CN117426352B - 一种间质性肺病变动物模型的构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种动物模型的构建方法及其应用，施用牙周病原体诱导间质性肺病变动物模型，进一步施用II型胶原蛋白以及佐剂提高了间质性肺病变的严重程度。该动物模型的病变特点与人类高度相似，更好的模拟了环境因素（例如吸烟患者和牙周炎患者）在RA‑ILD的关节表现和肺部表现。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种间质性肺病变动物模型的构建方法与应用。
背景技术
间质性肺病变（interstitial lung disease，ILD）是以弥漫性肺实质、肺泡炎症和间质纤维化为病理基本病变，以活动性呼吸困难、X线胸片弥漫性浸润阴影、限制性通气障碍、弥散（DLCO）功能降低和低氧血症为临床表现的不同种类疾病群构成的临床-病理实体的总称。
ILD通常不是恶性的，目前也不认为是由已知的感染性致病源所引起的，但却是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）最常见的关节外症状表现，大约发生在40～80%的RA患者，其死亡率为10～20%，平均生存期为5～8年。ILD预后极差，是导致RA患者死亡的主要原因之一。
建立实验动物模型是研究发病机制及研发创新药物的重要基础。虽然RA动物模型如胶原诱导型关节炎（CIA）和佐剂诱导型关节炎（AA）等能非常好地模拟关节炎的临床症状和病理特征，但ILD发病率较低。气管注射博来霉素致是目前ILD最为常见的方法，但该法虽操作简单、成本低，但肺部病变范围较局限，与人类病变的弥漫性分布有差异，且会给动物造成不可逆的器质性伤害。因此需要建立一种既有RA特征，又有高ILD发病率和显著ILD症状的RA-ILD动物模型。
根据现有文献报道RA-ILD的动物模型主要有CIA、AA、胶原诱导联合博来霉素型（CIA+BLM）、转基因小鼠、转基因小鼠联合酵母聚糖五种动物模型。但是：
（1）运用最多的CIA模型和AA模型都是RA的常用动物模型，且CIA模型和AA模型在RA的基础上并发肺部间质性病变的发病率较低。
（2）CIA+BLM模型（例如CN110604098A、CN116076438A）肺部病变范围较局限，与人类病变的弥漫性分布有差异，且会给动物造成不可逆的器质性伤害。
（3）转基因小鼠和转基因小鼠联合酵母聚糖动物模型，需要较长时间才能成型，不能完全复制RA-ILD中主要类型UIP（寻常性间质性肺炎）的相关肺部病理表现。
除此之外，环境因素包括吸烟和牙周炎是公认的可引起肺部炎症的环境触发因素，同时也是RA患者发生ILD的关键危险因素。它可能诱导RA患者中自身抗体的形成，与抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体的高滴度相关。而上述动物模型均未涉及环境因素，因此上述模型与RA-ILD的产生机制均不同。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明提供了通过牙周病原体感染结合II型胶原蛋白建立的一种既有RA特征，又有高ILD发病率和显著ILD症状的RA-ILD动物模型。具体的：
本发明的第一方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述的构建方法包括施用牙周病原体，所述的动物模型为间质性肺病变动物模型。
优选的，所述的牙周病原体包括但不限于牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）、福赛坦氏菌（Tannerella forsythia）、齿垢密螺旋体（Treponema denticola）、伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、中间普氏菌（Prevotella intermedia）、变黑普氏菌（Prevotella nigrescens）或粘性放线菌（Actinomyces viscosus）中的一种或两种以上组合。
在一个具体实施方式中，所述的牙周病原体可以为牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）。或者为牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）与其他牙周病原体（例如福赛坦氏菌（Tannerella forsythia）、齿垢密螺旋体（Treponema denticola）、伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、中间普氏菌（Prevotella intermedia）、变黑普氏菌（Prevotella nigrescens）或粘性放线菌（Actinomyces viscosus）中的一种或两种以上组合）的组合。
