CN117412985A - 靶向ror1的嵌合抗原受体 - Google Patents

靶向ror1的嵌合抗原受体 Download PDF

Info

Publication number
CN117412985A
CN117412985A CN202280016400.4A CN202280016400A CN117412985A CN 117412985 A CN117412985 A CN 117412985A CN 202280016400 A CN202280016400 A CN 202280016400A CN 117412985 A CN117412985 A CN 117412985A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fold
polypeptide
cells
cell
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280016400.4A
Other languages
English (en)
Inventor
S·帕克
Q·冯
B·萨瑟
B·琉
M·拉乔伊
H·莫菲特
B·魏茨纳
Y·宋
S·博伊肯
N·沙玛
S·波图里
B·保勒达基普尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd filed Critical Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Priority claimed from PCT/US2022/017738 external-priority patent/WO2022182891A1/en
Publication of CN117412985A publication Critical patent/CN117412985A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本公开涉及编码包含c‑Jun多肽、ROR1结合蛋白和截短EGF受体的嵌合多肽的多核苷酸。还提供了表达CAR的细胞(例如，T细胞)，所述CAR包含ROR1结合蛋白并且过表达c‑Jun多肽。CAR T细胞中的c‑Jun的过表达赋予改良的性质，例如，减少或防止耗竭。

Description

靶向ROR1的嵌合抗原受体
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2021年2月25日提交的美国临时申请第63/153,878号；2021年10月28日提交的第63/263,229号；和2022年2月11日提交的第63/309,393号的优先权益处；所述申请各自以全文引用的方式并入本文中。
经由EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用
在本申请中提交的以电子方式提交的序列表(名称：4385_042PC04_Seqlisting_ST25.txt，大小：80,716个字节；和创建日期：2022年2月23日)的内容以全文引用的方式并入本文中。
发明背景
使用表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继免疫疗法是有希望的癌症治疗，因为这些细胞可以不依赖于人类白细胞抗原(HLA)的方式直接识别和杀灭表达抗原的肿瘤细胞。然而，T细胞耗竭是限制CAR T细胞治疗剂的功效的主要因素。
因此，需要提供耐耗竭性CAR T细胞以便允许最大功效的方法。
发明内容
在一些方面，本公开提供了编码包含c-Jun多肽(c-jun)、ROR1结合蛋白和截短EGF受体(EGFRt)的嵌合多肽的多核苷酸。在一些方面，c-Jun多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，当嵌合多肽在细胞中表达时，c-Jun多肽能够防止或减少细胞的耗竭。在一些方面，ROR1结合蛋白包含特异性结合到ROR1的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些方面，CAR包含特异性结合到ROR1的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，ROR1结合蛋白特异性结合到与R12抗体相同的表位。在一些方面，ROR1结合蛋白包含有包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。在一些方面，VH CDR1包含SEQID NO:45，VH CDR2包含SEQ ID NO:46，并且VH CDR3包含SEQ ID NO:47。在一些方面，VLCDR1包含SEQ ID NO:49，VL CDR2包含SEQ ID NO:50，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:51。在一些方面，ROR1结合部分的VH包含SEQ ID NO:44并且ROR1结合部分的VL包含SEQ ID NO:48。在一些方面，ROR1结合部分包含与SEQ ID NO:52具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，CAR还包含跨膜(TM)结构域。在一些方面，TM结构域衍生自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152，或它们的任何组合。在一些方面，TM结构域衍生自CD28。在一些方面，TM结构域包含与SEQ ID NO:54具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，编码本公开的CAR的多核苷酸还包含特异性结合到ROR1的抗体或其抗原结合部分与TM结构域之间的间隔子。在一些方面，间隔子衍生自免疫球蛋白铰链区或CD8。在一些方面，间隔子包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列。在一些方面，间隔子还包含连接子。在一些方面，连接子包含GGGSG(SEQ ID NO:16)。在一些方面，CAR还包含细胞内信号转导结构域。在一些方面，其中细胞内信号转导结构域包含CD3ζ激活结构域、CD3δ激活结构域、CD3ε激活结构域、CD3η激活结构域、CD79A激活结构域、DAP 12激活结构域、FCER1G激活结构域、DAP10/CD28激活结构域、ZAP70激活结构域，或它们的任何组合。在一些方面，细胞内信号转导结构域包含CD3ζ激活结构域。在一些方面，CD3ζ激活结构域包含与SEQ ID NO:55具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，CAR包含细胞内共刺激信号转导区域。在一些方面，细胞内共刺激信号转导结构域包含以下各者的共刺激结构域：白细胞介素-2受体(IL-2R)、白细胞介素-12受体(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck结合缺失CD28(ICA)、OX40、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、Fc受体γ链、Fc受体ε链、与CD83特异性结合的配体，或它们的任何组合。在一些方面，细胞内信号转导结构域包含4-1BB共刺激结构域。在一些方面，4-1BB共刺激结构域包含与SEQ ID NO:53具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含(i)ROR1结合蛋白、(ii)包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列的间隔子、(iii)CD28跨膜蛋白、(iv)4-1BB共刺激区域和(v)CD3ζ激活结构域。
在一些方面，本文提供了包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含(i)包含有包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)的ROR1结合蛋白；(ii)包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列的间隔子；和(iii)编码截短EGF受体(EGFRt)的核苷酸序列。在一些方面，ROR1结合部分的VH包含SEQ ID NO:44并且ROR1结合部分的VL包含SEQ ID NO:48。在一些方面，EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本文所述的多核苷酸还包含编码c-Jun多肽的核苷酸序列。在一些方面，编码c-jun多肽的核苷酸序列和编码CAR的核苷酸序列在同一载体上。在一些方面，c-jun多肽和CAR通过连接子来连接。在一些方面，连接子是可裂解连接子。在一些方面，连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。在一些方面，编码c-jun多肽的核苷酸序列和编码CAR的核苷酸序列在不同载体上。
在一些方面，多核苷酸还包含编码截短EGF受体(EGFRt)的核苷酸序列。在一些方面，编码截短EGF受体(EGFRt)的核苷酸序列和编码CAR的核苷酸序列在同一载体上。在一些方面，EGFRt和CAR通过连接子来连接。在一些方面，连接子是可裂解连接子。在一些方面，连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。在一些方面，CAR还包含信号肽。在一些方面，信号肽衍生自hIgK。在一些方面，hIgK信号肽包含如SEQ ID NO:17阐述的氨基酸序列。在一些方面，EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本文公开的多核苷酸还包含骨髓增生性肉瘤病毒增强子、负控制区域缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子、EF1a启动子和/或泛素启动子。在一些方面，MND启动子包含与SEQ ID NO:64具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:58具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些方面，本公开提供了编码CAR的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQ IDNO:57具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含本文公开的多核苷酸的载体。在一些方面，本公开提供了由本文公开的多核苷酸或载体编码的多肽。
在一些方面，本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述多肽包含(i)ROR1结合抗体或其抗原结合部分、(ii)包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列的间隔子、(iii)CD28跨膜蛋白、(iv)4-1BB共刺激区域和(v)CD3ζ激活结构域。在一些方面，ROR1结合抗体或其抗原结合部分特异性结合到与R12抗体相同的表位。在一些方面，ROR1结合抗体或其抗原结合部分包含有包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。在一些方面，VH CDR1包含SEQ ID NO:45，VH CDR2包含SEQ ID NO:46，并且VH CDR3包含SEQ ID NO:47。在一些方面，VL CDR1包含SEQ ID NO:49，VL CDR2包含SEQ ID NO:50，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:51。在一些方面，ROR1结合抗体或其抗原结合部分的VH包含SEQ ID NO:44并且ROR1结合部分的VL包含SEQ ID NO:48。在一些方面，ROR1结合抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:52具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，多肽还包含跨膜(TM)结构域。在一些方面，CD28TM结构域包含与SEQID NO:54具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，CD3ζ激活结构域包含与SEQ ID NO:55具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，4-1BB共刺激结构域包含与SEQ ID NO:53具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含c-Jun多肽(c-jun)、CAR多肽和截短EGF受体(EGFRt)的嵌合多肽。在一些方面，CAR多肽是本文公开的任何CAR多肽。在一些方面，c-Jun多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，当嵌合多肽在细胞中表达时，c-Jun多肽能够防止或减少细胞的耗竭。在一些方面，其中c-jun多肽和CAR多肽在同一载体上。在一些方面，c-jun多肽和CAR多肽通过连接子来连接。在一些方面，连接子是可裂解连接子。在一些方面，连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。在一些方面，c-jun多肽和CAR多肽在不同载体上。在一些方面，截短EGF受体(EGFRt)和CAR在同一载体上。在一些方面，EGFRt和CAR通过连接子来连接。在一些方面，连接子是可裂解连接子。在一些方面，连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。在一些方面，EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，嵌合多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含与SEQ ID NO:52具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列的嵌合多肽。在一些方面，CAR多肽还包含信号肽。在一些方面，信号肽衍生自hIgK。在一些方面，hIgK信号肽包含如SEQ ID NO:17阐述的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含多核苷酸、载体、多肽、嵌合多肽或它们的任何组合的经修饰的细胞。
在一些方面，本公开提供了包含c-jun多肽、嵌合抗原受体多肽和截短EGF受体(EGFRt)的经修饰的细胞。在一些方面，经修饰的细胞包含本文公开的多肽。在一些方面，经修饰的细胞包含CAR多肽并且EGFRt在细胞表面上表达。在一些方面，细胞是免疫细胞。在一些方面，细胞是T细胞、B细胞、调控T细胞(Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、干细胞、诱导性多能干细胞，和它们的任何组合。在一些方面，细胞在体外或离体工程化。在一些方面，细胞在体外或离体培养。
在上述经修饰的细胞中的任一者中，在一些方面，与未被修饰成包含本公开的多核苷酸、载体、多肽和/或嵌合多肽中的任一者的对应细胞相比，c-Jun多肽的表达增加。在一些方面，与对应细胞相比，c-Jun多肽的表达增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。
本文还提供了包含c-Jun多肽、嵌合抗原受体(CAR)多肽和截短EGF受体(EGFRt)的免疫细胞的群体，其中如与不包含c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，所述群体包含减少数目的TIGIT阳性免疫细胞。
在一些方面，与参照群体相比，在抗原刺激之后存在于群体中的TIGIT阳性免疫细胞的数目减少了至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％或至少约60％。在一些方面，在抗原刺激之后，免疫细胞的群体包含少于约15％、少于约14％、少于约13％、少于约12％、少于约11％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％或少于约5％的TIGIT阳性免疫细胞。
在一些方面，本公开还提供了包含c-Jun多肽、嵌合抗原受体(CAR)多肽和截短EGF受体(EGFRt)的免疫细胞的群体，其中如与不包含c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，所述群体包含减少数目的TNFRSF9阳性免疫细胞。
在一些方面，与参照群体相比，在抗原刺激之后，存在于群体中的TNFRSF9阳性免疫细胞的数目减少了至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％或至少约70％。在一些方面，在抗原刺激之后，免疫细胞的群体包含少于约5％、少于约4.5％、少于约4％、少于约3.5％或少于约2％的TNFRSF9阳性免疫细胞。
