CN117430717A - 一种高产l-半胱氨酸的多酶复合物组装体系及基因工程菌 - Google Patents
一种高产l-半胱氨酸的多酶复合物组装体系及基因工程菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种高产L‑半胱氨酸的多酶复合物组装体系，通过对L‑半胱氨酸合成途径中的关键途径酶CysE、CysM、NrdH、CysK和L‑半胱氨酸转运相关的通道蛋白EamA、EamB的筛选，确定合理的代谢改造靶点，将两个亲和短肽RIDD和RIAD分别与关键途径酶和通道蛋白进行融合表达，通过组合优化，实现关键途径酶和通道蛋白的组装，从而加快L‑半胱氨酸合成途径的反应速率，提高代谢通量，加强产物在细胞膜附近的聚集程度。基于上述多酶复合物组装体系的构建与应用策略，本发明还提供了一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，实现了L‑半胱氨酸的高效合成。
Description
技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系及基因工程菌。
背景技术
L-半胱氨酸作为生物体内重要的有机硫源，在新陈代谢和抗氧化防御网络中发挥着多种关键作用。在蛋白质中，两个半胱氨酸的巯基可以共价键合在一起，形成二硫键，使得蛋白质分子的三维空间结构得以稳定地形成，同时也确保了蛋白质分子的正确折叠，特别是在结构蛋白例如角蛋白和骨骼和***蛋白质中。同时，它还是许多酶催化反应中的重要辅助因子，在细胞生理活动过程中承担着十分重要的功能。L-半胱氨酸及其衍生产品已经广泛应用到医药行业(退热、止痛、消炎)、化妆品行业(抗氧化、抗辐射、抗衰老)、食品行业(面包添加剂、增香剂、抗氧化剂、保鲜剂)以及畜牧行业(促进家禽和牲畜生长，缩短存栏时间)
在L-半胱氨酸的生物技术生产中，主要通过以谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌作为宿主菌的基因工程菌进行发酵表达；但以谷氨酸杆菌作为宿主菌的基因工程菌的产量较低，约950mg/L，故大肠杆菌是微生物发酵法生产L-半胱氨酸的首选宿主。
在大肠杆菌中，L-半胱氨酸的合成途径主要分为碳代谢途径和两条硫代谢途径。在碳代谢中，作为L-半胱氨酸合成中的一个关键酶，丝氨酸乙酰转移酶(也称作SAT)CysE和乙酰辅酶A共同催化L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸为O-乙酰丝氨酸(OAS)。此外，丝氨酸乙酰转移酶CysE与O-乙酰丝氨酸巯基酶A(OASS-A，由基因cysK编码)还可以形成半胱氨酸合酶复合物(CSC)。在两条硫同化途径中，存在两种关键酶，分别是OASS-A和O-乙酰丝氨酸巯基酶B(OASS-B，由基因cysM编码)。OASS-A在硫酸盐途径中催化OAS和硫化物(S2-)转化为产物L-半胱氨酸；OASS-B在硫代硫酸盐途径中催化OAS和硫代硫酸盐转化为SSC，中间产物SSC再于谷氧还蛋白NrdH的催化下转化为L-半胱氨酸和亚硫酸盐，亚硫酸盐还可作为硫源继续进入硫酸盐途径。
代谢途径往往是由多种酶催化的，在自然代谢途径中酶在何时何地发挥其活性，以及代谢产物的浓度都受到严格的调节。细胞是高度动态和复杂的代谢***，其中大多数酶不是孤立地发挥作用，而是形成超分子复合物，这些复合物通过优化底物通道，从而防止中间体的损失，并提高了对催化反应的控制性和催化效率。近年来，区室化和中间产物通道等策略被提出，人工将酶固定在支架上或者限制在某一区域中，将关键代谢途径中的相关酶共定位，构建底物通道，提高代谢速率和目标产物的转化效率，在空间尺度上对酶的位置和距离进行控制，从而提高多酶组装体系稳定性和催化活性。目前，已经开发出的较为成熟的生物脚手架技术，例如DNA脚手架、RNA脚手架和蛋白质脚手架，这些大分子自组装体系目前已经成功应用到代谢通路中的多酶复合物领域，并且成功提高了代谢效率。其中，一对人工蛋白支架RIAD-RIDD，因配体与受体的高特异性结合和纳摩尔级高亲和力被设计为蛋白骨架体系。RIDD肽是由腺苷酸环化酶依赖性的蛋白激酶(PKA)的两种调节亚基(regulatorysubunit,R亚基)的N末端的二聚化/对接结构域(dimerization and docking,D/D)组成，RIAD肽衍生自A激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域上14-18个残基的两亲性螺旋，RIAD和RIDD肽通过蛋白质-蛋白质相互作用形成稳定的二聚体α-螺旋对接结构域。RIAD和RIDD肽对具有以下特点：(1)尺寸很小，分别为44和18个氨基酸，使用其作为标签融合时最大限度地减少了对酶的结构、位置和活性的干扰；(2)肽对具有高亲和力，RIDD二聚体与RIAD肽之间的KD＝1.2nM，可以确保胞内酶复合物的完整性；(3)RIDD和RIAD具有2:1的结合化学计量比，可以得到分支结构。
因此，对L-半胱氨酸合成途径中的关键酶以及通道蛋白进行***性研究，构建多酶复合物组装体系，或成为提高L-半胱氨酸产量的潜在的方法，对于L-半胱氨酸的的工业化生产具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明设计并构建了一套基于亲和短肽RIAD-RIDD的无支架多酶复合物组装体系，将半胱氨酸合成途径中重要途径酶和通道蛋白组装起来，从而加快L-半胱氨酸合成途径的反应速率，提高代谢通量，加强产物在细胞膜附近的聚集程度，从而获得高产L-半胱氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