优选的，所述的牙周病原体每1-7（例如1、2、3、4、5、6、7）天施用一次。
优选的，所述的牙周病原体每次施用量为1×107-1×1010（例如1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010）CFU。
优选的，所述的施用总天数为45-60（例如45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60）天。
优选的，所述的牙周病原体施用方式包括但不限于涂抹给药、口服给药、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射或静脉内注射，进一步优选的，所述的施用方式为涂抹给药，更优选为口腔涂抹，更进一步优选为在上下颚龈缘涂抹。
优选的，所述的构建方法还包括施用II型胶原蛋白。优选的，施用II型胶原蛋白至少一次，例如1次、2次、3次或4次以上；优选的，两次施用II型胶原蛋白的间隔时间为15-25（例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25）天。
首次施用牙周病原体与首次施用II型胶原蛋白的间隔时间为8-20（例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）天，进一步优选为间隔14天。优选的，首次施用牙周病原体与首次施用II型胶原蛋白和佐剂组合的间隔时间为8-20（例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）天。
进一步优选的，还包括施用佐剂。更进一步优选为II型胶原蛋白和佐剂组合施用。再优选为将佐剂与II型胶原蛋白同时施用。优选的，所述的佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、明矾、热休克蛋白或细胞因子中的一种或两种以上的组合。
在一个具体实施方式中，所述的构建方法为仅施用牙周病原体、II型胶原蛋白和佐剂。
优选的，所述的构建方法包括先施用牙周病原体，再施用II型胶原蛋白（优选其与佐剂的组合）。
优选的，所述的II型胶原蛋白和/或佐剂的施用方式包括但不限于涂抹给药、口服给药、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射或静脉内注射。
优选的，所述的II型胶原蛋白和佐剂等体积施用。
在一个具体实施方式中，所述的造模方法包括从第1天起在非人动物上下颚龈缘每天涂抹1×107-1×1010CFU（例如1×107-1×1010CFU/mL的Pg的2% CMC的PBS液10-1000μL）的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis），持续到造模结束；在第8-20天和第30-40天分别用II型胶原蛋白和佐剂的组合（其中II型胶原蛋白和佐剂等体积）免疫。
优选的，所述的动物模型为关节炎合并间质性肺病变动物模型，进一步优选的，所述的关节炎为类风湿关节炎。
优选的，所述动物模型可以是除人类以外的任何哺乳动物，例如马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗或啮齿动物如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。特别优选为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿动物。
优选的，所述的动物模型为具有免疫易感性的大鼠或小鼠。
在一个具体实施方式中，鼠的种类包括但不限于：ICR或DDY; BALB/cA、C57BL/6N、C3H/HeN、DBA/1J、DBA/2N或CBA/N; BDF1 (C57BL/6 x DBA/2), CDF1 (CBA/N x DBA/2)或B6C3F1(C57BL6 x C3H/HeN); 可以使用任何用作实验小鼠的东西，例如属于突变***的BALB/c-nu或C,B-17SCID。
优选的，所述的构建方法还包括在施用牙周病原体前，施用抗生素，进一步优选的，所述的抗生素包括但不限于氨苄青霉素、万古霉素、新霉素、甲硝唑或四环素。
本发明的第二方面，提供了一种上述的构建方法获得的动物模型。
优选的，所述的动物模型出现关节肿胀、滑膜炎症、血管翳、软骨破坏、骨破坏并伴随肺泡炎病变、间质炎症细胞浸润和肺泡壁增厚症状。
本发明的第三方面，提供了上述的构建方法获得动物模型或上述的动物模型在筛选或制备治疗间质性肺病变或关节炎合并间质性肺病变的药物中的应用。