本文还提供了包含c-Jun多肽、嵌合抗原受体(CAR)多肽和截短EGF受体(EGFRt)的免疫细胞的群体，其中如与不包含c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，所述群体包含减少数目的GZMA阳性免疫细胞。
在一些方面，与参照群体相比，在抗原刺激之后，存在于群体中的GZMA阳性免疫细胞的数目减少了至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％或至少约20％。在一些方面，在抗原刺激之后，免疫细胞的群体包含少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％或少于约10％的GZMA阳性免疫细胞。
在上述免疫细胞的群体中的任一者中，在一些方面，CAR多肽包含本文所述的CAR多肽中的任一者。在一些方面，c-Jun多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在以上提供的免疫细胞的群体中的任一者中，在一些方面，免疫细胞包含T细胞、B细胞、调控T细胞(Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、干细胞、诱导性多能干细胞，或它们的组合。在一些方面，免疫细胞是T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞，或两者)。
在一些方面，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的多核苷酸、载体、多肽、嵌合多肽或经修饰的细胞和药学上可接受的运载体。
在一些方面，本公开提供了制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括用本文公开的多核苷酸或载体来转染细胞。在一些方面，本公开提供了制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括在细胞中表达本文公开的多肽或嵌合多肽。在一些方面，细胞包括T细胞、B细胞、调控T细胞(Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、干细胞、诱导性多能干细胞，和它们的任何组合。在一些方面，细胞在体外或离体培养。
在一些方面，本公开提供了扩增表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括在合适条件下培养包含多核苷酸或载体的细胞或表达本文公开的多肽或嵌合多肽。
在一些方面，本公开提供了治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用免疫细胞，所述免疫细胞过表达c-Jun多肽并且包含嵌合抗原受体(CAR)和截短EGF受体(EGFRt)，其中CAR对于在肿瘤上表达的抗原具有特异性。在一些方面，免疫细胞包括本文公开的经修饰的细胞中的任一者。
在一些方面，肿瘤衍生自癌症，包括乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结直肠癌、***癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃癌、胃肠癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，或它们的组合。在一些方面，肿瘤是实体瘤。在一些方面，所述方法还包括向受试者施用至少一种额外治疗剂。在一些方面，至少一种额外治疗剂包括化疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子激活剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法，或它们的任何组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体，或它们的任何组合。
在以上提供的治疗方法中的任一者(例如，***的方法)中，在一些方面，与参照肿瘤大小相比，在施用之后，肿瘤的大小(肿瘤大小)减小。在一些方面，参照肿瘤大小包括：(i)施用之前的肿瘤大小，(ii)未接受施用(例如，接受不过表达c-Jun多肽的对应免疫细胞的施用)的对应受试者中的肿瘤大小，或(iii)同时(i)和(ii)。在一些方面，与参照肿瘤大小相比，肿瘤大小减小了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
在以上提供的治疗方法中的任一者(例如，***的方法)中，在一些方面，与参照生存持续时间相比，在施用之后，受试者的生存持续时间增加。在一些方面，参照生存持续时间包括未接受施用(例如，接受不过表达c-Jun多肽的对应免疫细胞的施用)的对应受试者的生存持续时间。在一些方面，与参照生存持续时间相比，生存持续时间增加了至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约一年。
在以上提供的治疗方法中的任一者(例如，***的方法)中，在一些方面，与不过表达c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，在施用之后，免疫细胞能够在受试者中持续更长时间。
在一些方面，在施用之后，免疫细胞能够在受试者中持续比对应免疫细胞长至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。在一些方面，在施用之后约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月或约八个月，如与存在于接受对应免疫细胞的施用的参照受试者中的对应免疫细胞相比，存在于受试者中的所施用免疫细胞为约1倍与约10倍之间。
本公开还提供了杀灭肿瘤细胞的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与过表达c-Jun多肽并且包含嵌合抗原受体(CAR)和截短EGF受体(EGFRt)的免疫细胞接触，其中CAR对于在肿瘤细胞上表达的抗原具有特异性。在一些方面，免疫细胞包括本文提供的经修饰的细胞中的任一者。
在一些方面，与肿瘤细胞与不过表达c-Jun多肽的对应免疫细胞接触的参照方法相比，肿瘤细胞的杀灭增加。在一些方面，参照方法，肿瘤细胞的杀灭增加了至少约0.5倍、1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
本文还提供了增加响应于抗原刺激的免疫细胞的细胞因子产生的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽，其中ROR-1结合蛋白特异性结合到与R12抗体相同的表位。
在一些方面，细胞因子包括IFN-γ、IL-2，或两者。在一些方面，与对应免疫细胞相比，在修饰之后，响应于抗原刺激的细胞因子产生增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。在一些方面，细胞因子的产生的增加使用Meso ScaleDiscovery(MSD)U-Plex测定来测量。
在一些方面，本公开还提供了增加响应于抗原刺激的免疫细胞的增殖的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽，其中ROR-1结合蛋白特异性结合到与R12抗体相同的表位。
在一些方面，与对应免疫细胞相比，在修饰之后，响应于抗原刺激的免疫细胞的增殖增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。在一些方面，增殖增加引起更大数目的免疫细胞。
本文提供了增加响应于持续抗原刺激的免疫细胞的效应功能的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽，其中ROR-1结合蛋白特异性结合到与R12抗体相同的表位。
在一些方面，如与对应免疫细胞相比，免疫细胞保持效应功能达至少一轮、至少两轮或至少额外三轮的抗原刺激测定。在一些方面，效应功能包括以下能力：(i)杀灭肿瘤细胞，(ii)在进一步抗原刺激后产生细胞因子，或(iii)同时(i)和(ii)。在一些方面，如与对应免疫细胞相比，免疫细胞的效应功能增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
本文提供了减少或防止响应于持续抗原刺激的免疫细胞的耗竭的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽，其中ROR-1结合蛋白特异性结合到与R12抗体相同的表位。在一些方面，如与对应免疫细胞相比，在修饰之后，响应于持续抗原刺激，免疫细胞表达：(i)降低水平的与耗竭相关的基因，(ii)增加水平的与激活相关的基因，或(iii)同时(i)和(ii)。
在一些方面，适用于以上方法的免疫细胞被修饰成包含本文所述的多核苷酸中的任一者。
附图说明
图1A和1B示出了本文所述的抗ROR1 CAR T细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1 CART细胞)选择性裂解表达ROR1的NSCLC肿瘤细胞。以1:1的效应物与靶标(E:T)细胞比率，将模拟(未转导)T细胞、对照R12(例如，不表达c-Jun)CAR T细胞或c-Jun-R12 CAR T细胞与表达NucLight Red(NLR；核限制性mKate2)的表达ROR1的NSCLC肿瘤细胞(“H1975”)(图1A)或缺少ROR1表达的NSCLC肿瘤细胞(“H1975-ROR1KO”)(图1B)共孵育120小时。随着时间的推移(x轴)来计数NLR阳性细胞的总数并且相对于时间点0小时的计数来归一化，以便计算归一化靶标杀灭(y轴)。
图2A、2B、2C和2D示出了c-Jun过表达增强抗ROR1 CAR T细胞的ROR1依赖性细胞因子分泌，但是不增加紧张性信号转导。以1:1的效应物与靶标(E:T)细胞比率，将模拟(未转导)T细胞、对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)或过表达c-Jun的抗ROR1CAR T细胞与表达ROR1的NSCLC肿瘤细胞(图2A和2C)或缺少ROR1表达的NSCLC肿瘤细胞(图2B和2D)共孵育24小时，此刻，收集来自共孵育孔的上清液以便用于细胞因子定量。IL-2(图2A和2B)和IFN-γ(图2C和2D)的浓度使用Meso Scale Discovery(MSD)U-Plex来测量。图2A-2D示出的结果来自三个独立供体(即，供体1、供体2和供体3)。
图3A，3B和3C示出了c-Jun过表达增强抗ROR1 CAR T细胞的细胞因子依赖性增殖能力。模拟(未转导)T细胞、对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)或过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞个别地在Grex 24孔板中用基础T-细胞培养基(图3A)、T-细胞培养基+200IU/ml IL-2(图3B)或T-细胞培养基+1200IU/ml IL-7+200IU/mL IL-15(图3C)来培养。第0天，针对各个条件，将1百万个细胞接种并且每7天，并且将细胞计数并且重新接种1百万个细胞。总细胞数目(y轴)示出每次扩增结束时的实际T细胞数目。
图4A和4B示出了在长期暴露于表达ROR1的NSCLC肿瘤细胞系之后，c-Jun过表达延长抗ROR1 CAR T细胞的细胞溶解活性和IFN-γ分泌。对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)或过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞通过暴露于ROR1+A549 NSCLC肿瘤细胞7天来长期刺激。通过每2天，以1:1E:T比率用新鲜靶细胞来重新涂铺CAR T细胞，确保长期抗原暴露。长期刺激后第7天，将CAR T细胞收集并且与A549-NLR(E:T细胞比率1:1)或H1975-NLR(E:T1:5)共孵育。靶细胞的裂解通过追踪相对于测定设置的时间0小时来归一化的总NLR强度来评估(图4A)。收集24小时上清液以便通过MSD来进行IFN-γ、IL-2和TNF-α定量(图4B)。n＝3个供体(D13814、D15195和D15842)。
图5A、5B、5C和5D示出了在长期抗原刺激之后，c-Jun过表达减少抗ROR1 CAR T细胞中的耗竭相关转录概况。所示结果来自2个供体中的单细胞CITE-seq(使用Seurat)。图5A示出了长期刺激之后第7天过表达c-Jun的±CAR+T细胞之间的基因差异表达的基因集富集(fgsea)。图5B示出了来自单一细胞的过表达c-Jun的±CAR+细胞的统一流形逼近和投影。每个点表示投影至2维空间上的细胞。示出在添加c-Jun时具有递减频率的丛集(丛集0、3和5)的标志物和对应频率(参见箭头)。丛集3包含主要针对基于文献的耗竭标志物来富集的细胞。丛集0和5包含主要针对基于文献的T细胞分化/激活标志物(例如，TIGIT、TNFRSF9、颗粒酶A)来富集的细胞。图5C示出了2维空间的图5B的过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的TIGIT(第1图)、CD137(TNFRSF9；第2图)和颗粒酶A(GZMA；第3图)的表达。图5D示出了针对耗竭标志物(丛集3)和分化/激活标志物(0，5)来富集的丛集0、3和5随着添加c-Jun而在频率方面降低(细胞的百分比降低)。
图6示出了工程化NSCLC细胞系H1975上的不同ROR1表达水平。具有不同强度的一组突变脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点元件用于控制人ROR1在广泛范围内的相对表达并且引入缺少ROR1表达的H1975细胞系中。按照细胞系(x轴)的ROR1的表达水平表示为几何MFI(y轴)。
图7示出了c-Jun过表达不改变抗ROR1 CAR T细胞针对表达低水平ROR1的NSCLC细胞系的细胞溶解活性所需要的抗原密度临限值。将模拟(未转导)T细胞、对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)或过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞与表达NLR和不同水平的ROR1(如图6所描述)的NSCLC细胞系(H1975)孵育148小时，在此期间计数NLR阳性细胞的总数并且相对于时间点0小时的计数来归一化，以便计算归一化靶标杀灭(4个供体；效应物与靶标[E:T]比率＝1:16)。ROR1敲除和ROR1低表达的细胞分别展示于左上和右上图中。ROR1低-中表达和ROR1中表达的细胞分别展示于左中和右中图中。ROR1中-高表达和ROR1高表达的细胞分别展示于左下和右下图中。
图8A和8B示出了c-Jun过表达基本上不改变响应于表达低水平ROR1的H1975NSCLC细胞系的抗ROR1 CAR T细胞的细胞因子分泌所需要的抗原密度临限值。模拟(未转导)T细胞(圆形)、对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)(正方形)或过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞(三角形)在含有表达不同水平ROR1(如图6所描述)的H1975细胞的孔中孵育24小时，此刻，收集来自孔的上清液以便进行IL-2(图8A)和IFN-γ(图8B)定量。浓度使用Meso Scale Discovery(MSD)U-Plex(4个供体；效应物与靶标[E:T]比率＝1:1)来测量。
图9A、9B和9C提供了本文所述的抗ROR1 CAR T细胞(例如，过表达c-Jun)的抗肿瘤效应的比较。皮下植入有人ROR1阳性H1975NSCLC细胞的动物用单一剂量(4×106个细胞)的以下中的一者来静脉内治疗：(i)高剂量的模拟(未转导)T细胞，(ii)对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)，和(iii)过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞。然后，动物的肿瘤大小(图9A)、体重(图9B)和生存(图9C)在施用CAR T细胞后的各个时间点评定。
图10示出了带有H1795肿瘤的NSG小鼠中的抗ROR1 CAR T细胞的持久性。如示出，动物接受单一静脉内施用的以下中的一者：(i)模拟(未转导)T细胞(圆形)，(ii)对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)(三角形)，和(iii)过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞(菱形)。然后，在施用后的各个时间点，收集末梢血液并且每毫升血液的CAR T细胞的数目使用流式细胞术来定量。
具体实施方式