本发明第一方面，提供了一种高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系，由如下方法构建得到：将短肽RIAD与短肽RIDD分别与至少一种L-半胱氨酸通道蛋白、至少一种L-半胱氨酸关键途径酶进行融合表达，使得连接有短肽RIAD的L-半胱氨酸通道蛋白与连接有短肽RIDD的L-半胱氨酸关键途径酶经RIAD-RIDD结合，得到高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系。
具体地，所述L-半胱氨酸通道蛋白包括EamA、EamB。
具体地，所述L-半胱氨酸关键途径酶包括CysM、NrdH、CysK。
本发明第二方面，提供了一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建得到：
以菌株E.coli W3110 EYC作为出发菌株，构建上述的高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系，并导入过表达cysEf基因的质粒，得到所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
本发明通过以下设计思路，构建得到一套多酶复合物组装体系以及最优的高产L-半胱氨酸的基因工程菌株E.coli W3110 EYC::eamAAD::cysMDD::nrdHDD/pTrc99a-cysEf：
(1)选择生产半胱氨酸的实验室保藏工程菌株E.coli W3110 EYC作为出发菌株(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20191026，已在CN 111019877A中公开)；所述菌株包含丝氨酸乙酰转移酶突变体CysEf的编码基因。
(2)在(1)获得的菌株中，通过构建不同表达质粒pTrc99a-cysEf、pTrc99a-cysEf-eamA、pTrc99a-cysEf-eamAAD、pTrc99a-cysEf-eamB、pTrc99a-cysEf-eamBAD，研究短肽标签RIAD分别融合到通道蛋白EamA和EamB的C端后对发酵生产L-半胱氨酸的影响。
(3)在(1)获得的菌株中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将短肽RIDD分别融合到L-半胱氨酸合成途径中关键途径酶CysE、CysM、NrdH、CysK的C端，来验证短肽RIDD的添加对L-半胱氨酸产量和菌体生长的影响。
(4)基于(2)～(3)的实验结果，在(1)获得的菌株中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将短肽RIAD分别融合到通道蛋白EamA和EamB的C端，将短肽RIDD分别融合到L-半胱氨酸合成途径中关键途径酶CysM、NrdH、CysK的C端，分别将上述修饰后的通道蛋白与途径酶进行组合，以L-半胱氨酸的产量为标准，筛选得到最佳的通道蛋白和关键途径酶的组装方式，获得能够高产L-半胱氨酸的菌株。
本发明通过多酶复合组装体系的搭建，构建得到L-半胱氨酸生产-输出通道，有效地促进L-半胱氨酸在特定空间，即细胞膜附近的合成通量，加快连续反应的催化效率，同时加快了L-半胱氨酸向胞外的运输，加速L-半胱氨酸的产生和积累。
作为优选，所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌为菌株E.coli W3110EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf。以E.coliW3110 EYC作为出发菌株，将短肽RIAD融合到通道蛋白EamA的C端，将短肽RIDD分别融合到L-半胱氨酸合成途径中关键途径酶CysM、NrdH的C端，将上述修饰后的通道蛋白与关键途径酶经RIAD-RIDD结合进行组合，得到最佳的包括有通道蛋白EamA、关键途径酶CysM、NrdH的多酶复合物组装体系，并以此构建得到上述最优的高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
本发明第三方面，提供了一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)以菌株E.coli W3110 EYC作为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将短肽RIAD编码基因***到其基因组上eamA基因一端，构建得到菌株E.coli W3110EYC::eamARIAD。
(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将短肽RIDD编码基因分别***到菌株E.coliW3110 EYC::eamARIAD基因组上cysM基因和nrdH基因的一端，构建得到菌株E.coliW3110EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD。
(3)构建载体pTrc99a-cysEf，并导入至菌株E.coli W3110EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD，构建得到所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf。