本申请是借助牙周病原体牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）结合Ⅱ型胶原诱导关节炎（Pg+CIA）建立RA-ILD动物模型，通过小鼠关节炎指数评分、膝关节HE染色、抗CCP抗体检测和免疫球蛋白IgG结果共同证实了RA的发生。同时统计了小鼠的发病率和发病情况，结合小鼠组织的HE染色、Masson染色证实ILD的发生。与以往的RA-ILD的动物模型相比本申请动物模型具有以下优点：
（1）Pg+CIA模型ILD发病率高。
（2）由于Pg是牙周炎引起RA的主要危险因素，因此Pg+CIA模型更好的模拟了吸烟患者和牙周炎患者在RA-ILD的关节表现和肺部表现。
（3）Pg+CIA模型组小鼠肺部HE和Masson染色病理报告显示病变程度高，病变特点与人类高度相似。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
附图说明
图1：DBA/1J小鼠的临床特征，A为后爪代表性照片；B为关节炎评分。其中，P<0.01 vs Control组。
图2：DBA/1J小鼠自身抗体检测，其中，P<0.01 vs Control组；##P<0.01，#P<0.05 vs Pg+CIA组；&&P<0.01 vs CIA组。
图3：膝关节病理染色（A）及病理学评分（B），其中，P<0.01 vs Control组；##P<0.01 vs Pg+CIA组；&&P<0.01 vs CIA组。
图4：Micro-CT影像学检测、骨计量学参数检测结果，其中，P<0.01 vs Control组；##P<0.01，#P<0.05 vs Pg+CIA组； &&P<0.01，&P<0.05 vs CIA组；BMD为膝关节骨密度、BV/TV为骨体积分数、Tb.Th为骨小梁厚度、Tb.N为骨小梁数量。
图5：肺组织病理染色及病理学评分结果，P<0.01 vs Control组，##P<0.01，#P<0.05 vs Pg+CIA组。
图6：肺组织Masson染色及胶原面积比，P<0.01 vs Control组；##P<0.01 vsPg+CIA组。
图7：肺组织α-SMA、Col Ⅰ、FN蛋白的表达水平和KL-6 mRNA表达量（A）（B）小鼠各组肺组织α-SMA、Col Ⅰ、FN蛋白的表达水平（免疫组化，×400）;（C）α-SMA、Col Ⅰ、FN、和KL-6mRNA表达量；其中， P <0.01 vs Control组; #P<0.05 vs Pg+CIA组; ##P <0.01 vs Pg+CIA组。
图8：肺组织TNF- α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平，P<0.01 vs Control 组;&&P<0.01 vs CIA 组; #P<0.05 vs Pg+CIA组; ##P<0.01 vs Pg+CIA组。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1 实验方法和材料
1.1 实验动物
雄性6周龄DBA/1J小鼠40只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SYXK（京）2019-0008]，实验单位使用许可证编号：SYXK（京）2021-0017。饲养于22±2℃的环境中，自由摄食和饮水，适应饲养7天后用于后续实验。本研究中动物福利和实验过程均遵循中国中医科学院动物伦理委员会的相关规定。
1.2 药品与试剂
Pg（Porphyromonas gingivalis，Pg）菌株（ATCC#33277）购自北纳创联生物科技有限公司；哥伦比亚血琼脂培养基购自比克曼生物科技有限公司；牛二型胶原乙酸溶液（货号：NO.2002-2）和完全弗氏佐剂（货号：NO.7001）均购自美国Chondrex公司；小鼠抗环瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP-antibody）ELISA试剂盒（货号：CSB-EQ027743MO）购自CUSBIO公司；小鼠牙龈卟啉单胞菌抗体检测试剂盒（货号：ml023665-J）、小鼠免疫球蛋白IgG（货号：ml057874）检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；Masson三色染色液试剂盒（批号:C210601）购自珠海贝索生物技术有限公司；DEPC无酶水购自北京兰杰柯科技有限公司（货号：BL510B），逆转录试剂盒（货号：AE311）购自全式金生物科技有限公司，康为世纪Ultra SYBR Mixture (High