本公开针对编码嵌合结合蛋白(例如，CAR)的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)。在一些方面，多核苷酸包含编码c-Jun蛋白和/或截短EGFR的一个或多个额外核苷酸序列。如本文所描述，在一些方面，这些额外组分(即，c-Jun蛋白和/或截短EGFR)的表达可改良被修饰成表达嵌合结合蛋白的细胞的一个或多个性质。本公开提供了表达本文所述的多核苷酸的工程化细胞，例如T细胞。工程化T细胞，例如，ROR特异性CAR T细胞，过表达c-Jun。T细胞中的c-Jun的过表达通过例如减轻或防止T细胞功能不良(例如，T细胞耗竭)来有助于保持细胞的激活状态。本发明的工程化T细胞表现出针对带有ROR1的肿瘤细胞的持续、有效细胞毒性。如与不过表达c-Jun的T细胞相比，本发明的工程化T细胞显示较少的T细胞耗竭迹象和增加的持续效应细胞迹象。
在更详细地描述本公开之前，应了解本公开不限于所描述的特定组合物或方法步骤，因为其当然可变化。如本领域的技术人员在阅读本公开后所显而易知，本文中描述和说明的每个个别方面具有可轻易地与任何其它几个方面的特征分离或组合的分立组分和特征，而不背离本公开的范围或精神。所叙述的任何方法可以所叙述事件顺序或在逻辑上可能的任何其它顺序来执行。
本文提供的标题不限制本公开的各个方面，所述方面可参照整个说明书来定义。还应理解本文中使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并且无意具有限制性，因为本公开的范围仅受随附权利要求书限制。
因此，以下直接定义的术语参照整个说明书来更完全定义。
术语
为了使本说明书可更容易理解，首先定义某些术语。除了如本文另外明确提供以外，以下术语的各者应具有以下阐述的含义。额外定义在整个具体实施方式中阐述。
应注意术语“一(个)”实体是指该实体的一者或多者；例如，“核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一(个)”、“一个或多个”和“至少一个”可在本文中可互换使用。进一步应注意，权利要求可撰写成排除了任何任选的要素。因此，对于与叙述权利要求要素有关所使用的象“单独”、“只”等这类排他性术语或所使用的否定性限制，该声明仅意图充当一个先行基础。
此外，本文使用的“和/或”应理解为具体公开两个指定特征或组分中的每一者，有或无另一者。因此，如本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”意图包涵以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应理解，当在本文中用语言“包含”描述各方面时，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的其它相似方面。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语皆具有本公开相关领域的一般技术人员通常理解的相同含义。举例来说，以下出版物为本领域的技术人员提供了本公开中所用的许多术语的综合词典：Concise Dictionary of Biomedicine and MolecularBiology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Cell andMolecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,Oxford University Press。
单位、前缀和符号皆以其国际单位制(Système International de Unites，(SI))公认形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。当列举值的范围时，应了解也具体地公开该范围的所述上下限之间的每个间插整数值，和它的每个分数，以及这些值之间的每个子范围。任何范围的上下限可独立地包含在该范围中或从该范围排除，并且其中包含任一极值、不包含任何极值或包含两个极限的每个范围也涵盖在本公开内。因此，本文列举的范围应理解为该范围内的全部值的简略表达方式，包含所述端点。例如，1至10的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组的任何数字、数字的组合或子范围。
当明确叙述某个值时，应了解约为与所述值相同数量或量的值也在本公开的范围内。当公开某个组合时，也具体地公开该组合的要素的每个子组合并且在本公开的范围内。相反地，当个别地公开不同要素或要素的群组时，也公开它们的组合。当本公开的任何要素被公开为具有多个替代物时，每个替代物单独或在与其它替代物的任何组合形式下被排除的本公开的实例也由此得以公开；本公开的一个以上要素可具有这类排除，并且具有这类排除的要素的所有组合由此得以公开。
核苷酸由其通常接受的单字母码表示。除非另外指示，否则核苷酸序列在5'到3'方向上从左到右书写。核苷酸在本文中由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的其通常已知的一字母符号表示。因此，‘a’表示腺嘌呤，‘c’表示胞嘧啶，‘g’表示鸟嘌呤，‘t’表示胸腺嘧啶，并且‘u’表示尿嘧啶。
氨基酸序列在氨基到羧基方向上从左至右书写。氨基酸在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学委员会推荐的单字母符号表示。
术语“约”在本文中用于意指近似、大概、大约或接近。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界扩展到所述数值以上和以下来修饰该范围。一般来说，术语“约”可通过例如向上或向下(增大或降低)10％的变化来修饰高于或低于所述值的数值。
术语“施用(administration/administering)”和其语法变体是指经由药学上可接受的途径，将本公开的组合物(例如，编码CAR的多核苷酸或表达CAR的细胞)引入受试者中。将本公开的组合物(例如，编码CAR的多核苷酸或表达CAR的细胞)引入受试者中是通过任何合适的途径，包括肿瘤内、经口、经肺、鼻内、肠胃外(静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内、鞘内、眼周或局部。
施用包含自身施用和他人施用。合适的施用途径允许组合物或剂执行其规定功能。例如，如果合适途径是静脉内，则组合物通过将组合物或剂引入受试者的静脉中来施用。
术语“氨基酸取代”是指将存在于亲本或参照序列(例如，野生型序列)中的氨基酸残基用另一个氨基酸残基来置换。氨基酸可在亲本或参照序列(例如，野生型多肽序列)中，例如，经由化学肽合成或通过本领域中已知的重组方法来取代。因此，提及“位置X处的取代”是指存在于位置X处的氨基酸用替代氨基酸残基来取代。在一些方面，取代方式可根据模式AnY来描述，其中A是对应于天然地或最初存在于位置n处的氨基酸的单一字母代码，并且Y是取代氨基酸残基。在一些方面，取代方式可根据模式An(YZ)来描述，其中A是对应于取代天然地或最初存在于位置n处的氨基酸的氨基酸残基的单一字母代码，并且Y和Z的可置换A的替代的取代氨基酸残基。
如本文所用，术语“近似”在应用于所感兴趣的一个或多个值时是指与规定参照值相似的值。在某些方面，术语“近似”是指在任一方向(大于或小于)上落于规定参照值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的一系列值，除非另外规定或另外从上下文中显而易见(除这类数字超过可能值的100％的情形以外)。
如本文所用，术语“保守”是指在进行比较的两个或两个以上序列的相同位置中无改变地出现的相应多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是在更相关序列之中保守的核苷酸或氨基酸，而非在序列中的其它位置中出现的核苷酸或氨基酸。
在一些方面，两个或两个以上序列如果彼此100％相同，则认为它们“完全保守”或“相同”。在一些方面，两个或两个以上序列如果彼此至少约70％同一、至少约75％同一、至少约80％同一、至少约85％同一、至少约90％同一或至少约95％同一，则认为它们“高度保守”。在一些方面，两个或两个以上序列如果彼此约70％同一、约75％同一、约80％同一、约85％同一、约90％同一、约95％同一、约98％同一或约99％同一，则认为它们“高度保守”。在一些方面，两个或两个以上序列如果彼此至少约30％同一、至少约35％同一、至少约40％同一、至少约45％同一、至少约50％同一、至少约55％、至少约60％同一、至少约65％同一、至少约70％同一、至少约75％同一、至少约80％同一、至少约85％同一、至少约90％同一或至少约95％同一，则认为它们“保守”。在一些方面，两个或两个以上序列如果彼此约30％同一、约35％同一、约40％同一、约45％同一、约50％同一、约55％同一、约60％同一、约65％同一、约70％同一、约75％同一、约80％同一、约85％同一、约90％同一、约95％同一、约98％同一或约99％同一，则认为它们“保守”。序列的保守可应用于多核苷酸或多肽的整个长度或可应用于其一部分、区域或特征。
如本文所用的术语“衍生自”指示第一与第二分子之间的关系(例如，结构相似性)。例如，在本公开的CAR间隔子包含衍生自人类免疫球蛋白序列(例如，铰链和/或恒定区序列)的氨基酸序列的情况下，衍生自人类免疫球蛋白序列(例如，铰链和/或恒定区序列)的序列可包含或由以下组成：完整铰链、铰链片段、完整铰链或铰链片段加上与野生型免疫球蛋白中的铰链相邻的额外残基(例如，来自恒定结构域例如CH1或CH2结构域的一个或多个氨基酸)，或可包含或由以下组成：环区域的完整序列、环区域片段，或环区域片段加上与野生型免疫球蛋白中的环相邻的额外残基(例如，来自与CH1、CH2或CH3结构域中的环区域相邻的二级结构元件例如β-折叠的一个或多个氨基酸)。在一些方面，衍生自恒定结构域的间隔子可衍生自轻链恒定结构域(CL)。
如本文所用的术语“环区域”是指氨基酸残基的一级序列，它在环区域的一级结构的紧邻N端和C端方向上，连接包含二级结构例如α-螺旋或β-折叠的两个区域。环区域的实例包括但不限于CH2或CH3环区域。免疫球蛋白折叠包括通过希腊钥匙拓扑结构，在两个β-折叠中配置的7至9个反平行β-链的2层分层结构。因此，本公开的恒定结构域衍生的CAR间隔子可包含环序列(或其片段)、由所述环序列组成，或基本上由所述环序列组成，所述环序列在免疫球蛋白结构域，例如，恒定免疫球蛋白结构域(例如，CH1、CH2、CH3或CL)中连接β-折叠A和β-折叠B，β-折叠B和β-折叠C，β-折叠C和β-折叠C’，β-折叠C’和β-折叠C”，β-折叠C”和β-折叠D，β-折叠D和β-折叠E，β-折叠E和β-折叠F，或β-折叠F和β-折叠G。
本文公开的衍生自人Ig免疫球蛋白(例如，铰链和/或恒定区序列)的CAR间隔子还涵盖经由肽键来共价连接如上所述的铰链区衍生序列而产生的序列，即，间隔子可以是包含完整铰链、其片段或它们的组合的多个重复序列的聚合物。
在一些方面，“衍生自”第二核酸序列(例如，衍生自CD8a TM序列的目前公开CAR的TM结构域序列)的核酸序列可包括与第二核酸序列的核苷酸序列相同或基本上类似的核苷酸序列。在一些方面，核酸序列可通过例如天然发生的诱变、人工定向诱变或人工随机诱变来获得。用于衍生核苷酸的诱变可为有意地定向的或有意地随机的，或各者的混合物。诱变核苷酸以便产生衍生自第一者的不同核苷酸可以是随机事件(例如，通过聚合酶失真来引起)并且衍生的核苷酸的鉴别可通过例如如本文论述的合适筛检方法来进行。
在一些方面，衍生自第二核苷酸序列的核苷酸或氨基酸与相应地第二核苷酸序列具有至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的序列同一性，其中第一核苷酸序列保持第二核苷酸序列的生物活性。
术语“互补”和“互补性”是指通过沃森-克里克碱基配对规则(Watson-Crickbase-pairing rule)来彼此相关的两个或两个以上寡聚物(即，各自包含核碱基序列)，或在寡聚物与靶基因之间。例如，核碱基序列“T-G-A(5’→3’)”与核碱基序列“A-C-T(3’→5’)”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则，给定核碱基序列的少于全部核碱基与另一核碱基序列匹配。例如，在一些方面，给定核碱基序列与其它核碱基序列之间的互补性可以是约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。或者，给定核碱基序列与另一核碱基序列之间可存在“完全”或“完美”(100％)互补性以便继续该实例。核碱基序列之间的互补性程度对于序列之间的杂交的效率和强度具有显著影响。
术语“下游”是指位于参照核苷酸序列3’的核苷酸序列。在某些方面，下游核苷酸序列涉及在转录开始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录开始位点下游。术语“上游”是指位于参照核苷酸序列5’的核苷酸序列。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”和“抗体”涵盖天然或部分或全部合成产生的免疫球蛋白，和其抗原结合部分。该术语还包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白。“抗原结合结构域”和“抗体”还包括包含框架区的多肽，所述框架区来自特异性结合并且识别抗原，并且包含至少一个CDR的免疫球蛋白或其一部分。所使用的术语“抗原结合结构域”和“抗体”意图包括完整抗体、多克隆、单克隆和重组抗体、其部分，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠科抗体、嵌合、小鼠-人、小鼠-灵长类动物、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体构建体，例如scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd、二硫化物连接的Fv(dsFc)和抗体相关多肽。
在一些方面，“抗原结合部分”是指与抗原接触的多肽序列，包括但不限于衍生自抗体的CDR。
抗原结合部分还可以并入单结构域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合部分还可以接枝在基于多肽例如纤连蛋白III型(Fn3)的支架上(参见美国专利第6,703,199号，它描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。因此，术语“抗原结合结构域”和“抗体”还包括基于纤连蛋白III型域(单价抗体)的支架、其中接枝有一个或多个CDR的其它支架***(例如，腱生蛋白)、适体等的抗体模拟物。
术语“抗原结合结构域”和“抗体”还包括可根据本公开来使用的其它合适抗原结合结构域，例如纳米抗体、VHH抗体、DARPin(预设计锚蛋白重复蛋白)、亲和体、单价抗体、阿德耐汀、阿尔法体、白蛋白结合结构域、Adhiron、人泛蛋白和其它γ-B晶体蛋白衍生人工蛋白、Affimer、Affitin(NANOFITINTM)、抗运载蛋白、犰狳重复蛋白(ARM-重复蛋白，例如β-连环蛋白、a-输入、斑珠蛋白、腺瘤性结肠息肉病、ARMC4、ARMCX3等)、Atrimer(例如，四连接素和衍生蛋白)、Avimer/Maxibody、Centyrin、Fynomer和其它FynSH3结构域衍生蛋白、库尼茨结构域(Kunitz domain)、Obody/OB-fold、Pronectin、Repebody，或任何合成和/或计算设计的结合蛋白或支架。
利用抗体的模块化架构来产生超过60种不同双特异性或多特异性抗体格式。因此，在一些方面，抗体可呈选自例如以下的形式：crossMab、DAF(双重作用Fab)(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵臼共同LC、杵臼组件、Charge对、Fab-臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y(亮氨酸拉链诱导两个HC的异二聚化的双特异性抗体)、Fcab、Kλ-抗体、正交Fab、DVD-IgG(双重可变结构域IgG)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG(四合一)、纳米抗体、纳米抗体-HSA、BiTE(双特异性T细胞衔接体)、双价抗体、DART(双重亲和力重新定位)、TandAb(串联抗体)、scDiabody、scDiabody-CH3、Triple Body、微型抗体、微小抗体、TriBi微小抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-ScFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HC Ab、scDiabody-Fc、双价抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体、Dock and Locck、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HSA、串联scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-主体，和scFv1-PEG-scFV2。
“抗原结合结构域”和“抗体”还包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需生物活性或功能。在一些方面，本公开的嵌合结合蛋白(例如，CAR)包含细胞外抗原结合结构域，例如scFv。
