I，以及X5是L或I。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括选自Ac-X1LFRALWRLLRSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：26)、Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLLWKA-半胱酰胺(SEQ ID NO：27)、Ac-X1LWRALWRLLRSLWRLWRKA-半胱酰胺(SEQ ID NO：28)、Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLWRKA-半胱酰胺(SEQ ID NO：29)、Ac-X1LWRALWRLLRALWRLLWKA-半胱酰胺(SEQ ID NO：30)、和Ac-X1LWRALWRLLRNLWRLLWKA-半胱酰胺(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQID NOs：15-31中任一种的氨基酸序列，进一步包括第8和12位两个残基之间的烃键合。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括选自下列的氨基酸序列：Ac-X1LFRALWRSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：32)、Ac-X1LFLARWRSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：33)、Ac-X1LFRALWSSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：34)、Ac-X1LFLARWSSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：35)、Ac-X1LFRALWRLLRSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：36)、Ac-X1LFLARWRLLRSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：37)、Ac-X1LFRALWRLLSSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：38)、Ac-X1LFLARWRLLSSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：39)、和Ac-X1LFARSLWRLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO：40)，其中X1是β-A或S，并且其中后接下标"S"的残基是通过所述烃键合连接的那些残基。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒核芯中的基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的核芯中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN(例如，Cas9)、DGEN、或整合酶缔合。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与gRNA或gDNA缔合。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与RGEN/gRNA复合物或DGEN/gDNA复合物缔合。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与供体核酸缔合。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽连接至靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括VEPEP-9细胞穿透肽，该VEPEP-9细胞穿透肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQID NO：41)，其中X1是β-A或S，X2是L或空白，X3是R或空白，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或空白，X12是A、R或空白，和X13是W或F，并且其中如果X3是空白，则X2、X11和X12也是空白。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2RWWLRWAX6RWX8X9X10WX12WX13R(SEQ ID NO：42)，其中X1是β-A或S，X2是L或空白，X6是S或P，X8是F或A，X9是S、L或P，X10是R或S，X12是A或R，以及X13是W或F。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括选自下列的氨基酸序列：X1LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO：43)、X1LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO：44)、X1RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO：45)、X1RWWLRWASRWFLSWRWWR(SEQ ID NO：46)、X1RWWLRWAPRWFPSWRWWR(SEQ ID NO：47)、和X1RWWLRWASRWAPSWRWWR(SEQ ID NO：48)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1WWX4X5WAX6X7X8RX10WWR(SEQ ID NO：49)，其中X1是β-A或S，X4是R或G，X5是W或S，X6是S、T或P，X7是W或P，X8是A或R，以及X10是S或R。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括选自X1WWRWWASWARSWWR(SEQ ID NO：50)、X1WWGSWATPRRRWWR(SEQ ID NO：51)，和X1WWRWWAPWARSWWR(SEQ ID NO：52)的氨基酸序列，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒核芯中的基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的核芯中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN(例如，Cas9)、DGEN、或整合酶缔合。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与gRNA或gDNA缔合。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与RGEN/gRNA复合物或DGEN/gDNA复合物缔合。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与供体核酸缔合。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽连接至靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括ADGN-100细胞穿透肽，该ADGN-100细胞穿透肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO：53)，其中X1是任何氨基酸或空白，和X2-X8是任何氨基酸。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO：54)，其中X1是βA、S、或空白，X2是A或V，X3是或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V、或A，X7是S或L，以及X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括氨基酸序列KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO：55)、KWRSALYRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO：56)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO：57)、或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO：58)。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括被通过烃键合连接的3或6个残基隔开的两个残基。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括氨基酸序列KWRSSAGWRSWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO：59)、KWRSSAGWRWRSLWRVRSWSR(SEQ ID NO：60)、KWRSAGWRSWRLWRVRSSWSR(SEQ ID NO：61)、KWRSSALYRSWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO：62)、KWRSSALYRWRSLWRSRSWSR(SEQ ID NO：63)、KWRSALYRSWRLWRSRSSWSR(SEQ ID NO：64)、KWRSALYRWRSLWRSSRSWSR(SEQ ID NO：65)、KWRSALYRWRLWRSSRSWSSR(SEQ ID NO：66)、KWRSSALYRWRSLWRSALYSR(SEQ ID NO：67)、KWRSSALYRSWRLWRSALYSR(SEQ ID NO：68)、KWRSALYRWRSLWRSSALYSR(SEQ ID NO：69)、或KWRSALYRWRLWRSSALYSSR(SEQ ID NO：70)，其中标有下标“S”的残基通过烃键合来连接。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒核芯中的基因组编辑复合物中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的核芯中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN(例如，Cas9)、DGEN、或整合酶缔合。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与gRNA或gDNA缔合。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与RGEN/gRNA复合物或DGEN/gDNA复合物缔合。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的核芯中，并且与供体核酸缔合。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，ADGN-100肽连接至靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。
在一些实施方式中，本文描述的CPP(例如，VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽)进一步包括连接至CPP的N端的一个或多个部分。在一些实施方式中，一个或多个部分被共价连接至CPP的N端。在一些实施方式中，一个或多个部分选自乙酰基基团、硬脂酰基基团、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，一个或多个部分是乙酰基基团和/或硬脂酰基基团。在一些实施方式中，CPP包括连接至其N端的乙酰基基团和/或硬脂酰基基团。在一些实施方式中，CPP包括连接至其N端的乙酰基基团。在一些实施方式中，CPP包括连接至其N端的硬脂酰基基团。在一些实施方式中，CPP包括共价连接至其N端的乙酰基基团和/或硬脂酰基基团。在一些实施方式中，CPP包括共价连接至其N端的乙酰基基团。在一些实施方式中，CPP包括共价连接至其N端的硬脂酰基基团。
在一些实施方式中，本文描述的CPP(例如，VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽)进一步包括连接至CPP的C端的一个或多个部分。在一些实施方式中，一个或多个部分被共价连接至CPP的C端。在一些实施方式中，一个或多个部分选自半胱酰胺基团、半胱氨酸、硫醇、酰胺、次氮基三乙酸、羧基、线性或分支C1-C6烷基、伯胺或仲胺、糖苷衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，一个或多个部分是半胱酰胺基团。在一些实施方式中，CPP包括连接至其C端的半胱酰胺基团。在一些实施方式中，CPP包括共价连接至其C端的半胱酰胺基团。
在一些实施方式中，本文描述的CPP(例如，VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽)是U型钉式的。本文所用的“U型钉式”指代化学键合在肽中两个残基之间。在一些实施方式中，CPP是U型钉式的，其包括在肽的两个氨基酸之间的化学键合。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸被3或6个氨基酸隔开。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸被3个氨基酸隔开。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸被6个氨基酸隔开。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸每一个均是R或S。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸每一个均是R。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸每一个均是S。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸中的一个是R，并且另一个是S。在一些实施方式中，化学键合是烃键合。
复合物
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽和一种或多种基因组编辑***分子(包括编码所述一种或多种基因组编辑***分子中的任一种的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)和基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN(例如，Cas9)、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)，其中gRNA或gDNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：包括RGEN和gRNA的预成形复合物、或包括DGEN和gDNA的预成形复合物。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括细胞穿透肽和整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，整合酶是噬菌体整合酶(例如，ΦC31)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与所述一种或多种基因组编辑***分子中的至少一种(如，一种或多种基因组编辑***分子全部)的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与所述一种或多种基因组编辑***分子中的至少一种(如，所述一种或多种基因组编辑***分子全部)的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系(poly-arginine-based)肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的gRNAs或dDNAs，该gRNAs或dDNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括完整基因组编辑***。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)和ZFN或TALEN(或一个或多个编码ZFN或TALEN的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与ZFN或TALEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与ZFN或TALEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)和整合酶(或一个或多个编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，整合酶是噬菌体整合酶(例如，ΦC31)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与整合酶的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与整合酶的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)以及RGEN(或编码RGEN的核酸)和gRNA(或编码gRNA的核酸)中的一者或两者，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是单指导RNA(sgRNA)包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5，1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)以及DGEN(或编码DGEN的核酸)和gDNA(或编码gDNA的核酸)中的一者或两者，其中gDNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与包括DGEN和gDNA的预成形复合物缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，DGEN是NgAgo。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中DGEN与gDNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5，1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中DGEN与gDNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与DGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与DGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的gDNAs，该另外的gDNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括与包括RGEN和gRNA的预成形RGEN/gRNA复合物缔合的细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5，1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、ZFN或TALEN、和供体核酸，其中ZFN或TALEN切割靶多核苷酸中的靶序列，并且其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***，并且供体核酸是双链DNA分子，如质粒。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与ZFN或TALEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与ZFN或TALEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括TALEN。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的供体核酸，该另外的供体核酸包括不同的修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于将外源核酸引入靶多核苷酸基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、整合酶、和包括外源核酸的供体核酸，其中整合酶能够介导靶多核苷酸中的第一重组位点和供体核酸中的第二重组位点之间的重组。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与整合酶的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与整合酶的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的供体核酸，该另外的供体核酸包括不同的外源核酸。在一些实施方式中，外源核酸被***靶多核苷酸的编码序列。在一些实施方式中，外源核酸被***靶多核苷酸的非编码序列。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以表达外源核酸的产物(如蛋白质，例如，外源蛋白质)。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)以及RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)和供体核酸中的一种或多种，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括RGEN和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***，并且供体核酸是双链DNA分子，如质粒。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的供体核酸，该另外的供体核酸包括不同的修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括RGEN和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中约1和约50之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，供体核酸是单链DNA寡核苷酸。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自是约20和约150之间(如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、和150中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的供体核酸，该另外的供体核酸包括不同的修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中异源核酸的***。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括RGEN和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是长度大于约50个(如，大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸的异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是双链DNA分子。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自大于约300个(如，大于约300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种另外的供体核酸，该另外的供体核酸包括不同的修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于修饰一种或多种靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、和多种gRNAs(或编码所述多种gRNAs的一种或多种核酸)，其中所述多种gRNAs每一种各自包括不同的、与所述一种或多种靶多核苷酸中的一种靶多核苷酸的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与包括RGEN和所述多种gRNAs的预成形复合物缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，多种gRNAs每一种均是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，多种gRNAs每一种均是包括gRNA指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括一种或多种供体核酸，其中所述一种或多种供体核酸每一种各自包括用于将修饰引入所述一种或多种靶多核苷酸中的一种靶多核苷酸的序列。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括与基因组编辑酶(或编码基因组编辑酶的核酸)如核酸酶或整合酶缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑酶是选自ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN的核酸酶。在一些实施方式中，基因组编辑酶是Cas9。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑酶是整合酶。在一些实施方式中，基因组编辑复合物进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括与包括RGEN和gRNA的预成形RGEN/gRNA复合物缔合的细胞穿透肽，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、和gRNA(或编码gRNA的核酸)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括RGEN和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***，并且供体核酸是双链DNA分子，如质粒。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括RGEN和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中约1和约50之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，供体核酸是单链DNA寡核苷酸。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自是约20和约150之间(如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、和150中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中异源核酸的***，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括RGEN和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是长度大于约50个(如，大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸的异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是双链DNA分子。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自大于约300个(如，大于约300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰一种或多种靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、和多种gRNAs(或编码所述多种gRNAs的一种或多种核酸)，其中所述多种gRNAs每一种各自包括不同的、与所述一种或多种靶多核苷酸中的一种靶多核苷酸的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ IDNOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与包括RGEN和所述多种gRNAs的预成形复合物缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括与包括Cas9和gRNA预成形Cas9/gRNA复合物缔合的细胞穿透肽，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、和gRNA(或编码gRNA的核酸)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括Cas9和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***，并且供体核酸是双链DNA分子，如质粒。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括Cas9和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中约1和约50之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，供体核酸是单链DNA寡核苷酸。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自是约20和约150之间(如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、和150中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸。
在一些实施方式中，提供了用于将修饰引入靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中异源核酸的***，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与下列缔合的细胞穿透肽：a)包括Cas9和gRNA的预成形复合物；和b)供体核酸。在一些实施方式中，修饰是长度大于约50个(如，大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸的异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是双链DNA分子。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自大于约300个(如，大于约300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸。
在一些实施方式中，提供了用于修饰一种或多种靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、和多种gRNAs(或编码所述多种gRNAs的一种或多种核酸)，其中所述多种gRNAs每一种各自包括不同的、与所述一种或多种靶多核苷酸中的一种靶多核苷酸的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ IDNOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑复合物包括与包括Cas9和所述多种gRNAs的预成形复合物缔合的细胞穿透肽。
在一些实施方式中，根据本文所述任何实施方式的基因组编辑复合物中包含的gRNA的指导序列与调节免疫应答中涉及的蛋白质(包括免疫检查点(immune checkpoint)调节子和抗原呈递中涉及的蛋白质)的编码基因中的靶序列互补。在一些实施方式中，根据本文所述任何实施方式的基因组编辑复合物中包含的gRNA的指导序列与调节胆固醇运输和/或代谢中涉及的蛋白质的编码基因中的靶序列互补。在一些实施方式中，指导序列与非限制地包括下列的蛋白质的编码基因中的靶序列互补：PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-1、TIM-3、TIM-4、BTLA、VISTA、LAG-3、CTLA-4、TIGIT、4-1BB、OX40、CD27、CD28、HVEM、GITR、ICOS、CD40、CD80、CD86、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、A2aR、toll样受体TLR-2、3、4、6、7、8、和9、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF、CD40L、FLT-3配体、细胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、和IL-35、FasL、TGF-β、吲哚胺-2,3二氧酶(IDO)、主要的组织相容性复合物(MHC)蛋白质——包括β-2微球蛋白(β2M)、低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)、载脂蛋白B(ApoB)、低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1)、和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9(PCSK9)。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何基因组编辑复合物，基因组编辑复合物进一步包括基因组编辑***分子以外的蛋白质、或编码该蛋白质的核酸分子(如DNA质粒或mRNA)。
在一些实施方式中，本文所述基因组编辑复合物的平均尺寸(直径)在约10nm和约10微米中的任一者之间，包括例如约30nm和约1微米之间、约50nm和约250nm之间、约50nm和约180nm之间、和约150nm和约200nm之间。在一些实施方式中，基因组编辑复合物在约10nm和约400nm之间。在一些实施方式中，基因组编辑复合物在约20nm和约400nm之间。在一些实施方式中，基因组编辑复合物在约30nm和约200nm之间。在一些实施方式中，基因组编辑复合物在约40nm和约200nm之间。在一些实施方式中，基因组编辑复合物在约40nm和约150nm之间。在一些实施方式中，基因组编辑复合物在约40nm和约100nm之间。在一些实施方式中，基因组编辑复合物是基本上无毒的。
在一些实施方式中，本文所述基因组编辑复合物的靶向部分使基因组编辑复合物靶向组织或特定细胞类型。在一些实施方式中，组织是需要治疗的组织。在一些实施方式中，靶向部分使基因组编辑复合物靶向可被基因组编辑***治疗的组织或细胞。
纳米颗粒
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种本文所述的基因组编辑复合物。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括多种基因组编辑复合物。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括以预定比例存在的多种基因组编辑复合物。在一些实施方式中，预定比例被选择以使纳米颗粒在下文更详细描述的任何方法中的应用最有效。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的细胞穿透肽、一种或多种另外的基因组编辑核酸酶、一种或多种另外的gNAs、和/或一种或多种另外的供体核酸。在一些实施方式中，一种或多种另外的细胞穿透肽不包括在所述一种或多种基因组编辑复合物中的任一者中找到的细胞穿透肽。在一些实施方式中，一种或多种另外的基因组编辑核酸酶不包括在所述一种或多种基因组编辑复合物中的任一者中找到的基因组编辑核酸酶。在一些实施方式中，一种或多种另外的gNAs不包括在所述一种或多种基因组编辑复合物中的任一者中找到的gNA。在一些实施方式中，一种或多种另外的供体核酸不包括在所述一种或多种基因组编辑复合物中的任一者中找到的供体核酸。在一些实施方式中，一种或多种另外的细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，一种或多种另外的细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)和基因组编辑酶(或编码基因组编辑酶的核酸)，如核酸酶或整合酶。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的基因组编辑酶的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的基因组编辑酶的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑酶是选自ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN的核酸酶。在一些实施方式中，基因组编辑酶是Cas9。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种gRNAs或gDNAs(或编码所述一种或多种gRNAs或gDNAs的一种或多种核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑酶是整合酶。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、和gRNA(或编码gRNA的核酸)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；和/或b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA的摩尔比，在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；和/或b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于第二复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一或第二复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、DGEN(或编码DGEN的核酸)、和gDNA(或编码gDNA的核酸)，其中gDNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括DGEN和gDNA的预成形复合物(DGEN/gDNA复合物)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与DGEN缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gDNA缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，DGEN是NgAgo。在一些实施方式中，纳米颗粒中DGEN与gDNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中DGEN与gDNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的DGEN；和/或b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gDNA的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的DGEN；和/或b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gDNA的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的gDNAs，该另外的gDNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的gDNAs中的至少一种存在于预成形的DGEN/gDNA复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gDNAs中的至少一种存在于第二复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gDNAs中的至少一种存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的DGEN/gDNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一或第二复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)和包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)，其中所述一种或多种细胞穿透肽中至少一种与预成形的RGEN/gRNA复合物缔合，并且其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的预成形RGEN/gRNA复合物中的RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的预成形RGEN/gRNA复合物中的RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于第二复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一或第二复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)；第一复合物，该第一复合物包括与RGEN(或编码RGEN的核酸)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA(或编码gRNA的核酸)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，a)第一复合物中细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；和/或b)第二复合物中细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，a)第一复合物中细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；和/或b)第二复合物中细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于第二复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一或第二复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽、预成形的RGEN/gRNA复合物、和供体核酸的三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***，并且供体核酸是双链DNA分子，如质粒。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA；和/或c)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的供体核酸的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA；和/或c)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的供体核酸的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于第二复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一或第二复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽、预成形的RGEN/gRNA复合物、和供体核酸的三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中约1和约50之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，供体核酸是单链DNA寡核苷酸。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自是约20和约150之间(如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、和150中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA；和/或c)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的供体核酸的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA；和/或c)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的供体核酸的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于第二复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一或第二复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中异源核酸的***。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽、预成形的RGEN/gRNA复合物、和供体核酸的三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是长度大于约50个(如，大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸的异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是双链DNA分子。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自大于约300个(如，大于约300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，gRNA是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，gRNA是包括指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA；和/或c)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的供体核酸的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA；和/或c)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的供体核酸的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于第二复合物中。