ROX)，无水乙醇（货号：100092683），环保型脱蜡透明液（货号：G1128），20×柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）（货号：G1202），20×Tris-EDTA 抗原修复液（pH9.0）（货号：G1203），20×Tris-EDTA 抗原修复液（pH 8.0）（货号：G1206），苏木素染液（货号：G1004），苏木素分化液（G1039），苏木素返蓝液（货号：G1040），组化试剂盒 DAB显色剂（货号：G1212）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。
1.3 实验仪器
三菱2.5LMGC厌氧罐，厌氧产气袋（日本三菱化学株式会社）；Multiskan MK3酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司）。烤片机（KPJ-1A）、轮转式切片机（QPJ-C）、生物组织包埋机（BMJ-1B）（天津天利航空机电有限公司）；BX50型正置显微镜（奥林巴斯（日本）公司）；微计算机断层扫描Micro-CT（GE Healthcare公司，RS0800604-0063），涡旋混匀仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司、预冷离心机购自上海楚柏实验室设备有限公司，匀浆机购自艾卡（广州）仪器设备有限公司，PCR仪（德国耶拿），赛默飞qPCR仪。
1.4 细菌活化
将0.3-0.5ml左右无菌水或液体培养基注入冻干管中，轻轻吹打，充分溶解成菌悬液。吸取菌悬液，均匀打入2个哥伦比亚血琼脂培养基表面上(约200uL/个)，涂布均匀，在厌氧罐和厌氧产气袋中用90%的氮、5%的二氧化碳和5%的氢的混合物平衡。活化成功后，即可进行相关试验。用分光光度计测定细菌细胞计数，分光光度在600nm时为1.0，相当于1×109CFU/ml。然后收集109CFU/ml细菌重悬于PBS中。
1.5 造模和分组
将实验动物随机分为四组，分别为正常对照组（Control）、胶原诱导组（CIA）、单纯牙龈卟啉单胞菌感染组（Pg）和胶原诱导结合牙龈卟啉单胞菌感染组（Pg+CIA）。所有小鼠均适应性饲养7天，在适应性饲养前三天内，所有组别均饲喂氨苄青霉素(10 mg/500mL)以消除不利于Pg定植的内源性细菌。各组别的具体造模方法如下：（1）Control组：从第1天起小鼠上下颚龈缘每天涂抹2%CMC（羧甲基纤维素）的PBS液200μL，持续到造模结束；（2）CIA组：从第1天起小鼠上下颚龈缘每天涂抹2%CMC的PBS液200μL，持续到造模结束。在第14天和第35天分别用CII（Ⅱ型胶原蛋白，2mg/ml）和CFA（完全弗氏佐剂，4mg/ml）等体积（各100μl）的乳浊液免疫，从小鼠尾部皮下注射；（3）Pg组：从第1天起小鼠上下颚龈缘每天涂抹含1×109CFU/mL的Pg的2% CMC的PBS液100μL，持续到造模结束；（4）Pg+CIA组：从第1天起小鼠上下颚龈缘每天涂抹含1×109CFU/mL的Pg的2%CMC的PBS液100μL，持续到造模结束。在第14天和第35天分别用CII和CFA等体积（各100μl）的乳浊液免疫，从小鼠尾部皮下注射。整个造模天数为56天。其中，CII具体使用牛二型胶原乙酸溶液。
1.6 发病率和关节炎评分
统计小鼠RA发病率，发病率=每组小鼠发病只数/每组小鼠总数×100%。关节炎评分参考表1小鼠评价其4个踝腕关节、4个足中段、12个指趾关节。
表1：关节炎评分
1.7 ELISA检测
小鼠处死后摘眼球取血，静置、离心后获得血清。取试剂盒自备的96孔板，加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。将50ul生物素标记抗体立即加入到反应孔内，用封孔膜贴合96孔板，在37℃振荡的条件下温育60分钟。甩去并拍干96孔板内的液体，然后在各孔中加入200ul洗涤液，重复洗板3次。洗板后拍干，往每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，在37℃振荡的条件下温育30分钟。甩去并拍干96孔板内的液体，然后在各孔中加入200ul洗涤液，重复洗板3次。向反应孔中加入底物A（试剂盒中的显色剂A（含过氧化氢）为供氢体（DH2））和底物B（显色剂B（含TMB）,用于显色）的等体积混合溶液100ul，在37℃振荡的条件下温育10分钟，并避免光照。最后将96孔板取出，向反应孔中加入50ul终止液，加入完毕后立即于Multiskan MK3酶标仪中检测吸光度。在试剂盒（小鼠抗环瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP-antibody）ELISA试剂盒、小鼠牙龈卟啉单胞菌抗体检测试剂盒、小鼠免疫球蛋白IgG检测试剂盒）指定波长处测定各孔的OD值。