术语“scFv”是指包含有至少一个包含轻链可变区的抗体部分和至少一个包含重链可变区的抗体部分的融合蛋白，其中轻链和重链可变区例如经由合成连接子，例如短的柔性多肽连接子来相邻连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留产生其的完整抗体的特异性。除非指定，否则如本文所用，scFv可具有任一顺序的VL和VH可变区，例如相对于多肽的N端和C端，scFv可包含VL-连接子-VH或可包含VH-连接子-VL。
如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，通常，存在每个重链可变区中的三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3)和每个轻链可变区中的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。给定CDR的确切氨基酸序列边界可使用许多众所周知的方案中的任一者来确定，包括通过Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immuno logical Interest”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)所描述的方案，或它们的组合。根据Kabat编号方案，在一些方面，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些方面，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些方面，CDR对应于作为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些方面，CDR对应于VH，例如哺乳动物VH，例如人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；和VL，例如哺乳动物VL，例如人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
如本文所用，“细胞工程”或“细胞修饰”(包括其衍生词)是指细胞，例如本文公开的免疫细胞的靶向修饰。在一些方面，细胞工程包括病毒基因工程化、非病毒基因工程化、引入受体以便允许肿瘤特异性靶向(例如，抗ROR1 CAR)引入一个或多个改良T细胞功能的内源性基因，引入一个或多个改良免疫细胞，例如T细胞，功能的合成基因(例如，编码c-Jun多肽的多核苷酸，以使得与未修饰的对应细胞相比，免疫细胞表现出增加的c-Jun表达)，或它们的任何组合。如在本公开中别处进一步描述，在一些方面，细胞可用转录激活剂(例如，基于CRISPR/Cas***的转录激活剂)来工程化或修饰，其中转录激活剂能够诱导和/或增加感兴趣的蛋白质(例如，c-Jun)的内源性表达。
术语“抗原”是指引起免疫反应的分子。该免疫反应可涉及抗体产生，或特异性免疫感受态细胞的激活，或两者。本领域的技术人员理解任何巨分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可充当抗原。此外，抗原可衍生自重组或基因组DNA。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体分子特异性地相互作用的抗原的部分。这些部分，在本文中称为抗原决定性决定簇，通常包含例如氨基酸侧链或糖侧链的要素或作为这些要素的一部分。抗原决定性决定簇可例如通过在本领域中已知的方法，例如通过晶体学或通过氢-氘交换来界定。与抗原决定性决定簇特异性地相互作用的抗体分子上的至少一个或一些部分通常位于CDR中。通常表位具有特定的三维结构特征。通常表位具有特定的电荷特征。一些表位是线性表位，而其它表位是构象表位。
术语“自体”是指来源于同一个体的任何物质，之后将该物质再引入该个体中。
术语“嵌合抗原受体”或替代地“CAR”是指一组多肽，通常呈最简单形式的两个多肽，当处于免疫效应细胞中时，所述多肽向细胞提供针对靶细胞，通常癌细胞的特异性，以及细胞内信号产生。在一些方面，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号转导结构域(在本文中又称为“细胞内信号转导结构域”)，包含衍生自如以下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号转导结构域。在一些方面，该组多肽在同一多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些方面，该组多肽不彼此相邻，例如在不同多肽链中。在一些方面，该组多肽包括二聚化开关，在存在二聚化分子时，所述开关可使多肽彼此偶合，例如可使抗原结合结构域偶合至细胞内信号转导结构域。在一些方面，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链(例如，CD3ζ)。在一些方面，细胞质信号转导结构域包含一级信号转导结构域(例如，CD3-ζ的一级信号转导结构域)。在一些方面，细胞质信号转导结构域还包含衍生自至少一个如以下定义的共刺激分子的一个或多个功能性信号转导结构域。在一些方面，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。
在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域的细胞内信号转导结构域，其中抗原结合结构域和跨膜结构域通过CAR间隔子来连接。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含经由CAR间隔子来连接到跨膜结构域的抗原结合结构域和包含衍生自共刺激分子的功能性信号转导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域的细胞内信号转导结构域。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含经由CAR间隔子来连接到跨膜结构域的抗原结合结构域和包含衍生自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号转导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域的细胞内信号转导结构域。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含经由CAR间隔子来连接到跨膜结构域的抗原结合结构域和包含衍生自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号转导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域的细胞内信号转导结构域。在一些方面，CAR包含CAR的氨基端(N端)处的任选的前导序列。在一些方面，CAR还包含抗原结合结构域的N端处的前导序列，其中在CAR的细胞处理和定位到细胞膜期间，前导序列任选地从抗原结合结构域(例如，scFv)上裂解。
虽然本申请经常使用CAR来例示所公开主题的不同方面，但是本领域的技术人员显而易知本文提供的相关公开内容可同样适用于其它嵌合结合蛋白。如本文所用，术语“嵌合结合蛋白”是指如下蛋白，该蛋白能够结合到一个或多个抗原(例如，包含抗原结合部分)并且经由以非天然存在的取向来连接最初编码独立蛋白或蛋白片段或同一蛋白的多个片段的两个或两个以上异源多核苷酸来产生。其它嵌合结合蛋白的非限制性实例包括T细胞受体(TCR)(例如，工程化TCR)、嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)、嵌合信号转导受体(CSR)、T细胞受体模拟物(TCR模拟物)，和它们的组合。因此，除非另外指示，否则术语CAR，在一些方面，可涵盖在本领域中已知的其它类型的嵌合结合蛋白，例如本文描述的嵌合结合蛋白。
术语“癌症”是指特征是异常细胞的不受控制的生长的疾病。癌细胞可局部扩散或经由血流和淋巴***扩散到身体的其它部分。本文中描述了各种癌症的实例并且包括但不限于乳腺癌、***癌、卵巢癌、***、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如两个术语涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如弥漫性肿瘤或循环肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包含癌前期以及恶性癌症和肿瘤。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”或其变体可互换地是指与正常细胞相比，完整地或作为片段(例如，MHC/肽)在癌细胞的表面上优先表达，并且适用于将药剂优先靶向输送到癌细胞的分子(通常蛋白质、碳水化合物或脂质)。在一些方面，肿瘤抗原是正常细胞和癌细胞表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在某些方面，肿瘤抗原衍生自癌症包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、***、膀胱癌、肾癌和腺癌，例如乳腺癌、***癌、卵巢癌、胰腺癌等。
在一些方面，肿瘤抗原是特定增殖病症常见的抗原。在一些方面，癌症相关抗原是与正常细胞相比，在癌细胞中过表达，例如与正常细胞相比，约1倍过表达、约2倍过表达、约3倍过表达或更大倍数过表达的细胞表面分子。在一些方面，癌症相关抗原是在癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如与在正常细胞上表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在一些方面，癌症相关抗原完整地或作为片段(例如，MHC/肽)仅在癌细胞的细胞表面上表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。
术语“抗癌作用”是指可通过各种方式来表明的生物作用，包括但不限于，例如肿瘤体积减少、癌细胞数目减少、转移数目减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞生存减少或与癌性病状相关的各种生理症状改善。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基经具有相似侧链的氨基酸残基置换的情况。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸经来自相同侧链家族的另一个氨基酸置换，则取代被视为保守的。在一些方面，一串氨基酸可用在侧链家族成员的顺序和/或组成上有所不同的在结构上类似的串来进行保守置换。
非保守氨基酸取代包括如下取代，其中(i)具有正电性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)取代或经负电性残基(例如，Glu或Asp)取代，(ii)亲水性残基(例如，Ser或Thr)取代或经疏水性残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代或经任何其它残基取代，或(iv)具有庞大疏水性或芳族侧链的残基(例如，Val、His、Ile或Trp)取代或经具有较小侧链(例如，Ala或Ser)或无侧链(例如，Gly)的残基取代。
还可以使用其它氨基酸取代。例如，对于氨基酸丙氨酸，取代可来自D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中任一者。对于赖氨酸，置换可以是D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸或D-鸟氨酸中任一者。总体上，可预期诱导分离多肽的性质变化的在功能上重要区域的取代为如下取代，其中：(i)极性残基，例如丝氨酸或苏氨酸，与疏水性残基，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸发生的取代；(ii)半胱氨酸残基与任何其它残基发生的取代；(iii)具有正电性侧链的残基，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸与具有负电性侧链的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸发生的取代；或(iv)具有庞大侧链的残基，例如苯丙氨酸，与不具有该侧链的残基，例如甘氨酸发生的取代。前述非保守取代中的一者可改变蛋白质的功能性质的可能性也与取代相对于蛋白质的在功能上重要区域的位置相关：一些非保守取代可相应地对于生物性质几乎没有影响。
在本公开的内容中，如上文定义的术语“突变”和“氨基酸取代”(有时简称为“取代”)被视为可互换的。
在本公开的情形中，取代(甚至当其被称为氨基酸取代时)在核酸水平下进行，即，氨基酸残基经替代氨基酸残基取代是通过编码第一氨基酸的密码子经编码第二氨基酸的密码子取代来进行。
如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。总体上，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，同源的两个分子具有共同进化祖先。在本公开的情形中，术语同源性涵盖同一性和相似性。
在一些方面，如果分子中的单体的至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％为相同的(完全相同的单体)或类似的(保守取代)，则聚合物分子被视为彼此“同源的”。术语“同源”一定涉及至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多肽分子或多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间的总体单体保守。没有任何额外限定词的术语“同一”，例如蛋白A与蛋白B同一，意味着序列是100％相同的(100％序列同一性)。将两个序列描述为，例如“70％同一”相当于将其描述为具有例如“70％序列同一性”。
两个多肽序列的同一性百分比的计算，例如可通过出于最佳比较目的而比对两个序列来执行(例如，为了最佳比对，可将空隙引入第一和第二多肽序列中的一者或两者中并且为了便于比较，可忽略不相同序列)。在某些方面，为了便于比较而比对的序列长度是参照序列长度的至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸。
当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比随序列共有的相同位置的数目而变化，考虑到了空隙的数目和每个空隙的长度，需要引入所述空隙以达成两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的判定可使用数学算法来完成。
可获得来自各种来源，并且用于比对蛋白质和核苷酸序列的合适软件程序。测定序列同一性百分比的一种合适程序是bl2seq，它是可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法来执行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，是EMBOSS生物信息学程序套件的一部分并且也可以从European Bioinformatics Institute(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa处获得。
序列比对可使用在本领域中已知的方法例如MAFFT、Clustal(ClustalW、ClustalX或Clustal Omega)、MUSCLE等进行。
单一多核苷酸或多肽靶标序列内的与多核苷酸或多肽参照序列比对的不同区域可各自具有其自己的序列同一性百分比。注意将序列同一性百分比值四舍五入到小数点后一位。例如，将80.11、80.12、80.13，和80.14向下舍入到80.1，而将80.15、80.16、80.17、80.18，和80.19向上舍入到80.2。还应注意长度值始终为整数。
在某些方面，第一氨基酸序列(或核酸序列)相对于第二氨基酸序列(或核酸序列)的同一性百分比(％ID)计算为％ID＝100x(Y/Z)，其中Y是在第一和第二序列的比对(如通过目视检查或特定序列比对程序来比对)中算作相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)的数目并且Z是第二序列中的残基的总数。如果第一序列的长度比第二序列更长，则第一序列相对于第二序列的同一性百分比高于第二序列相对于第一序列的同一性百分比。
本领域的技术人员认识到为了计算序列同一性百分比而产生序列比对不限于仅由原始序列数据推动的二元序列-序列比较。还应认识到序列比对可通过将序列数据与来自异类来源的数据例如结构数据(例如，晶体学蛋白结构)、功能数据(例如，突变的位置)或***发生数据整合来产生。整合异类数据以便产生多重序列比对的合适程序是可在www.tcoffee.org处获得，和替代地可例如从EBI获得的T-Coffee。还应认识到用于计算序列同一性百分比的最终比对可自动或手动进行。