在一些实施方式中，一种或多种另外的gRNAs中的至少一种存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一或第二复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰一种或多种靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括一种或多种细胞穿透肽(例如，VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)、RGEN(或编码RGEN的核酸)、和多种gRNAs(或编码所述多种gRNAs的一种或多种核酸)，其中所述多种gRNAs每一种各自包括不同的、与所述一种或多种靶多核苷酸中的一种靶多核苷酸的靶序列互补的指导序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和所述多种gRNAs中至少一种gRNAs的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，预成形的RGEN/gRNA复合物包括所述多种gRNAs中的每一种gRNAs。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽；和一种或多种如下复合物：每种复合物包括与所述多种gRNAs中的至少一种gRNAs缔合的、所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽。在一些实施方式中，一种或多种复合物是包括所述多种gRNAs中的每一种gRNA的第二复合物。在一些实施方式中，在纳米颗粒中所述一种或多种细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，多种gRNAs每一种均是包括融合于辅助反式激活crRNA(tracrRNA)的决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方式中，多种gRNAs每一种均是包括gRNA指导序列、tracr配偶序列、tracr序列和尾部序列的sgRNA。在一些实施方式中，RGEN是Cas9或Cpf1。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；和/或b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，a)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的RGEN；和/或b)纳米颗粒中存在的复合物中的细胞穿透肽与该细胞穿透肽缔合的gRNA的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，供体核酸存在于预成形的RGEN/gRNA复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物或所述一种或多种复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括所述一种或多种细胞穿透肽中的一种细胞穿透肽的另外的复合物中。在一些实施方式中，靶多核苷酸的编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸的非编码序列被修饰。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽和基因组编辑酶(或编码基因组编辑酶的核酸)，其中细胞穿透肽与基因组编辑酶缔合，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑酶是选自ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN的核酸酶。在一些实施方式中，基因组编辑酶是Cas9。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑酶是整合酶。在一些实施方式中，纳米颗粒核芯进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、和gRNA(或编码gRNA的核酸)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽和包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)，其中细胞穿透肽与预成形的RGEN/gRNA复合物缔合，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽；第一复合物，该第一复合物包括与RGEN(或编码RGEN的核酸)缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA(或编码gRNA的核酸)缔合的细胞穿透肽，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ IDNOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽、和包括与供体核酸缔合的细胞穿透肽的单独复合物。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括细胞穿透肽、预成形的RGEN/gRNA复合物、和供体核酸的三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***，并且供体核酸是双链DNA分子，如质粒。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ IDNOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽、和包括与供体核酸缔合的细胞穿透肽的单独复合物。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括细胞穿透肽、预成形的RGEN/gRNA复合物、和供体核酸的三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中约1和约50之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，供体核酸是单链DNA寡核苷酸。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自是约20和约150之间(如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、和150中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中异源核酸的***，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和gRNA的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽、和包括与供体核酸缔合的细胞穿透肽的单独复合物。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括细胞穿透肽、预成形的RGEN/gRNA复合物、和供体核酸的三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是长度大于约50个(如，大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸的异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是双链DNA分子。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自大于约300个(如，大于约300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰一种或多种靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、RGEN(或编码RGEN的核酸)、和多种gRNAs(或编码所述多种gRNAs的一种或多种核酸)，其中所述多种gRNAs每一种各自包括不同的、与所述一种或多种靶多核苷酸中的一种靶多核苷酸的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括RGEN和所述多种gRNAs中至少一种gRNAs的预成形复合物(RGEN/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，预成形的RGEN/gRNA复合物包括所述多种gRNAs中的每一种gRNAs。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的细胞穿透肽；和一种或多种如下复合物：每种复合物包括与所述多种gRNAs中的至少一种gRNAs缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，一种或多种复合物是包括所述多种gRNAs中的每一种gRNA的第二复合物。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、和gRNA(或编码gRNA的核酸)，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括Cas9和gRNA的预成形复合物(Cas9/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与RGEN缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽和包括Cas9和gRNA的预成形复合物(Cas9/gRNA复合物)，其中细胞穿透肽与预成形的Cas9/gRNA复合物缔合，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽；第一复合物，该第一复合物包括与Cas9(或编码Cas9的核酸)缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA(或编码gRNA的核酸)缔合的细胞穿透肽，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ IDNOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括Cas9和gRNA的预成形复合物(Cas9/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽、和包括与供体核酸缔合的细胞穿透肽的单独复合物。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括细胞穿透肽、预成形的Cas9/gRNA复合物、和供体核酸三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与Cas9缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且供体核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***，并且供体核酸是双链DNA分子，如质粒。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ IDNOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括Cas9和gRNA的预成形复合物(Cas9/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽、和包括与供体核酸缔合的细胞穿透肽的单独复合物。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括细胞穿透肽、预成形的Cas9/gRNA复合物、和供体核酸三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与Cas9缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是靶多核苷酸中约1和约50之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸的添加、缺失、或取代。在一些实施方式中，供体核酸是单链DNA寡核苷酸。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自是约20和约150之间(如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、和150中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)个核苷酸。
在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、gRNA(或编码gRNA的核酸)、和用于将特定修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，并且修饰是靶核酸中异源核酸的***，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括Cas9和gRNA的预成形复合物(Cas9/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽、和包括与供体核酸缔合的细胞穿透肽的单独复合物。在一些实施方式中，供体核酸存在于包括细胞穿透肽、预成形的Cas9/gRNA复合物、和供体核酸三元复合物中。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与Cas9缔合的细胞穿透肽；和第二复合物，该第二复合物包括与gRNA缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，供体核酸存在于第一复合物中。在一些实施方式中，供体核酸存在于第二复合物中。在一些实施方式中，修饰是长度大于约50个(如，大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸的异源核酸的***。在一些实施方式中，供体核酸是双链DNA分子。供体核酸包括与5’靶同源区同源的5’同源臂，该5’靶同源区包括修饰邻近的并且5’侧的靶多核苷酸部分；和与3’靶同源区同源的3’同源臂，该3’靶同源区包括修饰邻近的并且3’侧的靶多核苷酸部分。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区与靶序列中的至少约1个(如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或更多中的任一者)核苷酸重叠。在一些实施方式中，5’靶同源区和/或3’靶同源区在距靶序列约1000个(如，约1000、500、400、300、200、100、75、50、25、20、15、10、5、或1中的任一者之内)核苷酸之内。在一些实施方式中，5’同源臂和3’同源臂的长度每一个各自大于约300个(如，大于约300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)核苷酸。
在一些实施方式中，提供了用于修饰一种或多种靶多核苷酸的纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括细胞穿透肽、Cas9(或编码Cas9的核酸)、和多种gRNAs(或编码所述多种gRNAs的一种或多种核酸)，其中所述多种gRNAs每一种各自包括不同的、与所述一种或多种靶多核苷酸中的一种靶多核苷酸的靶序列互补的指导序列，并且其中细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括与包括Cas9和所述多种gRNAs中的至少一种gRNAs的预成形复合物(Cas9/gRNA复合物)缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，预成形的Cas9/gRNA复合物包括所述多种gRNAs中的每一种gRNAs。在一些实施方式中，纳米颗粒的核芯包括第一复合物，该第一复合物包括与Cas9缔合的细胞穿透肽；和一种或多种如下复合物：每种复合物包括与所述多种gRNAs中的至少一种gRNAs缔合的细胞穿透肽。在一些实施方式中，一种或多种复合物是包括所述多种gRNAs中的每一种gRNA的第二复合物。
在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括表面层包括包围核芯的外周CPP。在一些实施方式中，外周CPP与核芯中的CPP相同。在一些实施方式中，外周CPP与核芯中的任何CPP不同。在一些实施方式中，外周CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，外周CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽。在一些实施方式中，表面层中的外周细胞穿透肽中的至少一些被连接于靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括在纳米颗粒核芯与表面层之间的中间层。在一些实施方式中，中间层包括中间CPP。在一些实施方式中，中间CPP与核芯中的CPP相同。在一些实施方式中，中间CPP与核芯中的任何CPP不同。在一些实施方式中，中间CPP包括，但不限于，PTD系肽、两亲性肽、聚精氨酸系肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(如VEPEP-3、VEPEP-6、或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。在一些实施方式中，中间CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽。
在一些实施方式中，根据本文所述任何实施方式的纳米颗粒中包含的gRNA或gDNA的指导序列与调节免疫应答中涉及的蛋白质(包括免疫检查点调节子和抗原呈递中涉及的蛋白质)的编码基因中的靶序列互补。在一些实施方式中，根据本文所述任何实施方式的纳米颗粒中包含的gRNA或gDNA的指导序列与调节胆固醇运输和/或代谢中涉及的蛋白质的编码基因中的靶序列互补。在一些实施方式中，指导序列与非限制地包括下列的蛋白质的编码基因中的靶序列互补：PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-1、TIM-3、TIM-4、BTLA、VISTA、LAG-3、CTLA-4、TIGIT、4-1BB、OX40、CD27、CD28、HVEM、GITR、ICOS、CD40、CD80、CD86、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、A2aR、toll样受体TLR-2、3、4、6、7、8、和9、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF、CD40L、FLT-3配体、细胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、和IL-35、FasL、TGF-β、吲哚胺-2,3二氧酶(IDO)、主要的组织相容性复合物(MHC)蛋白质——包括β-2微球蛋白(β2M)、LDLR、ApoB、LDLRAP1、和PCSK9。
在一些实施方式中，根据本文描述的任何纳米颗粒，纳米颗粒进一步包括基因组编辑***分子以外的蛋白质、或编码该蛋白质的核酸分子(如DNA质粒或mRNA)。
在一些实施方式中，根据本文描述的任何纳米颗粒，纳米颗粒的平均尺寸(直径)是约10nm至约400nm，包括例如约50nm至约200nm、约60nm至约180nm、约80nm至约140nm、和约90nm至约120nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均尺寸(直径)不大于约1000纳米(nm)，如不大于约900、800、700、600、500、400、300、200、或100nm中的任一者。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均(average或mean)直径不大于约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径不大于约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径不大于约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径是约10nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径是约20nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径是约30nm至约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径是约40nm至约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径是约40nm至约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径是约40nm至约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒是可无菌过滤的。
在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电位是约-30mV至约60mV(如，约-30、-25、-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、和60mV中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电位是约-30mV至约30mV，包括例如约-25mV至约25mV、约-20mV至约20mV、约-15mV至约15mV、约-10mV至约10mV、和约-5mV至约10mV。在一些实施方式中，纳米颗粒的多分散指数(PI)是约0.05至约0.6(如，约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、和0.6中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒是基本上无毒的。
货物
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的基因组编辑***分子(例如，RGEN)是蛋白质或多肽。例如，在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括RGEN(例如，Cas9)。在一些实施方式中，该蛋白质或多肽在约10kDa和约200kDa之间(如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、和200kDa中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括多种蛋白质或多肽，其中所述多种蛋白质或多肽每一种均在约10kDa和约200kDa之间(如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、和200kDa中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的基因组编辑***分子(例如，gRNA)是核酸。在一些实施方式中，该核酸在约20nt和约20kb之间(如，约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、和20kb中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。例如，在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括gRNA(例如，Cas9 gRNA)。在一些实施方式中，gRNA在约20nt和约200nt之间(如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、和200nt中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，核酸是DNA，如编码基因组编辑***分子的DNA质粒。在一些实施方式中，DNA质粒包括用于表达基因组编辑***分子的表达盒。在一些实施方式中，DNA质粒在约1kb和约20kb之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、和20kb中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，核酸是RNA，如编码基因组编辑***分子的mRNA。在一些实施方式中，mRNA在约100nt和约10kb之间(如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、和10kb中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括多种核酸，如本文描述的任何核酸。例如，在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括gRNA和编码基因组编辑***分子的核酸(例如，编码基因组编辑***分子的DNA质粒或mRNA)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括编码多种基因组编辑***分子的核酸(例如，编码所述多种基因组编辑***分子的一种或多种DNA质粒、或编码所述多种基因组编辑***分子的多种mRNAs)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的基因组编辑***分子(例如，RGEN或gRNA)被替换为编码该基因组编辑***分子的核酸。例如，在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括编码RGEN的核酸和/或编码gRNA的核酸。在一些实施方式中，核酸是DNA，如编码基因组编辑***分子的DNA质粒。在一些实施方式中，DNA质粒包括用于表达基因组编辑***分子的表达盒。在一些实施方式中，DNA质粒在约1kb和约20kb之间(如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、和20kb中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，核酸是RNA，如编码基因组编辑***分子的mRNA。在一些实施方式中，mRNA在约100nt和约10kb之间(如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、和10kb中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指代任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包括修饰核苷酸，如甲基化核苷酸和其类似物。本文所用的术语“核酸”指代单链或双链形式的包含至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。DNA可以是下列形式：例如，反义分子、质粒DNA、缩合前DNA、PCR产物、载体(PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或这些基团的衍生物和组合。RNA可以是下列形式：siRNA、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、RNA、病毒RNA(vRNA)、和其组合。核酸包括包含已知的核苷酸类似物或被修饰的骨架残基或键合的核酸——包括例如锁核酸(LNA)、解锁核酸(unlocked nucleic acid，UNA)、和拉链核酸(ZNA)，其可以是合成的、天然存在的、和非天然存在的，并且与参考核酸具有相似的结合性质。这种类似物的实例非限制地包括硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、和肽-核酸(PNAs)。除非特别指出，该术语包括包含与参考核酸具有相似的结合性质的、天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另有说明，具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、同源物(同源基因，orthologs)、SNPs、和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成这样的序列来实现：其中一个或多个被选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer eal.,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka et a.,j.Biol.Chern.,260:2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基、和磷酸基。核苷酸通过磷酸基连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然类似物、以及合成的嘌呤和嘧啶衍生物，其包括但不限于，安排新反应性基团——如但不限于胺、醇、硫醇、羧化酶、和烷基卤化物——的修饰。本文所用的“寡核苷酸”总体上指代短的、通常合成的、长度通常但不一定小于约200核苷酸的多核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排除的。以上关于多核苷酸的描述同等并且完全适用于寡核苷酸。
在一些实施方式中，核酸是单链寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸是双链寡核苷酸。本文描述的核酸可以是上至(但不是一定)200个核苷酸(在反义寡核苷酸、RNAi、siRNA、shRNA、iRNA、antagomirs的情况下)或上至100万个碱基(在质粒DNA的情况下)的长度范围中的任一者。
在一些实施方式中，核酸是质粒DNA或DNA片段(例如上至约1000bp长度的DNA片段)。另外，质粒DNA或DNA片段可以是高甲基化的或低甲基化的。在一些实施方式中，质粒DNA或DNA片段编码一个或多个基因，并且可包含表达所述一个或多个基因所需的调节元件。在一些实施方式中，质粒DNA或DNA片段可包括编码可选择的标志物的一个或多个基因，实现质粒DNA或DNA片段在适当宿主细胞中的维持(maintenance)。
修饰
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括靶向部分，其中靶向部分是能够进行细胞特异性和/或核靶向的配体。细胞膜表面受体和/或细胞表面标志物是可以高亲和力和优选高特异性结合所述配体的分子或结构。所述细胞膜表面受体和/或细胞表面标志物优选是具体细胞特异性的，即，其主要在一种类型的细胞中，而不在其它类型的细胞中，被发现(例如，半乳糖基残基，靶向肝细胞表面上的无唾液酸糖蛋白受体)。细胞膜表面受体促进配体(例如，靶向部分)和附接分子(例如，本发明的复合物或纳米颗粒)的细胞靶向和在靶细胞中的内化。大量在本发明环境下可用的配体部分/配体结合伴侣(binding partner)被广泛描述于文献中。这种配体部分能够赋予本发明的复合物或纳米颗粒以结合定位于至少一种靶细胞的表面的给定结合伴侣分子或结合伴侣分子类的能力。适当的结合伴侣分子无限制地包括选自细胞特异性标志物、组织特异性标志物、细胞受体、病毒抗原、抗原表位和肿瘤相关标志物的多肽。结合伴侣分子可此外由下列组成或包括下列：例如，一种或多种糖、脂质、糖脂、抗体分子或其片段、或适体(aptamer)。根据本发明，配体部分可以是例如脂质、糖脂、激素、糖、聚合物(例如，PEG、聚赖氨酸、PET)、寡核苷酸、维生素、抗原、凝集素的全部或部分、多肽的全部或部分——如例如JTS1(WO 94/40958)、抗体或其片段、或其组合。在一些实施方式中，用于本发明的配体部分是最小长度为7个氨基酸的肽或多肽。其是天然多肽或从天然多肽衍生的多肽。“衍生”意为包含(a)关于天然序列的一个或多个修饰(例如，一个或多个残基的添加、缺失和/或取代)；(b)氨基酸类似物，包括非天然存在的氨基酸；(c)取代键合；或(d)本领域已知的其它修饰。充当配体部分的多肽包括通过融合不同来源的序列而获得的变体和嵌合多肽，如例如，组合了小鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区的人源化抗体。另外，这种多肽可具有线性或环化结构(例如，通过在两端通过半胱氨酸残基侧接多肽配体)。另外，用作配体部分的多肽可包括通过化学部分的取代或添加对其原始结构的修饰(例如，糖基化、烷基化、乙酰化、酰胺化、磷酸化、巯基添加和类似方式)。本发明进一步考虑赋予配体部分可检测性的修饰。为此，可设想具有可检测部分的修饰(即，闪烁性、放射性、或荧光性部分、或染料标记和类似物)。这种可检测标记可通过任何常规技术被附接至配体部分，并且可被用于诊断性目的(例如，肿瘤细胞成像)。在一些实施方式中，结合伴侣分子是抗原(例如，靶细胞特异性抗原、疾病特异性抗原、在工程化靶细胞的表面上被特异性表达的抗原)，并且配体部分是抗体、其片段或最小识别单元(例如，仍呈现抗原特异性的片段)，如免疫学手册中详细描述的那些(参见例如Immunology,1993年第三版,Roitt,Brostoff and Male,ed Gambli,Mosby)。配体部分可以是单克隆抗体。结合这些抗原中的多种抗原的多种单克隆抗体是已知的，并且利用单克隆抗体技术相关领域已知的技术，大多数抗原的抗体可被制备。配体部分可以是部分抗体(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如，ScFv)。在一些实施方式中，配体部分从抗体片段中，而非从全抗体中选择。全抗体的有效功能，如补体结合，被去除。ScFv和dAb抗体片段可作为与一种或多种其它多肽的融合物被表达。最小识别单元可衍生自Fv片段的一个或多个互补决定区(CDR)的序列。全抗体和F(ab')2片段是“二价”的。“二价”意为所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相比之下，Fab、Fv、ScFv、dAb片段和最小识别单元是单价的，仅具有一个抗原结合位点。在一些实施方式中，配体部分允许靶向肿瘤细胞并且能够识别和结合肿瘤状态相关的分子，如肿瘤特异性抗原、在肿瘤细胞中差异性或过度表达的细胞蛋白质或癌症相关vims的基因产物。肿瘤特异性抗原的实例包括但不限于与乳腺癌相关的MUC-1(Hareuven i et al.,990,Eur.J.Biochem 189,475-486)、与乳腺癌和卵巢癌相关的突变BRCAl和BRCA2基因编码的产物(Miki et al,1994,Science 226,66-7 1；Fuireal et al,1994,Science 226,120-122；Wooster et al.,1995,Nature 378,789-792)、与结肠癌相关的APC(Poiakis,1995,Curr.Opin.Genet.Dev.5,66-71)、与***癌相关的***特异性抗原(PSA)(Stamey et al.,1987,New England J.Med.317,909)、与结肠癌相关的癌胚胎抗原(CEA)(Schrewe et al.,1990,Mol.Cell.Biol.10,2738-2748)、与黑素瘤相关的酪氨酸酶(Vile et al,1993,Cancer Res.53,3860-3864)、在黑素瘤细胞中高度表达的黑素细胞刺激激素受体(MSH)、与乳腺癌和胰腺癌相关的ErbB-2(Harris et al.,1994,GeneTherapy 1,170-175)、和与肝癌相关的α-胎蛋白(Kanai et al.,1997,Cancer Res.57,461-465)。在一些实施方式中，配体部分是能够识别和结合MUC-1抗原并因此靶向MUC-1阳性肿瘤细胞的抗体片段。在一些实施方式中，配体部分是识别MUC-1抗原的串联重复区的SM3单克隆抗体的scFv片段(Burshell et al.,1987,Cancer Res.47,5476-5482；Girling etal.,1989,Int.J.Cancer 43,1072-1076；Dokurno et al.,1998,J.Mol.Biol.284,713-728)。在肿瘤细胞中差异性或过度表达的细胞蛋白质的实例包括但不限于在一些淋巴肿瘤中过表达的白介素2(IL-2)受体、在肺癌细胞、胰腺肿瘤、***肿瘤和胃肿瘤中过表达的GRP(胃泌素释放肽)(Michael et al.,1995,Gene Therapy 2,660-668)、TNF(肿瘤坏死因子)受体、表皮生长因子受体、Fas受体、CD40受体、CD30受体、CD27受体、OX-40、α-v整合蛋白(Brooks et al,994,Science 264,569)和某些血管生成生长因子的受体(Hanahan,1997,Science 277,48)。基于这些说明，限定适当的能够识别和结合这种蛋白质的配体部分是在本领域技术人员的能力范围内的。为进行示例，IL-2是结合TL-2受体的适宜配体部分。在纤维化和炎症特异性受体的情况下，这些包括上文鉴定的并且属于本发明组合物的适宜靶标的TGFβ受体或腺苷受体。多发性骨髓瘤的细胞表面标志物包括，但不限于，CD56、CD40、FGFR3、CS1、CD138、IGF1R、VEGFR、和CD38、并且是本发明组合物的适宜靶标。结合这些细胞表面标志物的适宜配体部分包括，但不限于，抗CD56、抗CD40、PRO-001、Chir-258、HuLuc63、抗CD138-DM1、抗IGF1R和贝伐单抗(bevacizumab)。
靶标
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括靶向一个或多个基因的一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)，该基因包括，但不限于，腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酰环化酶、Akt、ALK、ALK/Met、血管生成素受体、血管紧张素II、APC、AR、ARK5、抑制蛋白、ATF1、ATF-2、B7-1、B7-h1(pdl-1)、β-联蛋白、Bcl-2、BCL2L12、Bcl6、Bcr-Abl、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTK、半胱天冬蛋白酶-2、半胱天冬蛋白酶-9、CCL2、CCN1、Ccnd2、CDK活化激酶、CEBPA、Chop、c-Jun、c-Myc、CREB、CREB1、CS1、CTGF、CTNNB1、CXCR4、Cyclin d1-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、DEPTOR、DNMT3B、DPC4、EBOV聚合酶L、EGF、EGFR、eIF5A、Elk-1、ER、Erbb4、ERK、ESR1、Ets1、EWSR1、FAK、FGF、FGFR、FOXO1、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、Fyn、GATA1、GATA3、GLI1、GM-CSF、GP/sGP、GSK、HBV保守序列、HDACs、HDGF、HDGFR、Her2、Her3、Hexo激酶II、HGF、HGFR、HIF-1、HIF-1α、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、HIV TAR RNA、HIV Tat、HLA-B7/β2-微球蛋白、HMGA2、HNF1A、HNF1B、Hsp27、HSP47、人CCR5、Idh1、Idh2、IGF、IGFR、IKK、IKZF1、IL-12、IL-2、INK4、干扰素-γ、IRF1、IRF4、JAK、JNK、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白K6A、角蛋白K6B、KGFR、KLF6、KRAS、LMO、LMO1、LMP2、LMP7、LOXL2、LPL、LYL1、MADR2、MAPK、Max、Mcl-1、MDA-7、MDM2、MDR-1、MDS1-EVI1、MECL-1、MEF2C、MEK、MEKK、MKK、MLH1、MLST8、MMP-2、MMP-9、MSFR、MSH2、MSH6、MSIN1、mTOR、MUC-1、突变体DDX3X、MYC、NCAP-D2、NCAP-D3、NCAP-G、NCAP-G2、NCAP-H、NCAP-H2、NF1、NF2、NFAT4、NF-κB、Notch1、NPC1、NR4A3、NRAS、Olig2、骨桥蛋白、p53、PAI-1、PARP-1、patched、PAX3、PAX5、PAX7、PBX1、PDCD4、PDGF、PDGFR、PDK1、PHOX2B、PI3K、PKA、PKC、PKN3、PLK-1、PML、PR、PRAS40、PRDM16、Prdx1和Prdx2(burkitts淋巴瘤)、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S、PTC、PTEN、Pyk2、Rad51、RAF、Raptor、Rb、RET、Rictor、RPN13、RRM2、RSV核衣壳、RUNX1、S6激酶、Sap1a、SETBP1、Shc、SLAMF7、Smad、Smad 3、Smad 4、Smad 7、SMC-2、SMC-4、smoothened、SOX9、SPARC、Spry2、Src、β-2肾上腺素受体(ADRB2)、β-珠蛋白、STAT5B、STATs、免死蛋白、Syk、Tal、TAL1、TGFR、TGF-α、TGF-β、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、TGFβ1、血小板反应蛋白、胸苷激酶、TIM-1、TIMP、TNF-α、TP53、甲状腺素运载蛋白、TRPV1、泛素连接酶、uPAR、VEGF、VEGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VHL、VP24、VP30、VP35、VP40、wnt、WT1、WT2、XBP1(剪接型和未剪接型)、XIAP、和ZBTB16，包括其突变体(例如，突变体PTEN、突变体KRAS、突变体p53、和类似物)。例如，在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种RGEN系基因组编辑***分子(例如，CRISPR/Cas9基因组编辑***)，其中RGEN系基因组编辑***包括靶向本文所述基因中的一种基因的gRNA。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种DGEN系基因组编辑***分子，其中DGEN系基因组编辑***包括靶向本文所述基因中的一种基因的gDNA。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种ZFN系基因组编辑***分子，其中ZFN靶向本文所述基因中的一种基因。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种TALEN系基因组编辑***分子，其中TALEN靶向本文所述基因中的一种基因。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种归巢核酸内切酶系基因组编辑***分子，其中归巢核酸内切酶靶向本文所述基因中的一种基因。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种整合酶系基因组编辑***分子，其中整合酶靶向本文所述基因中的一种基因。
核酸指导的核酸内切酶
在一些实施方式中，核酸指导的核酸内切酶是CRISPR相关核酸酶。总体上，CRISPRs(成簇规律间隔短回文重复)，也被称为SPIDRs(间隔序列介入性同向重复(SPacerInterspersed Direct Repeats))，构成通常是具体细菌物种特异性的一类DNA部位。CRISPR部位包括在大肠杆菌(E.coli)中被识别的一类独特的穿插短序列重复(SSRs)(Ishino et al.,J.Bacteriol.,169:5429-5433[1987]；和Nakata et al.,J.Bacteriol.,171:3553-3556[1989])和相关基因。相似的穿插SSRs已在地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鱼腥藻属(Anabaena)、和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中被识别(参见Groenen et al.,Mol.Microbiol.,10:1057-1065[1993]；Hoe et al.,Emerg.Infect.Dis.,5:254-263[1999]；Masepohl etal.,Biochim.Biophys.Acta 1307:26-30[1996]；和Mojica et al.,Mol.Microbiol.,17:85-93[1995])。CRISPR部位一般与其它SSRs的区别在于重复(已被称为短规律间隔重复(SRSRs))的结构(Janssen et al.,OMICS J.Integ.Biol.,6:23-33[2002]；和Mojica etal.,Mol.Microbiol.,36:244-246[2000])。总体上，重复是成簇存在的、被长度基本恒定的独特介入序列规律隔开的短元件(Mojica et al.,[2000]，出处同上)。虽然重复序列是菌种之间高度保守的，但穿插的重复和间隔区序列的数量一般是菌种与菌种之间不同的(vanEmbden et al.,J.Bacteriol.,182:2393-2401[2000])。CRISPR部位已在多于40种原核生物中被识别(参见例如Jansen et al.,Mol.Microbiol.,43:1565-1575[2002]；和Mojicaet al.,[2005])，包括但不限于气火菌属(Aeropyrum)、火棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌(Sulfolobus)、古球状菌属(Archaeoglobus)、嗜盐小盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、火球菌属(Pyrococcus)、Picrophilus、rmoplasma、棒状杆菌(Corynebacterium)、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、产液菌属(Aquifex)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、杆菌(Bacillus)、利斯特菌(Listeria)、葡萄球菌(Staphylococcus)、梭菌(Clostridium)、高温厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Azarcus、色素细菌(Chromobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、Geobacter、粘球菌属(Myxococcus)、弯曲菌(Campylobacter)、沃林氏菌属(Wolinella)、不动细菌属(Acinetobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、军团杆菌(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、发光菌(Photobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia)、密螺旋体(Treponema)、和栖热孢菌属(Thermotoga)。