作为优选，所述短肽RIAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述短肽RIDD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，所述eamA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述基因eamB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为优选，所述cysEf基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述基因cysK的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述cysM基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述nrdH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明第四方面，提供了所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
具体的，所述应用为：挑取基因工程菌株的单菌落先接种至10ml LB培养基试管中，于温度37℃，转速150～200rpm的摇床中培养12～24h。然后以体积浓度1％接种量接种到20～50ml发酵培养基中开始发酵。培养4小时后添加终浓度为0.1mM的IPTG。发酵温度为30℃，转速150-200rpm，发酵时长为2～4天。发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
作为优选，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20～30g/L、(NH4)2SO45～10g/L、KH2PO42～5g/L、Na2S2O35～10g/L、酵母提取物5～10g/L、Na2HPO410～15g/L、蛋白胨1～5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：300～500g/LMgSO4·8H2O，2～5g/L MnSO4·8H2O，2～5g/L ZnSO4·7H2O，2～8g/L Fe2SO4，溶剂为去离子水。
本发明的有益效果：本发明提出了多酶复合物组装体系的构建与应用策略来控制大肠杆菌中L-半胱氨酸生物合成途径的表达。首先，通过对L-半胱氨酸合成途径中的的关键代谢酶CysE、CysM、NrdH、CysK和L-半胱氨酸转运相关的通道蛋白EamA、EamB的筛选，确定合理的代谢改造靶点。随后，将两个亲和短肽RIDD和RIAD分别与关键途径酶和转运蛋白进行融合表达，通过组合优化，实现途径酶和通道蛋白的组装。多酶复合组装体系的搭建，将会构建一条L-半胱氨酸生产-输出通道，有效地促进L-半胱氨酸在特定空间，即细胞膜附近的合成通量，加快连续反应的催化效率。同时，该体系通过实现L-半胱氨酸合成途径与细胞膜的组装，可以有效提高通道蛋白识别和捕获L-半胱氨酸的能力，加快L-半胱氨酸向胞外的运输，加速L-半胱氨酸的产生和积累。本发明通过多酶复合物组装体系的构建与应用策略，构建了一株高产L-半胱氨酸的大肠杆菌基因工程菌株，实现了L-半胱氨酸的高效合成。
附图说明
图1为：
菌株E.coli W3110 EYC/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamA、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamARIAD、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamB、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamBRIAD的L-半胱氨酸产量和OD600。
图2为：
菌株E.coli W3110 EYC::cysE-RIDD/pTrc99a-cysEf DD、
菌株E.coli W3110 EYC::cysK-RIDD/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110 EYC::cysM-RIDD/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110 EYC::nrdH-RIDD/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量和OD600。
图3为：
菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysKRIDD/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD::cysKRIDD/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD::cysMRIDD/pTrc99a-cysEf、
菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量和OD600。
图4为菌株E.coli W3110 EYC::eamAAD::cysMDD::nrdHDD/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量和OD600。
具体实施方式