如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此相似性百分比的计算可以与同一性百分比的计算相同的方式来执行，除了相似性百分比的计算考虑到如在本领域中理解的保守取代以外。应了解相似性百分比取决于所使用的比较量表，即，是否对氨基酸进行比较，例如根据其进化接近性、电荷、体积、柔性、极性、疏水性、芳族性、等电点、抗原性，或它们的组合。
如本文所用，术语“分离”、“纯化”、“萃取”和其语法变体可互换使用并且是指经历一个或多个纯化过程的本公开的所需组合物，例如本公开的CAR的制备状态。在一些方面，如本文所用的分离或纯化是将本公开的组合物，例如本公开的CAR从含有污染物的样品中去除、部分去除(例如，一部分)的过程。
在一些方面，分离的组合物不具有可检测的非所需活性或，替代地，非所需活性的水平或量等于或低于可接受的水平或量。在一些方面，分离的组合物具有等于或高于可接受的量和/或浓度和/或活性的本公开的所需组合物的量和/或浓度。在一些方面，如与获得组合物的起始物质相比，分离组合物得以富集。如与起始物质相比，该富集可为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％、至少约99.9999％或大于99.9999％。
在一些方面，分离的制剂基本上不含残留的生物产品。在一些方面，分离的制剂100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约91％不含或至少约90％不含任何污染的生物物质。残留的生物产品可包括非生物材料(包括化学品)或不想要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。
“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”和其语法变体可互换使用并且是指呈单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。单链核酸序列是指单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，和尤其DNA或RNA分子，仅是指分子的一级和二级结构，并且不将其限于任何特定三级形式。因此，该术语包括尤其在线性或圆形DNA分子(例如，限制片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构中，可在本文中根据仅给出沿着非转录DNA链(即，具有与mRNA同源的序列的链)在5’到3’方向上的序列的通常惯例来描述序列。
“重组DNA分子”是经历分子生物学操纵的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。本公开的“核酸组合物”包含如本文所描述的一种或多种核酸。
如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。该术语是指分子的一级结构。因此，该术语包含三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。其还包括例如通过烷基化和/或加帽来修饰，和未修饰形式的多核苷酸。更具体地说，术语“多核苷酸”包含不论剪接还是未剪接的聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)和多核苷酸(含有D-核糖)，包括mRNA，作为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，和含有正核苷酸主链的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和多吗啉代聚合物，和其它合成序列特异性核酸聚合物，限制条件为所述聚合物含有允许例如在DNA和RNA中发现的碱基配对和碱基堆积的配置下的核碱基。
在一些方面，本文公开的多核苷酸包含DNA，例如***载体中的DNA。在一些方面，本文公开的多核苷酸包含mRNA。在一些方面，mRNA是合成mRNA。在一些方面，合成mRNA包含至少一个非天然核碱基。在一些方面，某种类别的所有核碱基经非天然核碱基置换(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷可经非天然核碱基，例如5-甲氧基尿苷置换)。
术语“编码”是指例如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中的特定核苷酸序列充当模板的固有性质，用于合成生物过程中的具有核苷酸(例如，rRNA、tRNA和mRNA)的经定义序列或氨基酸的经定义序列和由此产生的生物性质的其它聚合物和巨分子。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物***中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链均可称为编码该蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。
除非另外规定，否则“编码”氨基酸序列”的核苷酸序列，例如“编码”本公开的CAR的多核苷酸，包括作为彼此简并型式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
术语“表达”是指由启动子推动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可包含经修饰的氨基酸。所述术语还涵盖天然地或通过干预来修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化，或任何其它操纵或修饰，例如与标记组分缀合。在该定义内还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸，例如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)，以及在本领域中已知的其它修饰的多肽。
如本文所用的术语“多肽”是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述各者的其它等效物、变体和类似物。多肽可以是单一多肽或可以是多分子复合物，例如二聚体、三聚体或四聚体。其还可以包含单链或多链多肽。最通常二硫键发现于多链多肽中。术语多肽还可应用于一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。在一些方面，“肽”可以是小于或等于50个氨基酸长度，例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸长度。
“重组”多肽或蛋白是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白。与通过任何合适的技术来分离、分开或部分地或大致上纯化的天然或重组多肽一样，出于本公开的目的，重组产生的多肽和在工程化宿主细胞中表达的蛋白被视为分离的。通过本文公开的多核苷酸来编码的多肽(例如，抗ROR1 CAR、c-Jun和/或EGFRt)可使用在本领域中已知的方法来重组产生。在一些方面，在通过至少一个编码本文描述的多肽的多核苷酸或载体来转染之后，通过本公开的多核苷酸来编码的多肽(例如，抗ROR1 CAR、c-Jun和/或EGFRt)通过细胞，例如T细胞产生。
如本文所用，术语多肽(例如，c-Jun多肽)的“片段”是指与天然存在的多肽相比，N和/或C端缺失或多肽的任何部分缺失的比天然存在的序列短的多肽的氨基酸序列。因此，片段不一定只缺失N和/或C端氨基酸。相对于天然存在的序列，内部氨基酸缺失的多肽也被视为片段。
如本文所用，术语“功能性片段”是指保留多肽功能的多肽片段。因此，在一些方面，Ig铰链的功能性片段保持将CAR中的抗原结合结构域(例如，scFv)定位于距靶表位(例如，肿瘤抗原)的一定距离处以使得抗原结合结构域(例如，scFv)可与靶表位(例如，肿瘤抗原)有效地相互作用的能力。类似地，在一些方面，c-Jun功能性片段是在CAR T细胞中表达时，产生具有表达对应全长c-Jun的参照CAR T细胞的活性的例如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的CAR T细胞的片段。该活性的非限制性实例在本公开中别处进一步描述。
如本文所用，术语“参照CAR T细胞”是指包含相同结构CAR组分但是不过表达c-Jun的对应CAR T细胞。
如在本公开中别处进一步描述，编码本文所述的CAR(例如，抗ROR1 CAR)的多核苷酸可包含编码c-Jun蛋白或其功能片段的额外核苷酸序列。c-Jun片段是否为功能性片段可通过测定c-Jun激活(例如，来自abcamTM的比色c-Jun转录因子测定试剂盒(比色))等的任何已知方法来评定。c-Jun在T细胞，例如本文所述的CAR T细胞中的过表达通过减轻或防止T细胞功能不良(例如，T细胞耗竭)而有助于保持细胞的激活状态。因此，c-Jun的功能性片段可基于其在工程化免疫细胞，例如本文所述的CAR T细胞中赋予该活性的能力来评定。该活性包括但是不限于针对带有靶标的肿瘤细胞(例如，ROR1+肿瘤细胞)的持续、有效细胞毒性(例如，裂解或杀灭肿瘤细胞的能力)或减少的T细胞耗竭迹象(例如，抑制受体，例如PD-1的表达降低)和增加的持续效应细胞迹象。评估T细胞耗竭和由此评估c-Jun的功能性片段的这类方法包括例如在本领域中已知的适用于测量耗竭、细胞表型、持久性、细胞毒性和/或杀灭、增殖、细胞因子释放和基因表达概况的测定，例如流式细胞术、细胞内细胞因子染色(ICS)、IncuCyte免疫细胞杀灭分析、Meso Scale Discovery(MSD)或类似测定、持续抗原刺激测定、连续抗原刺激测定(类似于持续抗原刺激测定，但是不随着每轮再刺激来重新设定E:T细胞比率)、整体和单一细胞RNAseq(参见例如Fron Genet.2020；11:220；2019Bioinformatics 35:i436-445；2019Annual Review of Biomed.Data Sci.2:139-173)、细胞毒性/杀灭测定、ELISA、蛋白质印迹法和例如在本文中描述或如例如在CurrentProtocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology(John Wiley&Sons公司,1999-2021)中或在别处中描述的其它标准分子和细胞生物学方法。
使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可产生变体以便改良或改变多肽的特征。例如，分泌蛋白的N端或C端可缺失一个或多个氨基酸而不实质性损失生物功能。以全文引用的方式并入本文中的Ron等人，J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)报告了甚至在缺失3个、8个或27个氨基端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，干扰素γ在从该蛋白质的羧基端缺失8-10个氨基酸残基之后展现多达十倍的更高活性。(Dobeli等人,J.Biotechnology 7:199-216(1988)，其以全文引用的方式并入本文中。)
另外，充分证据证明变体通常保持与天然存在的蛋白类似的生物活性。例如，Gayle和合作者(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，其以全文引用的方式并入本文)进行人类细胞因子IL-1a的广泛突变分析。它们使用随机诱变来产生超过3,500种个别IL-1a突变体，在分子的整个长度上每个变体具有平均2.5个氨基酸变化。在每个可能氨基酸位置处检查多个突变。研究者发现“大多数分子可在对于[结合或生物活性]具有极少影响的情况下加以改变”。(参见摘要。)事实上，在所检查的超过3,500个核苷酸序列中，仅23个独特氨基酸序列产生在活性方面与野生型显著不同的蛋白。
如上所述，变体或衍生物包括例如经修饰的多肽。在一些方面，例如多肽、多核苷酸、脂质、糖蛋白的变体或衍生物是化学修饰和/或内源性修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体内修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体外修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是生产细胞例如T细胞中的细胞内修饰的结果。
存在于变体和衍生物中的修饰包括，例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接核黄素、共价附接血红素部分、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环合、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人，Blood 116:270-79(2010)，其以全文引用的方式并入本文中)、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋、硒化、硫酸化、转移RNA介导的将氨基酸添加到蛋白(例如精胺酰化)和泛素化。
术语“信号转导结构域”是指经由规定信号转导通道来在细胞内传输信息，以便通过产生第二信使或通过对于这些信使作出响应而充当效应物，从而起到调控细胞活性的作用的蛋白质的功能性部分。
术语如本文所用的“细胞内信号转导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号转导结构域可产生促进含有CAR的细胞，例如本文所述的抗ROR1 CAR T细胞的免疫效应功能的信号。例如，CAR T细胞中的免疫效应功能的非限制性实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。在一些方面，细胞内信号结构域是转导效应功能信号并且向导细胞执行特殊功能的蛋白质的部分。虽然可使用整个细胞内信号转导结构域，但是在许多情况下，不需要使用整个链。就使用细胞内信号转导结构域的截短部分来说，该截短部分可代替完整链来使用，只要其转导效应功能信号。因此，术语细胞内信号转导结构域意图包括足以转导效应功能信号的细胞内信号转导结构域的任何截短部分。
在一些方面，细胞内信号转导结构域可包含一级细胞内信号转导结构域。示例性一级细胞内信号转导结构域包括衍生自负责一级刺激或抗原依赖性刺激的分子的结构域。在一些方面，细胞内信号转导结构域可包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号转导结构域包括衍生自负责共刺激信号或不依赖于抗原的刺激的分子的结构域。例如，在CAR T细胞(例如，本文所述的抗ROR1 CAR T细胞)的情况下，一级细胞内信号转导结构域可包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号转导结构域可包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
一级细胞内信号转导结构域可包含被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号转导基序。含有ITAM的一级细胞质信号转导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10和DAP12的序列。
术语“共价连接”、“融合”和其语法变体可互换使用并且是指第一部分，例如第一氨基酸序列或核苷酸序列相应地共价或非共价连接到第二部分，例如第二氨基酸序列或核苷酸序列。第一部分可与第二部分直接连接或并置或替代地间插部分可将第一部分共价连接到第二部分。术语“连接”不仅意指第一部分在C端或N端处融合到第二部分，而且包括完整第一部分(或第二部分)***第二部分(或相应地第一部分)中的任何两个点，例如氨基酸中。在一些方面，第一部分通过肽键或连接子来连接到第二部分。第一部分可通过磷酸二酯键或连接子来连接到第二部分。连接子可以是肽或多肽(对于多肽链)或核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽或多核苷酸链或任何化学分子)。
如本文所用，术语“药物组合物”是指混合或混杂，或悬浮于一种或多种其它化学组分，例如药学上可接受的运载体和赋形剂中的本文描述的化合物，例如，本公开的CAR或本公开的表达CAR的细胞，或表达CAR并且过表达c-Jun的细胞中的一者或多者。药物组合物的一个用途是促进将如本文所述的例如表达CAR并且过表达c-Jun的细胞制剂施用于受试者。
术语“赋形剂”和“运载体”可互换使用并且是指添加到药物组合物以便进一步有助于施用化合物，例如本公开的CAR或被工程化成表达CAR、c-Jun和在某些方面截短EGFR的细胞的惰性物质。
术语“药学上可接受的运载体”、“药学上可接受的赋形剂”和其语法变化形式涵盖由美国联邦政府的监管机构批准或在美国药典中列出供动物，包括人类使用的任何剂，以及不会在妨碍组合物施用于受试者的程度上导致产生不当生理作用并且不消除所施用化合物的生物活性和性质的任何运载体或稀释剂。包含适用于制备药物组合物并且通常安全、无毒和合乎需要的赋形剂和运载体。
术语“受试者”、“患者”、“个体”和“宿主”和其变体在本文中可互换使用并且是指需要诊断、治疗，或疗法的任何哺乳动物受试者，包括但不限于人、家畜(例如，犬、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)，尤其是人。本文描述的方法适用于人类治疗和兽医应用。