总体上，“CRISPR***”统一指代CRISPR相关(“Cas”)核酸酶(如RNA指导的核酸内切酶、或“RGENs”)活性涉及的蛋白质、转录物和其它分子，包括Cas基因产物、Cas基因序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-配偶序列(包括“同向重复”和tracrRNA加工的部分同向重复——在内源CRISPR***环境下)、指导序列(在内源CRISPR***环境下也被称为“间隔序列”)、或衍生自CRISPR部位的其它序列、转录物、和产物。在一些实施方式中，一种或多种CRISPR***分子衍生自I型、II型、或III型CRISPR***。在一些实施方式中，一种或多种CRISPR***分子衍生自包括内源CRISPR***的具体生物体，如酿脓链球菌。总体上，CRISPR***的特征在于促进CRISPR复合物在靶序列(在内源CRISPR***环境下也被称为前间隔序列)位点处形成的分子。在CRISPR复合物形成的环境下，“靶序列”指代这样的序列：指导序列被设计与之具有互补性——其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物形成。完全互补性不是必需的——如果互补性足以引起杂交和促进CRISPR复合物形成。靶序列可包括任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方式中，靶序列存在于中细胞的核或细胞质中。在一些实施方式中，靶序列可处于真核细胞的细胞器中，例如，线粒体或叶绿体。可用于重组到包括靶序列的被靶向部位中的序列或模板被称为“编辑模板”、“编辑多核苷酸”、“编辑序列”、“供体序列”或“供体核酸”。在本发明的方面中，外源模板多核苷酸可被称为编辑模板。在本发明的一方面中，重组是同源重组。
一般，在内源CRISPR***环境下，CRISPR复合物(包括杂交至靶序列并与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致靶序列中或附近(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多碱基对之内)的一条链或两条链被切割。tracr序列——其可包括野生型tracr序列的全部或部分(例如，野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)或由之组成——也可形成CRISPR复合物的部分，如通过沿至少部分tracr序列与可操作地连接至指导序列的tracr配偶序列的全部或部分杂交。在一些实施方式中，tracr序列具有足以使tracr配偶序列杂交和参与CRISPR复合物形成的互补性。关于靶序列，认为不需要完全互补性，如果(互补性)足以发挥作用。在一些实施方式中，tracr序列在最佳对齐时沿tracr配偶序列长度具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。在一些实施方式中，一种或多种CRISPR***分子被引入宿主细胞，使得CRISPR复合物在一个或多个靶位点处的形成可发生。例如，Cas核酸酶、连接至tracr-配偶序列的指导序列、和tracr序列每一个均可被引入宿主细胞，以允许CRISPR复合物在宿主细胞中与指导序列互补的靶序列处形成。
Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(还被称为Csn1和Csx12)、Cas10、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、或其修饰形式，如诱导型、失活型、或脱落Cas蛋白(参见例如Dominguez et al.(2015).Nature Reviews Molecular Cell Biology；Polstein,L.R.,&Gersbach,C.A.(2015).Nature chemical biology,11(3):198-200；Dow et al.(2015).Nature biotechnology,33(4):390-394；Zetsche et al.(2015).Nature biotechnology,33(2):139-142；Kleinstiver et al.(2015).Nature.523:481–485；Bikard et al.(2013).Nucleic acidsresearch,41(15):7429-7437；Qi et al.(2013).Cell,152(5):1173-1183)。这些酶是本领域技术人员已知的；例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)CAS9蛋白的氨基酸序列可在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到，并且氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)Cpf1蛋白的氨基酸序列可在SwissProt数据库中以登录号U2UMQ6找到。在一些实施方式中，未修饰CRISPR酶具有DNA切割活性，如Cas9。在一些实施方式中，CRISPR酶是Cas9、并且可以是来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumoniae)的Cas9。在一些实施方式中，CRISPR酶是Cpf1，并且可以是来自氨基酸球菌或毛螺菌科(Lachnospiraceae)的Cpf1。在一些实施方式中，CRISPR酶引导在靶序列位置处一条链或两条链的切割，如在靶序列内和/或在靶序列的补体内。在一些实施方式中，CRISPR酶引导在距靶序列第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、或更多个碱基对内的、一条链或两条链的切割。在一些实施方式中，CRISPR酶被相对于相应的野生型酶突变，使得突变CRISPR酶不具有切割包含靶序列的靶多核苷酸的一条链或两条链的能力。例如，酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸的取代(D10A)使Cas9从切割双链的核酸酶转化成切口酶(切割单链)。致使Cas9成为切口酶的突变的其它实例非限制地包括H840A、N854A、和N863A。在一些实施方式中，Cas9切口酶可与指导序列组合使用，例如，分别靶向DNA靶的正义和反义链的两个指导序列。这种组合允许双链均被切口和用于引起NHEJ。
作为进一步实例，两种或更多种Cas9催化结构域(RuvC I、RuvC II、和RuvC III)可被突变以产生基本上不具有全部DNA切割活性的突变Cas9。在一些实施方式中，D10A突变与H840A、N854A、或N863A突变中的一种或多种组合，以产生基本上不具有全部DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施方式中，在突变酶的DNA切割活性相对于其非突变形式小于约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更低时，认为CRISPR酶基本上不具有全部DNA切割活性。其它突变可以是有用的；在Cas9或其它CRISPR酶来自酿脓链球菌以外的物种时，可进行相应氨基酸的突变以实现相似的效果。
在一些实施方式中，Cas蛋白(如Cas9)是脱落Cas蛋白，其包括N端Cas蛋白片段Cas(N)和C端Cas蛋白片段Cas(C)，其中Cas(N)融合于第一二聚结构域(dimerizationdomain)，并且Cas(C)融合于第二二聚结构域，并且其中第一和第二二聚结构域促进Cas(N)和Cas(C)二聚，以形成具有功能性Cas核酸酶活性的复合物。在一些实施方式中，第一和第二二聚结构域的二聚对二聚剂敏感。例如，在一些实施方式中，第一和第二二聚结构域包括FK506结合蛋白12(FKBP)和哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域，并且二聚剂是雷帕霉素(rapamycin)。
在一些实施方式中，编码CRISPR酶的酶编码序列是针对具体细胞如真核细胞中的表达优化的密码子。真核细胞可以属于或衍生自具体生物体，如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人灵长类。总体上，密码子优化指代为增强目标宿主细胞中的表达而修饰核酸序列的过程，该修饰通过下列进行：在维持天然氨基酸序列的同时，将天然序列的至少一个密码子(例如，约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、或更多个密码子)替换成更常或最常用于宿主细胞基因的密码子。各种物种呈现对具体氨基酸的某些密码子的特别偏好。密码子偏好(生物体之间的密码子使用差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率有关，其进而被认为取决于被翻译密码子的性质和具体转运RNA(tRNA)分子的可利用性。被选择的tRNAs在细胞中的占优总体上是最常用于肽合成的密码子的体现。因此，可基于密码子优化来修整基因，以在给定生物体中最佳基因表达。密码子使用表是可容易获得的，例如，在“密码子使用数据库(Codon Usage Database)”，并且这些表可以多种方式被采用。参见Nakamura,Y.,et al.“Codon usage tabulated from the international DNAsequence databases:status for the year 2000”Nucl.Acids Res.28:292(2000)。优化在具体宿主细胞中表达的具体序列的密码子计算机算法也是可获得的，如Gene Forge(Aptagen；Jacobus，Pa.)也是可获得的。在一些实施方式中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个或全部密码子)相应于具体氨基酸的最常用密码子。
在一些实施方式中，CRISPR酶包括一个或多个核定位序列(NLSs)，如约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个NLSs。在一些实施方式中，CRISPR酶包括在氨基端处或附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个NLSs，在羧基端处或附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个NLSs、或其组合(例如，在氨基端处的一个或多个NLS和在羧基端处的一个或多个NLS)。当多于1个NLS存在时，各NLS可彼此独立地被选择，使得单个NLS可在多于一个拷贝中存在，和/或与一个或多个其它NLSs组合在一个或多个拷贝中存在。在一些实施方式中，CRISPR酶包括至多6个NLSs。在一些实施方式中，当NLS的最近氨基酸在沿多肽链距N端或C端约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多个氨基酸之内时，认为NLS在N端或C端附近。一般，NLS由一个或多个、暴露于蛋白质表面上的带正电荷的赖氨酸或精氨酸的短序列组成，已知单其它类型的NLS。NLSs的非限制性实例包括衍生自下列的NLS序列：SV40病毒大T-抗原的NLS，具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO：83)；来自核质蛋白的NLS(例如，核质蛋白二分NLS，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO：84))；c-mycNLS，具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQ ID NO：85)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO：86)；hRNPA1M9 NLS，具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO：87)；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO：88)；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO：89)和PPKKARED(SEQ ID NO：90)；人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO：91)；小鼠c-ab1 IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO：92)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO：93)和PKQKKRK(SEQ ID NO：94)；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO：95)；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO：96)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO：97)；和聚合酶激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO：98)。
总体上，指导序列是与靶多核苷酸序列具有充分互补性以与靶序列杂交和引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方式中，在利用适当的对齐(比对，alignment)算法最佳对齐时，指导序列和其相应靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。最佳对齐可通过利用任何适于对齐序列的算法来确定，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如，Burrows Wheeler对齐器)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies,ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获得)、和Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。在一些实施方式中，指导序列的长度是约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26，27、28、29、30、35、40、45、50、75、或更多个核苷酸。在一些实施方式中，指导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12、或更少个核苷酸。指导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何适当的分析来评估。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR***组分——包括待测试的指导序列——可被提供给具有相应靶序列的宿主细胞，然后评估靶序列内的优先切割，如通过本文描述的Surveyor分析。类似地，靶多核苷酸序列的切割可在测试管中通过下列来评价：提供靶序列、CRISPR复合物组分——包括测试指导序列和不同于测试指导序列的对照指导序列；和比较测试和对照指导序列反应之间在靶序列处的结合或切割率。其它分析是可能的，并且将被本领域技术人员想到。
指导序列可被选择以靶向任何靶序列。在一些实施方式中，靶序列是细胞基因组中的序列。示例性靶序列包括靶基因组中独特的那些序列。在一些实施方式中，指导序列被选择以降低指导序列中二级结构的程度。二级结构可通过任何适当的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序基于计算最小吉布斯自由能。一种这种算法的实例是mFold，如Zuker和Stiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)所述。另一实例折叠算法是在线网络服务器RNA折叠，其在维也纳大学的理论化学研究所(Institute for TheoreticalChemistry at the University of Vienna)被开发，利用了质心结构预测算法(参见例如，A.R.Gruber et al.,2008,Cell 106(1):23-24；和P A Carr and G M Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62)。进一步算法可在美国申请序号61/836,080中找到；该申请通过引用被并入本文。
总体上，tracr配偶序列包括与tracr序列具有充分互补性以促进下列一项或多项的任何序列：(1)包含相应tracr序列的细胞中侧接tracr配偶序列的指导序列的切除；和(2)CRISPR复合物在靶序列处的形成，其中CRISPR复合物包括杂交至tracr序列的tracr配偶序列。总体上，互补程度参考tracr配偶序列和tracr序列沿这两序列中较短者的长度的最佳对齐。最佳对齐可通过任何适当的对齐算法确定，并且可进一步解释二级结构，如tracr序列或tracr配偶序列内的自互补性。在一些实施方式中，在最佳对齐时tracr序列和tracr配偶序列之间沿这两者中的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。在一些实施方式中，tracr序列的长度是约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、或更多个核苷酸。在一些实施方式中，指导序列、tracr序列和tracr配偶序列被包含在单RNA(在本文中被称为“单指导RNA”或“sgRNA”)中，使得tracr序列和tracr配偶序列之间的杂交产生二级结构，如发夹。用于发夹结构的优选成环序列的长度是4个核苷酸，并且最优选具有序列GAAA。然而，可使用更长或更短的环序列作为可选的序列。该序列优选包括核苷酸三联体(例如，AAA)，和另外的核苷酸(例如C或G)。成环序列的实例包括CAAA和AAAG。在本发明的实施方式中，sgRNA具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施方式中，sgRNA具有2、3、4或5个发夹。在本发明的进一步实施方式中，sgRNA具有至多5个发夹。在一些实施方式中，sgRNA进一步包括转录终止序列；优选地，这是多T(聚T，polyT)序列，例如6个T核苷酸。
在一些实施方式中，还提供供体核酸。在一些实施方式中，供体核酸被设计以在同源重组中充当模板，如在被CRISPR酶(作为CRISPR复合物的一部分)切开或切割的靶序列之内或附近。供体核酸可以具有任何适当的长度，如约或多于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、或更多个核苷酸的长度。在一些实施方式中，供体核酸包括与包括靶序列的多核苷酸的部分互补的序列。在一些实施方式中，当供体核酸和包括靶序列的多核苷酸最佳对齐时，供体核酸与靶序列的一个或多个核苷酸重叠(例如，约或多于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸)。在一些实施方式中，当供体核酸和包括靶序列的多核苷酸最佳对齐时，互补区域中供体核酸的最近核苷酸在距靶序列约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、或更多个核苷酸之内。
在一些实施方式中，CRISPR酶包括一个或多个异源蛋白质结构域(例如，在CRISPR酶以外约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个结构域)的融合蛋白的部分。CRISPR酶融合蛋白可包括任何另外的蛋白质序列和任选地，任意两个结构域之间键合序列。可融合于CRISPR酶的蛋白质结构域的实例非限制地包括表位标签、报告基因序列、和具有下列一个或多个活性的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽S转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、和自体荧光蛋白——包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可融合于编码如下蛋白质或蛋白质片段的基因序列：结合DNA分子或结合其它细胞分子，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体、GAL4 DNA结合结构域融合体、和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可构成包括CRISPR酶的融合蛋白的部分的其它结构域被描述于US20110059502，其通过引用被并入本文。在一些实施方式中，带标签的CRISPR酶被用于识别靶序列的位置。
ZFPs和ZFNs；TALs、TALEs、和TALENs
在一些实施方式中，基因组编辑***包括DNA结合蛋白，如一个或多个锌指蛋白(ZFP)或转录激活因子样蛋白质(TAL)，该DNA结合蛋白融合于效应物蛋白，如核酸内切酶(或编码DNA结合蛋白/效应物蛋白融合体的核酸)。实例包括ZFNs、TALEs、和TALENs。参见Lloyd et al.,Fronteirs in Immunology,4(221),1-7(2013)。
ZFPs和ZFNs
在一些实施方式中，基因组编辑***包括以序列特异性方式结合DNA的一个或多个锌指蛋白(ZFPs)或其结构域。ZFP或其结构域是较大蛋白质中通过一个或多个锌指(结合结构域中的氨基酸序列区域，其结构通过锌离子的配位而稳定化)以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或结构域。术语锌指DNA结合蛋白通常被简称为锌指蛋白或ZFP。
在ZFPs中，人工ZFP结构域靶向特定DNA序列，一般9-18个核苷酸长，通过组装各个指(fingers)而生成。
ZFPs包括这样的ZFPs：其中单个指结构域长度是大约30个氨基酸并且包含α螺旋——该α螺旋包含通过锌与单个β转角的两个半胱氨酸配位的两个不变组氨酸残基，并且具有2、3、4、5或6个指。总体上，ZFP的序列特异性可通过如下被改变：在锌指识别螺旋上的4个螺旋位置(-1、2、3和6)处进行氨基酸取代。因此，在一些实施方式中，ZFP或包含ZFP的分子是非天然存在的，例如，被工程化以结合选择的靶位点。参见例如，Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，其整体全部通过引用被并入本文。
在一些实施方式中，基因组编辑***包括锌指DNA结合结构域，该锌指DNA结合结构域融合于DNA切割结构域以形成锌指核酸酶(ZFN)。在一些实施方式中，融合蛋白包括来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)、和一个或多个锌指结合结构域，该锌指结合结构域可以是或可以不是工程化的。在一些实施方式中，切割结构域来自IIS型限制核酸内切酶Fok I。Fok I总体上催化DNA的双链切割——在一条链上距其识别位点9个核苷酸处和在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处。参见例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim et al.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim et al.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。
在一些实施方式中，ZFNs靶向靶细胞中存在的基因。在一些方面中，ZFNs有效地产生双链断裂(DSB)，例如在基因编码区中的预定位点。一般的被靶向区域包括外显子、编码N端区域的区域、第一外显子、第二外显子、和启动子或增强子区域。在一些实施方式中，ZFNs的瞬时表达促进靶细胞中靶基因的高效和永久中断。具体地，在一些实施方式中，ZFNs的递送导致基因永久中断，效率超过50％。
多种基因特异性工程化锌指是可商业获得的。例如，Sangamo Biosciences(Richmond，CA，USA)已与Sigma–Aldrich(St.Louis，MO，USA)合作开发了锌指构建平台(CompoZr)，允许研究人员完全绕过锌指构建和验证，并且提供了用于数千种蛋白质的被特异性靶向的锌指。Gaj et al.,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405。在一些实施方式中，可商业获得的锌指被使用或被定制设计。(参见例如，Sigma-Aldrich目录编号CSTZFND、CSTZFN、CTI1-1KT、和PZD0020)。
TALEs和TALENs
在一些实施方式中，基因组编辑***包括天然存在的或工程化的(非天然存在的)转录激活因子样蛋白质(TAL)DNA结合结构域，如在转录激活因子样蛋白质效应物(TALE)蛋白质中，参见例如，美国专利公开号20110301073，其整体通过引用被并入本文。
TALEDNA结合结构域或TALE是包括一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域涉及TALE与其同源靶DNA序列的结合。单个“重复单元”(也被称为“重复”)一般长度是33-35个氨基酸，并且与天然存在的TALE蛋白中的其它TALE重复序列呈现至少一些序列同源性。各TALE重复单元包括1或2个DNA结合残基——构成重复可变双残基(RepeatVariable Diresidue，RVD)，一般在重复的第12和/或13位。这些TALEs的天然(典型)DNA识别码已被确定，使得第12和13位的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合，NG结合至T，NI至A，NN结合至G或A，以及NG结合至T，并且非典型(非一般)RVDs也是已知的。参见美国专利公开号20110301073。在一些实施方式中，通过设计具有对靶DNA序列的特异性的TAL阵列，TALEs可靶向至任何基因。靶序列总体上始于胸苷。
在一些实施方式中，基因组编辑***包括DNA结合核酸内切酶，如TALE-核酸酶(TALEN)。在一些方面中，TALEN是包括衍生自TALE的DNA结合结构域和切割核酸靶序列的核酸酶催化结构域的融合蛋白。在一些实施方式中，TALE DNA结合结构域已被工程化以结合靶基因中的靶序列。
在一些实施方式中，TALEN识别和切割基因中的靶序列。在一些方面中，DNA的切割导致双链断裂。在一些方面中，断裂刺激(激励，stimulate)了同源重组或非同源末端接合(NHEJ)的比率。总体上，NHEJ是不完美修复过程，其通常导致DNA序列在切割位点处的改变。在一些方面中，修复机制涉及两个DNA末端的剩余部分通过直接再连接(Critchlow andJackson,Trends Biochem Sci.1998Oct；23(10):394-8)或通过所谓的微同源介导的末端连接而再接合。在一些实施方式中，通过NHEJ修复导致小型***或缺失，并且可被用于中断和从而抑制基因。在一些实施方式中，修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失、或添加。在一些方面中，其中已发生引起切割的诱变事件，即，连续NHEJ事件的诱变事件的细胞可被通过本领域公知的方法被识别和/或选择。
在一些实施方式中，TALE重复被组装以特异性靶向基因(Gaj et al.,Trends inBiotechnology,2013,31(7),397-405)。靶向18,740种人类蛋白质编码基因的TALENs文库已被构建(Kim et al.,Nature Biotechnology.31,251–258(2013))。定制设计的TALE阵列是通过Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(Lexington，KY，USA)、和Life Technologies(Grand Island，NY，USA)可商业获得的。
在一些实施方式中，TALENs作为被一种或多种质粒载体编码的转基因被引入。在一些方面中，质粒载体可包含选择标志物，其提供对接收所述载体的细胞的识别和/或选择。
归巢核酸内切酶
在一些实施方式中，基因组编辑***包括归巢核酸酶(或编码归巢核酸酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)。归巢核酸内切酶是作为内含子中的独立基因、作为与宿主蛋白质的融合体、或作为自剪接内含肽被编码的核酸内切酶的集合。其在合成其的细胞中催化基因组DNA的水解，但在极少或甚至单个位置处催化。归巢核酸内切酶结合非常长的，和并且在多种情况下不对称的，跨越12至40bp的识别序列。归巢核酸内切酶识别序列长到仅以极低概率(大约每7×109 bp一次)随机存在，并且通常在每个基因组找到一例或极少例。被宿主细胞水解的DNA的修复经常导致编码归巢核酸内切酶的基因被拷贝到切割位点，因此术语“归巢”描述这些基因的移动。
归巢核酸内切酶作为单体或同型二聚体产生作用，但通常需要缔合蛋白以调节其活性、或形成核糖核蛋白复合物，其中RNA是催化机构的一体组分。目前由6种已知的结构家族。其保守结构基序是：LAGLIDADG、GIY-YIG、His-Cys盒、H-N-H、PD-(D/E)xK、和Vsr样(Vsr-like)。
在一些实施方式中，归巢核酸内切酶是被修饰以靶向特定DNA序列的、合成的酶(如完全合成的酶)。例如，在一些实施方式中，归巢核酸内切酶是ARC核酸酶TM(PrecisionBioSciences)。
整合酶
在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，其包括被整合酶识别的第一重组位点。在一些实施方式中，被基因组编辑***靶向以修饰的多核苷酸包括被整合酶识别的第二重组位点，使得整合酶能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的重组。
多种噬菌体和整合质粒编码位点特异性重组***——实现其基因组稳定并入其宿主的基因组。在这些***中，重组反应的最低要求是催化重组事件的重组酶或整合酶、和两个重组位点(Sadowski(1986)J.Bacteriol.165:341-347；Sadowski(1993)FASEB J.7:760-767)。对于噬菌体整合***，这些被称为附接(att)位点，其中attP元件来自噬菌体DNA并且attB元件被细菌基因组编码。这两个附接位点可具有低至几个碱基对的序列同一性。重组酶蛋白质结合两个att位点并且催化DNA链的保守的和相互的交换，导致圆形噬菌体或质粒DNA整合到宿主DNA中。另外的噬菌体或宿主因子，如DNA结合蛋白IHF(整合宿主因子)，可以为有效反应所需(Friedman(1988)Cell 55:545-554；Finkel&Johnson(1992)Mol.Microbiol.6:3257-3265)。反向切除反应有时需要另外的噬菌体因子，如噬菌体λ的xis基因产物(Weisberg&Landy(1983)"Site-specific recombination in phagelambda."In Lambda II,eds.Hendrix et al(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)pp.211-250；Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949)。
重组酶已被分成两组，λ整合酶(Argos et al.(1986)EMBOJ.5:433-44；Voziyanovet al.(1999)Nucl.Acids Res.27:930-941)和解离酶/转化酶(Hatfull&Grindley(1988)"Resolvases and DNA-invertases:a family of enzymes active in site-specificrecombination"In Genetic Recombination,eds.Kucherhpati,R.,&Smith,G.R.(Am.Soc.Microbiol.,Washington DC),pp.357-396)家族。其差异在于整合酶的结构和其催化模式的分子细节(Stark et al.(1992)Trends Genetics 8:432-439)。温带链霉菌噬菌体ΦC31编码后一类的68kD重组酶。ΦC31整合反应是简便在于其不需要宿主因子并且呈现不可逆性，最可能是因为切除需要另外的噬菌体蛋白质。噬菌体和细菌att位点仅具有在交叉点处的3个同源碱基对。此同源侧接倒置的重复，推测是整合酶蛋白的结合位点。attB和attP的最小的已知功能性尺寸均是～50bp。噬菌体PI的Cre-lox***和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP-FRT***已被广泛用于动物和植物的转基因和染色体工程(被评述于Sauer(1994)Curr.Opin.Biotechnol.5:521-527；Ow(1996)Curr.Opin.Biotechnol.7:181-186)。在动物或植物细胞中工作的其它***包括下列：1)来自鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的R-RS***(Onouchi et al(1995)MolGen.Genet.247:653-660)，2)来自噬菌体Mu的Gin-gix***(Maeser&Kahmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)，和3)来自细菌质粒pSM19035的β重组酶***(Diaz et al.(1999)J.Biol.Chem.21A:6634-6640)。通过利用位点特异性重组酶，可获得较高频率的整合。
在一些实施方式中，整合酶是原核生物重组酶，如噬菌体整合酶。在一些实施方式中，整合酶是单向的，因为其可催化两个互补重组位点之间的重组，但不能催化通过此重组形成的杂交位点(hybrid sites)之间的重组。在一些实施方式中，整合酶是ΦC31整合酶。ΦC31整合酶自己仅催化attB x attP反应，而不能介导在attB和attP之间重组后形成的attL和attR位点之间的重组。由于重组酶如ΦC31整合酶不能单独催化逆反应，通过这种重组酶形成的attB x attP重组是稳定的。
方法涉及使存在于真核细胞中的一对重组位点(例如，attB和attP)接触相应的重组酶。重组酶然后介导重组位点之间的重组。根据两个重组位点的相对位置，多种事件中的任一种可作为重组结果而发生。例如，如果两个重组位点存在于不同的核酸分子上，重组可导致一个核酸分子整合到第二分子中。因此，可实现包含一个重组位点的质粒在包括相应重组位点的真核细胞染色体中的整合。由于用于本发明方法的重组酶不能催化逆反应，整合是稳定的。这种方法可用的，例如，用于实现存在于质粒上的转基因在真核染色体中的稳定整合。两个重组位点也可存在于相同的核酸分子上。在这种情况下，所得产物一般取决于位点的相对方向。例如，处于正向定向(direct orientation)的位点之间的重组将总体上导致任何位于两个重组位点之间的DNA被切除。相比之下，处于反向定向的位点之间的重组可导致介入DNA的倒置。再一次，所得的重排核酸是稳定的，因为在不存在其它因子(通常被重组酶所源自的具体噬菌体编码，不常在真核细胞中找到)的情况下重组是不可逆的。此方法可用的应用的一个实例涉及启动子在两个重组位点之间的布置。如果启动子最初相对于待通过启动子表达的编码序列处在反方向上并且启动子侧接的重组位点处在倒置方向上，则接触重组位点将导致启动子倒置，因此使启动子处于正确的方向以驱动编码序列的表达。类似地，如果启动子最初处在对于表达来说正确的方向上并且重组位点处在相同方向上，则重组位点与启动子接触可导致启动子片段的切除，因此阻止编码序列的表达。
核酸
在一些实施方式中，基因组编辑***包括核酸。在一些实施方式中，核酸编码基因组编辑酶，如核酸酶或整合酶。在一些实施方式中，核酸是指导RNA或指导DNA(或编码指导RNA或指导DNA的核酸，如mRNA或DNA质粒)。在一些实施方式中，核酸是供体核酸，如用于通过同源重组将修饰引入靶多核苷酸或通过位点定向重组将外源核酸***靶多核苷酸。在一些实施方式中，核酸是RNA，如mRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA，如DNA质粒。在一些实施方式中，基因组编辑***的核酸包括至少一种修饰，如影响稳定性、亚细胞靶向、蛋白质结合亲和力、互补靶序列结合亲和力、细胞降解抗性、和/或细胞穿透性的修饰。在一些实施方式中，至少一种修饰包括标记。这种修饰和用于将其引入核酸的方法是本领域公知的，并且被考虑用于本文描述的任何核酸。参见例如WO2011015347、WO2015026885、WO2015026887、WO2015026883、和WO2015026886。
在一些实施方式中，基因组编辑***包括包含选自下列的至少一种修饰的核酸：5'帽、3'多腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供追踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2,6-二氨基嘌呤核苷酸、2'-氟A核苷酸、2'-氟U核苷酸；2'-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键，与胆固醇分子键合、与聚乙二醇分子键合、与间隔序列18分子键合、5'-3'共价键合、和其任何组合。
组合物
在一些实施方式中，提供了组合物，其包括本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，其包括本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒和药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物中复合物或纳米颗粒的浓度是约1nM至约100mM，包括例如约10nM至约50mM、约25nM至约25mM、约50nM至约10mM、约100nM至约1mM、约500nM至约750μM、约750nM至约500μM、约1μM至约250μM、约10μM至约200μM、和约50μM至约150μM。
术语“药学上可接受的稀释剂、赋形剂、和/或载体”，如本文所用，意图包括与给予人类或其它脊椎动物宿主相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、和类似物。一般，药学上可接受的稀释剂、赋形剂、和/或载体是被联邦、州政府或其它监管机构监管机构批准的或美国药典或其它公认用于动物(包括人类以及非人哺乳动物)的药典中列出的稀释剂、赋形剂、和/或载体。术语稀释剂、赋形剂、和/或“载体”指代伴随药物组合物一起被给予的稀释剂、佐剂、赋形剂、或媒介。这种药物稀释剂、赋形剂、和/或载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油，动物，植物或合成来源的那些。水、盐溶液和右旋糖(dextrose)和甘油水溶液可用作液体稀释剂、赋形剂、和/或载体，具体地用于可注射溶液。适当的药物稀释剂和/或赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇(二醇，glycol)、水、乙醇和类似物，包括冻干助剂。组合物，如需，可还包含少量润湿剂、增量剂、乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、持续释放制剂和类似的形式。适当的药物稀释剂、赋形剂、和/或载体的实例被描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。制剂应匹配给药模式。适当的稀释剂、赋形剂、和/或载体对于本领域技术人员将是显而易见的，并且将大部分取决于给药途径。
在一些实施方式中，本文描述的药物组合物被配制用于静脉内、肿瘤内、动脉内、局部、眼内、眼科、门静脉、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服给予。
在一些实施方式中，发现适于治疗人或哺乳动物对象的本发明药物组合物的剂量在以下范围内：约0.001mg/kg至约100mg/kg基因组编辑复合物或纳米颗粒(如，约0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、和100mg/kg中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，剂量范围是约0.1mg/kg至约20mg/kg(如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、和20mg/kg中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，剂量范围是约0.5mg/kg至约10mg/kg。
示例性用药频率包括，但不限于，每周一次不间断；每周一次，四周三次；每三周一次；每两周一次；每周一次，三周两次。在一些实施方式中，药物组合物被给予约每两周一次、每三周一次、每四周一次、每六周一次、或每八周一次。在一些实施方式中，药物组合物被给予至少约1×、2×、3×、4×、5×、6×、或7×(即，每天)/周中的任一者。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔小于约6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天中的任一者。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔大于约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、或12个月中的任一者。在一些实施方式中，用药进度方案中无间断。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔不长于约一周。在一些实施方式中，药物组合物给予个体的进度方案的范围是从单次给予构成整个治疗至每日给予。药物组合物的给予可长期延续，如约1个月上至约7年。在一些实施方式中，药物组合物经至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84个月中的任一者的时段被给予。
在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包括本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体是糖或蛋白质。在一些实施方式中，糖选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和其组合，并且在药物组合物中以约5％至约20％的浓度存在。在一些实施方式中，糖是蔗糖。在一些实施方式中，糖是葡萄糖。在一些实施方式中，糖是甘露醇。在一些实施方式中，蛋白质是白蛋白。在一些实施方式中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方式中，药物组合物是冻干的。
在一些实施方式中，本文描述的药物组合物进一步包括表达复合物，其包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽)和编码外源构建物的核酸分子。在一些实施方式中，外源构建物是外源蛋白质或核酸。在一些实施方式中，表达复合物中细胞穿透肽与核酸分子的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，表达复合物中细胞穿透肽与核酸分子的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，细胞穿透肽无限制地包括CADY、PEP-1、MPG、VEPEP-3、VEPEP-4、VEPEP,-5、VEPEP-6、VEPEP-9、和ADGN-100。在一些实施方式中，表达复合物中的细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：1-70和75-80的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽与药物组合物中基因组编辑复合物中的细胞穿透肽相同。在一些实施方式中，细胞穿透肽不与药物组合物中基因组编辑复合物中的细胞穿透肽相同。在一些实施方式中，外源蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方式中，外源蛋白质是或包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，外源蛋白质是重组受体，如能够在细胞表面上被表达的重组受体。在一些实施方式中，重组受体包括配体结合结构域，其中在配体结合后，受体能够通过信号传导结构域转导信号。在一些实施方式中，重组受体包括信号传导结构域。在一些实施方式中，重组受体能够与包括信号传导结构域的内源蛋白质缔合。在一些实施方式中，配体结合结构域是或包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，重组受体是抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。
因此，在一些实施方式中，提供了组合物，如药物组合物，其包括本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒和本文描述的表达复合物。在一些实施方式中，这种组合物，例如药物组合物，可被用于在细胞中同时引起基因编辑和基因表达。
示例性抗原受体(包括CARs)和工程化这种受体的方法包括例如，国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337、美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118、和欧洲专利申请号EP2537416描述的那些；和/或Sadelain et al.,CancerDiscov.2013April；3(4):388–398；Davila et al.(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtleet al.,Curr.Opin.Immunol.,2012October；24(5):633-39；Wu et al.,Cancer,2012March18(2):160-75描述的那些。在一些方面中，抗原受体包括被描述于美国专利号：7,446,190的CAR、和被描述于国际专利申请公开号：WO/2014055668A1的那些。CARs的实例包括上述任何出版物中公开的CARs，如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号：7,446,190、美国专利号：8,389,282、Kochenderfer et al.,2013,NatureReviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang et al.(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens et al.,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号：7,446,190、和美国专利号：8,389,282。
在本文描述的包括配体结合结构域的重组受体的一些实施方式中，配体结合结构域特异性地结合与疾病或状况相关的配体。在一些实施方式中，配体结合结构域特异性地结合癌症相关的抗原或病原特异性抗原。在一些实施方式中，配体结合结构域是对病毒抗原(如HIV、HCV、HBV等)、细菌抗原、和/或寄生抗原特异性的。在一些实施方式中，配体结合结构域特异性地结合非限制地包括下列的配体：孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素(mesothelin)、CEA、和肝炎B表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体s、NY-ESO-1、MART-1、gp100、肿瘤胚胎性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、***特异性抗原、PSMA、Her2/neu、***受体、孕酮受体、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、和MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、如细胞周期蛋白A1(CCNA1)、和/或生物素化分子、和/或通过HIV、HCV、HBV或其它病原表达的分子。