1.8 膝关节HE染色
取膝关节，多聚甲醛固定，用10%EDTA慢速脱钙后用石蜡使用生物组织包埋机包埋，轮转式切片机切片备用。切片置于烤片机上60℃烤片30 min，将切片放在二甲苯和梯度乙醇中脱蜡至水，载切片依次放入苏木素染液和伊红染液中染色，流水冲洗，分化液分化后0.5%氨水返蓝，最后再次用流水冲洗。切片稍稍晾干后用中性树脂封片，BX50型正置显微镜下观察拍照。具体观察内容和评分标准如下表2分值越高提示病变程度越高。
表2：膝关节病理学评分表
1.9 炎症膝关节Micro-CT扫描骨计量学分析
将膝关节置于10%甲醛溶液中固定48h，然后在25μm的分辨率下进行Micro-CT扫描，待扫描的膝关节组织扫描的单次时长为72min，Micro-CT扫描摄片后进行关节重建，同时进行骨计量学参数分析。对各组小鼠膝关节骨密度(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)等骨计量学参数进行统计分析。
1.10 肺组织HE染色
轮转式切片机切片，并脱蜡至水，苏木素染液10min，自来水充分洗，分化液5s，自来水充分洗，反蓝液反蓝5s，自来水充分洗，0.1%伊红1min，95%乙醇2min，95%乙醇2min，100%乙醇Ⅰ3min，100%乙醇Ⅱ3min，二甲苯Ⅰ7min，二甲苯Ⅱ7min，中性树胶封固，BX50型正置显微镜下观察拍照。病理形态学改变（肺泡炎病变程度，间质炎症细胞浸润，肺泡壁增厚程度）根据轻重标记为“+”“++”“+++”“++++”，分别表示轻微、轻度、中度、重度，对应评分为1-4分，无病变标记为0分，缺失记“无”。个体评分为各个病变评分（肺泡炎病变程度，间质炎症细胞浸润，肺泡壁增厚程度）之和，具体评分标准见表3。
表3：肺组织病理评分标准
1.11 Masson染色
切片置于烤片机上65℃烤片1h，将切片放在二甲苯和梯度乙醇中脱蜡至水，载切片依次放入苏木素染液、丽春红、磷钼酸和苯胺蓝中染色，1%冰醋酸溶液冲洗，梯度乙醇脱水二甲苯透明。切片稍稍晾干后用中性树脂封片，BX50型正置显微镜下观察拍照。在光镜下（10×10）同一样本随机选取3个视野，测算胶原面积比，采用Image-ProPlus测量胶原面积、整个图像总面积，计算胶原面积比，胶原面积比（%）=（胶原面积/整个图像总面积）×100%。具体使用了Masson三色染色液试剂盒进行实验。
1.12 肺组织免疫组化
将石蜡切片脱蜡至水后进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，滴加一抗，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗，切片平放于试剂盒内 4°C 孵育过夜；滴加二抗，室温孵育 50min，然后进行DAB显色，复染细胞核，脱水封片镜检。
1.13 q-PCR检测肺组织IL-1β，TNF-α，IL-6
TRIzol法提取组织RNA,检测浓度及纯度,调齐浓度,逆转录成cDNA,以cDNA为模版,通过RT-qPCR检测IL-1β，TNF-α，IL-6的mRNA的表达。GAPDH的上游引物为AGTGGCAAAGTGGAGATT（SEQ ID NO:1），下游引物为GTGGAGTCATACTGGAACA（SEQ ID NO:2）；IL-1β的上游引物为TCCTTGTGCAAGTGTCTGAAGC（SEQ ID NO:3），下游引物为ATGAGTGATACTGCCTGCCTGA（SEQ ID NO:4）；TNF-α的上游引物为CACCACCATCAAGGACTCAA（SEQID NO:5），下游引物为AGGCAACCTGACCACTCTCC（SEQ ID NO:6）；IL-6的上游引物为CTCTGCAAGAGACTTCCATCCAGT（SEQ ID NO:7），下游引物为GAAGTAGGGAAGGCCGTGG（SEQ IDNO:8）。
1.14 数据处理及统计分析
数据统计和绘图使用GraphPad Prism 8.0.2软件和Image-ProPlus软件进行，计量资料的结果用平均数（Mean）±标准差（SD）表示。
2实验结果
2.1小鼠造模后的症状表现
评估了Pg感染结合胶原诱导对小鼠RA发生的影响作用，首先观察了关节炎指数、发病率及发病相关情况。结果表明，CIA组和Pg+CIA组均出现明显关节红肿、足趾变形、皮肤充血，部分关节出现活动受限等症状，发病率均为100%(10/10)，关节炎临床积分分别为70和68，且两组间临床积分无统计学差异，具体见图1和表4。
表4：DBA/1J小鼠不同组别RA临床特点
2.2 模型动物血清抗体水平