如本文所用，短语“有需要的受试者”包括受益于施用本文描述的组合物(例如，本公开的抗ROR1 CAR T细胞)，以便例如改善与本文所述的疾病或病症(例如，癌症)相关的一个或多个症状的受试者，例如哺乳动物受试者。
如本文所用的术语“治疗”、“治疗”或“治疗”是指例如疾病或病状的严重程度的减少；疾病过程的持续时间的减少；与疾病或病状相关的一个或多个症状改善或消除；向患有疾病或病状的受试者提供有益作用，而不一定治愈疾病或病状。该术语还包括预防或阻止疾病或病状或其症状。在一些方面，术语“治疗”或“治疗”意指在受试者中诱导针对抗原的免疫反应。
如本文所用的术语“预防”、“预防”和其变体是指部分或完全延缓疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全延缓特定疾病、病症和/或病状的一个或多个症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延缓特定疾病、病症和/或病状的一个或多个症状、特征或表现的发作；部分或完全延缓特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低患上与疾病、病症和/或病状相关的病变的风险。在一些方面，防止某一结果经由预防性治疗来达成。
如本文所用，术语“治疗有效量”是足以在有需要的受试者中产生所需治疗效果、药理和/或生理作用的构成本文公开的组合物的试剂或医药化合物(例如，本公开的抗ROR1CAR T细胞)的量。
治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可被视为治疗。如本文所用，“预防”是指用于防止疾病或病状的发作，或防止或延缓与疾病或病状相关的症状的治疗或作用过程。如本文所用，“预防”是指为了保持健康状况和防止疾病或病状发作，或防止或延缓与疾病或病状相关的症状所采取的措施。
ROR1
如本公开显而易知，本文所述的多核苷酸包含编码特异性结合到ROR1的嵌合结合蛋白(例如，CAR)的核苷酸序列。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)在大约57％的患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者和42％的患有非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌的患者中过表达(Balakrishnan 2017)，并且代表嵌合抗原受体(CAR)T细胞的非常有吸引力的靶标。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1阳性(ROR1+)实体瘤可用抗ROR1 CAR T细胞来安全地靶向(Specht2020)；然而，功效受到限制，部分地归因于在输注于患有恶性实体瘤的患者之后，CAR T细胞表现出耗竭或功能不良。另外，实体瘤具有限制免疫治疗剂，例如CAR T细胞的抗肿瘤活性的免疫抑制屏障(Newick 2016，Srivastava2018，Martinez 2019)。不希望受任何一种理论束缚，表达本文所述的抗ROR1嵌合结合蛋白的细胞被修饰成过表达转录因子c-Jun并且与在本领域中可利用的其它抗ROR1细胞相比，更耐耗竭并且展现经改良的效应功能。
在一些方面，编码本公开的CAR，即，抗ROR1 CAR的核苷酸序列包含抗原结合结构域，包括抗体或其抗原结合片段(例如，ScFv)，其特异性结合到肿瘤抗原，例如蛋白激酶如酪氨酸蛋白激酶上的表位。
在一些方面，肿瘤抗原是酪氨酸蛋白激酶跨膜受体“ROR1”，又称为神经营养酪氨酸酶激酶受体相关1(NTRKR1)。人类氨基酸和核酸序列可发现于公用数据库，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中。例如，人ROR1的同种型1和2前体的氨基酸序列可分别发现于登录号NP_005003.2和NP_001077061.1中，并且编码其的mRNA序列可分别发现于登录号NM_005012.3和NM_001083592.1中。如本文所用，“ROR1”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型ROR1的点突变、片段、***、缺失和接合变体。在一些方面，CAR的抗原结合部分识别并且结合ROR1蛋白的胞外结构域内的抗原。在一些方面，ROR1蛋白在癌细胞上表达。
ROR1是受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)家族的成员。在人中，ROR1由ROR1基因编码。由该基因编码的蛋白质是受体酪氨酸激酶，它调节中枢神经***中的生长并且在癌细胞的转移中具有作用。ROR1被视为缺少显著催化活性并且与非典型Wnt信号转导通路相互作用的假激酶。ROR1的增加表达与癌症，例如与B细胞慢性淋巴细胞性白血病相关。ROR1在循环肿瘤细胞中高度表达并且促进胰腺癌细胞的入侵(Xu等人,2018,Mol.Med.Rep.18:5087-5094)。类似于其在卵巢癌中的作用，ROR1也似乎促进子宫内膜癌中的肿瘤进展(Henry等人，2018，Gynecol.Oncol.148:576-584)。ROR1在上皮肿瘤中表达(例如，在多个上皮癌症组织结构中高度表达)并且在卵巢癌、三阴性乳腺癌，和肺癌的子集中均匀地表达(Balakrishnan等人，2017,Clin,Cancer Res.23:3061-3071)。ROR1表达也与结直肠癌患者中的***转移正相关(Zhou等人，2017，Oncotarget 8:32864-32872)。ROR1CAR T和ADC研究的先前临床数据报告在非人类灵长类动物中没有中靶偏离肿瘤毒性并且没有显著毒性。另外，如在本文中证明，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞在体外和体内均表达出抗肿瘤功效。具体来说，在长期刺激之后(例如，在体外)观察到经改良的细胞因子产生、延长的细胞毒性和减少的耗竭相关基因表达概况，并且在NSCLC小鼠异种移植模型中，显示改良的抗肿瘤功效。
c-Jun
如本文所描述，在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，包含编码嵌合结合蛋白，例如CAR的核苷酸序列)包含编码c-Jun蛋白的额外核苷酸序列。在一些方面，本文提供的多核苷酸是多顺反子多核苷酸，其中多核苷酸编码包括c-Jun和CAR的多种蛋白质和在一些方面，一种或多种额外蛋白质(例如，安全开关蛋白，例如EGFRt)。在某些方面，本文提供的多核苷酸编码嵌合多肽(例如，嵌合结合蛋白)，其包含c-Jun多肽和ROR1结合蛋白。在一些方面，该嵌合多肽可包括可裂解连接子以使得在翻译之后，c-Jun多肽和ROR1结合蛋白被裂解成单独作用蛋白。
在人中，c-Jun蛋白通过位于染色体1(负链取向的GenBank登录号NC_000001.11的核苷酸58,780,791至58,784,047)上的JUN基因来编码。JUN基因，和其编码蛋白的同义词是已知的并且包括“Jun原致癌基因，AP-1转录因子亚基”、“v-Jun鸟类肉瘤病毒17致癌基因同源物”、“转录因子AP-1”、“Jun致癌基因”、“AP-1”、“Jun激活结构域结合蛋白”、“p39”和“增强子结合蛋白AP1”。野生型人c-Jun蛋白序列为331个氨基酸长度。野生型人c-Jun的氨基酸和核酸序列分别提供于表1和2中。
野生型人c-Jun(UniProt识别符：P05412-1)蛋白序列为331个氨基酸长度(SEQ IDNO:1)。氨基酸和核酸序列分别在表1和2中示出。
表1.c-Jun蛋白序列
表2.c-Jun核酸序列
/>
/>
或者，适用于本公开的c-Jun可以是突变体人c-Jun，只要突变体c-Jun不影响突变体拯救功能不良(耗竭)T细胞的能力。在一些方面，突变体c-Jun包含与野生型c-Jun的C端氨基酸残基(例如，C端50个、75个、100个、150个、200个或250个或更多个残基)、C端部分(例如，四分之一、三分之一或二分之一)或C端结构域(例如，ε、bZIP和其C端的氨基酸)的至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％)序列同一性。在一些方面，野生型c-Jun的N端氨基酸残基(例如，N端50个、75个、100个或150个或更多个)、N端部分(例如，四分之一、三分之一或二分之一)或N端结构域(例如，δ、转录激活结构域和其N端的氨基酸)缺失、突变，或以其它方式失活。
在一些方面，c-Jun在其转录激活结构域和/或其δ结构域中包含失活突变(例如，取代、缺失或***)。在一些方面，c-Jun包含S63A和S73A突变中的一者或两者(所述位置如上加双下划线)。在一些方面，如与野生型人c-Jun相比，c-Jun具有残基2与102之间或残基30与50之间的缺失。
在一些方面，c-Jun多肽包含截短c-Jun多肽，如WO2019/118902所公开，其明确以全文引用的方式并入本文中。在一些方面，c-Jun多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，c-Jun多肽包含SEQ ID NO:1阐述的氨基酸序列。
在一些方面，本文公开的c-Jun核苷酸序列可使用在本领域中已知的任何方法来密码子优化。参见例如美国公布第2011/0081708A1号、第2014/0244228A1号和第2019/0325989A1号，各自以全文引用的方式并入本文中。例如，在某些方面，本文公开的c-Jun核苷酸序列的密码子进行优化以便与野生型核苷酸序列(即，SEQ ID NO:2)相比，改变(例如，增加或减少)以下参数中的一者或多者：(i)密码子适应指数(即，密码子使用偏好)，(ii)鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)核苷酸含量，和(iii)其组合。
不受任何一种理论束缚，在一些方面，该密码子优化可增加由核苷酸序列编码的蛋白质的表达。因此，在一些方面，与用野生型核苷酸序列(即，SEQ ID NO:2)转染的细胞中的对应表达相比，本公开的密码子优化的c-Jun核苷酸序列在细胞中转染时能够增加所编码c-Jun蛋白的表达。
在一些方面，c-Jun多肽在细胞中过表达时能够防止和/或减少细胞(例如，抗ROR1CAR T细胞)的耗竭。不希望受任何一种理论束缚，在一些方面，过表达c-Jun的细胞是耐耗竭性的，由此解决了过继细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的进展的主要障碍。在某些方面，与参考细胞(例如不过表达c-Jun的细胞)相比，耐耗竭性增加了至少约0.01倍、至少约0.02倍、至少约0.03倍、至少约0.04倍、至少约0.05倍、至少约0.06倍、至少约0.07倍、至少约0.08倍、至少约0.09倍、至少约0.1倍、至少约0.2倍、至少约0.3倍、至少约0.4倍、至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。在一些方面，与参考细胞(例如，未被修饰成增加c-Jun表达的对应耗竭细胞)相比，耗竭细胞(例如，免疫细胞)中的c-Jun多肽的过表达可减少耗竭至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
免疫细胞如T细胞中的c-Jun的过表达通过例如减轻或防止T细胞功能不良(例如，T细胞耗竭)来有助于保持细胞的激活状态。本发明的工程化免疫细胞如T细胞表现出针对带有ROR1的肿瘤细胞的持续、有效细胞毒性。如与不过表达c-Jun的T细胞相比，本发明的工程化T细胞显示较少的T细胞耗竭迹象和效应细胞持续并且起作用更长时间的迹象增加。
如本文所用，术语“过表达(overexpression/overexpress)”(或其语法变体)是指与参考细胞相比增加的表达(在基因水平和/或蛋白水平下)。如本公开显而易知，在一些方面，例如与未被修饰成过表达c-Jun的对应细胞(例如，存在于自然界中的对应T细胞)相比，本文所述的细胞(例如，T细胞)被修饰成使得其过表达c-Jun。在一些方面，与对应细胞相比，本公开的细胞中的c-Jun多肽的表达增加。在一些方面，与对应细胞相比，c-Jun多肽的表达增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更多。修饰细胞以便过表达c-Jun的示例性方法在本公开中别处提供。
在某些方面，本文所述的抗ROR1 CAR工程化细胞(即，过表达c-Jun)具有一种或多种耗竭标志物，包括但不限于TIGIT、PD-1、TNFRSF9、颗粒酶A(GZMA)和CD39的减少表达。这类标志物(例如，耗竭标志物)的表达可在大量群体中通过流式细胞术，使用整体RNASeq转录体分析来测量或在某些方面，个别细胞转录体分析可使用单一细胞RNASeq来执行。在某些方面，与参考细胞(例如，未被工程化成过表达c-Jun的对应抗ROR1 CAR T细胞)相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR工程化T细胞中的一种或多种标志物(例如，耗竭标志物)的表达减少了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少4.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍或至少约100倍，或更多。在一些方面，与参考细胞中的对应表达相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞)中的一种或多种标志物(例如，耗竭标志物)的表达减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在某些方面，与参考细胞(例如，未被工程化成过表达c-Jun的对应抗ROR1 CAR T细胞)相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR工程化T细胞(例如，本文所述的细胞)中的TIGIT的表达减少了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍或至少约100倍，或更多。在一些方面，与参考细胞中的对应表达相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞)中的TIGIT的表达减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在某些方面，与参考细胞(例如，未被工程化成过表达c-Jun的对应抗ROR1 CAR T细胞)相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR工程化T细胞(例如，本文所述的细胞)中的PD-1的表达减少了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍或至少约100倍，或更多。在一些方面，与参考细胞中的对应表达相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞)中的PD-1的表达减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在某些方面，与参考细胞(例如，未被工程化成过表达c-Jun的对应抗ROR1 CAR T细胞)相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR工程化T细胞(例如，本文所述的细胞)中的CD39的表达减少了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍或至少约100倍，或更多。在一些方面，与参考细胞中的对应表达相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞)中的CD39的表达减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些方面，与参考细胞(例如，未被工程化成过表达c-Jun的对应细胞)相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1CAR T细胞)中的TNFRSF9的表达减少了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍或至少约100倍，或更多。在一些方面，与参考细胞中的对应表达相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1CAR T细胞)中的TNFRSF9的表达减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些方面，与参考细胞(例如，未被工程化成过表达c-Jun的对应细胞)相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1CAR T细胞)中的GZMA的表达减少了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍或至少约100倍，或更多。在一些方面，与参考细胞中的对应表达相比，本文所述的免疫细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1CAR T细胞)中的GZMA的表达减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些方面，如与不过表达c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，本文所述的免疫细胞(例如，被修饰成包含CAR、截短EGFRt，和过表达c-Jun多肽)的群体包含减少数目的TIGIT阳性免疫细胞。在一些方面，与参照群体相比，在抗原刺激之后存在于群体中的TIGIT阳性免疫细胞的数目减少了至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％或至少约60％。在一些方面，在抗原刺激之后，免疫细胞的群体包含少于约15％、少于约14％、少于约13％、少于约12％、少于约11％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％或少于约5％的TIGIT阳性免疫细胞。在某些方面，在14天持续抗原刺激之后，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CAR T细胞的群体具有不超过约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％ TIGIT阳性细胞。在一些方面，在14天持续抗原刺激之后，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CAR T细胞的群体具有不超过约5％-10％、约5％-15％、约8％-12％或约8％-15％ TIGIT阳性细胞。在此方面，工程化T细胞如CD4+或CD8+T细胞的群体内的TIGIT阳性细胞％可使用流式细胞术来测量。