制备方法
在一些实施方式中，提供了制备本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的方法，包括组合CPP与一种或多种基因组编辑***分子，从而形成基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑***包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***是CRISPR***(例如，CRISPR/Cas9)。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子中的一些在与CPP组合前处于预成形复合物中。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。
因此，在一些实施方式中，提供了制备本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的方法，包括a)组合CPP与RGEN(或编码RGEN的核酸)和gRNA(或编码gRNA的核酸)；或b)组合CPP与预成形的RGEN/gRNA复合物，从而形成基因组编辑复合物或纳米颗粒。
例如，在一些实施方式中，提供了制备本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的方法，包括a)组合包括一种或多种基因组编辑***分子(如基因组编辑酶、或编码基因组编辑酶的核酸)的第一组合物与包括处于水性介质中的细胞穿透肽的第二组合物，以形成混合物；和b)培育该混合物，以形成包括与所述一种或多种基因组编辑***分子缔合的细胞穿透肽的复合物，从而生成基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑***包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***是CRISPR***(例如，CRISPR/Cas9)。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子中的一些在与CPP组合前处于预成形复合物中。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。在一些实施方式中，水性介质是缓冲剂，包括例如PBS、Tris、或本领域已知的用于使核蛋白复合物稳定化的任何缓冲剂。在一些实施方式中，包括一种或多种基因组编辑***分子的第一组合物是包括下列浓度的一种或多种基因组编辑***分子(如基因组编辑核酸酶、gRNA或gDNA，和/或供体核酸)中的至少一种溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括一种或多种基因组编辑***分子的第一组合物是包括冻干形式的一种或多种基因组编辑***分子和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括细胞穿透肽的第二组合物是包括下列浓度的细胞穿透肽的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括细胞穿透肽的第二组合物是包括冻干形式的细胞穿透肽和适当载体的固体。在一些实施方式中，溶液被配制在水中。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，溶液被配制在缓冲剂中。在一些实施方式中，缓冲剂是本领域已知的用于储存核酸或多肽的任何缓冲剂。在一些实施方式中，第一组合物中基因组编辑核酸酶与gRNA或gDNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一组合物中基因组编辑核酸酶与gRNA或gDNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，混合物中细胞穿透肽与包括基因组编辑核酸酶的基因组编辑核酸酶或复合物的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，混合物中细胞穿透肽与包括基因组编辑核酸酶的基因组编辑核酸酶或复合物的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，混合物被培育形成包括与一种或多种基因组编辑***分子缔合的细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒，培育约10min至60min，包括例如约20min、30min、40min、和50min中的任一者，在约2℃至约50℃的温度下，包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃，从而产生包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液。在一些实施方式中，包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液在4℃下保持稳定至少约3周，包括例如至少约6周、2个月、3个月、4个月、5个月、和6个月中的任一者。在一些实施方式中，包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液在存在载体的情况下被冻干。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如，蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以约5％至约20％存在于包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液中，包括例如约7.5％至约17.5％、约10％至约15％、和约12.5％重量/体积。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，如人血清白蛋白。在一些实施方式中，细胞穿透肽是本文描述的VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NOs：75-80中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了制备本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的方法，包括a)在水性介质中组合包括RGEN的组合物与包括gRNA的组合物，以形成第一混合物；b)培育第一混合物，以形成包括RGEN和gRNA的RGEN/gRNA复合物；c)在水性介质中组合包括RGEN/gRNA复合物的组合物如b)的混合物与包括细胞穿透肽的组合物，以形成第二混合物；d)培育第二混合物，以形成包括与RGEN/gRNA复合物缔合的细胞穿透肽的复合物，从而生成基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，方法的步骤c)包括在水性介质中组合包括RGEN/gRNA复合物的组合物与包括细胞穿透肽的组合物和包括供体核酸的组合物，以形成第二混合物。在一些实施方式中，包括RGEN/gRNA复合物的组合物和包括供体核酸的组合物是单个组合物(single composition)。在一些实施方式中，水性介质是缓冲剂，包括例如PBS、Tris、或本领域已知的用于使核蛋白复合物稳定化的任何缓冲剂。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是以下列浓度包括RGEN的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是包括冻干形式的RGEN和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括下列浓度的gRNA的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括冻干形式的gRNA和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括细胞穿透肽的组合物是包括下列浓度的细胞穿透肽的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括细胞穿透肽的组合物是包括冻干形式的细胞穿透肽和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括下列浓度的供体核酸的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括冻干形式的供体核酸和适当载体的固体。在一些实施方式中，溶液被配制在水中。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，溶液被配制在缓冲剂中。在一些实施方式中，缓冲剂是本领域已知的用于储存核酸或多肽的任何缓冲剂。在一些实施方式中，第一混合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一混合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，第二混合物中细胞穿透肽与RGEN/gRNA复合物的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第二混合物中细胞穿透肽与RGEN/gRNA复合物的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一混合物被培育形成RGEN/gRNA复合物，培育约10min至60min，包括例如约20min、30min、40min、和50min中的任一者，在约2℃至约50℃的温度下，包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃，从而产生包括RGEN/gRNA复合物的溶液。在一些实施方式中，第二混合物被培育形成包括与RGEN/gRNA复合物缔合的细胞穿透肽的复合物，培育约10min至60min，包括例如约20min、30min、40min、和50min中的任一者，在约2℃至约50℃的温度下，包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃，从而结果产生包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液。在一些实施方式中，包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液在4℃下保持稳定至少约3周，包括例如至少约6周、2个月、3个月、4个月、5个月、和6个月中的任一者。在一些实施方式中，包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液在存在载体的情况下被冻干。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以约5％至约20％存在于包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液中，包括例如约7.5％至约17.5％、约10％至约15％、和约12.5％重量/体积。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，如人血清白蛋白。在一些实施方式中，细胞穿透肽是本文描述的VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NOs：75-80中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了制备本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的方法，包括a)在水性介质中组合包括细胞穿透肽的组合物、包括RGEN(或编码RGEN的核酸)的组合物、和包括gRNA(或编码gRNA的核酸)的组合物，以形成混合物；b)培育该混合物，以形成包括与RGEN和gRNA缔合的细胞穿透肽的复合物，从而生成基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，方法的步骤a)包括在水性介质中组合包括细胞穿透肽的组合物、包括RGEN的组合物、包括gRNA的组合物、和包括供体核酸的组合物，以形成混合物。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物、包括gRNA的组合物、和包括供体核酸的组合物中的至少两者是单个组合物(例如，单个组合物包括gRNA和供体核酸)。在一些实施方式中，水性介质是缓冲剂，包括例如PBS、Tris、或本领域已知的用于使核蛋白复合物稳定化的任何缓冲剂。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是包括下列浓度的RGEN的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是包括冻干形式的RGEN和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括下列浓度的gRNA的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括冻干形式的gRNA和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括细胞穿透肽的组合物是包括下列浓度的细胞穿透肽的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括细胞穿透肽的组合物是包括冻干形式的细胞穿透肽和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括下列浓度的供体核酸的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括冻干形式的供体核酸和适当载体的固体。在一些实施方式中，溶液被配制在水中。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，溶液被配制在缓冲剂中。在一些实施方式中，缓冲剂是本领域已知的用于储存核酸或多肽的任何缓冲剂。在一些实施方式中，混合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，混合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，混合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，混合物中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，混合物被培育形成包括与RGEN和gRNA缔合的细胞穿透肽的复合物，培育约10min至60min，包括例如约20min、30min、40min、和50min中的任一者，在约2℃至约50℃的温度下，包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃，从而结果产生包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液。在一些实施方式中，包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液在4℃下保持稳定至少约3周，包括例如至少约6周、2个月、3个月、4个月、5个月、和6个月中的任一者。在一些实施方式中，包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液在存在载体的情况下被冻干。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以约5％至约20％存在于包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液中，包括例如约7.5％至约17.5％、约10％至约15％、和约12.5％重量/体积。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，如人血清白蛋白。在一些实施方式中，细胞穿透肽是本文描述的VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NOs：75-80中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了制备本文描述的包括核芯和至少一个附加层的纳米颗粒的方法，包括a)在水性介质中组合包括RGEN的组合物与包括gRNA的组合物，以形成第一混合物；b)培育第一混合物，以形成包括RGEN和gRNA的RGEN/gRNA复合物；c)在水性介质中组合包括RGEN/gRNA复合物的组合物如b)的混合物与包括第一细胞穿透肽的组合物，以形成第二混合物；d)培育第二混合物，以形成包括与RGEN/gRNA复合物缔合的第一细胞穿透肽的纳米颗粒核芯；e)在水性介质中组合包括纳米颗粒核芯的组合物如d)的混合物与包括第二细胞穿透肽的组合物，以形成第三混合物，和f)培育第三混合物，以形成包括核芯和至少一个附加层的纳米颗粒。在一些实施方式中，方法进一步包括g)在水性介质中组合包括该纳米颗粒(其包括核芯和至少一个附加层)的组合物和包括第三细胞穿透肽的组合物，以形成第四混合物，和h)培育第四混合物，以形成包括核芯和至少两个附加层的纳米颗粒。将理解，该方法可被调整以形成包括递增层数的纳米颗粒。在一些实施方式中，组合步骤(例如，步骤a)、c)、e)、或g))中的至少一个进一步包括与包括供体核酸的组合物组合。在一些实施方式中，水性介质是缓冲剂，包括例如PBS、Tris、或本领域已知的用于使核蛋白复合物稳定化的任何缓冲剂。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是包括下列浓度的RGEN的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是包括冻干形式的RGEN和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括下列浓度的gRNA的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括冻干形式的gRNA和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括第一、第二和/或第三细胞穿透肽的组合物均是包括下列浓度的细胞穿透肽的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括第一、第二和/或第三细胞穿透肽的组合物均是包括冻干形式的细胞穿透肽和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括下列浓度的供体核酸的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括冻干形式的供体核酸和适当载体的固体。在一些实施方式中，溶液被配制在水中。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，溶液被配制在缓冲剂中。在一些实施方式中，缓冲剂是本领域已知的用于储存核酸或多肽的任何缓冲剂。在一些实施方式中，第一混合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一混合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，第二混合物中第一细胞穿透肽与RGEN/gRNA复合物的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第二混合物中第一细胞穿透肽与RGEN/gRNA复合物的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一、第二、第三和/或第四混合物均被培育约10min至60min，包括例如约20min、30min、40min、和50min中的任一者，在约2℃至约50℃的温度下，包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃。在一些实施方式中，包括纳米颗粒的溶液在4℃下保持稳定至少约3周，包括例如至少约6周、2个月、3个月、4个月、5个月、和6个月中的任一者。在一些实施方式中，包括纳米颗粒的溶液在存在载体的情况下被冻干。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以约5％至约20％存在于包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液中，包括例如约7.5％至约17.5％、约10％至约15％、和约12.5％重量/体积。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，如人血清白蛋白。在一些实施方式中，第一、第二和/或第三细胞穿透肽均是本文描述的VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽。在一些实施方式中，第一、第二和/或第三细胞穿透肽均包括SEQ ID NO：75、76、77、78、79、或80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了制备本文描述的包括核芯和至少一个附加层的纳米颗粒的方法，包括a)在水性介质中组合包括第一细胞穿透肽的组合物、包括RGEN(或编码RGEN的核酸)的组合物、和包括gRNA的组合物，以形成第一混合物；b)培育第一混合物，以形成包括与RGEN和gRNA缔合的第一细胞穿透肽的纳米颗粒核芯；c)在水性介质中组合包括纳米颗粒核芯的组合物如b)的混合物与包括第二细胞穿透肽的组合物，以形成第二混合物；和d)培育第二混合物，以形成包括核芯和至少一个附加层的纳米颗粒。在一些实施方式中，方法进一步包括e)在水性介质中组合包括该纳米颗粒(其包括核芯和至少一个附加层)的组合物和包括第三细胞穿透肽的组合物，以形成第三混合物；和f)培育第三混合物，以形成包括核芯和至少两个附加层的纳米颗粒。将理解，该方法可被调整以形成包括递增层数的纳米颗粒。在一些实施方式中，组合步骤(例如，步骤a)、c)、或e))中的至少一个进一步包括与包括供体核酸的组合物组合。在一些实施方式中，水性介质是缓冲剂，包括例如PBS、Tris、或本领域已知的用于使核蛋白复合物稳定化的任何缓冲剂。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是包括下列浓度的RGEN的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括RGEN的组合物是包括冻干形式的RGEN和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括下列浓度的gRNA的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括gRNA的组合物是包括冻干形式的gRNA和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括第一、第二和/或第三细胞穿透肽的组合物均是包括下列浓度的细胞穿透肽的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括第一、第二和/或第三细胞穿透肽的组合物均是包括冻干形式的细胞穿透肽和适当载体的固体。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括下列浓度的供体核酸的溶液：约1nM至约200μM(如，约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一者，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，包括供体核酸的组合物是包括冻干形式的供体核酸和适当载体的固体。在一些实施方式中，溶液被配制在水中。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，溶液被配制在缓冲剂中。在一些实施方式中，缓冲剂是本领域已知的用于储存核酸或多肽的任何缓冲剂。在一些实施方式中，第一混合物中RGEN与gRNA的摩尔比在约10：1和约1：10之间(如，约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、和1：10中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一混合物中RGEN与gRNA的摩尔比是约1：1。在一些实施方式中，第一混合物中第一细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间(如，约1：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一混合物中第一细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间(如，约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、和20：1中的任一者，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方式中，第一、第二和/或第三混合物均被培育约10min至60min，包括例如约20min、30min、40min、和50min中的任一者，在约2℃至约50℃的温度下，包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃。在一些实施方式中，包括纳米颗粒的溶液在4℃下保持稳定至少约3周，包括例如至少约6周、2个月、3个月、4个月、5个月、和6个月中的任一者。在一些实施方式中，包括纳米颗粒的溶液在存在载体的情况下被冻干。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以约5％至约20％存在于包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的溶液中，包括例如约7.5％至约17.5％、约10％至约15％、和约12.5％重量/体积。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，如人血清白蛋白。在一些实施方式中，第一、第二和/或第三细胞穿透肽均是本文描述的VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽。在一些实施方式中，第一、第二和/或第三细胞穿透肽均包括SEQ ID NO：75、76、77、78、79、或80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，对于本发明的包括基因组编辑复合物或纳米颗粒的稳定组合物，复合物或纳米颗粒的平均直径的变化不多于约10％，并且多分散指数的变化不多于约10％。
应用方法
疾病治疗方法
在一些实施方式中，提供了治疗个体的疾病或状况的方法，包括给予个体有效量的、包括本文描述的用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括可用于治疗疾病或状况的一种或多种基因组编辑***分子。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括CPP，该CPP包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑***包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***是CRISPR***(例如，CRISPR/Cas9)。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。在一些实施方式中，待治疗的疾病或状况包括，但不限于，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、老化和退化性疾病，和特征在于胆固醇水平异常的疾病。在一些实施方式中，基因组编辑***能够修饰一个或多个基因的序列。在一些实施方式中，基因组编辑***能够调节一个或多个基因的表达。在一些实施方式中，一个或多个基因编码的蛋白质包括，但不限于，生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调谐子、蛋白质表达和修饰调节子、肿瘤抑制因子(阻抑制子，suppressor)、和凋亡和转移调节子。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整基因组编辑***，使得药物组合物对个体的给予足以修饰个体的细胞中的靶多核苷酸。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括一种或多种另外的、本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中药物组合物中的多种基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整基因组编辑***，使得药物组合物对个体的给予足以修饰个体的细胞中的靶多核苷酸。在一些实施方式中，方法进一步包括给予个体有效量的一种或多种另外的药物组合物，该另外的药物组合物包括一种或多种另外的、本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中所述多种药物组合物中的多种基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整基因组编辑***，使得所述多种药物组合物对个体的给予足以修饰个体的细胞中的靶多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括根据本文所述任何实施方式的表达复合物。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子的表达复合物。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合与疾病或状况相关的抗原的嵌合抗原受体。
本文所用的活性或表达“调节”意为调节或改变基因或mRNA的状态或拷贝数或改变基因产物如蛋白质的产量。在一些实施方式中，基因组编辑***抑制靶基因的表达。在一些实施方式中，基因组编辑***使基因或基因产物的表达抑制至少约0％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中的任一者。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的疾病或状况的方法，包括给予个体有效量的、包括本文描述的用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括可用于治疗疾病或状况的一种或多种基因组编辑***分子和细胞穿透肽，该细胞穿透肽包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，基因组编辑***包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***是CRISPR***(例如，CRISPR/Cas9)。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。在一些实施方式中，待治疗的疾病或状况包括，但不限于，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、老化和退化性疾病、和胆固醇水平异常。在一些实施方式中，药物组合物中的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子，用于修饰个体中的一个或多个基因的序列。在一些实施方式中，药物组合物中的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子，用于调节个体中的一个或多个基因的表达。在一些实施方式中，一个或多个基因编码的蛋白质包括，但不限于，生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调谐子、蛋白质表达和修饰调节子、肿瘤抑制因子、和凋亡和转移调节子。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整基因组编辑***，使得药物组合物对个体的给予足以修饰个体的细胞中的靶多核苷酸。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括一种或多种另外的、本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中药物组合物中的多种基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整基因组编辑***，使得药物组合物对个体的给予足以修饰个体的细胞中的靶多核苷酸。在一些实施方式中，方法进一步包括给予个体有效量的一种或多种另外的药物组合物，该另外的药物组合物包括一种或多种另外的、本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中所述多种药物组合物中的多种基因组编辑复合物或纳米颗粒包括完整基因组编辑***，使得所述多种药物组合物对个体的给予足以修饰个体的细胞中的靶多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以使靶基因失活，如通过减少靶基因的表达或产生表达无活性产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，靶多核苷酸被修饰以激活靶基因，如通过增加靶基因的表达或产生表达活性靶基因产物的修饰靶基因。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，嵌合抗原受体特异性结合与疾病或状况相关的抗原。
在本文所述方法的一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括靶向一个或多个基因的一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)，该基因包括，但不限于，腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酰环化酶、Akt、ALK、ALK/Met、血管生成素受体、血管紧张素II、APC、AR、ARK5、抑制蛋白、ATF1、ATF-2、B7-1、B7-h1(pdl-1)、β-联蛋白、Bcl-2、BCL2L12、Bcl6、Bcr-Abl、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTK、半胱天冬蛋白酶-2、半胱天冬蛋白酶-9、CCL2、CCN1、Ccnd2、CDK活化激酶、CEBPA、Chop、c-Jun、c-Myc、CREB、CREB1、CS1、CTGF、CTNNB1、CXCR4、细胞周期蛋白d1-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、DEPTOR、DNMT3B、DPC4、EBOV聚合酶L、EGF、EGFR、eIF5A、Elk-1、ER、Erbb4、ERK、ESR1、Ets1、EWSR1、FAK、FGF、FGFR、FOXO1、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、Fyn、GATA1、GATA3、GLI1、GM-CSF、GP/sGP、GSK、HBV保守序列、HDACs、HDGF、HDGFR、Her2、Her3、Hexo激酶II、HGF、HGFR、HIF-1、HIF-1α、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、HIV TAR RNA、HIV Tat、HLA-B7/β2-微球蛋白、HMGA2、HNF1A、HNF1B、Hsp27、HSP47、人CCR5、Idh1、Idh2、IGF、IGFR、IKK、IKZF1、IL-12、IL-2、INK4、干扰素-γ、IRF1、IRF4、JAK、JNK、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白K6A、角蛋白K6B、KGFR、KLF6、KRAS、LMO、LMO1、LMP2、LMP7、LOXL2、LPL、LYL1、MADR2、MAPK、Max、Mcl-1、MDA-7、MDM2、MDR-1、MDS1-EVI1、MECL-1、MEF2C、MEK、MEKK、MKK、MLH1、MLST8、MMP-2、MMP-9、MSFR、MSH2、MSH6、MSIN1、mTOR、MUC-1、突变体DDX3X、MYC、NCAP-D2、NCAP-D3、NCAP-G、NCAP-G2、NCAP-H、NCAP-H2、NF1、NF2、NFAT4、NF-κB、Notch1、NPC1、NR4A3、NRAS、Olig2、骨桥蛋白、p53、PAI-1、PARP-1、patched、PAX3、PAX5、PAX7、PBX1、PDCD4、PDGF、PDGFR、PDK1、PHOX2B、PI3K、PKA、PKC、PKN3、PLK-1、PML、PR、PRAS40、PRDM16、Prdx1和Prdx2(burkitts淋巴瘤)、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S、PTC、PTEN、Pyk2、Rad51、RAF、Raptor、Rb、RET、Rictor、RPN13、RRM2、RSV核衣壳、RUNX1、S6激酶、Sap1a、SETBP1、Shc、SLAMF7、Smad、Smad 3、Smad 4、Smad 7、SMC-2、SMC-4、smoothened、SOX9、SPARC、Spry2、Src、β-2肾上腺素受体(ADRB2)、β-珠蛋白、STAT5B、STATs、免死蛋白、Syk、Tal、TAL1、TGFR、TGF-α、TGF-β、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、TGFβ1、血小板反应蛋白、胸苷激酶、TIM-1、TIMP、TNF-α、TP53、甲状腺素运载蛋白、TRPV1、泛素连接酶、uPAR、VEGF、VEGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VHL、VP24、VP30、VP35、VP40、wnt、WT1、WT2、XBP1(剪接型和未剪接型)、XIAP、和ZBTB16、包括其突变体(例如、突变体PTEN、突变体KRAS、突变体p53、和类似物)。
疾病和状况
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是实体肿瘤，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节一种或多种蛋白质编码基因的表达的一种或多种基因组编辑***分子，该蛋白质包括，但不限于，生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调谐子、蛋白质表达和修饰调节子、肿瘤抑制因子、和凋亡和转移调节子。在一些实施方式中，生长因子或细胞因子包括，但不限于，EGF、VEGF、FGF、HGF、HDGF、IGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α、和wnt，包括其突变体。在一些实施方式中，细胞表面受体包括，但不限于，ER、PR、Her2、Her3、血管生成素受体、EGFR、FGFR、HGFR、HDGFR、IGFR、KGFR、MSFR、PDGFR、TGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、smoothened、patched、和CXCR4，包括其突变体。在一些实施方式中，信号传导分子或激酶包括，但不限于，KRAS、NRAS、RAF、MEK、MEKK、MAPK、MKK、ERK、JNK、JAK、PKA、PKC、PI3K、Akt、mTOR、Raptor、Rictor、MLST8、PRAS40、DEPTOR、MSIN1、S6激酶、PDK1、BRAF、FAK、Src、Fyn、Shc、GSK、IKK、PLK-1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、CDK活化激酶、ALK/Met、Syk、BTK、Bcr-Abl、RET、β-联蛋白、Mcl-1、和PKN3，包括其突变体。在一些实施方式中，转录因子或其它转录调谐子包括，但不限于，AR、ATF1、CEBPA、CREB1、ESR1、EWSR1、FOXO1、GATA1、GATA3、HNF1A、HNF1B、IKZF1、IRF1、IRF4、KLF6、LMO1、LYL1、MYC、NR4A3、PAX3、PAX5、PAX7、PBX1、PHOX2B、PML、RUNX1、SMAD4、SMAD7、STAT5B、TAL1、TP53、WT1、ZBTB16、ATF-2、Chop、c-Jun、c-Myc、DPC4、Elk-1、Ets1、Max、MEF2C、NFAT4、Sap1a、STATs、Tal、p53、CREB、NF-κB、HDACs、HIF-1α、和RRM2，包括其突变体。在一些实施方式中，蛋白质表达或修饰的调节子包括，但不限于，泛素连接酶、LMP2、LMP7、和MECL-1，包括其突变体。在一些实施方式中，肿瘤抑制因子包括，但不限于，APC、BRCA1、BRCA2、DPC4、INK4、MADR2、MLH1、MSH2、MSH6、NF1、NF2、p53、PTC、PTEN、Rb、VHL、WT1、和WT2，包括其突变体。在一些实施方式中，凋亡或转移的调节子包括，但不限于，XIAP、Bcl-2、骨桥蛋白、SPARC、MMP-2、MMP-9、uPAR，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症，其中癌症是实体肿瘤，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括靶向编码涉及肿瘤发生和/或发展的蛋白质一个或多个基因的一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，编码涉及肿瘤发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，IL-2、IL-12、干扰素-γ、GM-CSF、B7-1、半胱天冬蛋白酶-9、p53、MUC-1、MDR-1、HLA-B7/β2-微球蛋白、Her2、Hsp27、胸苷激酶、和MDA-7，包括其突变体。在一些实施方式中，基因组编辑***包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***是CRISPR***(例如，CRISPR/Cas9)。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症，其中癌症是肝癌，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括靶向编码涉及肝癌发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，肝癌是肝细胞癌、胆管癌、肝的血管肉瘤(angiosarcoma of theliver)、或肝的血管肉瘤(hemangiosarcoma of the liver)。在一些实施方式中，该编码涉及肝癌发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，CCND2、RAD23B、GRP78、CEP164、MDM2、和ALDH2，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据任何本文所述方法，癌症是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方式中，HCC是早期HCC、非转移性HCC、原发性HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、转移性HCC、缓解期HCC、或复发性HCC。在一些实施方式中，HCC是局部化可切除的(即，局限于肝的一部分、允许完全外科切除的肿瘤)、局部化不可切除的(即，局部化的肿瘤可以是不可切除的，因为涉及重要的血管结构或因为肝受损)、或不可切除的(即，肿瘤涉及全部肝叶和/或已扩散以涉及其它器官(例如，肺、***、骨)。在一些实施方式中，根据TNM分类，HCC是阶段I肿瘤(无血管侵入的单个肿瘤)、阶段II肿瘤(有血管侵入的单个肿瘤、或均不大于5cm的多个肿瘤)、阶段III肿瘤(任一个大于5cm的多个肿瘤、或涉及门静脉或肝静脉的主要分支的肿瘤)、阶段IV肿瘤(直接侵入胆囊以外的相邻器官或脏层腹膜穿孔的肿瘤)、N1肿瘤(区域性***转移)、或M1肿瘤(远距离转移)。在一些实施方式中，根据AJCC(American JointCommission onCancer)分阶标准，HCC阶段T1、T2、T3、或T4 HCC。在一些实施方式中，HCC是肝细胞癌、HCC的纤维板层变体、和混合肝细胞胆管癌中的任一种。在一些实施方式中，个体可以是具有与肝细胞癌相关的基因、遗传突变、或多态现象(例如，CCND2、RAD23B、GRP78、CEP164、MDM2、和/或ALDH2的突变或多态现象)或具有一个或多个附加拷贝的与肝细胞癌相关的基因的人。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症，其中癌症是肺癌，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括靶向编码涉及肺癌发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，该编码涉及肺癌发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、Ot1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS、和AKT，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据任何本文所述方法，癌症是肺癌。在一些实施方式中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC的实例包括，但不限于，大细胞癌(例如，大细胞神经内分泌癌、组合型大细胞神经内分泌癌、类基底细胞癌、淋巴上皮瘤样癌、透明细胞癌、和具有杆状表型的大细胞癌)、腺癌(例如，腺泡、***状(例如，细支气管肺泡癌、非粘蛋白性、粘蛋白性、混合粘蛋白性和非粘蛋白性和不确定细胞类型)、带有粘蛋白的实体腺癌、带有混合亚型的腺癌、分化良好的胎儿腺癌、粘蛋白性(胶样)腺癌、粘蛋白性囊腺癌、印戒腺癌、和透明细胞腺癌)、神经内分泌肺肿瘤、和鳞状细胞癌(例如，***状、透明细胞、小细胞、和类基底细胞)。在一些实施方式中，根据TNM分类，NSCLC是阶段T肿瘤(原发性肿瘤)、阶段N肿瘤(区域性***)、或阶段M肿瘤(远距离转移)。在一些实施方式中，肺癌是类癌(典型或非典型)、腺鳞癌、圆柱瘤、或唾液腺癌(例如，腺样囊性癌或粘液表皮样癌)。在一些实施方式中，肺癌是带有多形性、肉瘤样、或肉瘤元素的癌(例如，带有梭形细胞和/或巨细胞的癌、梭形细胞癌、巨细胞癌、癌肉瘤、或肺胚细胞瘤)。在一些实施方式中，癌症是小细胞肺癌(SCLC；也被称为燕麦细胞癌)。小细胞肺癌可以是有限阶段(limited-stage)、扩散阶段(extensive stage)或复发性小细胞肺癌。在一些实施方式中，个体可以是具有怀疑或显示与肺癌相关的基因、遗传突变、或多态现象(例如，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、Ot1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS、和/或AKT的突变或多态现象)或具有一个或多个附加拷贝的肺癌相关基因的人。