以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为50mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为50mg/L，所述氨苄霉素在培养基中终浓度为100mg/L。本发明亲本菌株E.coliW3110 EYC来自中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20191026，已在CN111019877A中公开。菌株E.coli W3110 EYC以菌株E.coliW3110为底盘菌株构建得到，所述菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心Coli Genetic Stock Center，保藏编号CGSC#4474，已在专利US2009/0298135A1，US2010/0248311A1中公开。
实施例1：L-半胱氨酸含量的测定
(1)取1mL菌液于2mL的EP管中，在12000rpm条件下离心1分钟，将上清和沉淀分离。上清用于L-半胱氨酸，L-丝氨酸以及其他代谢产物的检测。
(2)称取0.27g的CNBF溶于10mL乙腈中作为Ⅰ液；以0.2M硼酸溶液和0.05M硼砂溶液作为母液，4:1体积混合配成pH＝9.0标准缓冲溶液记为Ⅱ液。将样品稀释成0～5g/L浓度，按照样品100μL，Ⅰ液300μL和Ⅱ液500μL比例混合，在恒温振荡器中40～60℃，500～1000rpm反应0.5～1小时。样品过膜装入液相瓶中待测。
(3)仪器为赛默飞UPLC超高压液相色谱仪。色谱柱为C18柱(4.6×250mm，5μm)；紫外检测器检测波长260nm；进样量10μL；柱温30℃；流速0.8mL/min；流动相使用AB两相，A相纯乙腈，B相50mM HAc-NaAc缓冲液：乙腈：三乙胺＝82.8：17：0.2，pH＝4.9。梯度洗脱程序如表1所示。
表1：梯度洗脱程序
| 序号 | 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 1 | 0 | 18 | 82 |
| 2 | 3 | 20 | 80 |
| 3 | 5 | 35 | 65 |
| 4 | 8 | 35 | 65 |
| 5 | 10 | 50 | 50 |
| 6 | 12 | 50 | 50 |
| 7 | 13 | 80 | 20 |
| 8 | 15 | 70 | 30 |
| 9 | 18 | 18 | 82 |
| 10 | 23 | 18 | 82 |
实施例2：短肽标签RIAD融合到EamA和EamB的C端后对菌株E.coliW3110 EYC发酵生产L-半胱氨酸的影响
为了研究短肽标签RIAD融合到EamA和EamB的C端后对发酵生产L-半胱氨酸的影响，构建了不同的含有强启动子Trc以及突变体CysEf编码基因的表达质粒pTrc99a-cysEf、pTrc99a-cysEf-eamA、pTrc99a-cysEf-eamAAD、pTrc99a-cysEf-eamB、pTrc99a-cysEf-eamBAD，将质粒导入L-半胱氨酸工程菌株E.coli W3110 EYC(SS1)中，分别得到菌株SS1-01、SS1-02、SS1-03、SS1-04、SS1-05。过表达未融合短肽RIAD的EamA和EamB的菌株为对照组，发酵48h后，测定发酵液上清中L-半胱氨酸的滴度。
(1)以pTrc99a质粒为模版，以99aline-F和99aline-R为引物，通过PCR进行扩增，得到线性化载体。以野生型菌株E.coli W3110基因组为模板，以cysE-F和cysE-R为引物，扩增得到基因cysE片段。用DpnI对PCR产物进行消化。所有PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化PCR片段。按照一步克隆试剂盒(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化载体与基因片段cysE进行连接，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落使用引物99a-VF和99a-VR进行菌落PCR验证，测序验证得到pTrc99a-cysE质粒。以质粒pTrc99a-cysE为模板，利用引物T167A-F和T167A-R，G245S-F和G245S-R进行PCR，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落用菌落PCR验证(引物99a-VF和99a-VR)，测序验证得到含CysE突变体的pTrc99a-cysEf的质粒。引物如表2所示。
(2)以pTrc99a-cysEf质粒为模版，以pE-line-F和pE-line-R为引物，通过PCR进行扩增，得到线性化载体。以野生型菌株E.coli W3110基因组为模板，以eamA-F和eamA-R为引物，扩增得到eamA片段。PCR产物消化以及片段和载体的一步克隆连接同(1)，测序验证得到pTrc99a-cysEf-eamA质粒。引物如表2所示。
(3)以pTrc99a-cysEf-eamA质粒为模版，以pEA-line-F和pEA-line-R为引物，通过PCR进行扩增，得到线性化载体。以pTrc99a-cysEf-eamA质粒为模版，以pEA-eamA-F和pEA-eamA-R为引物，得到eamA片段。以pET28a-RIAD质粒为模版，以pEA-RIAD-F和pEA-RIAD-R为引物，得到RIAD片段。以片段eamA和片段RIAD为模板，以pEA-eamA-F和pEA-RIAD-R为引物进行融合PCR，得到片段eamA-RIAD。所有PCR产物片段用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化PCR片段。按照一步克隆试剂盒(One step Clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化载体与基因片段eamA-RIAD进行连接，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落使用引物99a-VF和99a-VR进行菌落PCR验证，测序验证得到pTrc99a-cysEf-eamAAD质粒。引物如表2所示。