在某些方面，在约14天持续刺激之后，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1CAR T细胞的群体具有不超过约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％ PD1阳性细胞。在一些方面，在14天持续抗原刺激之后，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1CAR T细胞的群体具有不超过约2％-5％ PD1阳性细胞。在此方面，CD4+和/或CD8+CAR+c-Jun+T细胞的群体内的PD1阳性细胞％可使用在本领域中已知的方法如流式细胞术来测量。
在某些方面，在14天持续刺激之后，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CART细胞的群体具有不超过约20％-60％ CD39阳性细胞。在一些方面，在14天持续刺激之后，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CAR T细胞的群体具有不超过约20％-40％或25％-45％或30％-40％ CD39阳性细胞。CAR+c-Jun+T细胞的群体内的CD39阳性细胞百分比可使用在本领域中已知的方法如流式细胞术来测量。
在一些方面，如与不过表达c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，本文所述的免疫细胞(例如，被修饰成包含CAR、截短EGFRt，和过表达c-Jun多肽)的群体包含减少数目的TNFRSF9阳性免疫细胞。在一些方面，与参照群体相比，在抗原刺激之后，存在于群体中的TNFRSF9阳性免疫细胞的数目减少了至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％或至少约70％。在一些方面，在抗原刺激之后，免疫细胞的群体包含少于约5％、少于约4.5％、少于约4％、少于约3.5％或少于约2％的TNFRSF9阳性免疫细胞。
在一些方面，如与不过表达c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，本文所述的免疫细胞(例如，被修饰成包含CAR、截短EGFRt，和过表达c-Jun多肽)的群体包含减少数目的GZMA阳性免疫细胞。在一些方面，与参照群体相比，在抗原刺激之后，存在于群体中的GZMA阳性免疫细胞的数目减少了至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％或至少约20％。在一些方面，在抗原刺激之后，免疫细胞的群体包含少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％或少于约10％的GZMA阳性免疫细胞。
在某些方面，如与不过表达c-Jun的T细胞的对照群体相比，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CAR T细胞的群体分泌至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍、至少约100倍、至少约125倍或至少约150倍更多的IL-2、INF-γ，和/或TNFα。在某些方面，如与不过表达c-Jun的工程化T细胞的对照群体相比，在以1:1、1:5、1:10和/或1:20E:T比率来持续抗原刺激的第0天和/或第14天，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1CAR T细胞的群体表达至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍，或至少约100倍或更多的IL-2、INF-γ和/或TNFα。细胞因子分泌可使用在本领域中已知的方法如ELISA或MSD分析来测量。
在某些方面，如与不过表达c-Jun的工程化T细胞的对照群体相比，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CAR T细胞的群体展示出至少约2倍、至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍，或至少约250倍或更高的增强的杀灭效率，例如如通过曲线下面积(AUC)来定量。
在某些方面，如与不过表达c-Jun的工程化T细胞的对照群体相比，如本文所述过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CAR T细胞的群体展示出至少相等或至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约125倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约225倍、至少约250倍、至少约300倍、至少约400倍或至少约500倍或更大的增强的响应于抗原的增殖。抗原诱导增殖可使用在本领域中已知的增殖测定，例如本文所述的测定来测试。
适用于测量本文所述的细胞(例如，抗ROR1 CAR T细胞)的一个或多个性质如耗竭、细胞表型、持久性、细胞毒性和/或杀灭、增殖、细胞因子释放和基因表达概况的测定是本领域中已知的并且包括例如流式细胞术、细胞内细胞因子染色(ICS)、IncuCyte免疫细胞杀灭分析、Meso Scale Discovery(MSD)或类似测定、持续抗原刺激测定、连续抗原刺激测定(类似于持续抗原刺激测定，但是不随着每轮再刺激来重新设定E:T细胞比率)、整体和单一细胞RNAseq(参见例如，Fron Genet.2020；11:220；2019Bioinformatics 35:i436-445；2019Annual Review of Biomed.Data Sci.2:139-173)、细胞毒性/杀灭测定、ELISA、蛋白质印迹法和例如在本文中描述或如例如在Current Protocols in Molecular Biology orCurrent Protocols in Immunology(John Wiley&Sons公司,1999-2021)中或在别处中描述的其它标准分子和细胞生物学方法。
EGFRt
在一些方面，本文所述的本发明的多核苷酸(例如，包含编码嵌合结合蛋白，例如CAR的核苷酸序列)还包含编码截短表皮生长因子受体(EGFRt)的核苷酸序列。因此，在某些方面，本公开的多核苷酸编码嵌合多肽(例如，嵌合结合蛋白)，其包含(i)c-Jun多肽、(ii)ROR-1结合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)，和(iii)EGFRt。
表皮生长因子受体(EGFR)是受体酪氨酸激酶，其结合EGF家族的配体，从而激活多个信号转导级联以便将细胞外提示转化成合适的细胞反应。如本文所用，“截短表皮生长因子受体”或“EGFRt”仅包含全长EGFR蛋白(例如，SEQ ID NO:3)的部分序列。在一些方面，EGFRt包含EGFR胞外结构域III和IV和EGFR跨膜结构域，但是缺少EGFR胞外结构域I和II和EGFR细胞内序列。
在一些方面，本文所述的EGFRt另外包含近膜域。如本文所用，术语“近膜结构域”是指直接在跨膜结构域的C端的细胞表面蛋白(例如，EGFR)的细胞内部分。不受任何一种理论束缚，在一些方面，添加近膜域可增加由本公开的多核苷酸来编码的蛋白质的表达。因此，在一些方面，EGFRt包含胞外结构域、跨膜结构域，和细胞内结构域的前三个氨基酸。在一些方面，EGFRt包含EGFR结构域III、EGFR结构域I、跨膜结构域和氨基酸Arg-Arg-Arg)(SEQ ID NO:3；参见表3)。
表3.EGFRt氨基酸序列
如本公开显而易知，包含编码EGFRt的核苷酸序列向本公开的多核苷酸(例如，包含编码嵌合结合蛋白，例如CAR的核苷酸序列)提供了某些优势。
在一些方面，EGFRt可充当杀灭开关。在一些方面，当身体中不再需要工程化细胞(例如，本文所述的过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞)，可将医药级抗EGFR抗体如西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或奈昔妥珠单抗(necitumumab)施用于患者，由此例如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)去除了工程化细胞。
在一些方面，EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，EGFRt包含SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列。
间隔子
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，包含编码嵌合结合蛋白，例如CAR的核苷酸序列)包含一个或多个编码间隔子的核苷酸序列。如本文所用的术语“间隔子”是指能够将两个隔开部分共价连接在一起的多肽序列：例如，嵌合结合蛋白(例如，CAR)的抗原结合结构域和跨膜结构域。在一些方面，本文公开的嵌合结合蛋白(例如，CAR)包含特异性结合到ROR1的抗体或其抗原结合部分与跨膜结构域之间的间隔子。
在一些方面，间隔子衍生自免疫球蛋白(例如，衍生自铰链区域或环区域)。在某些方面，这些间隔子包含例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM铰链区域、其片段(单独或通过额外序列，例如CH1或CH2区域序列来加帽)，或来自IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM铰链区域的片段的组合。在一些方面，间隔子包含例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM恒定结构域环区域、其片段(单独或封端额外序列，例如相邻β链)，或来自片段IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM环区域的组合。在一些方面，本公开的间隔子包含铰链区衍生序列、环区域衍生序列，或它们的组合。
因此，在一些方面，本公开提供了编码嵌合多肽(例如，嵌合结合蛋白，例如CAR)的多核苷酸，其中CAR包含(i)抗原结合结构域(例如，抗ROR1 scFv)、(ii)跨膜结构域，和(iii)细胞内结构域。在某些方面，本文中的多核苷酸还编码(iv)c-Jun多肽和(v)EGFRt肽。在某些方面，本文所述的多核苷酸还编码包含衍生自人类免疫球蛋白(Ig)铰链区和/或环区域的氨基酸序列的一个或多个间隔子，和任选地连接子(例如，富含gly-ser的连接子)，其中间隔子位于抗原结合结构域与跨膜结构域之间。在一些方面，本公开提供了包含编码本公开的CAR的转基因的重组核酸构建体。本公开还提供了通过本文公开的多核苷酸序列或载体中的一者或多者来编码的CAR。在一些方面，本公开的CAR被设计成标准CAR、分体CAR、关断CAR、接通CAR、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR、***CAR或第五代CAR。
术语“本公开的间隔子“和“Ig衍生间隔子”可互换使用，是指
(i)“铰链区衍生间隔子”，即，包含衍生自位于人类免疫球蛋白如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM的CH1与CH2恒定结构域之间的铰链区的氨基酸序列，和任选地来自相邻CH1和/或CH2结构域的一个或多个氨基酸，或它们的组合的间隔子(例如，多个串联铰链区衍生间隔子)；
(ii)“环区域衍生间隔子”，即，包含衍生自人类免疫球蛋白如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM的恒定结构域的环区域的氨基酸序列，和任选地来自相邻β-链的一个或多个氨基酸，或它们的组合的间隔子(例如，多个串联环区域衍生间隔区)；或，
(iii)它们的组合(例如，两个或两个以上串联铰链区衍生间隔子和环区域衍生间隔子)。
在一些方面，本公开的术语间隔子是指选自由以下组成的组的免疫球蛋白重链的子序列：人类IgA1(Uniprot:P01876，IGHA1_HUM AN，免疫球蛋白重链恒定α1；SEQ ID NO:5)、人类IgA2(Unipr ot P01877，IGHA2_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定α2；SEQ ID NO:6)、鼠科IgG2A(Uniprot P01665，GCAM_MOUSE，免疫球蛋白γ2A链C区域；SEQ ID NO:7)、人类IgG1(Uniprot P01857，IGHG1_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定γ1；SEQ ID NO:8)、人类IgG2(Uniprot P01859，IGHG2_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定γ2；SEQ ID NO:9)、人类IgG3(Uniprot P01860，IGHG3_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定γ3；SEQ ID NO:10)、人类IgG4(Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重链恒定γ4；SEQ ID NO:11)、人类Ig D(UniprotP01880，IGHD_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定δ；SEQ ID NO:12)、人类IgE(Uniprot P01854，IGHE_HUMAN，免疫球蛋白重恒定链ε；SEQ ID NO:13)；或IgM(Uniprot P01871，IGHM_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定μ；SEQ ID NO:14)，其中子序列包含CH1-CH2铰链区或其一部分。在一些方面，子序列还包含CH1和/或CH2恒定结构域的相邻部分。
在一些方面，本公开的术语间隔子是指选自由以下组成的组的免疫球蛋白重链的子序列：人类IgA1(Uniprot:P01876，IGHA1_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定α1；SEQ ID NO:5)、人类IgA2(Uniprot P01877，IGHA2_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定α2；SEQ ID NO:6)、鼠科IgG2A(Uniprot P01665，GCAM_MOUSE，免疫球蛋白γ2A链C区域；SEQ ID NO:7)、人类IgG1(Uniprot P01857，IGHG1_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定γ1；SEQ ID NO:8)、人类IgG2(Uniprot P01859，IGHG2_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定γ2；SEQ ID NO:9)、人类IgG3(Uniprot P01860，IGHG3_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定γ3；SEQ ID NO:10)、人类IgG4(Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重链恒定γ4；SEQ ID NO:11)、人类IgD(UniprotP01880，IGHD_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定δ；SEQ ID NO:12)、人类IgE(Uniprot P01854，IGHE_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定ε；SEQ ID NO:13)，或IgM(Uniprot P01871，IGHM_HUMAN，免疫球蛋白重链恒定μ；SEQ ID NO:14)，其中子序列包含来自恒定结构域的环区域或其一部分。在一些方面，子序列还包含β-链的相邻部分。