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症，其中癌症是肾细胞癌(RCC)，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括靶向编码涉及RCC发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，该编码涉及RCC发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，VHL、TSCl、TSC2、CUL2、MSH2、MLHl、INK4a/ARF、MET、TGF-α、TGF-βl、IGF-I、IGF-IR、AKT、和PTEN，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据任何上述方法，癌症是肾细胞癌。在一些实施方式中，肾细胞癌是腺癌。在一些实施方式中，肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌、***状肾细胞癌(也被称为嗜染肾细胞癌)、嫌染肾细胞癌、集合管肾细胞癌、粒状肾细胞癌、混合粒状肾细胞癌、肾血管肌脂瘤、或梭形肾细胞癌。在一些实施方式中，个体可以是具有与肾细胞癌相关的基因、遗传突变、或多态现象(例如，VHL、TSCl、TSC2、CUL2、MSH2、MLHl、INK4a/ARF、MET、TGF-α、TGF-βl、IGF-I、IGF-IR、AKT、和/或PTEN的突变或多态现象)或具有一个或多个附加拷贝的肾细胞癌相关基因的人。在一些实施方式中，肾细胞癌下列相关：(1)von Hippel-Lindau(VHL)综合征、(2)遗传性***状肾癌(HPRC)、(3)与Birt-Hogg-Dube综合征(BHDS)相关的家族性肾嗜酸细胞瘤(FRO)、或(4)遗传性肾癌(HRC)。在一些实施方式中，根据AmericanJoint Committee on Cancer(AJCC)分阶组，肾细胞癌处于阶段I、II、III、或IV中的任一者。在一些实施方式中，肾细胞癌是阶段IV肾细胞癌。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症，其中癌症是中枢神经***(CNS)肿瘤，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括靶向编码涉及CNS肿瘤发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，药物组合物在对CNS肿瘤的外科程序(手术，procedure)期间或之后(如紧随其后)被给予。在一些实施方式中，外科程序是CNS肿瘤的切除。在一些实施方式中，药物组合物被给予到由外科程序产生的外科腔(surgical cavity)中。在一些实施方式中，该编码涉及CNS肿瘤发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，NF1、NF2、SMARCB1、pVHL、TSC1、TSC2、p53、CHK2、MLH1、PMS2、PTCH、SUFU、和XRCC7，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据任何本文所述方法，癌症是CNS肿瘤。在一些实施方式中，CNS肿瘤是神经胶质瘤(例如，脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(还被称为成多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤(如高级星形细胞瘤)、儿童神经胶质瘤或成胶质细胞瘤(如儿童高级神经胶质瘤(HGG)和弥漫性内在脑桥神经胶质瘤(DIPG))、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、或脑转移。在一些实施方式中，个体可以是具有怀疑或显示与CNS肿瘤相关的基因、遗传突变、或多态现象(例如，NF1、NF2、SMARCB1、pVHL、TSC1、TSC2、p53、CHK2、MLH1、PMS2、PTCH、SUFU、和XRCC7的突变或多态现象)或具有一个或多个附加拷贝的CNS肿瘤相关基因的人。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是血液***疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及血液***疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，血液***疾病是血红蛋白病，如镰状细胞病、地中海贫血、或高铁血红蛋白血症、贫血如巨幼细胞性贫血、溶血性贫血(例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞性贫血、先天性红细胞生成障碍性贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症、免疫介导性溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血性、***性红斑狼疮、Evans综合征、冷性自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素疾病、阵发性冷性血红蛋白尿症、传染性单核细胞增多症、同种免疫性溶血性贫血、新生儿溶血性疾病、或阵发性睡眠性血红蛋白尿症)、再生障碍性贫血(例如，Fanconi贫血、Diamond-Blackfan贫血、或获得性纯红细胞再生障碍)、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、中性白细胞减少症、粒细胞缺乏症、Glanzmann血小板机能不全、血小板减少症、骨髓增生性障碍、如真性红细胞增多症、红细胞增多症、白细胞增多症、或血小板增多症、或凝血紊乱如复发性血栓症、弥散性血管内凝血、血友病(例如、血友病A、血友病B、或血友病C)、VonWillebrand病、蛋白质S缺乏症、抗磷脂综合征、或Wiskott-Aldrich综合征。在一些实施方式中，该编码涉及血液***疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包，但不限于，HBA1、HBA2、HBB、PROC、ALAS2、ABCB7、SLC25A38、MTTP、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1(BRCA2)、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ(BRIP1)、FANCL、FANCM、FANCN(PALB2)、FANCP(SLX4)、FANCS(BRCA1)、RAD51C、XPF、ANK1、SPTB、SPTA、SLC4A1、EPB42、和TPI1，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是基于器官的疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及基于器官的疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，基于器官的疾病是眼、肝、肺、肾、心脏、神经***、肌肉、或皮肤的疾病。在一些实施方式中，疾病是心血管疾病，如冠状心脏病、高血压、心房颤动、外周动脉疾病、Marfan综合征、长QT综合征、或先天性心脏缺陷。在一些实施方式中，疾病是消化***疾病，如肠道易激综合征、溃疡性结肠炎、Crohn病、腹部疾病、消化性溃疡疾病、胃食管反流病、或慢性胰腺炎。在一些实施方式中，疾病是泌尿***疾病，如慢性***炎、良性***增生症、或间质性膀胱炎。在一些实施方式中，疾病是肌肉骨骼疾病，如骨性关节炎、骨质疏松、成骨不全、或Paget骨疾病。在一些实施方式中，疾病是皮肤疾病，如湿疹、银屑病、粉刺、酒渣鼻、或皮炎。在一些实施方式中，疾病是牙齿或颅面障碍，如牙周疾病或颞下颌关节和肌肉障碍(TMJD)。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是眼部疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及眼部疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，眼部疾病是年龄相关性黄斑变性或类似物、早产儿视网膜病变、息肉状脉络膜血管病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、缺血性增生性视网膜病变、色素性视网膜炎、锥体营养不良、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、角膜炎、结膜炎、葡萄膜炎、Leber病、视网膜脱离、视网膜色素上皮脱离、新生血管性青光眼、角膜新生血管形成、视网膜脉络膜新生血管形成。在一些实施方式中，该编码涉及血液***疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，Rho、PDE6β、ABCA4、RPE65、LRAT、RDS/Peripherin、MERTK、CNGA1、RPGR、IMPDH1、ChR2、GUCY2D、RDS/Peripherin、AIPL1、ABCA4、RPGRIP1、IMPDH1、AIPL1、GUCY2D、LRAT、MERTK、RPGRIP1、RPE65、CEP290、ABCA4、DFNB31、MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、USH1G、CLRN1、GNAT2、CNGA3、CNGB3、Rs1、OA1、MT-ND4、(OCA1)、酪氨酸酶、p21 WAF-1/OCipl、REP-1、PDGF、Endostatin、Angiostatin、VEGF抑制剂、Opsin、OPN1LW、芳基硫酸酯酶B、和β-葡糖苷酸酶，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是肝病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及肝病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，肝病是肝炎、脂肪肝病(酒精性和非酒精性)、血色病、Wilson病、进行性家族性肝内胆汁郁积3型、遗传性果糖不耐症、糖原贮积病IV型、酪氨酸血症I型、精氨琥珀酸裂解酶缺乏症、柠檬素缺乏症(CTLN2、NICCD)、胆固醇酯贮积病、囊性纤维化、综合征、先天性肝纤维化、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病II型、甲状腺素运载蛋白相关性遗传性淀粉样变性、Gilbert综合征、硬化、原发性胆汁性硬化、或原发性硬化性胆管炎。在一些实施方式中，该编码涉及肝病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，ATP7B、ABCB4、ALDOB、GBE1、FAH、ASL、SLC25A13、LIPA、CFTR、ALMS1、HFE、HFE2、HFDE2B、HFE3、SLC11A3/SLC40A1、ceruloplasmin、转铁蛋白、A1AT、BCS1L、B3GAT1、B3GAT2、B3GAT3、UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A5、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2A1、UGT2A2、UGT2A3、UGT2B4、UGT2B7、GT2B10、UGT2B11、UGT2B15、UGT2B17、和UGT2B28，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是肺病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及肺病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，肺病是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍、肺纤维化、Birt Hogg Dube综合征、结节性硬化症、Kartagener综合征、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、肺毛细血管瘤病(PCH)、或遗传性出血性毛细血管扩张症。在一些实施方式中，该编码涉及肺病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，EIF2AK4、IREB2、HHIP、FAM13A、IL1RL1、TSLP、IL33、IL25、CFTR、DNAI1、DNAH5、TXNDC3、DNAH11、DNAI2、KTU、RSPH4A、RSPH9、LRRC50、TERC、TERT、SFTPC、SFTPA2、FLCN、TSC1、TSC2、A1AT、ENG、ACVRL1、和MADH4，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是肾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及肾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，肾病是囊性肾病(例如，常染色体显性多囊肾病、常染色体隐性多囊肾病、肾结核(nephronophthisis)、或髓质海绵肾)、Alport综合征、Bartter综合征、先天性肾病综合征、指甲-髌骨综合征综合征、原发性免疫性肾小球肾炎、反流性肾病、或溶血性尿毒综合征。在一些实施方式中，该编码涉及肾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，PKD1、PKD2、PKD3、fibrocystin、NPHP1、NPHP2、NPHP3、NPHP4、NPHP5、NPHP6、NPHP7、NPHP8、NPHP9、NPHP11、NPHP11、NPHPL1、GDNF、COL4A5、COL4A3、COL4A4、SLC12A2(NKCC2)、ROMK/KCNJ1、CLCNKB、BSND、CASR、SLC12A3(NCCT)、和ADAMTS13，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是肌肉疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及肌肉疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，肌肉疾病是肌病(例如，线粒体肌病)、肌营养不良症(例如，Duchenne、Becker、Emery-Dreifuss、面肩肱型、肌强直性、先天性、远端、肢带型、和眼咽型)、脑瘫、进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificans progressiva)、皮肌炎、隔室综合症、重症肌无力、肌萎缩侧索硬化、横纹肌溶解症、多肌炎、纤维肌痛、肌强直、肌筋膜疼痛综合征。在一些实施方式中，该编码涉及肌肉疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，DMD、LAMA2、胶原蛋白VI(COL6A1、COL6A2、或COL6A3)、POMT1、POMT2、FKTN、FKRP、LARGE1、POMGNT1、ISPD、SEPN1、LMNA、DYSF、EMD、DUX4、DMPK、ZNF9、PABPN1、CAV3、CAPN3、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、TTN、ANO5、DNAJB6、HNRNPDL、MYOT、TCAP、TNPO3、TRAPPC11、和TRIM32，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是神经***疾病(如中枢神经***疾病)，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及神经***疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，神经***疾病是肾上腺脑白质营养不良、Angelman综合征、共济失调毛细血管扩张症、Charcot-Marie-Tooth综合征、Cockayne综合征、特发性震颤、脆性X综合征、Friedreich共济失调、Gaucher病、Lesch-Nyhan综合征、枫糖尿病、Menkes综合征、嗜眠发作(narcolepsy)、神经纤维瘤病、Niemann-Pick病、苯丙酮尿症、Prader-Willi综合征、Refsum病、Rett综合征、脊髓性肌萎缩症、脊髓小脑性共济失调、Tangier病、Tay-Sachs病、结节性硬化症、Von Hippel-Lindau综合征、Williams综合征、Wilson病、Zellweger综合征、注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、自闭症、双相障碍、抑郁、癫痫、偏头痛、多发性硬化症、脊髓病、阿尔茨海默氏症、亨廷顿症、帕金森症、或妥瑞氏症。在一些实施方式中，该编码涉及神经***疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，ALD、PS1(AD3)、PS2(AD4)、SOD1、UBE3A、ATM、PMP22、MPZ、LITAF、EGR2、MFN2、KIF1B、RAB7A、LMNA、TRPV4、BSCL2、GARS、NEFL、HSPB1、GDAP1、HSPB8、MTMR2、SBF2、SH3TC2、NDRG1、PRX、FGD4、FIG4、DNM2、YARS、GJB1、PRPS1、CSA、CSB、Cx26、EPM2A、ETM1(FET1)、ETM2、FMR1、frataxin、GBA、HTT、HPRT1、BCKDH、ATP7A、ATP7B、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DRB1、NF1、NF2、SMPD1、NPC1、NPC2、LRRK2、PARK7、PINK1、PRKN、SNCA、UCHL1、PAH、PHYH、PEX7、MeCP2、SMN1、ATXN基因(例如，ATXN1、ATXN2等)、ABC1、HEXA、TSC1、TSC2、VHL、CLIP2、ELN、GTF2I、GTF2IRD1、LIMK1、和PXR1，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症，其中癌症是血液***恶性肿瘤，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及血液***恶性肿瘤发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，该编码涉及血液***恶性肿瘤发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，GLI1、CTNNB1、eIF5A、突变体DDX3X、Hexo激酶II、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、ARK5、ALK、MUC1、HMGA2、IRF1、RPN13、HDAC11、Rad51、Spry2、mir-146a、mir-146b、免死蛋白、MDM2、MCL1、CMYC、XBP1(剪接型和未剪接型)、SLAMF7、CS1、Erbb4、Cxcr4(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血(waldenstromsmacroglobulinemia))、Myc、Bcl2、Prdx1和Prdx2(burkitts淋巴瘤)、Bcl6、Idh1、Idh2、Smad、Ccnd2、细胞周期蛋白d1-2、B7-h1(pdl-1)、和Pyk2，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是病毒感染疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及病毒感染疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，病毒感染疾病的特征在于感染肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、人Coxsackie病毒、流感病毒、鼻病毒、echo病毒、风疹病毒、脑炎病毒、狂犬病毒、疱疹病毒、***瘤病毒、多瘤病毒、RSV、腺病毒、黄热病病毒、登革热病毒、副流感病毒、出血性病毒、痘病毒、水痘带状疱疹病毒、副流感病毒、呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒、细小病毒、非洲猪瘟病毒、麻疹、腮腺炎或Norwalk病毒。在一些实施方式中，病毒感染疾病的特征在于感染致癌病毒，该致癌病毒包括，但不限于，CMV、EBV、HBV、KSHV、HPV、MCV、HTLV-1、HIV-1、和HCV。在一些实施方式中，该编码涉及病毒感染疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，编码下列的基因：RSV核衣壳、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S,X、HBV保守序列、HIV Gag多蛋白(p55)、HIV Pol多蛋白、HIV Gag-Pol前体(p160)、HIV基质蛋白(MA、p17)、HIV衣壳蛋白(CA、p24)、HIV间隔肽1(SP1、p2)、HIV核衣壳蛋白(NC、p9)、HIV间隔肽2(SP2、p1)、HIV P6蛋白、HIV逆转录酶(RT、p50)、HIV RNA酶H(p15)、HIV整合酶(IN、p31)、HIV蛋白酶(PR、p10)、HIVEnv(gp160)、gp120、gp41、HIV反式激活因子(Tat)、病毒体蛋白表达的HIV调节子(Rev)、HIV慢病毒蛋白R(Vpr)、HIV Vif、HIV阴性因子(Nef)、HIV病毒蛋白U(Vpu)、人CCR5、miR-122、EBOV聚合酶L、VP24、VP40、GP/sGP、VP30、VP35、NPC1、和TIM-1，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗的疾病或状况是自身免疫性或炎性疾病或状况，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及自身免疫性或炎性疾病或状况发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，自身免疫性或炎性疾病或状况是粉刺、过敏症(allergies)、过敏性反应(anaphylaxis)、哮喘、腹部疾病、憩室炎、肾小球肾炎、炎性肠道疾病、间质性膀胱炎、狼疮、耳炎、***性疾病、类风湿性关节炎、肉状瘤病(sarcoidosis)、或脉管炎。在一些实施方式中，该编码涉及自身免疫性或炎性疾病或状况发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，编码补体***分子(CD46、CD59、CFB、CFD、CFH、CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CFI、CFP、CR1、CR1L、CR2、C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、C3AR1、C4A、C4B、C5、C5AR1、C6、C7、C8A、C8B、C8G、C9、ITGAM、ITGAX、和ITGB2)的基因，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗的疾病或状况是溶酶体贮积病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及溶酶体贮积病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，溶酶体贮积病是鞘脂类代谢障碍(Sphingolipidoses)(例如，Farber病、Krabbe病(婴儿发作性、迟发性)、半乳糖唾液酸沉积症(galactosialidosis)、神经节苷脂沉积症(gangliosidoses)(例如，Fabry病、Schindler病、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿、幼年、成年/慢性)、GM2神经节苷脂沉积症(例如，Sandhoff病(婴儿、幼年、成年发作)、Tay–Sachs))、Gaucher病(I型、II型、III型)、溶酶体酸脂肪酶缺乏症(早发性、迟发性)、Niemann–Pick病(A型、B型)、硫脂类病(例如，异染性脑白质营养不良(MLD)、多发性硫酸酯酶缺乏症缺乏症))、粘多糖贮积症(例如，MPS I Hurler综合征、MPSI S Scheie综合征、MPS I H-S Hurler–Scheie综合征、II型(Hunter综合征)、III型(Sanfilippo综合征)、IV型(Morquio病)、VI型(Maroteaux–Lamy综合征)、VII型(Sly综合征)、IX型(透明质酸酶缺乏症))、粘脂糖症(例如、I型(唾液酸贮积病)、II型(I-细胞疾病)、III型(Pseudo-Hurler多营养不良/磷酸转移酶缺乏症)、IV型(Mucolipidin 1缺乏症))、脂质沉积症(例如、Niemann–Pick病(C型、D型)、神经元蜡样脂褐质沉积症、Wolman病)、Α-甘露糖苷贮积症、Β-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积症、溶酶体运输疾病(例如，胱氨酸贮积症、致密性成骨不全症(Pycnodysostosis)、Salla病/唾液酸贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD))、胆固醇酯贮积病。在一些实施方式中，该编码涉及溶酶体贮积病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，编码下列的基因：神经酰胺酶、Α-半乳糖苷酶(A、B)、Β-半乳糖苷酶、己糖胺酶A、鞘磷脂酶、溶酶体酸脂肪酶、鞘脂激活蛋白B(Saposin B)、硫酸酯酶、透明质酸酶、磷酸转移酶、Mucolipidin 1、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、cystinosin、组织蛋白酶K(cathepsin K)、唾液酸转运蛋白(sialin)、SLC17A5、酸性α-葡萄糖苷酶、LAMP2，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗的疾病或状况是糖原贮积病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及糖原贮积病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，糖原贮积病是von Gierke病、Pompe病、Cori病或Forbes病、Andersen病、McArdle病、Hers病、Tarui病、Fanconi-Bickel综合征、或红细胞醛缩酶缺乏症。在一些实施方式中，该编码涉及糖原贮积病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，编码下列的基因：糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、糖原脱支酶、糖原分支酶、肌肉糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖转运蛋白、GLUT2、醛缩酶A、和β-烯醇酶，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗的疾病或状况是免疫缺陷疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及糖原贮积病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，糖原贮积病是von Gierke病、Pompe病、Cori病或Forbes病、Andersen疾病、McArdle疾病、Hers病、Tarui病、Fanconi-Bickel综合征、或红细胞醛缩酶缺乏症。在一些实施方式中，该编码涉及糖原贮积病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，编码下列的基因：糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、糖原脱支酶、糖原分支酶、肌肉糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖转运蛋白、GLUT2、醛缩酶A、和β-烯醇酶，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗状况的特征在于异常胆固醇水平(如异常高的LDL水平，例如，约100mg/dL以上的LDL，和/或异常低的HDL水平，例如，约40-50mg/dL以下的HDL)，包括，例如，家族性高胆固醇血症，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及胆固醇运输和/或代谢的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，该编码涉及胆固醇运输和/或代谢的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)、载脂蛋白B(ApoB)、低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1)、和PCSK9，包括其突变体。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于激活LDLR表达。利用这种***激活LDLR的细胞表达的方法完全在技术人员的水平之内。指导RNA/DNA序列的示例性LDLR特异性靶序列可包括SEQ ID NOS：110-112展示的任一种。可商业获得的试剂，如核酸酶死Cas9(dCas9)和gRNA载体，是可容易获得的，例如，获自Santa CruzBiotechnology(参见例如，目录编号sc-400645-ACT和sc-400645-ACT-2)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于校正LDLR编码基因中的突变。利用这种***与相应于野生型LDLR序列的模板DNA联用的方法完全在技术人员的水平之内。利用CRISPR***的方法——例如用于在LDLR基因中引入双链DNA断裂——是本领域已知的，并且可组合，例如与用于同源定向DNA修复(HDR)以用野生型序列置换LDLR基因中的突变序列的供体核酸组合。例如，指导RNA序列的示例性靶序列可包括SEQ ID NOS：104-109中展示的任一种。可商业获得的用于在LDLR基因中引入双链DNA断裂和通过HDR校正突变的试剂盒、gRNA载体、和供体载体是可容易获得的，例如，获自SantaCruz Biotechnology(参见例如，目录编号sc-400645和sc-400645-HDR)或GeneCopoeia(参见例如，目录编号HTN210577、HTN261606、HTN261605、HTN261608、和HTN261607)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于引入LDLR编码基因。这种***与包括LDLR编码基因的模板DNA联用的方法完全在技术人员的水平之内。利用CRISPR***的方法——例如用于在基因组中引入双链DNA断裂——是本领域已知的，并且可组合，例如与用于HDR介导的LDLR编码基因在基因组中的***的供体核酸组合。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于激活ApoB表达。利用这种***激活ApoB的细胞表达的方法完全在技术人员的水平之内。指导RNA/DNA序列的示例性ApoB特异性靶序列可包括SEQ ID NOS：119-121中展示的任一种。可商业获得的试剂，如核酸酶死Cas9(dCas9)和gRNA载体，是可容易获得的，例如，获自Santa CruzBiotechnology(参见例如，目录编号sc-400705-ACT和sc-400705-ACT-2)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于校正ApoB编码基因中的突变。这种***与相应于野生型ApoB序列的模板DNA联用的方法完全在技术人员的水平之内。利用CRISPR***的方法——例如用于在ApoB基因中引入双链DNA断裂——是本领域已知的，并且可组合，例如与用于同源定向DNA修复(HDR)以用野生型序列置换ApoB基因中的突变序列的供体核酸组合。例如，指导RNA序列的示例性靶序列可包括SEQ IDNOS：113-118中展示的任一种。可商业获得的用于在ApoB基因中引入双链DNA断裂和通过HDR校正突变的试剂盒、gRNA载体和供体载体是可容易获得的，例如，获自Santa CruzBiotechnology(参见例如，目录编号sc-400705-KO-2和sc-400705-HDR-2)或GeneCopoeia(参见例如，目录编号HTN209218)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于引入ApoB编码基因。这种***与包括ApoB编码基因的模板DNA联用的方法完全在技术人员的水平之内。利用CRISPR***的方法——例如用于在基因组中引入双链DNA断裂——是本领域已知的，并且可组合，例如与用于HDR介导的ApoB编码基因在基因组中的***的供体核酸组合。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于激活LDLRAP1表达。利用这种***激活LDLRAP1的细胞表达的方法完全在技术人员的水平之内。指导RNA/DNA序列的示例性LDLRAP1特异性靶序列可包括SEQ ID NOS：128-130中展示的任一种。可商业获得的试剂，如核酸酶死Cas9(dCas9)和gRNA载体，是可容易获得的，例如，获自Santa Cruz Biotechnology(参见例如，目录编号sc-406114-ACT和sc-406114-ACT-2)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于校正LDLRAP1编码基因中的突变。这种***与相应于LDLRAP1序列的野生型的模板DNA联用的方法完全在技术人员的水平之内。利用CRISPR***的方法——例如用于在LDLRAP1基因中引入双链DNA断裂——是本领域已知的，并且可组合，例如与用于同源定向DNA修复(HDR)以用野生型序列置换LDLRAP1基因中的突变序列的供体核酸组合。例如，指导RNA序列的示例性靶序列可包括SEQ ID NOS：122-127中展示的任一种。可商业获得的用于在LDLRAP1基因中引入双链DNA断裂和通过HDR校正突变的试剂盒、gRNA载体和供体载体是可容易获得的，例如，获自Santa Cruz Biotechnology(参见例如，目录编号sc-406114、sc-406114-KO-2、和sc-406114-HDR-2)或GeneCopoeia(参见例如，目录编号HTN207062)。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于引入LDLRAP1编码基因。这种***与包括LDLRAP1编码基因的模板DNA联用的方法完全在技术人员的水平之内。利用CRISPR***的方法——例如用于在基因组中引入双链DNA断裂——是本领域已知的，并且可组合，例如与用于HDR介导的LDLRAP1编码基因在基因组中的***的供体核酸组合。
在一些实施方式中，本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒被用于抑制PCSK9表达，如通过基因敲除。利用这种***抑制PCSK9的细胞表达的方法完全在技术人员的水平之内。指导RNA/DNA序列的示例性PCSK9特异性靶序列可包括SEQ ID NOS：131-136中展示的任一种。可商业获得的用于在PCSK9基因中引入双链DNA断裂的试剂盒、gRNA载体和供体载体是可容易获得的，例如，获自Santa Cruz Biotechnology(参见例如，目录编号sc-402445)或GeneCopoeia(参见例如，目录编号HTN206606)。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是遗传性疾病，如遗传性疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及遗传性疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，基因组编辑***校正编码涉及遗传性疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因中的突变。在一些实施方式中，遗传性疾病包括，但不限于，22q11.2缺失综合征、软骨发育不全、Α-1抗胰蛋白酶缺乏症、Angelman综合征、常染色体显性多囊肾病、乳腺癌、Canavan病、Charcot–Marie–Tooth病、结肠癌、色盲、囊性纤维化、Duchenne肌营养不良症、Leiden因子V血栓形成倾向、家族性地中海热病、脆性X综合征、Gaucher病、血色素沉着症、血友病、Huntington病、Marfan综合征、肌强直性营养不良、成骨不全、帕金森症疾病、苯丙酮尿症、多囊肾病、卟啉症、Prader–Willi综合征、早衰症、SCID、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩症、Tay–Sachs病、地中海贫血、Trimethylamine、和Wilson病。在一些实施方式中，涉及遗传性疾病发生和/或发展的基因包括，但不限于，AAT、ADA、ALAD、ALAS2、APC、ASPM、ATP7B、BDNF、BRCA1、BRCA2、CFTR、COL1A1、COL1A2、COMT、CNBP、CPOX、CREBBP、CRH、CRTAP、CXCR4、DHFR、DMD、DMPK、F5、FBN1、FECHFGFR3、FGR3、FIX、FVIII、FMO3、FMR1、GARS、GBA、HBB、HEXA、HFE、HMBS、HTT、IL2RG、KRT14、KRT5、LMNA、LRRK2、MEFV、MLH1、MSH2、MSH6、PAH、PARK2、PARK3、PARK7、PGL2、PHF8、PINK1、PKD1、PKD2、PMS1、PMS2、PPOX、RHO、SDHB、SDHC、SDHD、SMNI、SNCA、SRY、TSC1、TSC2、UCHL1、UROD、UROS、MEFV、APP、GAST、INS、LCK、LEP、LIF、MCM6、MYH7、MYOD1、NPPB、OSM、PKC、PIP、SLC18A2、TBX1、甲状腺素运载蛋白、MDS1-EVI1、PRDM16、SETBP1、β-珠蛋白、和LPL，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是老化或退化性疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及老化或退化性疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，该编码涉及老化或退化性疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因包括，但不限于，角蛋白K6A、角蛋白K6B、角蛋白16、角蛋白17、p53、β-2肾上腺素受体(ADRB2)、TRPV1、VEGF、VEGFR、HIF-1、和半胱天冬蛋白酶-2，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗疾病是纤维化或炎性疾病，并且药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括修饰编码涉及纤维化或炎性疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因的序列和/或表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，该编码涉及纤维化或炎性疾病发生和/或发展的蛋白质的一个或多个基因选自SPARC、CTGF、TGFβ1、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、VEGF、血管紧张素II、TIMP、HSP47、血小板反应蛋白、CCN1、LOXL2、MMP2、MMP9、CCL2、腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酰环化酶、Smad 3、Smad 4、Smad 7、SOX9、抑制蛋白、PDCD4、PAI-1、NF-κB、和PARP-1，包括其突变体。
在本文所述方法的一些实施方式中，药物组合物包括这样的基因组编辑复合物或纳米颗粒：包括调节涉及疾病或状况的一种或多种miRNAs的表达的、一种或多种基因组编辑***分子(如完整基因组编辑***)。在一些实施方式中，该疾病或状况包括，但不限于，肝炎B、肝炎C、多囊性肝和肾病、癌症、心血管疾病、心脏衰竭、心脏肥大、神经发育疾病、脆性X综合征、Rett综合征、Down综合征、阿尔茨海默氏症、亨廷顿症、精神***症、炎性疾病、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、银屑病、和骨骼肌疾病。在一些实施方式中，一种或多种miRNAs包括，但不限于，has-mir-126*、Has-miR-191、has-mir-205、has-mir-21、hsa-let-7a-2、let-7家族、let-7c、let-7f-1、miR-1、miR-100、miR-103、miR-103-1、miR-106b-25、miR-107、miR-10b、miR-112、miR-122、miR-125b、miR-125b-2、miR125bl、miR-126、miR-128a、mIR-132、miR-133、miR-133b、miR135、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR143、miR-143、miR145、miR-145、miR-146、miR-146b、miR150、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR16、miR-16、miR-17-19家族、miR-173p、miR17-5p、miR-17-5p、miR-17-92、miR-181a、miR-181b、miR-184、miR-185、miR-189、miR-18a、miR-191、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-198、miR-199、miR-199a、miR-19a、miR-19b-1、miR200a、miR-200a、miR-200b、miR200c、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-208、miR-20a、miR-21、miR-214、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-26a、miR-26b、miR-27b、miR-29、miR-298、miR-299-3p、miR-29c、miR-30a-5p、miR-30c、miR-30d、miR-30e-5p、miR31、miR-34、miR342、miR-381、miR-382、miR-383、miR-409-3p、miR-45、miR-61、miR-78、miR-802、miR-9、miR-92a-1、miR-99a、miR-let7、miR-let7a、和miR-let7g。
在本文所述方法的一些实施方式中，药物组合物通过下列中的任一种被给予个体：静脉内、肿瘤内、动脉内、局部、眼内、眼科、门静脉、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服给予。
在本文所述方法的一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
细胞递送方法
在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到细胞中的方法，包括使细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包括CPP，该CPP包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，细胞是永生化细胞，如来自细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，如来自个体的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或天然杀伤细胞。在一些实施方式中，细胞是源自外周血的T细胞、中央记忆T细胞、源自脐带血的T细胞、或造血干细胞或其它前体细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是T细胞，并且并且接触在激活T细胞后进行。在一些实施方式中，细胞是T细胞，并且接触在激活T细胞后至少12小时(如至少约12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、或更多中的任一者)进行。在一些实施方式中，T细胞用抗CD3/CD28试剂(如microbeads)激活。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，如个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，如个体的肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，基因组编辑***包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***是CRISPR***。在一些实施方式中，一种或多种CRISPR***分子选自CRISPR相关蛋白质(例如，RGEN，如Cas9、或编码RGEN的核酸)和核酸(例如，gRNAs和供体核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。在一些实施方式中，基因组编辑***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、和老化和退化性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种另外的基因组编辑***分子。在一些实施方式中，另外的基因组编辑***可用于治疗疾病。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触根据本文所述任何实施方式的表达复合物。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。