小鼠血清抗体的检测结果显示，相较于正常对照组，Pg组的抗Pg抗体表达量明显升高(P<0.01)，CIA组的IgG抗体含量显著升高(P<0.01)，Pg + CIA组的抗Pg抗体和IgG抗体均明显升高，且均有统计学差异(P<0.01)。与CIA组比较，Pg组IgG含量明显降低(P<0.01)。与Pg + CIA组相比，Pg组抗CCP抗体、抗Pg抗体和IgG抗体表达量明显少(P<0.01、0.05)，CIA组抗Pg抗体表达量减少(P<0.05、0.01)，具体如图2所示。
2.3 膝关节组织病理学检测
RA的病理特征是慢性侵袭性关节炎，关节的组织病理学观察是目前实验研究中评估RA模型动物发病特点及疾病严重度的最重要方法。膝关节HE染色结果显示，正常组和Pg组小鼠均关节表面光滑，无血管翳形成，细胞排列整齐。CIA组和Pg+CIA组均出现明显踝关节腔周围滑膜组织明显增生并突入关节腔，关节间隙变窄，增生的滑膜组织侵犯皮下，部分形成纤维硬化灶，伴滑膜内大量的炎性细胞浸润和肉芽组织增生，滑膜血管翳形成，骨和软骨出现明显损伤，如图3所示。病理积分分滑膜炎症、血管翳、软骨破坏、骨破坏等4方面进行。
2.4 Micro-CT影像学检测
Micro-CT 3D重建结果显示，Control组膝关节光滑完整，骨轮廓清晰。Pg组出现轻微骨质侵蚀和关节腔狭窄等变化。CIA组和Pg+CIA组小鼠膝关节表面疏松粗糙，凹凸不平，骨结构遭到侵蚀，骨组织表明出现成片蜂窝状侵蚀点。进一步骨计量学统计结果显示，Pg+CIA组BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N均与Control组和Pg组有统计学差异(P<0.05)，见图4所示。
2.5 肺组织HE染色病理学检测
肺间质病变的病理特征是肺泡和肺间质炎性细胞浸润，泡壁严重增厚，出现纤维化和结节形成，肺的组织病理学观察是目前实验研究中评估肺间质病变模型动物发病特点及疾病严重度的最重要方法。肺组织HE染色结果显示，正常组小鼠肺组织结构清晰，肺泡表面光滑，无明显变形或破裂，呼吸道上皮细胞排列整齐，间质未见炎症细胞浸润；Pg组小鼠肺泡大面积出血、水肿、坏死，肺泡间隔中度或重度增厚，伴轻度或中度炎症细胞浸润，以淋巴细胞和单核细胞为主。较正常组有明显差异；间质和支气管可见少量纤维组织增生；CIA组小鼠肺泡壁轻度或中度增厚，伴轻微或轻度炎症细胞浸润，以淋巴细胞和单核巨噬细胞为主，较正常组有明显差异；间质和支气管有少量纤维组织增生，与正常组比较未见统计学差异；Pg+CIA组小鼠大面积肺泡出血、水肿、坏死，肺泡间隔轻度~重度增厚，间质可见中度或重度肉芽肿性炎症细胞浸润，呈团状分布，以淋巴细胞和单核细胞为主，也有少量的中性粒细胞聚集，间质和支气管可见较多纤维组织增生，较正常组、Pg和模型组明显加重（P＜0.01）。如图5所示，病理积分分肺泡炎病变程度、间质炎症细胞浸润和肺泡壁增厚程度3方面进行。
Pg组可以诱导间质性肺病变症状，但在施加Pg一定时间后，如从首次免疫（第14天）或第二次免疫（第28天）开始，Pg干预均不能继续显著加重肺部病变。
2.6 肺组织Masson染色
Masson三色染色是***染色中最经典的一种方法，又称马松染色，是显示组织中纤维的主要方法之一，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。如图6所示，正常组小鼠肺组织结构清晰，肺泡表面光滑，无明显变形或破裂，呼吸道上皮细胞排列整齐，间质未见炎症细胞浸润；Pg组镜下可见肺泡大面积出血、水肿、坏死，肺泡间隔中度或重度增厚，伴轻度或中度炎症细胞浸润，以淋巴细胞和单核细胞为主。较正常对有明显差异；间质和支气管可见少量纤维组织增生；CIA组镜下可见肺泡壁轻度或中度增厚，伴轻微或轻度炎症细胞浸润，以淋巴细胞和单核巨噬细胞为主，较正常组有明显差异；间质和支气管有少量纤维组织增生，与正常组比较未见统计学差异；CIA+Pg组可见大面积肺泡出血、水肿、坏死，肺泡间隔轻度~重度增厚，间质可见中度或重度肉芽肿性炎症细胞浸润，呈团状分布，以淋巴细胞和单核细胞为主，也有少量的中性粒细胞聚集，间质和支气管可见较多纤维组织增生，较正常组、Pg模型组和CIA模型组明显加重（P＜0.01）。
2.7肺组织免疫组化