(4)同构建方法(2)构建质粒pTrc99a-cysEf-eamB。引物如表2所示。
(5)同构建方法(3)构建质粒pTrc99a-cysEf-eamBAD。引物如表2所示。
(6)将菌株E.coli W3110 EYC(SS1)制备成化转感受态细胞，分别将构建好的pTrc99a-cysEf、pTrc99a-cysEf-eamA、pTrc99a-cysEf-eamAAD、pTrc99a-cysEf-eamB、pTrc99a-cysEf-eamBAD质粒通过化学转化法转化到E.coli W3110EYC感受态中，获得菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf(SS1-01)、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamA(SS1-02)、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamARIAD(SS1-03)、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamB(SS1-04)、
菌株E.coli W3110EYC/pTrc99a-cysEf-eamBRIAD(SS1-05)。
(7)将菌株SS1-01、SS1-02、SS1-03、SS1-04、SS1-05接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20～30g/L、(NH4)2SO45～10g/L、KH2PO42～5g/L、Na2S2O35～10g/L、酵母提取物5～10g/L、Na2HPO410～15g/L、蛋白胨1～5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。微量元素溶液组成为：300～500g/L MgSO4·8H2O，2～5g/L MnSO4·8H2O，2～5g/LZnSO4·7H2O，2～8g/L Fe2SO4，溶剂为去离子水。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图1所示。
由图1可知，菌株SS1-02产量为1.27g/L，相比对照提升了57％，菌株SS1-04的产量提升了32％，这说明加强L-半胱氨酸外转运蛋白EamA和EamB的表达能够加速L-半胱氨酸的外排，从而提高产物的滴度。菌株SS1-03与SS1-02，菌株SS1-04与SS1-05的L-半胱氨酸产量没有显著差异，证明短肽标签RIAD的添加不会严重影响通道蛋白EamA、EamB行使其正常功能，这些结果为后续实验奠定了基础
表2：实施例2引物
实施例3：短肽标签RIID融合到关键途径酶的C端后对菌株E.coli W3110 EYC发酵生产L-半胱氨酸的影响
为了研究短肽RIDD的添加对关键途径酶CysE、CysK、CysM、NrdH的影响，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将RIDD分别融合到菌株SS1基因组上的CysEf、CysK、CysM和NrdH的C端，无缝***到终止密码子前。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以cysE-RIDD-PTTB-F和cysE-RIDD-PTTB-R为引物，根据pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)经PCR扩增对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的△pTarget质粒。使用线性化引物PTL-F和PTL-R将突变成功的△pTarget质粒进行线性化，产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，得到线性化载体。
(2)以E.coli W3110 EYC基因组为模板，通过引物cysE-RIDD-D1F和cysE-RIDD-D1R，cysE-RIDD-D3F和cysE-RIDD-D3R，进行PCR扩增得到基因组上基因cysEf***位点的上下游各500bp。以质粒pET28a-RIDD为模板，通过引物RIDD-D2F和RIDD-D2R，进行PCR扩增得到基因RIDD的片段。通过融合PCR将上述三个DNA片段融合，得到片段Donor-RIDD。
(3)按照一步克隆试剂盒(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将步骤(1)中的线性化载体与基因片段Donor-RIDD进行连接，转化到E.coli DH5α中，涂布于壮观霉素抗性平板，挑取单菌落使用引物pT-VF和pT-VR进行菌落PCR验证，测序验证得到pTD-RIDD质粒。
(4)由于基因片段是无缝***，所以PAM位点以及20bp同样存在于pTD-RIDD质粒中上下游各500bp的同源序列上，因此，为了避免pCas质粒表达的Cas9蛋白将PTD进行识别切割，对pTD-RIDD质粒的同源臂上的20bp进行同义密码子替换。以质粒pTD-RIDD为模板，以cysE-RIDD-STTBF和cysE-RIDD-STTBR为引物，进行PCR扩增得到pTD-RIDD-TB，用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物转化到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTD-RIDD-TB质粒。