因此，在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到细胞中的方法，包括使细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子和CPP，该CPP包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ IDNOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，细胞是永生化细胞，如来自细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，如来自个体的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或天然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，如个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，如个体的肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，基因组编辑***包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括gRNA或gDNA(或编码gRNA或gDNA的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸——用于将特定修饰引入靶多核苷酸。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是TALEN。在一些实施方式中，基因组编辑***是CRISPR***(例如，CRISPR/Cas9)。在一些实施方式中，基因组编辑***包括整合酶(或编码整合酶的核酸)。在一些实施方式中，基因组编辑***进一步包括供体核酸，该供体核酸包括被整合酶识别的重组位点。在一些实施方式中，基因组编辑***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、和老化和退化性疾病)。在一些实施方式中，基因组编辑***可用于调节涉及疾病的蛋白质，如本文描述的任何待治疗疾病(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、和老化和退化性疾病)。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。在一些实施方式中，细胞穿透肽是ADGN-100肽或VEPEP-3肽。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种CRISPR***(例如，CRISPR/Cas9)分子递送到细胞中的方法，包括使细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种CRISPR***分子和选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，细胞是永生化细胞，如来自细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，如来自个体的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或天然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，如个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，如个体的肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，CRISPR***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、和老化和退化性疾病)。在一些实施方式中，CRISPR***可用于调节涉及疾病的蛋白质，如本文描述的任何待治疗疾病(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、和老化和退化性疾病)。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。在一些实施方式中，细胞穿透肽是ADGN-100肽或VEPEP-3肽。在一些实施方式中，CRISPR***分子包括Cas9(或编码Cas9的核酸)和gRNA(或编码gRNA的核酸)，和任选地，用于引入修饰的供体核酸。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种CRISPR***分子递送到细胞中的方法，包括使细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括一种或多种CRISPR***分子和CPP，该CPP包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，细胞是永生化细胞，如来自细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，如来自个体的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或天然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，如个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，如个体的肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，CRISPR***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、和老化和退化性疾病)。在一些实施方式中，CRISPR***可用于调节涉及疾病的蛋白质，如本文描述的任何待治疗疾病(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、和老化和退化性疾病)。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。在一些实施方式中，细胞穿透肽是ADGN-100肽或VEPEP-3肽。在一些实施方式中，CRISPR***分子包括Cas9(或编码Cas9的核酸)和gRNA(或编码gRNA的核酸)，和任选地，用于引入修饰的供体核酸。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到T细胞中的方法，包括使细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子和选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，如个体的T细胞。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是核酸指导型核酸酶(例如，RGEN或DGEN)，并且细胞穿透肽与组合(如，复合)指导序列(或编码指导序列的核酸)的核酸指导型核酸酶(或编码核酸指导型核酸酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子进一步包括供体核酸作为同源性定向修复的模板。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑整合酶(或编码基因组编辑整合酶的核酸)——任选地组合(如，复合)供体核酸(其包括被整合酶识别的重组位点)以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种另外的基因组编辑***分子。在一些实施方式中，另外的基因组编辑***可用于治疗疾病。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种CRISPR***分子递送到T细胞中的方法，包括使细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中复合物或纳米颗粒包括所述一种或多种CRISPR***分子和CPP，该CPP包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，如个体的T细胞。在一些实施方式中，一种或多种CRISPR***分子选自CRISPR相关蛋白质(例如，RGENs，如Cas9，包括编码RGEN的核酸)和核酸(例如，gRNAs和供体核酸)。在一些实施方式中，CRISPR***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种另外的CRISPR***分子。在一些实施方式中，另外的CRISPR***可用于治疗疾病。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。在一些实施方式中，细胞穿透肽是ADGN-100肽或VEPEP-3肽。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到成纤维细胞中的方法，包括使成纤维细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子和选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，成纤维细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，成纤维细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，成纤维细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，成纤维细胞是永生化成纤维细胞，如来自成纤维细胞系的成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，如个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是核酸指导型核酸酶(例如，RGEN或DGEN)，并且其细胞穿透肽与组合(如，复合)指导序列(或编码指导序列的核酸)的核酸指导型核酸酶(或编码核酸指导型核酸酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子进一步包括供体核酸作为同源性定向修复的模板。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑整合酶(或编码基因组编辑整合酶的核酸)——任选地组合(如，复合)供体核酸(其包括被整合酶识别的重组位点)以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种另外的基因组编辑***分子。在一些实施方式中，另外的基因组编辑***可用于治疗疾病。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到肝细胞中的方法，包括使肝细胞接触本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒，其中复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子和选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，肝细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。在一些实施方式中，肝细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，肝细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，肝细胞是永生化肝细胞，如来自肝细胞系的肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，如个体的肝细胞。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是核酸指导型核酸酶(例如，RGEN或DGEN)，并且细胞穿透肽与组合(如，复合)指导序列(或编码指导序列的核酸)的核酸指导型核酸酶(或编码核酸指导型核酸酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子进一步包括供体核酸作为同源性定向修复的模板。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑整合酶(或编码基因组编辑整合酶的核酸)——任选地组合(如，复合)供体核酸(其包括被整合酶识别的重组位点)以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，基因组编辑***可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种另外的基因组编辑***分子。在一些实施方式中，另外的基因组编辑***可用于治疗疾病。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞接触表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码重组受体如嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，重组受体是特异性结合疾病相关抗原的嵌合抗原受体。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到个体的细胞中的方法，包括给予个体包括本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括一种或多种基因组编辑***分子和选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，组合物通过静脉内、动脉内、腹膜内、囊泡内、皮下、鞘内、颅内、脑内、脑室内、肺内、肌内、气管内、眼内、眼科、门静脉、经皮、皮内、口服、舌下、局部、或吸入途径被给予个体。在一些实施方式中，组合物通过静脉内途径被给予个体。在一些实施方式中，组合物通过皮下途径被给予个体。在一些实施方式中，细胞存在于器官或组织中，该器官或组织包括肺、肝、脑、肾、心脏、脾、血液、胰腺、肌肉、骨髓、和肠。在一些实施方式中，细胞存在于个体的肺、肝、肾、或脾中。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑核酸酶(或编码基因组编辑核酸酶的核酸，如mRNA或DNA质粒)。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是ZFN、TALEN、归巢核酸内切酶、RGEN、或DGEN。在一些实施方式中，基因组编辑核酸酶是核酸指导型核酸酶(例如，RGEN或DGEN)，并且细胞穿透肽与组合(如，复合)指导序列(或编码指导序列的核酸)的核酸指导型核酸酶(或编码核酸指导型核酸酶的核酸)复合，以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子进一步包括供体核酸作为同源性定向修复的模板。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括基因组编辑整合酶(或编码基因组编辑整合酶的核酸)——任选地组合(如，复合)供体核酸(其包括被整合酶识别的重组位点)以形成能够被递送至细胞的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或天然杀伤细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病、或有疾病罹患风险，并且CRISPR***可用于治疗疾病。在一些实施方式中，组合物进一步包括表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，嵌合抗原受体特异性结合疾病相关抗原。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种CRISPR***分子递送到个体的细胞中的方法，包括给予个体包括本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括所述一种或多种CRISPR***分子和CPP，该CPP包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包括SEQ ID NOs：1-14、75和76中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包括SEQ ID NOs：15-40和77中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括SEQ ID NOs：41-52和78中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包括SEQ ID NOs：53-70、79和80中任一者的氨基酸序列。在一些实施方式中，组合物通过静脉内、动脉内、腹膜内、囊泡内、皮下、鞘内、颅内、脑内、脑室内、肺内、肌内、气管内、眼内、眼科、门静脉、经皮、皮内、口服、舌下、局部、或吸入途径被给予个体。在一些实施方式中，组合物通过静脉内途径被给予个体。在一些实施方式中，组合物通过皮下途径被给予个体。在一些实施方式中，一种或多种CRISPR***分子选自CRISPR相关蛋白质(例如，RGENs，如Cas9，包括编码RGEN的核酸)和核酸(例如，gRNAs和供体核酸)。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或天然杀伤细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病、或有疾病罹患风险，并且CRISPR***可用于治疗疾病。在一些实施方式中，组合物进一步包括表达复合物，该表达复合物包括细胞穿透肽(如本文描述的任何细胞穿透肽，包括VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽)和编码嵌合抗原受体的核酸分子。在一些实施方式中，嵌合抗原受体特异性结合疾病相关抗原。在一些实施方式中，细胞穿透肽是ADGN-100肽或VEPEP-3肽。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
细胞工程方法
在一些实施方式中，提供了制备工程化细胞如工程化T细胞的方法，包括本文描述的用于向细胞内递送一种或多种基因组编辑***分子的方法。在一些实施方式中，方法是在此前工程化细胞制备方法(如涉及应用电穿孔或病毒转染的方法)上的改进。在一些实施方式中，改进无限制地包括提高方法的效率，降低方法相关的成本，降低方法的细胞毒性，和/或降低方法的复杂性(如通过消除对意图用于人类的细胞应用病毒方法时所需的预防措施的需要)。
基因组编辑***稳定化方法
在本申请的另一方面中，提供了使一种或多种基因组编辑***分子(如CRISPR***分子)稳定化的方法，包括如本文描述的组合一种或多种基因组编辑***分子与CPP，从而使一种或多种基因组编辑***分子稳定化。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子和CPP形成本文描述的基因组编辑复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子包括核酸，并且CPP使核酸的超螺旋结构稳定化。在一些实施方式中，一种或多种基因组编辑***分子容易降解(例如在体外或体内由于血清组分或核酸酶)，并且CPP保护所述一种或多种基因组编辑***分子免于降解。
将理解，本文描述的任何方法可被组合。因此，例如，第一组一种或多种基因组编辑***分子(如CRISPR***分子)和第二组一种或多种基因组编辑***分子可通过组合本文描述的任何用于将多种基因组编辑***分子递送到细胞中的方法而被递送到细胞中。考虑的可能组合包括两种或更多种本文描述的任何方法的组合。
试剂盒
本文还提供可用于本文所述方法的试剂盒、试剂和制品。这种试剂盒可包含与包含一种或多种基因组编辑***分子(如CRISPR***分子)的小瓶分开的、包含CPPs、组装分子和/或其它细胞穿透肽的小瓶。在患者治疗时，首先基于例如患者样品的基因表达分析或蛋白质学组或组织学分析确定所要治疗的具体病理是什么。获得那些结果后，将CPPs和任何任选的组装分子和/或细胞穿透肽相应地与适当的一种或多种基因组编辑***分子组合，以产生可被给予患者进行有效治疗的复合物或纳米颗粒。因此，在一些实施方式中，提供了试剂盒，其包括：1)CPP，和任选地2)一种或多种基因组编辑***分子。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括组装分子和/或其它细胞穿透肽。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括编码外源分子和任选地细胞穿透肽的核酸分子——本文关于表达复合物所述。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括用于确定基因表达谱图(profile)的剂。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括药学上可接受的载体。
本文描述的试剂盒可进一步包括利用试剂盒组分实践本发明方法的说明书(例如制备本文描述的药物组合物和/或使用该药物组合物的说明书)。实践本发明方法的说明书总体上被记录在适当的记录介质上。例如，说明书可被印刷在基材如纸或塑料等上。因此，说明书可作为包装***物存在于试剂盒中，在试剂盒容器或其构件(即，包装或子包装相关)的标签等中。在一些实施方式中，说明书作为存在于适当的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、磁盘等)上的电子存储数据文件存在。在再其它实施方式中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供从远程来源获得说明书的手段，例如通过因特网。这种实施方式的实例是包括可查看说明书和/或可下载说明书的网址的试剂盒。如同说明书，这种获得说明书的手段被记录在适当的基材上。
试剂盒的各种组分可在单独的容器中，其中容器可被包含在单一外壳内，例如，盒子。
示例性实施方式
实施方式1.在一些实施方式中，提供了用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽和一种或多种基因组编辑***分子，其中细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽，并且其中所述一种或多种基因组编辑***分子选自：
a)RNA指导的核酸内切酶(RGEN)和指导RNA(gRNA)中的一者或两者，其中gRNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列；
b)DNA指导的核酸内切酶(DGEN)和指导DNA(gDNA)中的一者或两者，其中gDNA包括与靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列；
c)锌指蛋白(ZFP)，其中ZFP识别靶多核苷酸中的靶序列；
d)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，其中TALEN识别靶多核苷酸中的靶序列；
e)归巢核酸内切酶，其中归巢核酸内切酶识别靶多核苷酸中的靶序列；和
f)整合酶，其中整合酶识别靶多核苷酸中的重组位点。
实施方式2.实施方式1所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽是VEPEP-3肽。
实施方式3.实施方式2所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括选自SEQID NOs：1-14的氨基酸序列。
实施方式4.实施方式2所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括SEQ IDNO：75或76的氨基酸序列。
实施方式5.实施方式1所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽是VEPEP-6肽。
实施方式6.实施方式5所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括选自SEQID NOs：15-40的氨基酸序列。
实施方式7.实施方式5所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括SEQ IDNO：77的氨基酸序列。
实施方式8.实施方式1所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽是VEPEP-9肽。
实施方式9.实施方式8所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括选自SEQID NOs：41-52的氨基酸序列。
实施方式10.实施方式8所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括SEQ IDNO：78的氨基酸序列。
实施方式11.实施方式1所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽是ADGN-100肽。
实施方式12.实施方式11所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括选自SEQID NOs：53-70的氨基酸序列。
实施方式13.实施方式11所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括SEQ IDNO：79或80的氨基酸序列。
实施方式14.实施方式1-13中任一项所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽进一步包括共价连接至细胞穿透肽N端的一个或多个部分，并且其中所述一个或多个部分选自乙酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向分子。
实施方式15.实施方式14所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括共价连接至其N端的乙酰基基团。
实施方式16.实施方式1-15中任一项所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽进一步包括共价连接至细胞穿透肽C端的一个或多个部分，并且其中所述一个或多个部分选自半胱酰胺、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选地被取代的次氮基三乙酸、羧基、任选地被取代的线性或分支C1-C6烷基、伯胺或仲胺、糖苷衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向分子。
实施方式17.实施方式16所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽包括共价连接至其C端的半胱酰胺基团。
实施方式18.实施方式1-17中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物中的至少一些细胞穿透肽通过键合连接至靶向部分。
实施方式19.实施方式18所述的基因组编辑复合物，其中键合是共价的。
实施方式20.实施方式1-19中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括RGEN和gRNA中的一者或两者。
实施方式21.实施方式20所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括RGEN和gRNA。
实施方式22.实施方式20或21所述的基因组编辑复合物，其中gRNA是单指导RNA(sgRNA)。
实施方式23.实施方式20-22中任一项所述的基因组编辑复合物，其中RGEN是Cas9。
实施方式24.实施方式20-23中任一项所述的基因组编辑复合物，其中RGEN与gRNA的摩尔比在约1：10和约10：1之间。
实施方式25.实施方式20-24中任一项所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约1：1和约80：1之间。
实施方式26.实施方式25所述的基因组编辑复合物，其中细胞穿透肽与RGEN的摩尔比在约5：1和约20：1之间。
实施方式27.实施方式20-26中任一项所述的基因组编辑复合物，进一步包括一种或多种另外的gRNAs，该另外的gRNAs包括不同的指导序列。
实施方式28.实施方式27所述的基因组编辑复合物，其中靶序列存在于靶基因中，并且所述一种或多种另外的gRNAs各自包括与靶基因中的序列互补的指导序列。
实施方式29.实施方式27所述的基因组编辑复合物，其中靶序列存在于第一靶基因中，并且所述一种或多种另外的gRNAs各自包括与一种或多种另外的靶基因中存在的序列互补的指导序列。
实施方式30.实施方式1-19中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括DGEN和gDNA中的一者或两者。
实施方式31.实施方式20中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括DGEN和gDNA。
实施方式32.实施方式1-19中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括ZFP。
实施方式33.实施方式1-19中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括TALEN。
实施方式34.实施方式1-19中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括归巢核酸酶。
实施方式35.实施方式20-34中任一项所述的基因组编辑复合物，进一步包括用于将修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，其中供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列。
实施方式36.实施方式35所述的基因组编辑复合物，其中修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代。
实施方式37.实施方式35或36所述的基因组编辑复合物，其中供体核酸是单链DNA寡核苷酸。
实施方式38.实施方式35所述的基因组编辑复合物，其中修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***。
实施方式39.实施方式35或38所述的基因组编辑复合物，其中供体核酸是包括侧接5’同源臂和3’同源臂的异源核酸的双链DNA，并且其中5’同源臂和3’同源臂与靶多核苷酸待修饰区域侧接的序列同源。
实施方式40.实施方式35-39中任一项所述的基因组编辑复合物，进一步包括一种或多种另外的供体核酸，用于将修饰引入一种或多种另外的靶多核苷酸。
实施方式41.实施方式1-19中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物包括整合酶。
实施方式42.实施方式41所述的基因组编辑复合物，进一步包括用于***靶多核苷酸的供体核酸，其中整合酶识别供体核酸中的重组位点，并且能够介导靶多核苷酸中的重组位点和供体核酸中的重组位点之间的重组，以将供体核酸***靶多核苷酸。
实施方式43.实施方式1-42中任一项所述的基因组编辑复合物，其中基因组编辑复合物的平均直径在约10nm和约300nm之间。
实施方式44.在一些实施方式中，提供了纳米颗粒，其包括核芯，该核芯包括实施方式1-43中任一项所述的基因组编辑复合物。
实施方式45.实施方式44所述的纳米颗粒，其中核芯进一步包括一种或多种另外的、实施方式1-43中任一项所述的基因组编辑复合物。
实施方式46.实施方式44或45所述的纳米颗粒，其中核芯进一步包括用于将修饰引入靶多核苷酸的供体核酸，该供体核酸包括与靶多核苷酸的被修饰以包含该修饰的部分相应的序列，其中供体核酸与第二细胞穿透肽复合。
实施方式47.实施方式46所述的纳米颗粒，其中第二细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。
实施方式48.实施方式47所述的纳米颗粒，其中第二细胞穿透肽包括选自SEQ IDNOs：1-70和75-80的氨基酸序列。
实施方式49.实施方式中46-48任一项所述的纳米颗粒，其中修饰是靶多核苷酸中一个或多个核苷酸的添加、缺失、或取代。
实施方式50.实施方式49所述的纳米颗粒，其中供体核酸是单链DNA寡核苷酸。
实施方式51.实施方式46-48中任一项所述的纳米颗粒，其中修饰是靶多核苷酸中异源核酸的***。
实施方式52.实施方式51所述的纳米颗粒，其中供体核酸是包括侧接5’同源臂和3’同源臂的异源核酸的双链DNA，并且其中5’同源臂和3’同源臂与靶多核苷酸待修饰区域侧接的序列同源。
实施方式53.实施方式46-52中任一项所述的纳米颗粒，其中核芯进一步包括一种或多种另外的供体核酸，用于将修饰引入一种或多种另外的靶多核苷酸。
实施方式54.实施方式44-53中任一项所述的纳米颗粒，其中纳米颗粒中的至少一些细胞穿透肽通过键合连接至靶向部分。
实施方式55.实施方式44-53中任一项所述的纳米颗粒，其中核芯被外壳包覆，该外壳包括外周细胞穿透肽。
实施方式56.实施方式55所述的纳米颗粒，其中外周细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。
实施方式57.实施方式56所述的纳米颗粒，其中外周细胞穿透肽包括选自SEQ IDNOs：1-70和75-80的氨基酸序列。
实施方式58.实施方式55-57中任一项所述的纳米颗粒，其中外壳中的至少一些外周细胞穿透肽通过键合连接至靶向部分。
实施方式59.实施方式54或58所述的纳米颗粒，其中键合是共价的。
实施方式60.实施方式44-59中任一项所述的纳米颗粒，其中纳米颗粒的平均直径在约10nm和约400nm之间。
实施方式61.在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包括实施方式1-43中任一项所述的基因组编辑复合物或实施方式44-60中任一项所述的纳米颗粒，和药学上可接受的载体。
实施方式62.实施方式61所述的药物组合物，进一步包括表达复合物，该表达复合物包括第三细胞穿透肽和编码外源蛋白质的核酸分子。
实施方式63.实施方式62所述的药物组合物，其中外源蛋白质是能够在细胞表面上被表达的重组受体。
实施方式64.实施方式63所述的药物组合物，其中重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式65.实施方式62-64中任一项所述的药物组合物，其中第三细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。
实施方式66.实施方式65所述的药物组合物，其中第三细胞穿透肽包括选自SEQID NOs：1-70和75-80的氨基酸序列。
实施方式67.在一些实施方式中，提供了制备实施方式1-19中任一项所述的基因组编辑复合物的方法，包括组合细胞穿透肽与一种或多种基因组编辑***分子，从而形成基因组编辑复合物。
实施方式68.实施方式67所述的方法，其中所述一种或多种基因组编辑***分子包括RGEN和gRNA，并且其中细胞穿透肽和RGEN分别以约1：1至约80：1的比例组合，并且RGEN和gRNA分别以约10：1至约1：10的比例组合。
实施方式69.实施方式68所述的方法，其中细胞穿透肽和RGEN分别以约5：1至约20：1的比例组合。
实施方式70.实施方式68或69所述的方法，其中RGEN和gRNA以约1：1的比例组合。
实施方式71.在一些实施方式中，提供了将一种或多种基因组编辑***分子递送到细胞中的方法，包括使细胞接触实施方式1-43中任一项所述的基因组编辑复合物或实施方式44-60中任一项所述的纳米颗粒，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括所述一种或多种基因组编辑***分子。
实施方式72.实施方式71所述的方法，其中细胞与基因组编辑复合物或纳米颗粒的接触在体内进行。
实施方式73.实施方式71所述的方法，其中细胞与基因组编辑复合物或纳米颗粒的接触离体进行。
实施方式74.实施方式71所述的方法，其中细胞与基因组编辑复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。
实施方式75.实施方式71-74中任一项所述的方法，其中细胞是粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、天然杀伤细胞、成纤维细胞、肝细胞、肺祖细胞、或神经元细胞。
实施方式76.实施方式75所述的方法，其中细胞是T细胞。
实施方式77.实施方式75或76所述的方法，其中基因组编辑***靶向选自下列的基因中的序列：PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CTLA-4、TIGIT、4-1BB、OX40、CD27、TIM-1、CD28、HVEM、GITR、和ICOS。
实施方式78.实施方式71-77中任一项所述的方法，进一步包括使细胞接触包括第四细胞穿透肽和编码外源蛋白质的核酸分子的表达复合物。
实施方式79.实施方式78所述的方法，其中外源蛋白质是能够在细胞表面上被表达的重组受体。
实施方式80.实施方式79所述的方法，其中重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式81.实施方式78-80中任一项所述的方法，其中第四细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽、和ADGN-100肽。
实施方式82.实施方式81所述的方法，其中第四细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：1-70和75-80的氨基酸序列。
实施方式83.在一些实施方式中，提供了修饰细胞中的靶多核苷酸的方法，包括使细胞接触实施方式1-43中任一项所述的基因组编辑复合物或实施方式44-60中任一项所述的纳米颗粒，其中基因组编辑复合物或纳米颗粒包括靶向靶多核苷酸中的序列的一种或多种基因组编辑***分子。
实施方式84.在一些实施方式中，提供了治疗个体的疾病的方法，包括给予个体有效量的、实施方式61-66中任一项所述的药物组合物。
实施方式85.实施方式84所述的方法，其中疾病选自癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼病、肝病、肺病、肾病、老化和退化性疾病，和特征在于胆固醇水平异常的疾病。
实施方式86.实施方式85所述的方法，其中疾病是癌症。
实施方式87.实施方式86所述的方法，其中癌症是实体肿瘤，并且其中药物组合物包括基因组编辑复合物或纳米颗粒，该基因组编辑复合物或纳米颗粒包括调节选自下列的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子：生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调谐子、蛋白质表达和修饰调节子、肿瘤抑制因子、和凋亡和转移调节子。
实施方式88.实施方式87所述的方法，其中癌症是肝、肺、或肾的癌症。
实施方式89.实施方式86所述的方法，其中癌症是血液***恶性肿瘤，并且其中药物组合物包括基因组编辑复合物或纳米颗粒，该基因组编辑复合物或纳米颗粒包括调节选自下列的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子：生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调谐子、蛋白质表达和修饰调节子、肿瘤抑制因子、和凋亡和转移调节子。
实施方式90.实施方式85所述的方法，其中疾病是病毒感染疾病，并且其中药物组合物包括基因组编辑复合物或纳米颗粒。该基因组编辑复合物或纳米颗粒包括调节涉及病毒感染疾病发生和/或发展的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子。
实施方式91.实施方式85所述的方法，其中疾病是遗传性疾病，并且其中药物组合物包括基因组编辑复合物或纳米颗粒，该基因组编辑复合物或纳米颗粒包括调节涉及遗传性疾病发生和/或发展的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子。
实施方式92.实施方式85所述的方法，其中疾病是老化或退化性疾病，并且其中药物组合物包括基因组编辑复合物或纳米颗粒，该基因组编辑复合物或纳米颗粒包括调节涉及老化或退化性疾病发生和/或发展的一种或多种蛋白质的表达的、一种或多种基因组编辑***分子。
实施方式93.实施方式85所述的方法，其中疾病是纤维化或炎性疾病，并且其中药物组合物包括基因组编辑复合物或纳米颗粒，该基因组编辑复合物或纳米颗粒包括调节涉及纤维化或炎性疾病发生和/或发展的两种或更多种蛋白质的表达的一种或多种基因组编辑***分子。
实施方式94.实施方式84-93中任一项所述的方法，其中个体是人。
实施方式95。在一些实施方式中，提供了试剂盒，其包括组合物，该组合物包括实施方式1-43中任一项所述的基因组编辑复合物和/或实施方式44-60中任一项所述的纳米颗粒。
实施例
本领域技术人员将认识到多种实施方式可能在本发明的范围和精神内。现将参考下文非限制性实施例对本发明进行更详细的描述。下文实施例进一步示例本发明，而当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
材料和方法
Lipofectamine 2000、RNAiMAX、TranscriptAid T7转录试剂盒、MEGAclear转录清理试剂盒、GeneArt Genomic Cleavage Detection试剂盒、和Platinum Green Hot StartPCR混合物得自Thermo Fisher Life Science(法国)。CRISPR/Cas9抗体得自Diagenode(Diagenode目录编号C15200223)和ABCAM(克隆7A9-ab191468)。HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒得自New England Biolab。所有寡核苷酸得自Eurogentec(比利时)。
gRNA
gRNAs通过体外转录获得。sgRNA的生成利用可体外转录的、包含T7启动子衔接序列作为PCR产物的模板的通用sgRNA表达质粒进行。利用TranscriptAid T7高收率转录试剂盒(Thermo Fisher life science，法国)，按照制造商的说明，将包含T7启动子结合位点后接20-bp sgRNA靶序列的线性DNA片段体外转录。将体外转录的gRNAs用乙醇沉淀，并进一步利用MEGAclear转录清理试剂盒(Thermo Fisher life Science)纯化。将sgRNAs原液溶于水中，通过UV吸光度定量，并储存在80℃下。
按照Fu et al.(2013).Nature biotechnology,31(9):822-826，利用sgRNA表达质粒(Addgene 47511，质粒pFYF1320 EGFP)，通过体外转录获得EGFP gRNA。EGFP靶位点：GGGCACGGGCAGCTTGCCGG(SEQ ID NO：71)。
按照Fu et al.，2013(出处同上)，利用sgRNA表达质粒(Addgene#47508，质粒pFYF1548 EMX1)，通过体外转录获得EMX1 gRNA。EMX1靶位点：GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA(SEQID NO：72)。
按照Liao et al.,(2015).Nucleic acids research,gkv675，利用sgRNA表达质粒(Addgene#69539，质粒HPRT2b-pGEM)，通过体外转录获得HPRT gRNA。HPRT靶位点：GACTGTAAGTGAATTACTT(SEQ ID NO：73)。
按照Mali et al.,(2013).Science,339(6121):823-826，利用sgRNA表达质粒(Addgene#41818，质粒gRNA_AAVS1-T2)，通过体外转录获得AAVS gRNA。AAVS靶位点：GGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO：74)。
按照Hart,T.,et al.(2015).Cell,163(6),1515-1526，利用sgRNA表达质粒(Addgene#74190，质粒pLCKO_荧光素酶_sgRNA)，通过体外转录获得荧光素酶gRNA。荧光素酶靶位点：ACAACTTTACCGACCGCGCC(SEQ ID NO：103)。
利用得自Eurogentec(比利时)的sgRNA表达质粒gRNAhPD1a和gRNAhPD1b，通过体外转录获得hPD1 gRNA。hPD1sgA1：ACCGCGTGACTTCCACATGAGCG(SEQ ID NO：99)。hPD1sgB1：AAACCGCTCATGTGGAAGTCACG(SEQ ID NO：100)。hPD1sgC1f：ACCGCAGTTGTGTGACACGGAAG(SEQID NO：101)。hPD1sgD2：AAACCTTCCGTGTCACACAACTG(SEQ ID NO：102)。
CAS9 mRNA
利用HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒(New England Biolab)和用于DNA模板的线性化pCS2-CAS9载体(Addgene#47322)，制备CAS9 mRNA。通过LiCl沉淀、苯酚：氯仿提取和乙醇沉淀，将合成的mRNA纯化。通过测量260nM下的紫外光吸光度确定mRNA浓度，并将样品储存在-20℃下。关于体内研究，从ThermoFisher获得聚腺苷酸化的封端的CAS9 mRNA。
CAS9蛋白表达和纯化
将酿脓链球菌HIS-NLS-CAS9在大肠杆菌中表达，并如前Zuris et al.,2015.Nature biotechnology,33(1):73-80所述纯化。使酿脓链球菌HIS-CAS9-NLS pET29表达载体(Addgene#62933)在BL21 STAR(DE3)感受态细胞中转化。使细胞在包含100mg/ml氨苄西林的luria Bertani(LB)培养基中在37℃下生长上至约0.5OD595。然后使细胞培养物冷却至20℃，并用0.5mM Isopropl-1-硫-β-D-半乳糖吡喃糖苷诱导蛋白质表达过夜。将细胞通过离心收集并通过声处理在包含50mM HEPES(pH 8.0)、0.5mM NaCl、50mM KCl、20％甘油和0.5mM Tris(2-羧基乙基)膦(TCEP)裂解缓冲剂中裂解。通过在20,000x g下离心30min获得包含HIS-NLS-CAS9的可溶性裂解物，并将其在4℃下与2ml NI-NTA(氮川乙酸)琼脂糖树脂(Thermo Fisher Life Science)培育1hr。然后将树脂用裂解缓冲剂洗涤两次，并用HEPES(pH 8.0)、0.1M NaCl、20％甘油、10mM TCEP和300mM咪唑洗脱HIS-NLS-CAS9蛋白。将蛋白质溶液施加至HITrap脱盐柱(GE Healhcare Life Science)，并在包含50mM HEPES(pH8.0)、0.1mM NaCl、20％甘油和10mM TCEP缓冲剂中平衡的阳离子交换HITrap SP HP柱(GEHealhcare Life Science)上进一步纯化。将HIS-CAS9-NLS用线性NaCl梯度洗脱，浓缩上至5mg/ml，并储存在-80℃下。对于一些研究，从Thermo Fisher Life Science(法国)获得CAS9蛋白。
细胞穿透肽：
肽以乙酸盐形式得自GENEPEP Montpellier(法国)。使用下列肽：
VEPEP-3a：βAKWFERWFREWPRKRR(SEQ ID NO：75)
VEPEP-3b：βAKWWERWWREWPRKRR(SEQ ID NO：76)
VEPEP-6：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO：77)
VEPEP-9：βALRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO：78)
ADGN-100a：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO：79)
ADGN-100b：βAKWRSALYRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO：80)
CADY：GLWRALWRLLRSLWRLLWKV(SEQ ID NO：81)
肽原液在蒸馏水或5％DMSO中以2mg/mL制备，并在水浴声波器中声处理10min，然后在使用前刻稀释。
细胞系
使用几种细胞系，包括稳定EGFP表达细胞系(GFP-U2OS、EGFP-JURKAT T、EGFP-HEK)以及U2OS(HTB-96TM)、原代人成纤维细胞、Hep G2(/>HB-8065TM)、人胚胎肾(HEK293)(/>CRL-1573TM)、人骨髓性白血病K562细胞(/>CCL243TM)、Jurkat T细胞(/>TIB-152TM)、人ESCs(H9)、和小鼠ESCs(ESF 158)。细胞得自American TypeCulture Collection[ATCC]。