与正常对照组比较，Pg组、CIA组和Pg + CIA组小鼠肺组织中的α-SMA、ColⅠ和FN蛋白表达水平均比正常组明显升高（P<0. 01）；与Pg + CIA组对比，Pg组仅Col Ⅰ蛋白表达水平明显降低（P<0. 01），CIA组α-SMA、ColⅠ和FN蛋白表达水平均明显降低（P<0.05、0. 01）；CIA组和Pg组两组间的三种蛋白表达无明显差异。纤维化相关mRNA检测实验结果，显示与正常对照组对比，Pg组α-SMA mRNA表达量明显升高（P<0.01），CIA组α-SMA和FN mRNA表达量明显升高（P<0.01），Pg + CIA组I型胶原(Collagen I, Col Ⅰ) 、α-SMA、FN和唾液酸化糖链抗原-6 (Correlation of Krebs von den Lungen-6, KL-6) mRNA表达量均明显升高（P<0.01）；与Pg + CIA组对比，Pg组和CIA组α-SMA、FN和KL-6 mRNA表达量均明显降低（P<0.01、0.05）。结果见图7A、B、C。
2.8肺组织q-PCR
炎症因子mRNA检测实验结果，显示与正常对照组对比，Pg组肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) mRNA表达量均明显升高（P<0.01），CIA组白介素-1β(interleukin-6, IL-1β) mRNA表达量均明显升高（P<0.01），Pg + CIA组TNF- α、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β mRNA表达量均明显升高（P<0.01）；与Pg + CIA组对比，Pg组IL-1β mRNA表达量明显降低（P<0.01），CIA组IL-6、TNF-α mRNA表达量明显降低（P<0.05、0.01）；Pg组的TNF- α mRNA表达量比CIA组高（P<0.01）。结果见图8。
从以上结果可以看出，单独Pg仅可诱导轻度的ILD，不能诱导关节炎，CIA和Pg+CIA均可诱导关节炎和ILD，且二组关节炎病变程度相近；与单独Pg和CIA组相比，Pg+CIA的ILD病变程度尤其是纤维化程度明显严重，抗CCP含量明显升高，提示Pg+CIA可以诱导明显的RA-ILD，其ILD和关节炎的病变程度高，病变特点与人类高度相似，更好的模拟了吸烟患者和牙周炎患者在RA-ILD的关节表现和肺部表现。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种动物模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括施用牙周病原体和II型胶原蛋白，所述的动物模型为关节炎合并间质性肺病变动物模型，所述的牙周病原体包括牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis），所述的动物为小鼠。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的牙周病原体每1-7天施用一次，所述的牙周病原体每次施用量为1×107-1×1010CFU，所述的施用总天数为45-60天。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的牙周病原体施用方式包括涂抹给药、口服给药、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射或静脉内注射。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括施用II型胶原蛋白至少一次。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，两次施用II型胶原蛋白的间隔时间为15-25天。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将佐剂与II型胶原蛋白同时施用。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的佐剂包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、明矾、热休克蛋白或细胞因子中的一种或两种以上的组合。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的II型胶原蛋白和/或佐剂的施用方式包括涂抹给药、口服给药、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射或静脉内注射。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，首次施用牙周病原体与首次施用II型胶原蛋白和佐剂组合的间隔时间为8-20天。
10.一种权利要求1-9任一所述的构建方法获得动物模型在筛选或制备治疗间质性肺病变或关节炎合并间质性肺病变的药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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