(5)将菌株E.coli W3110 EYC制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到感受态E.coli W3110 EYC中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株E.coli W3110 EYC/pCas。
(6)将菌株E.coli W3110 EYC/pCas制备成电转感受态。将质粒PTD-RIDD-TB电转到E.coli W3110 EYC/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落使用引物cysE-RIDD-VF和cysE-RIDD-VR进行菌落PCR验证，筛选编辑成功菌株，得到菌株E.coli W3110 EYC::cysEf RIDD。引物如表3所示。
(7)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，若不能生长单菌落，则其pTarget质粒成功消除。挑取pTarget质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，若不能生长单菌落，则其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒菌株E.coli W3110 EYC::cysEf RIDD。
(8)根据上述的方法，分别将短肽RIDD***到基因cysK、cysM和nrdH的C端。获得菌株E.coli W3110 EYC::cysKRIDD、菌株E.coli W3110 EYC::cysMRIDD、菌株E.coliW3110EYC::nrdHRIDD。在以上菌株中分别导入质粒pTrc99a-cysEf-RIDD和质粒pTrc99a-cysEf得到菌株SS1-06、SS1-07、SS1-08、SS1-09。为了验证RIDD对基因组上途径酶的影响，同时导入含有RIDD片段的质粒pTrc99a-cysEf-RIDD和不含RIDD片段的质粒pTrc99a-cysEf，以达到控制变量的要求。将菌株SS1-06、SS1-07、SS1-08、SS1-09分别接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。所述发酵培养基组成同实施例2。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图2所示。
从图2结果可以看出，菌株SS1-07、SS1-08、SS1-09的产量与对照组相比没有太大波动，而菌株SS1-06的产量显著下降57％，降至0.3g/L，说明将RIDD融合到cysK、cysM和nrdH的C端后不影响途径酶正常的活性，而将RIDD融合到CysE的C端后菌株产L-半胱氨酸的能力下降。可能的原因是短肽RIDD影响了丝氨酸乙酰转移酶CysE的结构，导致L-半胱氨酸的直接前体OAS的生成减少，从而导致产量的下降。
表3：实施例3引物
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实施例4：研究将通道蛋白与途径酶进行组合对菌株E.coliW3110 EYC生产L-半胱氨酸的影响筛选最优组合
为了筛选最优组合，根据实施例2～3的结果，选择途径酶CysK、CysM、NrdH和通道蛋白EamA、EamB来构建L-半胱氨酸多酶复合物组装***。在菌株E.coliW3110 EYC的基础上，将RIAD与通道蛋白EamA、EamB的C端融合，得到菌株E.coliW3110 EYC::eamARIAD(SS2)和菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD(SS3)。然后，在菌株SS2和菌株SS3的基础上分别将RIDD与途径酶CysK、CysM、NrdH的C端融合，得到菌株SS2::cysKRIDD(SS2-1)、SS2::cysMRIDD(SS2-2)、SS2::nrdHRIDD(SS2-3)以及SS3::cysKRIDD(SS3-1)、SS3::cysMRIDD(SS2-2)、SS3::nrdHRIDD(SS3-3)。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过引物eamA-RIAD-PTTBF和eamA-RIAD-PTTBR进行PCR扩增，根据pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)经PCR扩增对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget质粒。使用线性化引物PTL-F和PTL-R将突变成功的pTarget质粒进行线性化，产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，得到线性化载体。
(2)以E.coli W3110 EYC基因组为模板，通过引物eamA-RIAD-D1F和eamA-RIAD-D1R，eamA-RIAD-D3F和eamA-RIAD-D3R，进行PCR扩增得到基因组上基因eamA***位点的上下游各500bp。以质粒pET28a-RIAD为模板，通过引物RIAD-D2F和RIAD-D2R，进行PCR扩增得到基因RIAD的片段。通过融合PCR将上述三个DNA片段融合，得到片段Donor-RIAD。