实施例1：细胞穿透肽介导的、用于基因中断RGEN/gRNA蛋白-RNA复合物的功能性递送
关于RGEN/gRNA复合物在不同细胞系中的功能性细胞递送，对五种细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、VEPEP-3、ADGN-100和CADY)进行评价。将细胞穿透肽与包括RNA指导的核酸内切酶(RGEN)CAS9和指导RNA(gRNA)的基因组编辑RGEN/gRNA复合物缔合，其中gRNA包括与核酸序列靶互补的指导序列。通过监测在3种稳定EGFP表达细胞系(U2OS、Jurkat T、和HEK)中外源EGFP基因的基因中断和/或在小鼠和人细胞系(U2OS、HEK和K562)(包括人(H9)和小鼠(ESF-158)胚胎干(ES)细胞)中内源EMX1、AAVS、或HPRT内源基因的基因中断，考察CPP介导的、RGEN/gRNA复合物的功能性递送。
CPPs与RGEN(CAS9)和RGEN/gRNA(CAS9/sgRNA)复合物形成稳定的复合物
通过荧光光谱法，利用CY5荧光标记的CAS9蛋白，监测CPP/CAS9和CPP/CAS9/sgRNA复合物的形成。利用马来酰亚胺-CY5，将CAS9蛋白用CY5染料在可及的(accessible)半胱氨酸残基上标记。如图1A和1B所示，固定的5nM浓度的CY5-CAS9(图1A)或CY5-CAS9：sgRNA(以1：1的摩尔比)(图1B)用递增浓度的CPPs(VEPEP-3a/b、VEPEP-6、VEPEP-9、ADGN-100a/b、CADY)滴定。曲线拟合证明，VEPEP-3a/b、ADGN-100a/b和VEPEP-9与CY5-CAS9和CY5-CAS9/sgRNA复合物均相互作用，而VEPEP-6和CADY仅结合CY5-CAS9：sgRNA复合物。如表1所示，VEPEP-3a/b和ADGN-100a/b肽构成最有效的肽，并且对低纳摩尔范围内的RGEN/gRNA复合物呈现非常高的亲和力，VEPEP-9和CADY是中等结合物，并且VEPEP-6与CY5-CAS9和CY5-CAS9/sgRNA复合物均相互作用不良。
表1：CPP/CAS9、和CPP/CAS9-sgRNA结合参数。
对CPP/CAS9和CPP/CAS9/sgRNA颗粒进一步表征；用Zetasizer 4设备(MalvernLtd)测量平均尺寸、多分散性和ζ电位。在分析前，将CAS9和预载CAS9/gRNA与VEPEP-3b、VEPEP-9、ADGN-100a和CADY肽以10：1和20：1的CPP/货物摩尔比在生理条件(0.9％NaCl)下、在20℃下混合，并在37℃下培育30min。在25℃下确定CCP/CAS9和CCP/CAS9：gRNA复合物的平均尺寸和多分散性，每次测量3min，并用Zetasizer 4设备(Malvern Ltd)测量ζ电位。3次单独实验的平均值的数据显示在表2中。
在摩尔比10：1或20：1下，VEPEP-3b和ADGN-100a肽均能够与CAS9和CAS9：gRNA复合物形成稳定纳米颗粒。VEPEP-3b和ADGN-100a分别获得约50nm和80nm的平均直径以及0.25和0.35的多分散指数(PI)。对于10：1和20：1摩尔比，通过ζ电位获得的ADGN-100a/CAS9和ADGN-100a/CAS9：gRNA颗粒电荷相似，平均值在10：1的摩尔比下分别为6.0±0.8mV和5.3±1.0mV，并且在20：1的摩尔比下分别为7.2±1mV和4.8±0.3mV。对于10：1和20：1摩尔比，通过ζ电位获得的VEPEP-3b/CAS9和VEPEP-3b/CAS9：gRNA颗粒电荷相似，在10：1下平均值在17.0±0.5mV和27.0±4mV之间的范围内。
相比之下，CADY未与CAS9形成任何复合物，并且在10：1的摩尔比下，CADY和VEPEP-9均未与预载CAS9：gRNA复合物形成稳定颗粒。在摩尔比20：1下，VEPEP-9和CADY分别获得170±10和350±20nm的颗粒平均尺寸和0.58和0.6的多分散指数。
表2：CPP/RGEN和CPP/RGEN：gRNA纳米颗粒表征
靶向EGFP报告基因的RGEN/gRNA复合物的、CPP介导的功能性递送
关于RGEN/gRNA复合物的细胞递送，对五种CPPs(VEPEP-3b、VEPEP-6、VEPEP-9、CADY和ADGN-100a)进行评价。利用成熟建立的CAS9-诱导的基因中断方法(Fu et al，2013，出处同上)，通过靶向表达EGFP(GFP-U2OS，EGFP-HEK、EGFP-JURKAT)的3种人细胞系中的外源EGFP报告基因的特定位点，定量CPP介导的递送效力。
将两亲性肽原液在蒸馏水中以1mg/mL制备并声处理10min。在与该肽形成复合物前，将CAS9蛋白以1：1摩尔比预载纯化的EGFP sgRNA并培育10min。在细胞转染前，将预载CAS9/gRNA复合物(10nM、25nM、和50nM)与CPPs以5：1、10：1和20：1的CPP/货物摩尔比混合，并在37℃下培育30min。
将包含单个整合化EGFP报告基因(GFP-U2OS、EGFP-HEK和EGFP-JURKAT)的细胞系在包含5％CO2的潮湿气氛中，在37℃下，在补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中培养。使在转染前一天接种在35mm培养皿中的共计150,000个细胞生长至50-60％汇合并用200μl预先形成的复合物覆盖，培育3-5min，随后添加400μl的DMEM。在37℃下的30min培育后，添加包含16％FCS的1mL新制DMEM以达到10％的最终FCS浓度，而不移除CPP/CAS9-gRNA复合物覆层。将细胞放回培养箱72小时。
利用流式细胞术，通过监测EGFP表达水平，分析CAS9引起的双链断裂形成。图2-5中显示的基因中断频率数据作为3次单独实验的平均值平均值报告。Lipofectamine 2000和RNAiMAX递送方法均用作阳性对照。
如图2A-2D和图3A-3D所示，所有CPPs均促进了CAS9/gRNA的功能性递送并且在EGFP-U2OS和EGFP-HEK细胞中均引起了EGFP表达的CAS9/gRNA浓度依赖性下损失。最佳双链断裂形成由以20：1的CPP与预载CAS9/gRNA的摩尔比形成的CPP/CAS9/gRNA复合物获得，并且利用分别以1：1或1：2摩尔比形成的预载CAS9/gRNA未观察到差异。
在U2OS细胞中，通过与VEPEP-3b、ADGN-100a、VEPEP-9、CADY和VEPEP-6缔合的CAS9：gRNA(50nM)(20：1的CPP/货物摩尔比)分别获得92％、87％、55％、33％和25％的EGFP表达减少。相比之下，分别利用Lipofectamine 2000或RNAiMAX作为递送载体，获得22％或71％的EGFP表达减少(图2C)。
在HEK细胞中，通过与VEPEP-3b、ADGN-100a、VEPEP-9、CADY和VEPEP-6缔合的CAS9：gRNA(50nM)(20：1的CPP/货物摩尔比)，分别获得93％、86％、58％、42％和30％的EGFP表达减少。相比之下，利用Lipofectamine 2000或RNAiMAX作为递送载体，分别获得35％或78％的EGFP表达减少(图3C)。
对于这两种细胞系，通过ADGN-100a和VEPEP-3b肽获得较多双链断裂形成，导致EGFP阳性细胞的减少多于85％。剂量响应考察(图2D和3D)证明，CAS9：gRNA在与ADGN-100a或VEPEP-3b缔合时可在低纳摩尔浓度下有效。利用与VEPEP-3b或ADGN-100a缔合的1nMCAS9：gRNA，分别使表达EGFP的U2OS细胞的数量减少68％或57％。利用与VEPEP-3b或ADGN-100a缔合的1nM CAS9：gRNA，分别使表达EGFP的HEK细胞的数量减少71％或62％。相比之下，对于这两种细胞系，在利用VEPEP-6、CADY和Lipofectamine 2000时，利用1nM CAS9：gRNA不导致EGFP表达变化，并且利用RNAiMIX或VEPEP-9分别获得仅18％或5％的EGFP表达损失。因此，对于递送CRISPR复合物，ADGN-100a和VEPEP-3b比Lipofectamine和CADY有效7至10倍，并且比RNAiMAX有效2至4倍。
如图4A-4D和图5A和5B所示，ADGN-100和VEPEP-3肽促进CAS9/gRNA的功能性递送，并且引起EGFP-JURKAT细胞中EGFP表达的浓度依赖性损失。这两种肽均导致EGFP阳性细胞的减少多于80％(81％——ADGN-100a和87％——VEPEP-3b)。通过VEPEP-9或CADY，分别获得EGFP阳性细胞的仅22％或18％减少，并且通过VEPEP-6或Lipofectamine 2000未观察到EGFP细胞数量的显著变化。对于递送CRISPR复合物，ADGN-100a和VEPEP-3b肽比Lipofectamine和CADY有效12至20倍。关于其它细胞系，剂量响应分析(图4D)证明，在JURKAT中，CAS9：gRNA与ADGN-100a和VEPEP-3b缔合时可在低纳摩尔浓度下有效。利用与VEPEP-3b或ADGN-100a缔合的1nM CAS9：gRNA，分别使EGFP表达细胞的数量减少55％或51％。相比之下，在相同CAS9：gRNA浓度下，利用VEPEP-6、CADY、VEPEP-9或Lipofectamine2000未观察到EGFP表达的显著变化，并且利用RNAiMAX获得EGFP表达的仅18％损失。
CPP介导的CAS9/sgRNA复合物的细胞递送不引起毒性
发现在这三种细胞系中观察到的可靠的EGFP中断不是因为细胞毒性。考察CPP/CAS9/gRNA复合物在这三种细胞系(EGFP-U2OS、EGFP-HEK，EGFP-JURKAT)中的毒性。将在转染前一天接种于24孔板中的共计30,000细胞与1至200nM范围内递增浓度的CPP/CAS9/gRNA(以10：1或20：1的CPP与预载CAS9/gRNA复合物的摩尔比复合)一起培育30min，然后添加培养基以达到至最终10％的FCS浓度。24小时后通过比色MTT分析(Sigma，德国)测量细胞毒性响应。对于MTT分析，将细胞培养基移除并更换为包含2.5mg/ml MTT的PBS，4小时。结果相应于3次单独实验的平均值。如图6A-6C所示，对于上至100nM的浓度，VEPEP-3b或ADGN-100a肽在这三种细胞系中未观察到毒性。在200nM下使存活率减少小于10％。相比之下，在200mM下，关于Lipofectamine2000或RNAiMAX，观察到60-70％和20-25％之间的细胞死亡——取决于细胞系。此外，这两种脂质方法均对JURKAT细胞呈现高度毒性，引起75％(Lipofectamine 2000)或45％(RNAiMAX)的细胞死亡。
CPP介导的、靶向EMX1内源基因的RGEN/gRNA复合物的功能性递送
关于靶向3种人细胞系(U2OS、JURKAT和K562)中的内源EMX1基因的RGEN/gRNA复合物的细胞递送，对VEPEP-3b、VEPEP-9和ADGN-100a肽进行评价。
将预载CAS9/gRNA(25nM、50nM)复合物与VEPEP-3b、VEPEP-9和ADGN-100a肽以20：1的CPP/货物摩尔比混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。RNAiMAX递送用作阳性对照，因为其此前被报道显示结果优于Lipofectamine 2000(Zuris et al.，2015，出处同上)。将细胞系(U2OS、JURKAT和K562)在补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中，在37℃下，在包含5％CO2的潮湿气氛中培养。使在转染前一天接种在35mm培养皿中的共计150,000细胞生长至50-60％汇合并用200μl预先形成的复合物覆盖，培育3-5min，随后添加400μl的DMEM。在37℃下的30min培育后，添加包含16％FCS的1mL新制DMEM以达到10％的最终FCS浓度，而不移除CPP/CAS9-gRNA复合物覆层。将细胞放回培养箱72小时。对CAS9引起的双链断裂形成然后通过非同源末端接合(NHEJ)进行的修复通过T7E1分析或基因组切割检测试剂盒(GCD Thermo Fisher)进行分析，并利用片段分析***来定量。利用T7E1分析，定量靶基因中的***缺失频率。
如图7A-7C所示和表3总结，VEPEP-3b和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均在全部三种细胞系中引起EMX-1基因的可靠编辑。在这三种细胞系中，RGEN/gRNA引起NHEJ介导的在目标靶位点处的***缺失突变。利用25nM浓度的CAS9-gRNA，在U2OS，K562和JURKAT细胞中与ADGN-100a一起递送时，分别获得67％、71％、和65％的平均***缺失频率。利用VEPEP-3b在U2OS、K562和JURKAT细胞中分别获得75％、79％、和69％的平均***缺失频率。利用VEPEP-9在U2OS、K562、和JURKAT细胞中分别获得27％、29％、和21％的平均***缺失频率。VEPEP-3b和ADGN-100a效率与RNAiMAX相比高至少2倍，RNAiMAX在同样的细胞系中呈现31％、39％、和22％的***缺失频率。
表3：对于RGEN/gRNA递送不同肽与RNAiMAX的比较和在不同细胞系中通过T7E1分析测量的所得编辑效率。
实施例2：用于编辑多基因的RGEN/gRNA复合物的、CPP介导的功能性递送
人细胞系
然后，关于靶向表达EGFP的两种人细胞系(GFP-U2OS、EGFP-JURKAT)中的内源EMX1和外源EGFP报告基因的多种RGEN/gRNA复合物的细胞递送，对VEPEP-3、VEPEP-9和ADGN-100肽进行评价。将两种预载CAS9/gRNA复合物(25nM)与VEPEP-3b、VEPEP-9和ADGN-100a肽以20：1的CPP/货物摩尔比混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。RNAiMAX递送用作阳性对照。将细胞如前所述进行处理，并在转染后72hr分析CAS9引起的NHEJ。对CAS9引起的双链断裂形成然后通过非同源末端接合(NHEJ)进行的修复通过T7E1分析或基因组切割检测试剂盒(GCD Thermo Fisher)进行分析，并利用片段分析***来定量。利用T7E1分析定量EMX1基因中的缺失(***缺失)频率，并通过流式细胞术监测EGFP表达的损失。RGEN/gRNA引起的靶上(命中，on-target)突变的数据以3次单独实验的平均值报告。
如图8A-8C所示和表4总结，VEPEP-3b和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均在两种细胞系中引起EMX-1和EGFP基因的可靠编辑。在这两种细胞系中，RGEN/gRNA在目标靶位点处引起NHEJ介导的***缺失突变。
利用25nM浓度的CAS9-gRNA，在U2OS和JURKAT细胞中通过ADGN-100a或VEPEP-3b获得对两种基因均多于70％的平均***缺失频率。VEPEP-9在U2OS和JURKAT细胞中分别获得约30％和15％的平均***缺失频率。通过脂质系载体RNAiMAX获得U2OS细胞中40％的基因中断效率和JURKAT细胞中28％的基因中断效率。VEPEP-3b和ADGN-100a肽各自在U2OS和JURKAT细胞中分别比RNAiMAX有效约2倍和2.8倍。
表4：对于多重RGEN/gRNA递送不同肽与RNAiMAX的比较和在不同细胞系中通过T7E1分析测量的所得编辑效率
总之，这些结果证明，VEPEP-3和ADGN-100肽均构成在不引起任何毒性响应的情况下在不同细胞系(包括难转染细胞系如JURKAT)中功能性递送多种RGEN/gRNA复合物的有效方法。
胚胎干细胞
然后，关于靶向U2OS以及人(H9)和小鼠(ESF-158)胚胎干细胞中的三种内源EMX1、AAVS和HPRT基因的多种RGEN：gRNA复合物的细胞递送，对VEPEP-3和ADGN-100肽进行评价。将3种预载CAS9/gRNA复合物(各20nM)与VEPEP-3b和ADGN-100a肽以20：1的CPP/货物摩尔比混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。RNAiMAX递送方法用作阳性对照。
U2OS将细胞如前所述进行处理。将H9胚胎干细胞在具有4mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改性Eagle培养基中培养，该培养基被调整以包含1.5g/L碳酸氢钠的和4.5g/L葡萄糖并且补充有0.1mM 2-巯基乙醇，85％；和15％ES细胞适格胎牛血清。将小鼠ESF-158胚胎干细胞在补充有0.1mM 2-巯基乙醇、1,000U/mL小鼠白血病抑制因子(LIF)和15％ES细胞适格FBS的小鼠ES细胞基础培养基中培养。对CAS9引起的双链断裂形成然后通过NHEJ进行的修复在转染后72hr通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。利用T7E1分析来定量EMX1、AAVS和HPRT基因中的缺失(***缺失)频率。RGEN：gRNA引起的靶上突变的数据以3次单独实验的平均值报告。
如表5所示，VEPEP-3b和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均在测试的这两种ES细胞系中引起EMX-1、AAVS和HPRT基因的可靠编辑。在全部三种细胞系中，RGEN/gRNA引起NHEJ介导的在目标靶上处的***缺失突变。相比之下，利用RNAiMAX递送方法在ES细胞系中观察到无或可忽略不计的基因编辑。
利用20nM浓度的3种CAS9/gRNA复合物，在U2OS和小鼠ES细胞中通过ADGN-100a或VEPEP-3b获得这三种基因大于70％的平均***缺失频率。在H9细胞中获得大于60％的平均***缺失频率。这些结果进一步证明，VEPEP-3和ADGN-100肽是递送多种RGEN：gRNA复合物的有效的媒介。
表5：对于ES细胞中的RGEN：gRNA递送不同肽与RNAiMAX的比较
实施例3：CPP介导的RGEN/gRNA复合物的功能性递送和通过同源定向修复(HDR)的基因编辑
关于用于利用精确的同源定向修复(HDR)的基因组工程的三元RGEN/gRNA/ssDNA复合物的递送，对VEPEP-3和ADGN-100肽进行评价。在三元复合物中，CAS9/gRNA(靶向EMX1基因)与ssDNA供体(使10-12个核苷酸在U2OS和JUKAT细胞中通过HDR***目标基因)缔合。
ss供体模板：5’-GGGGAGGACATCGATGTCACCTCCAATGAC AAGCTTGCTAGCGGTGGGCAACCACAAACCCACGAGGGCAGA-3’(SEQ ID NO：82)
ssDNA包含2个30nt的同源臂，该同源臂包围12核苷酸***序列(***在SEQ IDNO：82中以粗体显示)。该12核苷酸***包含特定的HindIII和NheI限制位点，该限制位点用于定量HDR效率。
EMX1部位的基因组编辑实验如下进行：为了高水平的双链断裂形成而优化实验——利用与VEPEP-3b或ADGN-100a肽以20：1的CPP/货物摩尔比缔合的50nM浓度的预载RGEN/gRNA。这种条件导致对于JURKAT T和U2OS细胞系均大于80％的双链断裂效率，如图2C和图4C报告。50nM的RGEN/gRNA和ssDNA-供体均与VEPEP-3b或ADGN-100a肽以20：1的CPP/货物摩尔比缔合——通过将所有组分组合在一起以形成三元复合物(RGEN/gRNA/ssDNA/CPP)或通过单独在一个步骤中将CPP与RGEN/gRNA复合物组合和在另一步骤中将CPP与ssDNA-供体组合以形成两个单独的复合物(RGEN/gRNA/CPP和ssDNA/CPP)，如表4所示。RNAiMAX用作对照。
使细胞生长至50-60％汇合，并用200μl预先形成的复合物覆盖，培育3-5min，随后添加400μl的DMEM。在37℃下的30min培育后，在不去除复合物覆层的情况下，添加包含16％FCS的1mL新制DMEM以达到10％的最终FCS浓度。将细胞放回培养箱72小时。利用限制片段长度多态现象(RFLP)分析和EMX1 PCR扩增子的NheI消化，分析HindIII和NheI限制酶位点的HDR***效率。
如图9A和9B所示和表6总结，在这两种细胞系中，通过ADGN-100a，利用单或双复合物方案获得了高效率的HDR。通过组合VEPEP-3b递送CAS9/gRNA复合物的效力与ADGN-100a递送ssDNA的效力，获得了上至47％的更高度的HDR***。在具有ADGN-100a和VEPEP-3b肽的一些配置下，与RNAiMAX相比效率增加了3倍或更多。
表6：通过RFLP分析监测的HDR***效率。
实施例4：CAS9表达质粒和靶向EGFP报告基因的gRNA的、ADGN-100介导的递送
关于编码CAS9质粒和靶向U2OS细胞(EGFP-U2OS)中外源EGFP报告基因中的特定位点的gRNA的细胞递送，对ADGN-100进行评价。
将两亲性肽原液在蒸馏水中以1mg/mL制备并声处理10min。将CAS9表达质粒(Addgene MLM3639-质粒#42252)和gRNA(50nM)与ADGN-100a以10：1和20：1的ADGN-100a与各质粒的摩尔比混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。
将包含单个整合EGFP报告基因的EGFP-U2OS细胞在补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中在37℃下，在包含5％CO2的潮湿气氛中培养。使在转染前一天接种在35mm培养皿中的共计150,000细胞生长至50-60％汇合，并用200μl预先形成的复合物覆盖，培育3-5min，随后添加400μl的DMEM。在37℃下的30min培育后，添加包含16％FCS的1mL新制DMEM以达到10％的最终FCS浓度，而不移除CPP/CAS9-gRNA复合物覆层。将细胞放回培养箱72小时。
利用流式细胞术，通过监测EGFP表达水平，分析CAS9引起的双链断裂形成。图10中报告的基因中断频率数据显示3次单独实验的平均值。Lipofectamine 2000递送用作阳性对照。
如图10所示，ADGN-100a促进了CAS9表达质粒和gRNA在人EGFP-U2OS细胞中的递送。通过以20：1的ADGN-100a/各核酸摩尔比形成的ADGN-100a/CAS9质粒/gRNA复合物，获得了最佳双链断裂形成。分别在10：1或20：1的摩尔比下获得了23％或38％的EGFP表达减少。相比之下，利用Lipofectamine 2000获得了20％的EGFP表达减少。
实施例5：CPP介导的CAR T细胞工程
对ADGN-肽技术对于CAR-T细胞工程的效力进行评价。关于在两种人细胞系(JURKAT和K562)和从不同供体的外周血液单核细胞(PBMC)制剂分离的T细胞中靶向PD-1受体的RGEN/gRNA复合物的有效细胞递送和编码抗CD19 CAR的DNA质粒的递送，对三种细胞穿透肽(ADGN-100a、VEPEP-3a、和CADY)进行评价。我们证明了ADGN-100a和VEPEP-3a肽均可有效用于通过中断PD-1而重编(重新编码，reprogram)原代人T细胞。一种T-细胞活性的负调节子是配体PD-L1，其通过结合活化T细胞上的程序性死亡-1(PD-1)受体而产生作用。此外，发现ADGN-100a肽，单独或组合VEPEP-3a，是有效的转染载体，用于将RGEN/gRNA复合物和CAR编码质粒有效递送到从PBMCs分离的T细胞中，以产生hPD1受体表达被有效下调的稳定抗CD19 CAR T细胞。
CAS9/gRNA/肽颗粒形成方案
将ADGN-100a和VEPEP-3a肽的原液在蒸馏水中以2mg/mL制备，并声处理10min。在与肽形成复合物前，使CAS9蛋白以1：1的摩尔比预载纯化的sgRNA，并培育10min。将预载CAS9/gRNA(2.5μg和5μg)与ADGN-100a或VEPEP-3a以20：1的摩尔比(肽与CAS9/gRNA)混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。
质粒DNA/肽颗粒形成方案
在CMV启动子的控制下编码CD19特异性嵌合抗原受体(CAR)的质粒由连接至CD28和CD3ζ信号传导部分CD19特异性scFv组成。编码荧光素酶(6.2Kb)的质粒得自New EnglandBioLabs，并被再克隆。将质粒原液以100μM的浓度在50mM Tris、0.5mM EDTA中制备。通过如下制备纳米颗粒：利用1ng或5ng质粒DNA，将ADGN-100a或CADY肽(稀释至400μM)和质粒(100μM原液)在37℃下以20：1的最终肽/质粒摩尔比混合30min。然后将复合物溶液在9000rpm下离心5min以去除任何沉淀，并在转染前刻在50％PBS溶液中稀释。
细胞系
K562和Jurkat T细胞系在75cm2烧瓶和6孔皿中、在包含10％最终浓度的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中培养。使细胞每4天传代，并且在新传代24hr后进行转染。
T细胞分离和激活
利用以3：1(小珠：细胞)的比例结合至顺磁珠(Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28，Invitrogen,)的抗CD3/抗CD28抗体，将T细胞从PBMCs(2种不同的供体)分离。将细胞和小珠在室温下共同培育2小时，并利用Dynal ClinExVIVO MPC磁体(Thermo Fisher)进行CD3+细胞富集。将抗CD3/抗CD28顺磁珠取出，洗涤，并浓缩。利用补充有10％胎牛血清、300IU/mlIL2和50ng/ml OKT3(MuromonAB-CD3)的AIM-V培养基(Thermo Fishers)，将CD3+部分中的细胞以1×106个细胞/ml的浓度重悬浮于激活培养基(media)中2天。
电穿孔方案
利用Nucleofector 2b(Lonza，德国)和Amaxa人T细胞Nucleofector试剂盒VPA-1002(Lonza，德国)，通过CD-19质粒或gRNA/CAS9(5μg/10μg)电穿孔，对细胞进行转染。通过在800rpm下离心5分钟将5x 106个细胞用DPBS洗涤两次，并重悬浮于100μl转染缓冲剂中，然后转移到电穿孔比色杯中。使用为T细胞高转染和高效率而选择的优化程序。在电穿孔后，将细胞重悬浮于包含10％FBS的500μl预加温AIM-V培养基中，并在37℃下在5％CO2中培育。48hr后通过流式细胞术或T7E1分析评价转染效率。
CPP介导的、gRNA/CAS9复合物在T-细胞系中的递送
关于靶向两种人T细胞系(JURKAT和K562)中的内源hPD1基因的RGEN/gRNA复合物的细胞递送，对VEPEP-3a、ADGN-100a和CADY肽进行评价。
将细胞系(JURKAT，K562)在补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的DMEM中，在37℃下，在包含5％CO2的潮湿气氛中培养。使在转染前一天接种在35mm培养皿中的共计150,000细胞生长至50-60％汇合。将预载有靶向hPD1的外显子2的两种不同的gRNA的CAS9(5μg/10μg CAS9/gRNA和2.5μg/5μg CAS9/gRNA)与VEPEP-3a、ADGN-100a或CADY肽以20：1的摩尔比(肽与CAS9/gRNA)混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。RNAiMAX递送方法用作阳性对照。将细胞重悬浮于或覆以100μl预成形复合物，培育3-5min，然后添加300μl的DMEM。在37℃下的30min培育后，在不移除CPP/CAS9-gRNA复合物覆层的情况下，添加包含16％FCS的1mL新制DMEM，以达到10％的最终FCS浓度，并且将细胞放回培养箱。对CAS9引起的双链断裂然后通过NHEJ的修复通过T7E1分析或利用基因组切割检测试剂盒(GCD Thermo Fisher)进行分析，并利用片段分析***来定量。利用T7E1分析来定量hPD1基因中的***缺失频率。
如表7报告，VEPEP-3a和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送引起这两种细胞系中hPD1基因的可靠编辑。在这两种细胞系中，RGEN/gRNA引起NHEJ介导的在目标靶上处的***缺失突变。利用5μg/10μg CAS9/gRNA，在与ADGN-100a一起在K562和JURKAT细胞中递送时，分别获得71％和72％的平均***缺失频率。在K562和JURKAT细胞中利用VEPEP-3a时，分别获得75％和78％的平均***缺失频率。在K562和JURKAT细胞中利用RNAiMAX，分别获得31％和35％的平均***缺失频率。利用5μg/10μg靶向GFP的CAS9/gRNA阴性对照，观察不到hPD1基因中的基因编辑。相比之下，利用电穿孔介导的5μg/10μg CAS9/gRNA递送，在K562和JURKAT细胞中分别获得65％和72％的平均***缺失频率。在培养的T细胞中，ADGN-100a和VEPEP-3a对于PD1敲低(knockdown)比RNAiMAX有效至少2倍，并且在较低量CAS9/sgRNA下比电穿孔有效上至50％。RGEN：gRNA引起的靶上突变的报告数据是3次独立实验的平均值。
表7
CPP介导的、质粒DNA在T细胞系中的递送
细胞系(Jurkat，K562)在新传代24hr后进行转染。将培养基去除，并将细胞用PBS洗涤两次。将细胞与100μl质粒/肽溶液一起重悬浮或培育5min，并添加0.3mL无血清培养基。30min后，添加1.2mL完全培养基，并将血清水平调整至10％。将培养物在37℃下培育48hr，然后通过FACS分析监测YFP，并通过流式细胞术、利用蛋白L分析评价抗CD19-CAR T表达。
ADGN-100介导的、编码抗CD19 CAR的质粒在人T细胞中的递送
将从两个供体分离的激活T细胞(1x 106)用包含2种浓度(2μg和5μg)的抗CD19CAR表达质粒的ADGN-100a或CADY颗粒(肽/质粒摩尔比20：1)转染48小时。所有测试条件在表8中列出，并且各实验进行三次。质粒(8.2Kb)在CMV启动子的控制下编码CD19特异性嵌合抗原受体(CAR)，并且由连接至CD28和CD3ζ信号传导部分的CD19特异性scFv组成。作为对照，利用编码荧光素酶(6.2Kb)的质粒进行相似的实验。将T细胞重悬浮于100μl质粒/ADGN-100a或质粒/CADY颗粒中并培育5min，并添加300μl无血清RPMI-1640培养基。30min后，添加1.2mL完全培养基，并将血清水平调整至10％。
在第5天，分析转导和未转导细胞的水平，并将细胞转移至新制T细胞扩增培养基。T细胞扩增培养基包含AIM V培养基，补充有5％热失活人AB血清、1％Gluta-Max、和300IU/mL IL-2。使培养物扩增到第12天，并通过流式细胞术分析存活率和抗CD19 CAR表达。通过流式细胞术、利用蛋白L分析评价抗CD19 CAR在T细胞中的表达。生物素化蛋白L购自ThermoScientific，在无菌水以50ng/μl原液浓度重构，并被储存在4℃下。利用7-AAD(Sigma)确定存活率。
如所图11示，ADGN-100a促进了抗CD19 CAR质粒在从PBMCs分离的T细胞中的转染，并且利用2μg和5μg质粒，在20：1摩尔比(肽/质粒)下效率分别为62％和55％。稳定表达保持超过6天，并且利用2μg和5μg质粒，最终转导效率分别为58％和42％。未观察到与ADGN-100a或转导相关的细胞毒性，如在所有条件下获得的大约80％或更高的平均存活率所示(参见图12)。结果证明，通过非病毒载体的ADGN-100转染技术可有效用于工程化肿瘤靶向T细胞，如用于过继性细胞治疗。
表8
ADGN-100a/VEPEP-3a介导的、靶向hPD1的RGEN/gRNA复合物在人T细胞中的功能性递送
将从两个不同供体分离的激活T细胞(1x 106)用采用2种浓度(5μg/10μg CAS9/gRNA和2.5μg/5μg CAS9/gRNA)的gRNA hPD1/CAS9复合物的ADGN-100a、VEPEP-3a、或CADY颗粒转染48小时。所有测试条件在表9中列出，并且各实验进行三次。将T细胞重悬浮于包含gRNA/CAS9复合物的100μl ADGN-100a、VEPEP-3a、或CADY颗粒中并培育5min，并添加1ml完全培养基和将血清水平调整至10％。作为对照，使用负载有靶向GFP的gRNA的CAS9。
将细胞放回培养箱72小时。对CAS9引起的双链断裂然后通过非同源末端接合(NHEJ)的修复通过T7E1分析或利用基因组切割检测试剂盒(GCD Thermo Fisher)进行分析，并利用片段分析***来定量。利用T7E1分析，定量靶基因中的***缺失频率。使培养物扩增，并且每10天分析存活率和PD1水平。T细胞扩增培养基包含AIM V培养基，补充有5％热失活人AB血清、1％Gluta-Max、和300IU/mL IL-2。
如表10报告，VEPEP-3a-和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均在来自两个供体的T细胞中引起hPD1基因的可靠编辑。利用5μg/10μg CAS9/gRNA，在与ADGN-100a和VEPEP-3a一起递送时，分别获得58％和66％的平均***缺失频率。利用CADY肽或RNAiMAX，未获得T细胞中hPD1基因的编辑。相比之下，利用电穿孔介导的5μg/10μgCAS9/gRNA递送，获得25％的平均***缺失频率。这些结果表明，ADGN-100a和VEPEP-3a构成T细胞中gRNA/CAS9复合物递送的高度有效策略。ADGN-100a和VEPEP-3a对于PD1敲低比电穿孔有效至少2倍。RGEN：gRNA引起的靶上突变的报告数据是3次独立实验的平均值。
表9
表10
ADGN-100/VEPEP-3介导的、靶向hPD1的RGEN/gRNA复合物和抗CD19 CAR表达质粒在人T细胞中的同时递送
将来自两个供体的激活T细胞(1x 106)同时用包含抗CD19 CAR表达质粒(5μg)的ADGN-100a或VEPEP-3a颗粒和包含2种浓度(5μg/10μg CAS9/gRNA和2.5μg/5μgCAS9/gRNA)的gRNA hPD1/CAS9复合物的ADGN-100a、VEPEP-3a、或CADY颗粒转染48小时。所有测试条件在表11中列出，并且各实验进行三次。将T细胞重悬浮于100μl无血清培养基中，该无血清培养基包含含有gRNA hPD1/CAS9复合物的ADGN-100a、VEPEP-3a、或CADY颗粒和含有抗CD19CAR表达质粒的ADGN-100a或VEPEP-3a颗粒。将细胞培育5min，并添加300μl无血清RPMI-1640培养基。30min后，添加1.2mL完全培养基，并将血清水平调整至10％。作为对照，使用负载有靶向GFP的gRNA的CAS9。为与电穿孔方法进行比较，利用Nucleofector 2b(Lonza，德国)和Amaxa人T细胞Nucleofector试剂盒，VPA-1002(Lonza，德国)，将细胞用抗CD-19CAR质粒(5μg)和gRNA/CAS9(5μg/10μg)转染。
在第5天，分析转导和未转导细胞的水平，并将细胞转移至新制T细胞扩增培养基。通过流式细胞术分析培养物的存活率和抗CD19 CAR表达。通过流式细胞术、利用蛋白L分析评价抗CD19 CAR在T细胞中的表达。生物素化蛋白L购自ThermoScientific，在无菌水中以50ng/μl原液浓度重构，并储存在4℃下。利用7-AAD(Sigma)确定存活率。对CAS9引起的双链断裂然后通过NHEJ***的修复通过T7E1分析或利用基因组切割检测试剂盒(GCD ThermoFisher)进行分析，并利用片段分析***来定量。利用T7E1分析，定量靶基因中的***缺失频率。使培养物扩增，并且每10天分析存活率、抗CD19表达和PD1水平。T细胞扩增培养基包含AIM V培养基，补充有5％热失活人AB血清、1％Gluta-Max、和300IU/mL IL-2。
如图13所示，ADGN-100a促进抗CD19 CAR质粒在从PBMC分离的T细胞中的转染，并且利用5μg质粒，在20/1摩尔比(肽/质粒)下效率在40％和45％之间。稳定表达保持至少超过6天。相比之下，在通过电穿孔被转染时，仅20％的T细胞表达抗CD19 CAR，表明在原代T细胞中ADGN-100a基因递送效率至少2倍高于电穿孔。
如表12报告，VEPEP-3a和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均在来自两个供体T细胞中引起hPD1基因的可靠编辑。利用5μg/10μg CAS9/gRNA，在与ADGN-100a和VEPEP-3a一起递送时，分别获得大约50％和57％的平均***缺失频率。相比之下，利用电穿孔介导的5μg/10μg CAS9/gRNA递送，获得了15％的平均***缺失频率。ADGN-100a和VEPEP-3a对于PD1敲低比电穿孔有效至少3倍。利用2.5μg/5μg CAS9/gRNA，在与ADGN-100a和VEPEP-3a一起递送时，分别获得大约42％和50％的平均***缺失频率。在该CAS9/gRNA浓度下，通过电穿孔未获得显著PD1敲低。
VEPEP-3a呈现对于CAS9/gRNA引起PD1敲低比ADGN-100a更有效。RGEN/gRNA引起的靶上突变的报告数据是3次独立实验的平均值。
表11
表12
CPP介导的、CAS9/sgRNA复合物的递送在T细胞中不引起毒性
在这两种细胞系中以及从PBMCs分离的原代T细胞中观察到的可靠的hPD1中断不与细胞毒性相关。在这两种细胞系(JURKAT和K562)中和在PBMC分离的T细胞中考察CPP/CAS9/gRNA复合物的毒性。利用MTT分析或7-AAD确定细胞存活率。
将在转染前一天接种在24孔板中的共计30,000个JURKAT或K562细胞与1nM至200nM范围内的递增浓度的CPP/CAS9/gRNA复合物以20：1摩尔比(CPP与CAS9/gRNA)一起培育30min，然后添加培养基以达到最终10％的FCS浓度。24小时后通过比色MTT分析(Sigma，德国)测量细胞毒性响应。对于MTT分析，将细胞培养基去除，并替换成包含2.5mg/ml MTT的PBS，4小时。结果相应于3次独立实验的平均值。如图14所示，对于这两种细胞系，上至100nM的浓度，VEPEP-3a或ADGN-100a肽未观察到毒性，并且在200nM下存活率降低小于10％。相比之下，在200mM下，RNAiMAX观察到40-45％之间的细胞死亡——根据细胞系。
将来自两个不同供体的原代T细胞用包含2种浓度(5μg/10μg CAS9/gRNA和2.5μg/5μg CAS9/gRNA)的CAS9/gRNA的ADGN-100a或VEPEP-3a颗粒转染48小时，并通过流式细胞术、利用7-AAD细胞经12天时间定量存活率。将数据相对于未被转染的细胞标准化，并与与游离CAS9/gRNA一起培育的T细胞进行比较。如图15所示，通过ADGN-100a或VEPEP-3a未观察到细胞毒性，如在所有条件下大约80％或更高的平均存活率所示。
在T细胞中CAS9/gRNA的电穿孔与肽系递送的比较
对利用CAS9和包含靶向原代T细胞中编码β2M的基因的指导序列的gRNA进行的β2微球蛋白(β2M)敲低，利用电穿孔介导的递送进行测试，并与通过CAS9/gRNA与肽VEPEP3或ADGN100的复合所介导的递送进行比较。将来自2个供体的T细胞，例如对于电穿孔，分别与5μg/10μg比例的CAS9/gRNA联用，以及对于肽，分别与5μg/10μg和2.5μg/5μg比例的CAS9/gRNA联用。在各种情况下，例如5x 106个T细胞被处理。通过肽的转染例如在5％血清培养基或无血清培养基中进行。评估第24小时的细胞存活率、第3天的敲低效率、和扩增期结束时的细胞数量。
在T细胞中质粒DNA的电穿孔与肽系递送的比较
对来自质粒pTRPE GFP(10Kb)的GFP在原代T细胞中的表达利用电穿孔介导的质粒递送进行测试，并与通过质粒与肽ADGN100或VEPEP9的复合所介导的递送进行比较。将来自2个供体的T细胞，例如，对于电穿孔，与3μg质粒联用，和对于肽，与2μg和5μg质粒联用。在各情况下，例如5x 106T细胞被处理。通过肽的转染例如在5％血清培养基或无血清培养基中进行。评估第24小时的细胞存活率、第3天的敲低效率、和扩增期结束时的细胞数量。
实施例6：ADGN-100介导的、RGEN/gRNA复合物在原代人心脏成纤维细胞和原代人肝细胞中的功能性递送
还关于靶向内源EMX1和HPRT基因的多种RGEN：gRNA复合物在原代人心脏成纤维细胞和原代人肝细胞中的细胞递送，对ADGN-100肽进行评价。CAS9/gRNA复合物包含CAS9蛋白或编码CAS9蛋白的mRNA和靶向EMX1或HPRT的gRNA。人原代心脏成纤维细胞和人原代肝细胞是新获得的，并且使之在扩增和处理前在预先覆以明胶系涂覆溶液的烧瓶中生长和在培养完全生长培养基中培育3天。然后将细胞用不同浓度的ADGN-100a：CAS9蛋白：gRNA复合物或ADGN-100a：CAS9 mRNA：gRNA复合物处理。对非同源末端接合(NHEJ)在转染后72小时通过T7E1分析进行分析，并与利用RNAiMAX脂质方法的递送进行比较。利用MTT分析，针对所有条件分析毒性。
利用HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒(New England Biolab)获得CAS9 mRNA。利用线性化质粒DNA合成mRNA，并将其通过苯酚：氯仿提取纯化。将合成的mRNA通过LiCl沉淀，苯酚：氯仿提取，然后乙醇沉淀纯化，并通过UV光吸光度定量。通过测量260nm下的紫外光吸光度确定RNA浓度。利用1μg该DNA模板获得18μg封端mRNA，并将其储存在-20℃下。酿脓链球菌HIS-NLS-CAS9被在大肠杆菌中表达并如此前Zuris et al,2015所述纯化——利用HIS-CAS9-NLS pET29表达载体(Addgene#62933)，或得自Thermo Fisher Life Science。Lipofectamine 2000、RNAiMAX、TranscriptAid T7转录和MEGAclear转录清理试剂盒、GeneArt Genomic Cleavage Detection试剂盒、和Platinium Green Hot Start PCR混合物得自Thermo Fisher life Science。所有寡核苷酸得自Eurogentec。
将ADGN-100a肽原液在蒸馏水中以1mg/mL制备，并声处理10min。在与ADGN肽形成复合物前，将CAS9蛋白以1：1的摩尔比预载纯化的gRNA-GFP，并培育10min。将预载CAS9/gRNA(10nM、20nM、50nM)与ADGN-100a以20：1摩尔比(肽/复合物)混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。
两种细胞类型均采用以下方案。在转染时将细胞培养至约70％汇合。将细胞保持在具有10％血清的高葡萄糖DMEM培养基中。在转染前，将细胞用DMEM洗涤两次，并重悬浮于轻柔混合的0.2ml复合物溶液(16μl复合物+184μl OPTiMEM)中，并在37℃下培育10min。添加0.8mL新制OPTiMEM(高葡萄糖)，并将细胞在37℃下培育20min。在不去除ADGN-100a/CAS9/gRNA复合物覆层的情况下，添加包含11.4％FCS的2mL完全OPTiMEM(高葡萄糖)以达到10％的最终FCS浓度。将细胞放回37℃培养箱，并在转染后72小时进行分析。
作为阳性对照，利用RNAiMAX(Invitrogen Thermo Fisher)递送复合物。对CAS9引起的双链断裂形成然后通过非同源末端接合(NHEJ)***的修复在72小时时通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。EMX1和HPRT基因的报告***缺失频率是3次单独实验的平均值。利用MTT分析来分析细胞毒性。
考察ADGN-100a/CAS9/gRNA复合物对两种原代细胞类型的毒性。将在转染前一天接种于35孔板中的共计30,000细胞与递增浓度的ADGN-100a/CAS9/gRNA复合物(10nM、20nM、和50nM)以20：1摩尔比(肽/复合物)一起培育30min，然后添加培养基以达到最终10％的FCS浓度。24小时后通过比色MTT分析(Sigma，德国)测量细胞毒性响应。对于MTT分析，将细胞培养基去除并替换成包含2.5mg/ml MTT的PBS，4小时。
数据被报告在图16(原代成纤维细胞)和图16B(原代肝细胞)以及表13中。如报告，ADGN-100介导的RGEN/gRNA递送在两种原代细胞类型中引起EMX-1和HPRT基因的可靠编辑。利用20nM浓度的CAS9-gRNA；在原代成纤维细胞和原代肝细胞中分别获得两基因均大于60％和55％的平均***缺失频率。通过RNAiMAX，利用50nM RGEN/gRNA，获得原代人成纤维细胞中约30％和原代人肝细胞细胞中20％的平均***缺失频率。这些结果证明，ADGN-100肽比RNAiMAX有效至少3-4倍。
表13：对于原代人成纤维细胞和原代人肝细胞中RGEN：gRNA递送和通过T7E1分析测量的所得编辑效率，ADGN-100a与RNAiMAX的比较
在两种原代细胞类型中观察到可靠EMX1和HPRT基因中断不与细胞毒性相关。如图17A和17B所示，对于两种原代细胞类型，利用ADGN-100a肽，均观察到小于10％的毒性。相比之下，通过RNAiMAX，观察到原代人肝细胞中60-65％之间的细胞死亡和原代人成纤维细胞中35-40％之间的细胞死亡。这些结果证明，ADGN-100a是有效的、无毒的、可用于原代人细胞中基因组编辑(如通过CRISPR)的递送技术。
实施例7：ADGN-100介导的、CAS9表达mRNA和gRNA在培养的U2OS细胞中的体外递送
在此实验中，关于CAS9 mRNA和CAS9 mRNA/gRNA在U2OS细胞中的细胞递送，对ADGN-100a肽进行评价。利用HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒(New England Biolab，利用线性pCS2-CAS9载体作为DNA模板(Addgene#47322)，获得CAS9 mRNA。
将CAS9 mRNA(0.2μg和0.5μg)与ADGN-100a以20：1摩尔比(肽/mRNA)混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。将U2OS细胞在补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中，在37℃下，在包含5％CO2的潮湿气氛中培养。使在转染前一天接种在35mm培养皿中的共计150,000细胞生长至50-60％汇合，并覆以200μl的预成形ADGN-100a/CAS9 mRNA复合物，培育5min，随后添加400μl的DMEM。在37℃下20min培育后，在不去除复合物覆层的情况下，添加包含16％FCS的1mL新制DMEM以达到10％的最终FCS浓度。将细胞放回培养箱72小时。通过利用抗CRISPR/Cas9抗体(Diagenode目录编号C15200223)对蛋白质提取物进行免疫印迹，定量CAS9表达水平。
如图18所示，免疫印迹分析解释了在被转染的U2OS细胞中CAS9蛋白的剂量依赖性表达。这些结果表明，ADGN-100a促进CAS9 mRNA的功能性递送然后CAS9蛋白表达。相比之下，利用Lipofectamine 2000或RNAiMAX作为mRNA递送载体，CAS9表达水平低约10倍。
实施例8：利用与CAS9蛋白或CAS9表达mRNA和gRNA复合的ADGN-100进行的eGFP-U2OS细胞的体外基因编辑
通过靶向eGFP-U2OS细胞系中外源eGFP报告基因的特定位点，评价利用ADGN-100a、利用CAS9蛋白或CAS9 mRNA的基因编辑。将预混合的CAS9/gRNA(2.5μM/5μM)或CAS9mRNA/gRNA(0.5μg/5μg)与ADGN-100a以20：1摩尔比(肽/复合物)混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。Lipofectamine 2000和RNAiMAX递送方法均被包括作为对照。将eGFP-U2OS细胞在补充2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)有的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中，在37℃下，在包含5％CO2的潮湿气氛中培养。使在转染前一天接种在35mm培养皿中的共计150,000细胞生长至50-60％汇合并用200μl预先形成的复合物覆盖，培育5min，随后添加400μl的DMEM。在37℃下的20min培育后，在不去除复合物覆层的情况下，添加包含16％FCS的1mL新制DMEM以达到10％的最终FCS浓度。将细胞放回培养箱72小时。