(3)按照一步克隆试剂盒(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化载体与基因片段Donor-RIAD进行连接，转化到E.coli DH5α中，涂布于壮观霉素抗性平板，挑取单菌落使用引物pT-VF和pT-VR进行菌落PCR验证，测序验证得到pTD-RIAD质粒。
(4)对pTD-RIAD质粒的同源臂上的20bp进行同义密码子替换。以质粒pTD-RIAD为模板，以eamA-RIAD-STTBF和eamA-RIAD-STTBR为引物，进行PCR扩增得到pTD-RIAD-TB，用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTD-RIAD-TB质粒。
(5)将菌株E.coli W3110 EYC制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到E.coli W3110 EYC化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株E.coli W3110 EYC/pCas。
(6)将菌株E.coli W3110 EYC/pCas制备成电转感受态。将质粒pTD-RIAD-TB电转到E.coli W3110 EYC/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落使用引物eamA-RIAD-VF和eamA-RIAD-VR进行菌落PCR验证，筛选编辑成功菌株，得到菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD。引物如表4所示。
(7)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，若不能生长单菌落，则其pTarget质粒成功消除。挑取pTarget质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，若不能生长单菌落，则其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD。
根据上述的方法，将短肽RIAD***到菌株E.coli W3110 EYC基因eamB的C端，获得菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD，引物如表4所示。将短肽RIDD分别***到菌株E.coliW3110 EYC::eamARIAD和菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD的基因组基因cysK、cysM和nrdH的C端，引物如表3所示，获得以下菌株：
菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysKRIDD(SS2-1)、
菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD(SS2-2)、
菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::nrdHRIDD(SS2-3)、
菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD::cysKRIDD(SS3-1)、
菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD::cysMRIDD(SS3-2)、
菌株E.coli W3110 EYC::eamBRIAD::nrdHRIDD(SS3-3)。
在以上菌株中分别导入质粒pTrc99a-cysEf，将构建得到的菌株SS2-1/pE、SS2-2/pE、SS2-3/pE、SS3-1/pE、SS3-2/pE以及SS3-3/pE接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
由图3(a)可知，相较于其他途径酶，将EamA和CysM组装的效果最佳，L-半胱氨酸的产量达到1.229g/L，提升了46％。将EamA和NrdH组装后产量1.212g/L，提升了44％，将EamA和CysK组装的效果不明显。其中，CysM、NrdH是硫代硫酸盐途径的两个重要酶，CysM催化OAS和硫代硫酸盐反应产生SSC，紧接着被NrdH还原为L-半胱氨酸和亚硫酸盐(SO3 2-)。分析原因可能是相较于硫酸盐途径，L-半胱氨酸的合成主要依赖于硫代硫酸盐途径该途径更加节能。因此，选择硫代硫酸盐途径上的两个重要途径酶CysM和NrdH来构建底物通道对L-半胱氨酸的发酵生产具有良好的提升作用。由3(b)可知，任何途径酶和EamB的组装都对L-半胱氨酸的产量没有显著影响，可能的原因是途径酶和EamB之间没有形成复合物。
表4：实施例4引物
实施例5：将通道蛋白EamA和硫代硫酸盐途径酶cysM和nrdH进行组装对菌株E.coli W3110 EYC生产L-半胱氨酸的影响。
根据实施例4的结果，在最优菌株菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD的基础上，将RIDD融合到nrdH的C端，得到菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD。