利用流式细胞术，通过72小时后的eGFP表达监测水平，分析CAS9引起的双链断裂形成，如图19所示。通过与ADGN-100a缔合的CAS9/gRNA或CAS9 mRNA/gRNA(肽/复合物摩尔比为20：1)分别获得了87％或85％的eGFP表达减少。这些结果证明，ADGN-100a递送功能性CAS9蛋白和CAS9 mRNA，导致相似的基因编辑效率。相比之下，利用Lipofectamine 2000或RNAiMAX作为CAS9 mRNA/gRNA的递送载体，分别获得22％或31％的eGFP表达减少。利用Lipofectamine 2000或RNAiMAX作为CAS9蛋白/gRNA的递送载体，分别获得35％或45％的eGFP表达减少。
实施例9：ADGN-100介导的、CAS9表达mRNA在小鼠中的体内递送
关于CAS9 mRNA在Swiss小鼠中的体内递送，对ADGN-100a肽进行评价。将CAS9mRNA(10μg)与ADGN-100a肽以20：1的肽/mRNA比缔合。小鼠接受游离ADGN-100a肽(2只动物/组)、游离CAS9 mRNA(2只动物/组)、或CAS9 mRNA/ADGN-100a(3只动物/组)的单次静脉内注射。在注射后72小时，将动物处死，并收集包括肺、肝、脑、肾、心脏、脾、血液、和胰腺在内的组织。将组织均质化，并通过如下分析CAS9表达：通过蛋白质提取物的免疫印迹，利用抗CRISPR/Cas9抗体(Diagenode目录编号C15200223)；或通过ELISA，利用Cas9单克隆抗体(SBI克隆7A9)。如图20A和20B所示，在肝中观察到CAS9蛋白高度表达，其水平高于背景的15倍。在肺和肾中也观察到CAS9表达，其水平是背景的约2至3倍。在考察的其它组织中未检测到CAS9蛋白表达显著增加。
实施例10：ADGN-100介导的、CAS9表达mRNA和靶向荧光素酶的gRNA在肝中表达荧光素酶的小鼠中的体内递送
关于CAS9 mRNA/gRNA在肝中表达荧光素酶的Swiss小鼠中的体内递送，对ADGN-100a肽进行评价。CAS9 mRNA和靶向荧光素酶的gRNA(10μg)与ADGN-100a肽以摩尔比20：1(肽/核酸)缔合。小鼠接受游离ADGN肽(3只动物/组)、游离CAS9 mRNA(3只动物/组)或CAS9mRNA/gRNA/ADGN-100a(3只动物/组)的单次静脉内注射。通过在注射后立即和在注射后72小时整体动物荧光成像，定量荧光素酶水平，如图21所示。
在注射后72小时，将动物处死，并收集下列组织：肝、肺、肾、脾、和血液。通过肝中荧光，定量荧光素酶。将组织均质化，并通过ELISA，利用Cas9单克隆抗体(SBI克隆7A9)，分析CAS9表达。
如图21和22所示，ADGN-100a介导的CAS9 mRNA/gRNA递送引起肝中荧光素酶表达60％至65％之间的敲低。相比之下，通过游离ADGN-100a或游离CAS9 mRNA/gRNA未观察到荧光素酶表达变化。与此前的CAS9 mRNA递送结果一致，如图23所示，ADGN-100a介导的CAS9mRNA/gRNA递送主要在肝中(约20倍背景水平)，并且在肺和肾中水平较低(约2倍背景水平)。这些结果证明，ADGN-100a肽构成了用于体内功能性递送CRISPR组分(包括CAS9 mRNA/gRNA)的有效方法。
实施例11：ADGN-100a和VEPEP-3a介导的、靶向β2-微球蛋白的CAS9/gRNA复合物在人原代T细胞中的功能性递送：评估基因编辑效率和毒性
将从单个供体分离的T细胞(5x 106)用与靶向β2-微球蛋白的CAS9/gRNA复合物(5μg/10μg CAS9/gRNA)缔合的ADGN-100a或VEPEP-3a转染。简言之，将T细胞重悬浮于包含CPP/CAS9/gRNA颗粒的100μl溶液中并培育5min，并添加1ml完全培养基，并将血清水平调整至10％。作为对照，将5x 106个细胞用CAS9/gRNA复合物通过电穿孔转染，用游离CAS9/gRNA处理或不经处理。将细胞放回培养箱72小时。通过FACS分析，定量β2-微球蛋白水平。
如图24所示，VEPEP-3a和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均引起T细胞中β2-微球蛋白基因的可靠编辑，分别为71％和78％的效率。相比之下，电穿孔介导的5μg/10μgCAS9/gRNA递送结果是32％的效率。利用游离复合物未观察到T细胞中β2-微球蛋白基因的编辑。这些结果表明，ADGN-100a和VEPEP-3a可介导CAS9/gRNA复合物在T细胞中高度有效的递送。对于β2-微球蛋白敲低，ADGN-100a和VEPEP-3a比电穿孔有效至少2倍。RGEN：gRNA引起的靶上突变的报告数据是3次独立实验的平均值。
利用48小时后的MTT分析和通过监测72小时后的激活伤害所致细胞死亡(DICD)，考察PBMC分离的T细胞中CPP/CAS9/gRNA复合物的毒性。在原代T细胞中观察到的可靠β2-微球蛋白敲低不与细胞毒性相关，如图25A和25B所示。通过MTT分析未观察到与CPP/CAS9/gRNA复合物或游离肽相关的毒性。此外，通过CPP/CAS9/gRNA复合物或CPP肽未观察到T细胞激活延迟或激活伤害所致细胞死亡。相比之下，在电穿孔后观察到55％的毒性，以及T细胞激活和DICD激活减少多于70％。
实施例12：ADGN-100a和VEPEP-3a介导的、靶向β-联蛋白(β-联蛋白)或HPRT的RGEN/gRNA复合物在C2C12细胞中的功能性递送
关于靶向内源HPRT和-联蛋白基因的RGEN/gRNA复合物在未分化的和分化的小鼠肌肉成肌细胞(C2C12)中的有效细胞递送，对VEPEP-3a和ADGN-100a肽进行评价。在心脏肌肉中，β-联蛋白位于夹层盘状结构(intercalated disc structures)中的粘附连接处(adherens junctions)，其对于相邻心肌细胞之间的电连接和机械连接至关重要。将预载CAS9/gRNA复合物(5μg/10μg CAS9/gRNA)与VEPEP-3a和ADGN-100a肽以20：1的CPP/货物摩尔比混合，并在37℃下培育30min，然后进行细胞转染。通过RNAiMAX的递送被包括在内作为阳性对照。
转染后72小时通过PCR(图26)和T7E1分析(图27)分析CAS9引起的NHEJ。利用T7E1分析，通过利用片段分析***定量未切割vs切割DNA量，定量HPRT基因中的缺失(***缺失)频率。RGEN/gRNA引起的靶上突变的数据以3次单独实验的平均值报告
使C2C12小鼠粘附成肌细胞在补充有热失活10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1％抗生素、0.5％抗支原体和25mM Hepes，pH 7.5的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中生长。将细胞系保持在5％CO2、37℃下，并通过台盼蓝排除测试评估细胞存活率。为引起肌原性分化，在约80％细胞汇合时，将包含10％胎牛血清的培养基换成包含1％胎牛血清的培养基。将细胞在未分化阶段或在分化后7天转染。
如图26和27所示，VEPEP-3a-和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均引起在未分化的和分化的C2C12细胞系中β-联蛋白和HPRT基因的可靠编辑。
通过在未分化的和分化的C2C12细胞系中VEPEP-3a介导的递送，分别获得了81％和73％的平均***缺失频率。通过在未分化的和分化的C2C12细胞系中ADGN-100a介导的递送，分别获得了79％和47％的平均***缺失频率。相比之下，RNAiMAX介导的递送导致在未分化的和分化的C2C12细胞系中分别46％和18％的***缺失频率。这些结果进一步证明，VEPEP-3和ADGN-100肽是在分化的肌肉成肌细胞中递送多种RGEN/gRNA复合物的有效媒介。
实施例13a：CPP介导的、CAS9 mRNA在多种粘附和悬浮细胞系中的递送
关于CAS9 mRNA在多种粘附(U2OS和原代人成纤维细胞)和悬浮(HEPG2和K562)细胞系中的细胞递送，对细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、VEPEP-3a、和ADGN-100a)进行评价。将CAS9 mRNA利用HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒(New England Biolab)，以线性化pCS2-CAS9载体(Addgene#47322)用于DNA模板制备，并通过苯酚：氯仿提取来纯化。通过以下形成CPP/CAS9 mRNA复合物：将CAS9 mRNA(0.5μg)与CPP以20：1的CPP：CAS9 mRNA摩尔比混合，并在37℃下培育30min，随后进行细胞转染。将细胞按照粘附或悬浮细胞系的优化方案转染。
粘附细胞转染
新制获得人原代成纤维细胞，并使其在预覆以明胶系涂覆溶液的烧瓶中生长，并在培养完全生长培养基中培育3天，然后进行扩增和处理。将U2OS细胞在补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中，在37℃下，在包含5％CO2的潮湿气氛中培养。在转染前一天接种有150,000个细胞的35mm培养皿生长至50-60％汇合并设定在转染时约70％汇合。在转染前，将细胞用DMEM(2X)然后PBS(1x)洗涤。然后对细胞覆以0.2ml复合物溶液(16μl在水中的CPP/货物复合物+184μl OPTiMEM，无抗生素)，轻柔混合，并在37℃下培育10min。然后添加0.8mL新制OPTiMEM或DMEM，并将细胞在37℃下培育20min。在不去除CPP/货物复合物覆层的情况下，然后添加包含11.4％FCS的2mL完全OPTiMEM(高葡萄糖)或DMEM以达到10％的最终FCS浓度。将细胞放回培养箱(37℃，5％CO2)，并在转染后72小时进行分析。
悬浮细胞转染
设定K562和HEpG2细胞在转染时为约70％汇合。将细胞保持在具有10％血清的高葡萄糖DMEM培养基中。在转染前，将细胞通过离心收集，并用DMEM(2X)然后PBS(1x)洗涤。然后将细胞重悬浮于0.2ml复合物溶液(16μl在水中的CPP/货物复合物+184μlOPTiMEM，无抗生素)中，轻柔混合，并在37℃下培育10min。然后添加0.8mL新制OPTiMEM，并将细胞在37℃下培育20min。在不去除CPP/货物复合物覆层的情况下，然后添加包含11.4％FCS的2mL完全OPTiMEM(高葡萄糖)以达到10％的最终FCS浓度。将细胞放回培养箱(37℃，5％CO2)，并在转染后72小时进行分析。
RNAiMAX脂质系递送(Invitrogen Thermo Fisher，法国)用作对照，并且转染遵照制造商的说明进行。在10天期间的多个时间点分析CAS9表达水平，该CAS9表达水平利用得自Diagenode的抗CRISPR/Cas9抗体(Diagenode目录编号C15200223)和ABCAM(克隆7A9-ab191468)，通过蛋白质提取物的ELISA来确定。CAS9蛋白表达结果显示在图28A-28D中，并且以3次单独实验的平均值报告。
如图28A-28D所示，VEPEP-6和ADGN-100a CPPs促进mRNA的有效递送，导致各测试细胞类型中可靠的CAS9蛋白表达。在U2OS、K562、和HepG2细胞中，在第3天，利用ADGN-100a和VEPEP-6，CAS9蛋白表达的ELISA信号分别增加至约25和30倍背景水平(第0天信号)。在原代人成纤维细胞中，利用ADGN-100a或VEPEP-6，在第3天，CAS9蛋白表达的ELISA信号增加至背景的约20倍。CAS9蛋白表达在转染后第3天最佳，并且到第10天减少至这些水平的约50％。利用VEPEP-9进行CAS9 mRNA递送，实现第3天CAS9蛋白表达的ELISA信号增加至背景的约5至10倍。相比之下，通过VEPEP-3a肽，观察到第3天CAS9蛋白表达极少增加至没有增加。相比之下，利用RNAiMAX脂质制剂进行CAS9 mRNA递送，在U2OS细胞中，第3天CAS9蛋白表达的ELISA信号增加至背景的约5至10倍，并且观察到在其它细胞类型(K562、HepG2、和原代人成纤维细胞)中CAS9表达极少增加至没有增加。这些结果证明，VEPEP-6和ADGN-100a肽是将mRNA递送至难转染细胞类型的有效媒介。
实施例13b：CPP介导的、CAS9 mRNA和EMX1靶向gRNA在多种粘附和悬浮细胞类型中的功能性递送
关于包含CAS9 mRNA和靶向内源EMX1基因的gRNA的核蛋白复合物在多种粘附(U2OS和原代人成纤维细胞)和悬浮(HEPG2、K562)细胞类型中的有效细胞内递送，对细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、和ADGN-100a)进行评价。
EMX1靶向gRNAs和CAS9 mRNA如上述制备。通过将CAS9 mRNA(0.5μg)和gRNA(5μg)与CPP以20：1的CPP：货物摩尔比混合并在细胞转染前在37℃下培育30min，形成CPP/CAS9mRNA/gRNA复合物。将悬浮和粘附细胞按照实施例13a描述的方案转染。RNAiMAX介导的递送(Invitrogen Thermo Fisher，法国)用作对照。对EMX1基因编辑在第3天和第6天通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。
EMX1基因中的***缺失频率结果显示在图29A-29D中(3次单独实验的平均值)。VEPEP-6-和ADGN-100a介导的CAS9 mRNA/gRNA递送引起各测试细胞类型中EMX-1基因的可靠编辑。对于这两种肽，在72小时后观察到包含CAS9 mRNA和gRNA的复合物的有效功能性细胞内递送。在U2OS和HepG2细胞中获得约70-80％的平均***缺失频率，并且在原代人成纤维细胞和K526细胞中获得约60％的平均***缺失频率。
利用VEPEP-9进行递送，在U2OS和HepG2细胞中获得约40-50％的平均***缺失频率，并且在原代人成纤维细胞和K562细胞中获得约10％的平均***缺失频率。相比之下，利用RNAiMAX进行递送，在U2OS和HepG2细胞中获得约40-50％的平均***缺失频率，并且在原代人成纤维细胞和K562细胞中获得约10-15％的平均***缺失频率。这些结果证明，对于CAS9 mRNA和gRNA的功能性递送，VEPEP-6和ADGN-100a肽的有效性是RNAiMAX的约3至5倍——根据细胞类型。
在这四种细胞类型中观察到可靠的CPP介导的EMX1基因中断不与细胞毒性相关。如图30所示，利用ADGN-100a或VEPEP-6肽，观察到小于10％的毒性。相比之下，通过RNAiMAX，观察到在原代人成纤维细胞和K562细胞中40-50％之间的细胞死亡和在U2OS和HepG2细胞中35-40％之间的细胞死亡。这些结果证明，VEPEP-6和ADGN-100a均是有效的、无毒的、可用于在多种人细胞类型中进行mRNA/gRNA递送的细胞穿透肽。
实施例13c：CPP介导的、CAS9蛋白/EMX1靶向gRNA复合物在多种粘附和悬浮细胞类型中的功能性递送
然后，关于靶向内源EMX1基因的CAS9蛋白/gRNA复合物在多种粘附(U2OS和原代人成纤维细胞)和悬浮(HEPG2和K562)细胞类型中的细胞递送，对CPPs(ADGN-100a、VEPEP-9、VEPEP-6和VEPEP-3a)进行评价。
HIS-NLS-CAS9蛋白和EMX1靶向gRNAs如上述制备。通过将预载CAS9/gRNA复合物(2.5μg/5μg CAS9/gRNA)与CPP肽以20：1的CPP/货物摩尔比混合并在细胞转染前在37℃下培育30min，制备CPP/CAS9/gRNA复合物。将细胞按照实施例13a描述的方案转染，并且RNAiMAX介导的递送(Invitrogen Thermo Fisher，法国)用作对照。对EMX1基因编辑在第3天和第6天通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。
RGEN/gRNA引起的靶上突变数据显示在图31A-31D中(3次单独实验的平均值)。VEPEP-3a-和ADGN-100a介导的RGEN/gRNA递送均引起各测试细胞类型中EMX1基因的可靠编辑。通过VEPEP-3a和ADGN-100a递送，分别获得约75-70％和约60-65％平均***缺失频率。利用VEPEP-9，获得35-40％的平均***缺失频率。相比之下，未观察到显著EMX1基因编辑。作为比较，RNAiMAX递送导致在U2OS和K562细胞中40％的***缺失频率和在HEPG2细胞和原代人成纤维细胞中25-30％的***缺失频率。
实施例13d：CPP介导的、CAS9表达质粒在多种粘附和悬浮细胞类型中的递送
关于编码CAS9蛋白的质粒在U2OS和HEPG2细胞系和原代人成纤维细胞中的细胞递送，对CPPs(ADGN-100a、VEPEP-9、VEPEP-3a、和VEPEP-6)进行评价。
通过将0.5μgCAS9表达质粒(Addgene MLM3639-质粒#42252)与CPP混合以20：1的CPP：货物摩尔比混合并在细胞转染前在37℃下培育30min，制备CPP/质粒复合物。将细胞按照实施例13a描述的粘附和悬浮细胞方案转染。Lipofectamine 2000用作脂质基递送对照。在10天期间多个时间点分析CAS9蛋白表达水平，其利用得自Diagenode的抗CRISPR/Cas9抗体(Diagenode目录编号C15200223)和ABCAM(克隆7A9-ab191468)、通过蛋白质提取物的ELISA来确定。
CAS9蛋白表达结果显示在图32A-32C中(3次单独实验的平均值)。ADGN-100a和VEPEP-9CPPs促进有效的CAS9表达质粒递送，如各测试细胞类型中可靠的CAS9蛋白表达所示。对于这两种肽，蛋白质表达均在转染后第6天最佳，并且到第10天减少约50％。CAS9蛋白表达的ELISA信号在第6天增加至背景的约9至10倍——利用ADGN-100a和VEPEP-9，在U2OS和HEPG2细胞和原代人成纤维细胞中；至背景的约4倍——利用VEPEP-6，在U2OS和HEPG2细胞中；和至背景的约2倍——利用VEPEP-6，在原代人成纤维细胞中。相比之下，通过VEPEP-3a肽观察到CAS9表达极少增加至无增加。相比之下，利用lipofectime 2000进行CAS9表达质粒递送，第6天CAS9蛋白表达的ELISA信号在U2OS细胞中增加至背景的约4倍，而在HepG2细胞和原代人成纤维细胞中未观察到显著CAS9蛋白表达(低于背景的2倍)。这些结果证明，ADGN-100a和VEPEP-9肽是在难转染细胞类型中递送CAS9表达质粒的有效媒介。
实施例13e：CPP介导的、CAS9表达质粒/EMX1靶向gRNA在多种粘附和悬浮细胞类型中的功能性递送
关于编码CAS9的质粒和靶向内源EMX1基因的gRNA在多种粘附(U2OS和原代人成纤维细胞)和悬浮(HEPG2)细胞类型中的功能性细胞内递送，对细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、和ADGN-100a)进行评价。
EMX1靶向gRNAs如上述制备。通过将0.5μgCAS9表达质粒(Addgene MLM3639-质粒#42252)和5μggRNA与CPP以20：1的CPP/核酸(质粒+gRNA)摩尔比混合并在细胞转染前在37℃下培育30min，制备CPP/质粒/gRNA复合物。将悬浮和粘附细胞按照实施例13a描述的方案转染。Lipofectamine 2000-和RNAiMAX介导的递送方法(Invitrogen Thermo Fisher，法国)用作对照。对EMX1基因编辑在第3天和第6天通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。
EMX1基因中的***缺失频率显示在图33A-33C中(3次单独实验的平均值)。ADGN-100a和VEPEP-9促进CAS9表达质粒和gRNA的递送，引起这三种细胞类型每一种中EMX-1基因的可靠编辑。利用ADGN-100a肽，获得最佳双链断裂形成。对于这两种肽，均在第3天观察到CAS9表达质粒和gRNA的有效功能性细胞内递送。利用ADGN-100a和VEPEP-9，在这三种细胞类型中分别获得约45-50％和约35-40％的平均***缺失频率。
相比之下，利用Lipofectamine 2000和RNAiMAX进行递送，获得U2OS细胞中约20％以及HepG2细胞和原代人成纤维细胞中小于10％的平均***缺失频率。这些结果证明，对于递送质粒和gRNA，VEPEP-9和ADGN-100a肽的有效性是RNAiMAX的约2至5倍——根据细胞类型。
实施例14：CPP介导的、CAS9表达mRNA在小鼠中的体内递送
关于CAS9表达mRNA在Swiss小鼠中的体内递送，对包括ADGN-100a、VEPEP-6、和VEPEP-9的CPPs进行评价。聚腺苷酸化并且封端的CAS9 mRNA得自ThermoFisher。通过将CAS9 mRNA(5μg)与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/mRNA比混合，制备CPP/CAS9 mRNA复合物。小鼠接受在生理缓冲剂中的CAS9mRNA/ADGN-100a(6只动物/组)、CAS9mRNA/VEPEP-6(6只动物/组)、或CAS9mRNA/VEPEP-9(6只动物/组)复合物的单次静脉内注射(100μl)。在生理缓冲剂中的游离CAS9 mRNA被注射作为对照。
为评价CPP/mRNA递送相关的体内细胞因子诱导，在多个时间点(12hr、24hr、48hr和72hr)通过隐静脉出血收集血液样品，收集不多于100μl或10％总血液体积/周。利用来自Invritrogen的细胞因子小鼠磁性20-Plex面板(LMC 0006M)测量血清细胞因子水平。用于LuminexTM平台的细胞因子小鼠磁性20-Plex面板被特别设计用于定量血清、血浆和组织培养上清液中的小鼠细胞因子、趋化因子、和生长因子。20-plex面板允许同时定量血清或组织培养上清液中的小鼠GM-CSF、IFN-g、IL1a、Il1b、Il2、IL4、Il5、Il6、Il10、Il12(p40/p70)、IL13、IL17、TNF-a、IP-10、KC、MCP-1、MIG；MIP-1a、碱性FGF、和VEGF。脂多糖(LPS)的给予被包括作为对照，并且结果在图34中报告。与LPS给予相比，在不同时间点观察到不同CPPs对非特异性细胞因子诱导的影响极小至没有。
注射后在第3天、第6天、和第10天，将动物处死，并收集包括肺、肝、脑、肾、心脏、脾、血液、胰腺、肌肉、骨髓、和肠在内的组织。将组织均质化，并通过ELISA，利用抗CRISPR/Cas9抗体(SBI克隆7A9)分析蛋白质提取物中的CAS9蛋白水平。如图35A(第3天)和35B(第6天)所示，利用3种CPPs(ADGN-100a、VEPEP-6、和VEPEP-9)，观察到肝中CAS9蛋白的可靠表达，其中CAS9蛋白表达的ELISA信号分别大于背景的20倍、15倍、和8倍。
利用ADGN-100a进行递送，也在肺和肾中观察到CAS9表达，其水平是背景的约2至3倍。在考察的其它组织中检测到CAS9蛋白表达极少至没有增加。
利用VEPEP-6进行递送，也在肺中(背景的约8倍)，以及在肾、心脏、脑和骨髓中(背景的约3至4倍)观察到可靠的CAS9表达。在考察的其它组织中检测到CAS9蛋白表达极少至没有增加。
利用VEPEP-9进行递送，也在脾、脑和***中观察到可靠的CAS9表达(背景的约4至5倍)。在考察的其它组织中检测到CAS9蛋白表达极少至没有增加。
对于全部3种CPPs，不同组织中的CAS9表达水平在第3天和第6天相似，表明CAS9蛋白表达的长期持久性。如图35C所示，CAS9蛋白表达在注射后保持10天。在第10天，通过3种CPPs(ADGN-100a、VEPEP-6、和VEPEP-9)在肝中、通过VEPEP-6和VEPEP-9在脑中、通过VEPEP-6在肺中、和通过VEPEP-9在***中，观察到CAS9表达。
实施例15：CPP介导的、CAS9表达mRNA和靶向PCSK9的gRNA在小鼠中的体内递送
关于CAS9表达mRNA和靶向前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9)(胆固醇稳态涉及的治疗相关基因)的gRNA在Swiss小鼠中的体内递送，对包括ADGN-100a、VEPEP-6和VEPEP-9的CPPs进行评价。人转化酶PCSK9的抑制剂已作为一类有前景的新型心脏保护药物出现，因为PCSK9的损失与心血管疾病风险降低和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平降低相关。
聚腺苷酸化并且封端的CAS9 mRNA得自ThermoFisher，并且靶向PCSK9外显子1的gRNA(5μg)得自Eurogentec。通过将CAS9 mRNA(5μg)和gRNA(5μg)与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)比混合并在给予前在37℃下培育30min，制备CPP/CAS9mRNA/gRNA复合物。Swiss小鼠接受在生理缓冲剂中的ADGN-100a/CAS9 mRNA/gRNA(4只动物/组)、VEPEP-6/CAS9 mRNA/gRNA(4只动物/组)、或VEPEP-9/CAS9 mRNA/gRNA(4只动物/组)复合物的单次静脉内注射(100μl)。游离CAS9 mRNA/gRNA被注射作为对照。
在多个时间点(第3、6、10、和21天)通过隐静脉出血收集血液样品，收集不多于100μl或10％总血液体积/周。通过ELISA，利用小鼠前蛋白转化酶9/PCSK9 Quantikine ELISA试剂盒(MPC-900、R&DSystems)确定PCSK9的血清水平。利用无限胆固醇试剂(ThermoFisher)测量血清中的总胆固醇水平。
如图36所示，利用ADGN-100a进行递送，PSCK9的血清水平在第1天、第3天、第6天、第10天、第14天、和第20天分别减少51％、62％、69％、65％、65％、和60％。利用VEPEP-6进行递送，PSCK9的血清水平在第1天、第3天、第6天、第10天、第14天、和第20天分别减少64％、73％、75％、73％、71％、和70％。最后，利用VEPEP-9进行递送，PSCK9的血清水平在第1天、第3天、第6天、第10天、第14天、和第20天分别减少仅13％、29％、31％、27％、25％、和24％。如图37所示、对于所有条件，PCSK9水平减少与血清胆固醇水平降低相关。利用ADGN-100a和VEPEP-6肽进行递送，胆固醇水平在第3、6、10、14、和20天减少约35％至42％。
这些结果证明，ADGN-100a和VEPEP-6肽均构成CRISPR组分(包括CAS9mRNA/gRNA)体内功能性递送的有效载体，表明其适用于治疗应用。
实施例16：VEPEP-3介导的CAS9蛋白体内递送在小鼠中不引起细胞因子激活
关于CAS9蛋白在Swiss小鼠中的体内递送，对VEPEP-3a进行评价。酿脓链球菌HIS-NLS-CAS9如上述制备。通过将CAS9蛋白(5μg)与VEPEP-3a以20：1的CPP/CAS9蛋白比混合，制备CPP/CAS9蛋白复合物。小鼠接受在生理缓冲剂中的CAS9/VEPEP-3a(6只动物/组)复合物的单次静脉内注射(100μl)。在生理缓冲剂中的游离CAS9蛋白被注射作为阴性对照，并且LPS给予用作细胞因子激活的阳性对照。为评价VEPEP-3a/CAS9递送相关的体内细胞因子诱导，在多个时间点(12hr、24hr、48hr、和72hr)通过隐静脉出血收集血液样品，收集不多于100μl或10％总血液体积/周。利用来自Invritrogen的细胞因子小鼠磁性20-Plex面板(LMC0006M)，测量血清细胞因子水平。如图38所示，与LPS给予相比，在不同时间点观察到VEPEP-3a对非特异性细胞因子诱导的影响极少至没有。
实施例17：CPP介导的、CAS9表达mRNA和质粒在原代人T细胞中的功能性递送
利用以3：1(小珠：细胞)的比例结合至顺磁珠(Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28、Invitrogen,)的抗CD3/抗CD28抗体，从PBMCs分离T细胞。将细胞和小珠在室温下共同培育2小时，并利用Dynal ClinExVIVO MPC磁体(Thermo Fisher)进行CD3+细胞富集。将抗CD3/抗CD28顺磁珠取出，洗涤和浓缩。将CD3+部分中的细胞以1×106个细胞/ml的浓度重悬浮于激活培养基中2天，其中AIM-V培养基(Thermo Fishers)补充有10％胎牛血清、300IU/ml IL2和50ng/ml OKT3(MuromonAB-CD3)。
关于CAS9 mRNA或CAS9表达质粒在从单个供体分离的T细胞(5x 106)中的细胞递送，对细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、VEPEP-3a、和ADGN-100a)进行评价。CAS9mRNA如上述制备。通过将CAS9 mRNA(0.5μg)与CPP以20：1的CPP：CAS9 mRNA摩尔比混合和在细胞转染前在37℃下培育30min，形成CPP/CAS9复合物。通过将CAS9表达质粒(Addgene MLM3639-质粒#42252)(0.5μg)与CPP以20：1的CPP：质粒摩尔比混合和在细胞转染前在37℃下培育30min，形成CPP/CAS9表达质粒复合物。
将细胞按照实施例13a关于悬浮细胞描述的方案转染。RNAiMAX和Lipofectamine2000脂质基递送方法(Invitrogen Thermo Fisher，法国)用作对照，并且转染遵照制造商的说明进行。在10天期间的多个时间点分析CAS9蛋白表达水平，其通过蛋白质提取物的ELISA，利用得自Diagenode的抗CRISPR/Cas9抗体(Diagenode目录编号C15200223)和ABCAM(克隆7A9-ab191468)来确定。
CAS9蛋白表达结果显示在图39A和39B中(3次单独实验的平均值)。VEPEP-6和ADGN-100a CPPs促进CAS9 mRNA的有效递送，如原代人T细胞中可靠的CAS9蛋白表达所示(图39A)。在第3天，CAS9蛋白表达的ELISA信号，在利用ADGN-100a和VEPEP-6进行CAS9 mRNA递送时分别增加至背景的约15和17倍，并且在利用VEPEP-9时增加至背景的约4倍。在所有条件下，高水平的CAS9蛋白表达在第6天保持，在第10天降低约50％。相比之下，通过VEPEP-3a肽或RNAiMAX，观察到极少至没有CAS9表达。这些结果证明，VEPEP-6和ADGN-100a肽是在难转染细胞类型中递送mRNA的有效媒介。
如图39B所示，ADGN-100a和VEPEP-9CPPs介导CAS9表达质粒的有效递送，如原代人T细胞中可靠的CAS9蛋白表达所示。利用ADGN-100a和VEPEP-9，CAS9蛋白表达的ELISA信号在第3天增加至背景的约4倍。在所有条件下，高水平的CAS9蛋白表达在第6天保持，在第10天降低约50％。相比之下，通过VEPEP-3a或VEPEP-6肽、或通过Lipofectamine 2000，观察到极少至没有CAS9表达。这些结果证明，ADGN-100a和VEPEP-9肽是在难转染细胞类型中递送CAS9表达质粒的有效媒介。
实施例18：CPP介导的、利用CAS9 mRNA、CAS9蛋白、或CAS9表达质粒的、EMX1靶向RGEN/gRNA在原代人T细胞中的功能性递送
关于靶向内源EMX1基因的gRNA与CAS9 mRNA、CAS9蛋白、或CAS9表达质粒在原代人T细胞中的功能性细胞内递送，对细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、ADGN-100a、和VEPEP-3a)进行评价。
EMX1靶向gRNAs和CAS9 mRNA如上述制备。通过将CAS9 mRNA(0.5μg)和gRNA(5μg)与CPP以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)摩尔比混合和在细胞转染前在37℃下培育30min，形成CPP/CAS9 mRNA/gRNA复合物。通过将CAS9表达质粒(Addgene MLM3639-质粒#42252)(0.5μg)和gRNA(5μg)与CPP以20：1的CPP/核酸(质粒+gRNA)摩尔比混合和在细胞转染前在37℃下培育30min，形成CPP/质粒/gRNA复合物。通过将预载CAS9/gRNA复合物(2.5μg/5μg CAS9/gRNA)与CPP以20：1的CPP/复合物摩尔比混合和在细胞转染前在37℃下培育30min，形成CPP/CAS9/gRNA复合物。
将T细胞按照实施例13a关于悬浮细胞描述的方案转染。Lipofectamine 2000和RNAiMAX介导的递送方法(Invitrogen Thermo Fisher，法国)被包括作为对照。对EMX1基因编辑在第3天、第6天、和第10天通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。
EMX1基因中的***缺失频率显示在图40A-40C中。VEPEP-6和ADGN-100a介导CAS9mRNA/gRNA递送，引起原代人T细胞中EMX-1基因的可靠编辑(图40A)。对于这两种肽，在72小时后均观察到CAS9 mRNA/gRNA的有效功能性细胞内递送。获得约60-65％的平均***缺失频率。相比之下，利用VEPEP-9或RNAiMAX，获得约10-15％的平均***缺失频率。VEPEP-3a和ADGN-100a介导的CAS9蛋白/gRNA递送引起原代T细胞中EMX1基因的可靠编辑(图40B)。通过两种肽均获得约60-65％的平均***缺失频率。利用VEPEP-9获得了约20％的平均***缺失频率。相比之下，通过VEPEP-6肽或RNAiMAX，观察到极少至没有EMX1基因编辑。ADGN-100a和VEPEP-9促进CAS9表达质粒和gRNA的递送，引起原代T细胞中EMX1基因的可靠编辑(图40C)。对于这两种肽，在第3天均观察到CAS9表达质粒和gRNA的有效功能性细胞内递送，其中平均***缺失频率为约30％。相比之下，通过VEPEP-6肽或RNAiMAX，观察到极少至没有EMX1基因编辑。
原代人T细胞中观察到的可靠的EMX1基因中断不与细胞毒性相关。如图40D所示，利用ADGN-100a、VEPEP-6、VEPEP-9、和VEPEP-3a货物复合物，观察到小于10％的毒性。相比之下，通过RNAiMAX和Lipofectamine 2000，观察到40-50％之间的细胞死亡。这些结果证明，CPPs是有效的、无毒的、可用于在原代人T细胞中递送不同类型的货物(包括CAS9 mRNA/gRNA、CAS9蛋白/gRNA、和CAS9质粒/gRNA)的载体。
实施例19：具有不同货物的肽系颗粒的颗粒尺寸测量和ζ电位
对CPP/CAS9蛋白、CPP/CAS9蛋白/sgRNA、CPP/CAS9-mRNA、CPP/CAS-mRNA/sgRNA颗粒进行表征；利用Zetasizer NANO ZS P设备(Malvern Ltd)测量平均尺寸、多分散性、和ζ电位。将CAS9蛋白(2.5μg)和预载CAS9蛋白(2.5μg)/gRNA(5μg)与VEPEP-3a、VEPEP-9、ADGN-100a和VEPEP-6肽以20：1的CPP/货物摩尔比在生理条件(0.9％NaCl)下在20℃下混合，并在37℃下培育30min，随后进行分析。
将CAS9 mRNA(0.5μg)和CAS9 mRNA(0.5μg)/gRNA(5μg)与VEPEP-6、VEPEP-9和ADGN-100a以20：1的CPP/货物摩尔比在生理条件(0.9％NaCl)下在20℃下混合，并在37℃下培育30min，随后进行分析。
在25℃下确定CCP/货物复合物的平均尺寸和多分散性，每次测量5min，并和用Zetasizer NANO ZS P设备(Malvern Ltd)测量ζ电位。3次单独实验的平均值的数据显示在表14中。
在摩尔比20：1下，VEPEP-6、VEPEP-9和ADGN-100a肽能够与CAS9-mRNA和CAS9-mRNA/gRNA复合物形成稳定的纳米颗粒。ADGN-100、VEPEP-6和VEPEP-9分别获得约75nM、100nM、和120nM的平均直径以及0.25、0.2、和0.15的多分散指数(PI)。
通过ζ电位获得的ADGN-100a/mRNA和ADGN-100a/CAS9-mRNA/gRNA颗粒电荷分别为-4.5±0.5mV和-5.8±0.6mV。
通过ζ电位获得的VEPEP-6/mRNA和VEPEP-6/CAS9-mRNA/gRNA颗粒电荷分别为-11.0±2mV和-12.7±2.0mV。
通过ζ电位获得的VEPEP-9/mRNA和VEPEP-9/CAS9-mRNA/gRNA颗粒电荷分别为15.4±4.0mV和11.1±2.0mV。
在摩尔比20：1下，VEPEP-3a和ADGN-100a肽能够与CAS9蛋白和CAS9蛋白/gRNA复合物形成稳定的纳米颗粒。VEPEP-3a和ADGN-100a分别获得约60nm和约100nM的平均直径以及约0.25和0.3的多分散指数(PI)。
通过ζ电位获得的ADGN-100a/CAS9蛋白和ADGN-100a/CAS9蛋白/gRNA颗粒电荷分别为3.6±0.5mV和8.3±1.5mV。
通过ζ电位获得的VEPEP-3a/CAS9蛋白和VEPEP-3a/CAS9蛋白/gRNA颗粒电荷分别为16.6±5mV和18.0±5mV。
相比之下，VEPEP-9与预载CAS9蛋白/gRNA复合物形成较大颗粒。在摩尔比20：1下，获得210±20的平均颗粒尺寸和0.51第多分散指数。
表14：CPP/RGEN和CPP/RGEN：gRNA纳米颗粒表征
实施例20：CPP介导的、CAS9 mRNA和靶向Olig2、HIF1-α、BCL2L2、或突变体PTEN或突变体KRAS的gRNA在成胶质细胞瘤或胰腺癌细胞系中的功能性递送
关于包含CAS9 mRNA和靶向Olig2、HIF1-α、BCL2L2、突变体PTEN、或突变体KRAS的gRNA的核蛋白复合物在成胶质细胞瘤或胰腺癌细胞系中的功能性细胞内递送，对细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、和ADGN-100a)进行评价。通过将CAS9 mRNA(0.5μg)和gRNA(5μg)与CPP以20：1的CPP：货物摩尔比混合和在细胞转染前在37℃下培育30min，形成CPP/CAS9mRNA/gRNA复合物。将细胞按照实施例13a描述的方案转染。RNAiMAX介导的递送(Invitrogen Thermo Fisher，法国)用作对照。对基因编辑在第3天和第6天通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。利用标准技术测量细胞增殖和细胞死亡。
实施例21：在成胶质细胞瘤或胰腺癌细胞系中CPP介导的、CAS9 mRNA和靶向突变体PTEN或突变体KRAS的gRNA的功能性递送和通过同源定向修复(HDR)进行的基因编辑
关于在成胶质细胞瘤或胰腺癌细胞系中功能性细胞内递送RGEN/gRNA/ssDNA以利用精确同源定向修复(HDR)进行基因组工程，对细胞穿透肽(VEPEP-6、VEPEP-9、和ADGN-100a)进行评价。包含CAS9 mRNA、靶向突变体PTEN或突变体KRAS的gRNA、和ssDNA供体模板的一种或多种复合物的递送允许通过HDR校正突变基因。
利用通过将CAS9 mRNA(0.5μg)和gRNA(5μg)与CPP以20：1的CPP：货物摩尔比混合而形成的CPP/CAS9 mRNA/gRNA复合物，为高水平双链断裂形成而优化基因组编辑实验。使50nM的REGN/gRNA和ssDNA-供体与VEPEP-6或ADGN-100a肽以20：1的摩尔比缔合——在相同颗粒中(mRNA/gRNA/ssDNA/CPP三元复合物)或在两不同颗粒(mRNA/gRNA/CPP和ssDNA/CPP)中。
将细胞按照实施例13a描述的方案转染。RNAiMAX介导的递送(Invitrogen ThermoFisher，法国)用作对照。对基因编辑在第3天和第6天通过T7E1分析进行分析，并利用片段分析***来定量。利用标准技术测量细胞增殖和细胞死亡。利用限制片段长度多态现象(RFLP)分析和基因组测序，分析靶基因的HDR校正效率。
实施例22：CPP介导的、CAS9表达mRNA和靶向Olig2、HIF1-α、BCL2L2、或突变体PTEN的gRNA在成胶质细胞瘤模型中的体内递送
关于肽系基因编辑复合物的抗肿瘤活性，对负载正位成胶质细胞瘤异种移植肿瘤(例如，U87)的裸鼠进行评价。关于CAS9表达mRNA和靶向Olig2、HIF1-α、BCL2L2、或突变体PTEN的gRNA的体内递送，对包括ADGN-100a、VEPEP-6和VEPEP-9的CPPs进行评价。
聚腺苷酸化并且封端的CAS9 mRNA得自ThermoFisher，并且靶向上述靶的gRNA商业获得。通过将CAS9 mRNA(5μg)和gRNA(5μg)与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)比混合并在给予前在37℃下培育30min，制备CPP/CAS9 mRNA/gRNA复合物。裸鼠接受在生理缓冲剂中的ADGN-100a/CAS9mRNA/gRNA(4只动物/组)、VEPEP-6/CAS9mRNA/gRNA(4只动物/组)、或VEPEP-9/CAS9 mRNA/gRNA(4只动物/组)复合物的单次静脉内或颅内/肿瘤内注射(100μl)。游离CAS9 mRNA/gRNA被注射作为对照。动物被治疗每周1x或2x，并且肿瘤尺寸被测量6周。
实施例23：CPP介导的、CAS9表达mRNA和靶向突变体KRAS的gRNA在胰腺癌模型中的体内递送
关于肽系基因编辑复合物的抗肿瘤活性，对负载胰腺异种移植肿瘤的裸鼠进行评价。关于CAS9表达mRNA和靶向Olig2、HIF1-α、BCL2L2、或突变体KRAS的gRNA的体内递送，对包括ADGN-100a、VEPEP-6和VEPEP-9的CPPs进行评价。
聚腺苷酸化并且封端的CAS9 mRNA得自ThermoFisher，并且靶向上述靶的的gRNAs商业获得。通过将CAS9 mRNA(5μg)和gRNA(5μg)与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)比混合并在给前予在37℃下培育30min，制备CPP/CAS9mRNA/gRNA复合物。裸鼠接受在生理缓冲剂中的ADGN-100a/CAS9mRNA/gRNA(4只动物/组)、VEPEP-6/CAS9 mRNA/gRNA(4只动物/组)、或VEPEP-9/CAS9 mRNA/gRNA(4只动物/组)复合物的单次静脉内注射(100μl)。游离CAS9 mRNA/gRNA被注射作为对照。动物被治疗每周1x或2x，并且肿瘤尺寸被测量6周。
实施例24：在成胶质细胞瘤模型中CPP介导的、CAS9表达mRNA和靶向突变体PTEN的gRNA的体内递送和通过同源定向修复(HDR)进行的基因编辑
关于肽系基因编辑复合物的抗肿瘤活性，对负载正位成胶质细胞瘤异种移植肿瘤(例如，U87)的裸鼠进行评价。关于CAS9表达mRNA、靶向突变体PTEN的gRNA、和允许通过HDR校正突变体PTEN基因的ssDNA供体模板的体内递送，对包括ADGN-100a、VEPEP-6和VEPEP-9的CPPs进行评价。
聚腺苷酸化并且封端的CAS9 mRNA得自ThermoFisher，并且靶向上述靶的gRNAs商业获得。CPP/CAS9mRNA/gRNA/ssDNA复合物通过以下制备：将CAS9 mRNA(5μg)、gRNA(5μg)、和ssDNA(10μg)与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)比混合——在相同颗粒(mRNA/gRNA/ssDNA/CPP三元复合物)中或在两不同颗粒(mRNA/gRNA/CPP和ssDNA/CPP)中；并在给予前在37℃下培育30min。裸鼠接受在生理缓冲剂中的ADGN-100a/CAS9 mRNA/gRNA/ssDNA(4只动物/组)、VEPEP-6/CAS9 mRNA/gRNA/ssDNA(4只动物/组)、或VEPEP-9/CAS9mRNA/gRNA/ssDNA(4只动物/组)复合物的单次静脉内注射(100μl)。游离CAS9mRNA/gRNA/ssDNA被注射作为对照。动物被治疗每周1x或2x，并且肿瘤尺寸被测量6周。在第6周通过基因组测序分析目标基因PTEN的HDR校正效率。
实施例25：在胰腺癌模型中CPP介导的、CAS9表达mRNA和靶向突变体KRAS的gRNA的体内递送和通过同源定向修复(HDR)进行的基因编辑
关于肽系基因编辑复合物的抗肿瘤活性，对负载胰腺异种移植肿瘤的裸鼠进行评价。关于CAS9表达mRNA、靶向突变体KRAS的gRNA、和允许通过HDR校正突变体KRAS基因的ssDNA供体模板的体内递送，对包括ADGN-100a、VEPEP-6和VEPEP-9的CPPs进行评价。
聚腺苷酸化并且封端的CAS9 mRNA得自ThermoFisher，并且靶向上述靶的gRNA商业获得。CPP/CAS9mRNA/gRNA/ssDNA复合物通过以下制备：将CAS9 mRNA(5μg)、gRNA(5μg)、和ssDNA(10μg)与ADGN-100a、VEPEP-6、或VEPEP-9肽以20：1的CPP/核酸(mRNA+gRNA)比混合——在相同颗粒(mRNA/gRNA/ssDNA/CPP三元复合物)中或在两不同颗粒(mRNA/gRNA/CPP和ssDNA/CPP)中；并在给予前在37℃下培育30min。裸鼠接受在生理缓冲剂中的ADGN-100a/CAS9 mRNA/gRNA/ssDNA(4只动物/组)、VEPEP-6/CAS9 mRNA/gRNA/ssDNA(4只动物/组)、或VEPEP-9/CAS9mRNA/gRNA/ssDNA(4只动物/组)复合物的单次静脉内注射(100μl)。游离CAS9mRNA/gRNA/ssDNA被注射作为对照。动物被治疗每周1x或2x，并且肿瘤尺寸被测量6周。在第6周通过基因组测序分析目标基因的HDR校正效率。
序列表
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Claims (10)
1.用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括细胞穿透肽和一种或多种基因组编辑***分子，其中所述细胞穿透肽选自VEPEP-6肽、VEPEP-3肽、VEPEP-9肽，并且其中所述一种或多种基因组编辑***分子选自：
a)RNA指导的核酸内切酶(RGEN)和指导RNA(gRNA)中的一者或两者，其中所述gRNA包括与所述靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列；
b)DNA指导的核酸内切酶(DGEN)和指导DNA(gDNA)中的一者或两者，其中所述gDNA包括与所述靶多核苷酸中的靶序列互补的指导序列；
c)锌指蛋白(ZFP)，其中所述ZFP识别所述靶多核苷酸中的靶序列；
d)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，其中所述TALEN识别所述靶多核苷酸中的靶序列；
e)归巢核酸内切酶，其中所述归巢核酸内切酶识别所述靶多核苷酸中的靶序列；和
f)整合酶，其中所述整合酶识别所述靶多核苷酸中的重组位点。
2.权利要求1所述的基因组编辑复合物，其中所述细胞穿透肽是VEPEP-6肽。
3.权利要求2所述的基因组编辑复合物，其中所述细胞穿透肽包括选自SEQ ID NOs：15-40或77的氨基酸序列。
4.纳米颗粒，其包括核芯，所述核芯包括权利要求1-3中任一项所述的基因组编辑复合物。
5.药物组合物，其包括权利要求1-3中任一项所述的基因组编辑复合物或权利要求4所述的纳米颗粒，和药学上可接受的载体。
6.制备权利要求1-3中任一项所述的基因组编辑复合物的方法，包括组合所述细胞穿透肽与所述一种或多种基因组编辑***分子，从而形成所述基因组编辑复合物。
7.将一种或多种基因组编辑***分子递送到细胞中的方法，包括使所述细胞接触权利要求1-3中任一项所述的基因组编辑复合物或权利要求4所述的纳米颗粒，其中所述基因组编辑复合物或所述纳米颗粒包括所述一种或多种基因组编辑***分子。
8.修饰细胞中的靶多核苷酸的方法，包括使细胞接触权利要求1-3中任一项所述的基因组编辑复合物或权利要求4所述的纳米颗粒，其中所述基因组编辑复合物或所述纳米颗粒包括靶向所述靶多核苷酸中的序列的一种或多种基因组编辑***分子。
9.治疗个体的疾病的方法，包括给予所述个体有效量的权利要求5所述的药物组合物。
10.试剂盒，其包括组合物，所述组合物包括权利要求1-3中任一项所述的基因组编辑复合物和/或权利要求4所述的纳米颗粒。
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