(1)以实施例3相同的方法将短肽RIDD***到菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD的基因组基因nrdH的C端，得到菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD(SS4)，引物如表3所示。导入质粒pTrc99a-cysEf，获得菌株菌株E.coli W3110EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf(SS4/pE)。
(2)将E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图4所示。
如图4所示，L-半胱氨酸的产量提升至1.52g/L，相比出发菌株提升了79％。研究结果证明该策略能够有效提升L-半胱氨酸产量，通过在L-半胱氨酸生物合成途径上安装一个个代谢节点，使原本物理分隔的代谢通路得以链接，其中EamA-CysM-NrdH多酶复合物如同一个纽带，将更多的L-半胱氨酸合成并引流至目标通道蛋白，使L-半胱氨酸生物合成流线化，并提高了滴度。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系，其特征在于，由如下方法构建得到：将短肽RIAD与短肽RIDD分别与至少一种L-半胱氨酸通道蛋白、至少一种L-半胱氨酸关键途径酶进行融合表达，使得连接有短肽RIAD的L-半胱氨酸通道蛋白与连接有短肽RIDD的L-半胱氨酸关键途径酶经RIAD-RIDD结合，得到高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系。
2.根据权利要求1所述的一种高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系，其特征在于，所述L-半胱氨酸通道蛋白包括EamA、EamB。
3.根据权利要求1所述的一种高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系，其特征在于，所述L-半胱氨酸关键途径酶包括CysM、NrdH、CysK。
4.一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建得到：
以菌株E.coli W3110 EYC作为出发菌株，构建如权利要求1～3任一所述的高产L-半胱氨酸的多酶复合物组装体系，并导入过表达cysEf基因的质粒，得到所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌为菌株E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf。
6.一种如权利要求5所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以菌株E.coli W3110 EYC作为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将短肽RIAD编码基因***到其基因组上eamA基因一端，构建得到菌株E.coliW3110 EYC::eamARIAD。
(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将短肽RIDD编码基因分别***到菌株E.coliW3110 EYC::eamARIAD基因组上cysM基因和nrdH基因的一端，构建得到菌株E.
coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD。
(3)构建载体pTrc99a-cysEf，并导入至菌株E.coli W3110EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD，构建得到所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌E.coli W3110 EYC::eamARIAD::cysMRIDD::nrdHRIDD/pTrc99a-cysEf。
7.根据权利要求6所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述短肽RIAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述短肽RIDD的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
8.根据权利要求6所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述eamA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求6所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述cysEf基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cysM基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述nrdH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
10.权利要求4或5所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌或者权利要求6～9任一所述方法构建得到的高产L-半胱氨酸的基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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