在一些方面，本公开的CAR间隔子包含IgG2铰链如鼠科IgG2A铰链衍生的CAR间隔子的序列、由所述序列组成，或基本上由所述序列组成，例如间隔子1，例如KPCPPCKCP(SEQID NO:15)。
在一些方面，本公开的间隔子与SEQ ID NO:15阐述的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％序列同一性。在一些方面，本公开的CAR间隔子包含与SEQ ID NO:15阐述的序列中任一者相同的序列，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10个氨基酸取代以外。在一些方面，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代包含至少一个非保守氨基酸取代。
在一些方面，本公开的间隔子包含SEQ ID NO:15阐述的序列，其中间隔子序列还包含任选的柔性连接子(例如，GGGSG(SEQ ID NO:16)的连接子)。因此，在一些方面，本公开的间隔子包含间隔子序列(例如，SEQ ID NO:15)和任选的C端或N端柔性连接子。在一些方面，本文公开的任何任选的柔性连接子(例如，富含gly/ser的连接子)可附加到间隔子的C端和/或N端。
因此，在一些方面，本公开的多核苷酸包含编码嵌合结合蛋白(例如，CAR)的核苷酸序列，所述嵌合结合蛋白包含(i)ROR1结合蛋白；(ii)间隔子；和(iii)编码EGFRt的核苷酸。在一些方面，多核苷酸包含CAR，所述CAR包含(i)ROR1结合蛋白，所述结合蛋白包含有包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)；(ii)包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列的间隔区；和(iii)编码截短EGF受体(EGFRt)的核苷酸序列。如在本公开中别处进一步描述，在一些方面，ROR1结合部分的VH包含SEQ ID NO:44并且ROR1结合部分的VL包含SEQ ID NO:48。在一些方面，EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
信号肽
如本文所描述，在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，包含编码嵌合结合蛋白，例如CAR的核苷酸序列)还包含编码信号肽的核苷酸序列。信号肽可促进所编码蛋白的细胞表面表达，然后可随后从成熟蛋白质上裂解。
在本领域中已知的任何合适信号肽可用于本公开。信号肽的非限制性实例提供于表4中(如下)。在某些方面，信号肽衍生自人Igκ。在一些方面，信号肽包含与SEQ ID NO:17(MVLQTQVFISLLLWI SGAYG)阐述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，信号肽包含SEQ ID NO:17(MVLQTQVFISLLLWISGAYG)阐述的氨基酸序列。在一些方面，信号肽衍生自GM-CSF。在某些方面，该信号肽包含与SEQ ID NO:18(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP)阐述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，信号肽包含SEQ ID NO:18(MLLLVTSLLLCELPHP AFLLIP)阐述的氨基酸序列。
在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单一信号肽(例如，SEQ ID NO:17或18)。在一些方面，多核苷酸包含多个信号肽(例如，至少两个、三个、四个或更多个)。在某些方面，本文所述的多核苷酸编码嵌合多肽(例如，嵌合结合蛋白，例如CAR)，其中CAR包含(i)抗原结合结构域(例如，抗ROR1 scFv)、(ii)跨膜结构域，和(iii)细胞内结构域。在某些方面，本文中的多核苷酸还编码(iv)c-Jun多肽和(v)EGFRt多肽。在某些方面，本文中的多核苷酸还编码一个或多个信号肽(例如，表4中阐述的信号肽)。
表4：信号肽序列
来源 序列
EGFR MRPSGTAGAALLALLAALCPASRA(SEQ ID NO:19)
GM-CSF MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:18)
人Igκ MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO:17)
人CD33 MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:20)
连接子
在一些方面，本发明的任何CAR间隔子可包含任选的N端连接子和/或任选的C端连接子。在一些方面，连接子可连接本文所述的CAR的任何组分。本领域中已知的柔性连接子序列可用作任选的连接子。在一些方面，任选的连接子是根据式[(Gly)n-Ser]m(SEQ IDNO:21)的甘氨酸/丝氨酸连接子，其中n是1至100的任何整数并且m是1至100的任何整数。在一些方面，甘氨酸/丝氨酸连接子根据式[(Gly)x-(Ser)y]z(SEQ ID NO:22)，其中x是1至4的整数，y是0或1，并且z是1至50的整数。在一些方面，任选的连接子包含序列(G)n(SEQ IDNO:23)，其中n可以是1至100的整数。在一些方面，任选的连接子可包含序列(GlyAla)n(SEQID NO:24)，其中n是1与100之间的整数。
在一些方面，任选的连接子的序列是GGGG(SEQ ID NO:25)。在一些方面，任选的连接子的序列是GGGSG(SEQ ID NO:26)。
在一些方面，任选的连接子包含序列(GGGSG)n(SEQ ID NO:27)。在一些方面，任选的连接子包含序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:28)。在一些方面，任选的连接子可包含序列(GGGS)n(SEQ ID NO:29)。在一些方面，任选的连接子可包含序列(GGS)n(SEQ ID NO:30)。在这些情况下，n可以是1至100的整数。在其它情况下，n可以是1至20的整数，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些方面n是1至100的整数。
任选的连接子的实例包括但不限于例如GSGSGS(SEQ ID NO:31)、GGSGG(SEQ IDNO:32)、SGGSGGS(SEQ ID NO:33)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:34)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:35)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:63)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:36)。
在一些方面，任选的连接子包含序列PGG。在一些方面，任选的连接子包含除了甘氨酸和丝氨酸以外的额外氨基酸。在一些方面，任选的连接子包含1个、2个、3个、4个或5个非gly/非ser氨基酸。在一些方面，Gly/Ser连接子包含至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少95％甘氨酸或丝氨酸氨基酸。
在一些特定方面，任选的连接子是1与10之间的氨基酸长度。在一些方面，任选的连接子是约5与约10之间、约10与约20之间、约20与约30之间、约30与约40之间、约40与约50之间、约50与约60之间、约60与约70之间、约70与约80之间、约80与约90之间或约90与约100之间的氨基酸长度。
在一些方面，连接子是不可裂解连接子，以使得连接子和本文提供的多核苷酸的不同组分(例如，c-Jun和嵌合结合蛋白)表达为单一多肽。在某些方面，连接子是可裂解连接子。如本文所用，术语“可裂解连接子”是指包含裂解位点，以使得当表达时可选择性地裂解以便产生两个或两个以上产物的连接子。在一些方面，连接子选自P2A连接子、T2A连接子、F2A连接子、E2A连接子、弗林蛋白酶裂解位点，或它们的任何组合(参见以下表5)。在一些方面，连接子还包含GSG连接子序列。在一些方面，适用于本公开的连接子包含内部核糖体进入位点(IRES)，以使得在翻译期间产生通过第一和第二基因编码的单独多肽。可用于本公开的连接子的额外描述提供于例如WO 2020/223625A1和US2019/0276801 A1中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
表5：连接子序列
在一些方面，连接子包含P2A连接子。在一些方面，连接子包含与SEQ ID NO:37阐述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，连接子包含SEQID NO:37阐述的氨基酸序列。
在一些方面，连接子包含T2A连接子。在一些方面，连接子包含与SEQ ID NO:38阐述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，连接子包含SEQID NO:38阐述的氨基酸序列。
在一些方面，连接子包含F2A连接子。在一些方面，连接子包含与SEQ ID NO:39阐述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，连接子包含SEQID NO:39阐述的氨基酸序列。
在一些方面，连接子包含E2A连接子。在一些方面，连接子包含与SEQ ID NO:40阐述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，连接子包含SEQID NO:40阐述的氨基酸序列。
在一些方面，连接子包含有包含弗林蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。在一些方面，连接子包含与SEQ ID NO:41阐述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，连接子包含SEQ ID NO:41阐述的氨基酸序列。
抗原结合结构域
在一些方面，由本公开的多核苷酸编码的嵌合结合蛋白(例如，CAR)的抗原结合结构域包含lg NAR、Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、微小抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体、胞内抗体、二硫化物稳定化Fv蛋白(dsFv)、单抗体或纳米抗体。在某些方面，抗原结合结构域是scFv。在一些情况下，scFv可根据在本领域中已知的方法(参见例如Bird等人,(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)来制备。ScFv分子可通过使用柔性多肽连接子将VH和VL区域连接在一起来产生。scFv分子包含具有优化长度和/或氨基酸组成的连接子(例如，Ser-Gly连接子)。连接子长度可极大地影响scFv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果使用较短多肽连接子(例如，5-10氨基酸之间)，则防止链内折叠。还需要链间折叠来使两个可变区结合在一起以便形成功能性表位结合位点。对于连接子取向和大小的实例，参见例如Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利申请公布第2005/0100543号、第2005/0175606号、第2007/0014794号和PCT公布第WO2006/020258号和第WO2007/024715号，其以引用的方式并入本文中。
scFv可包含其VL与VH区域之间的例如至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个氨基酸残基的连接子。连接子序列可包含任何天然存在的氨基酸。在一些方面，连接子序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在一些方面，连接子序列包含甘氨酸和丝氨酸重复序列的集合例如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:42)。在一些方面，连接子可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:43)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:36)，或以上公开的任何富含gly-ser的连接子。
连接子长度的变化可保持或增强活性，从而在活性研究中产生极好功效。
在一些方面，抗原结合结构域或其它部分或整个CAR的氨基酸序列可被修饰，例如本文所述的氨基酸序列可例如通过保守取代来修饰。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
示例性抗ROR1 CAR在Hudecek等人Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64中描述，其以全文引用的方式并入本文中。在一些方面，包含抗ROR1 CAR的本公开的CAR T细胞如Hudecek等人所描述(例如，如Hudecek等人第3155页，第一完整段落所描述，其以全文引用的方式并入本文)来产生，其中Hudecek公开的间隔子通过本公开的CAR间隔子来置换。在一些方面，本公开的抗ROR1 CAR包括包含2A2、R11和R12抗ROR1单克隆抗体的VH和/或VL序列的抗体或其片段，如Hudecek等人在连接第3154-55页的段落；Baskar等人MAbs 4(2012):349-61；和Yang等人PLoS ONE 6(2011):e21018中所描述，其以引用的方式并入本文其全文。
在一些方面，本公开的抗原结合结构域能够与抗ROR1抗体，例如R12抗体交叉竞争。R12抗体序列在表6中示出。在一些方面，适用于本公开的抗原结合结构域结合到R12抗体的相同表位。如本领域的技术人员显而易知，在本领域中已知的任何抗ROR1抗体可用于本公开。这类抗体的非限制性实例包括Hudecek，等人Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64；Baskar等人MAbs 4(2012):349-61；和Yang等人PLoS ONE 6(2011):e21018；US 9,316,646 B2；和US 9,758,586 B2所描述的2A2和R11抗体；其各自以全文引用的方式并入本文中。
表6.R12抗体CDR
在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2，和VL CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域，例如R12 scFv，包含R12抗体的VH和VL。在一些方面，R12 scFv通过IgG2连接子，例如间隔子1(SEQ ID NO:15)，和任选地连接子SEQ ID NO:16来连接到跨膜结构域。
在一些方面，ROR1结合抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:52具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，靶向ROR1的本公开的CAR包含靶向ROR1的抗体或其片段(例如，单链可变片段(scFv))，包括2017年9月12日发布的美国专利第US9316646B2号或2016年4月19日发布的第US9758586B2号所描述的抗体，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些方面，本公开的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域和跨膜结构域通过包含KPCPPCKCP(SEQ ID NO:15)的CAR间隔子和任选地SEQ ID NO:16的连接子来连接，并且其中抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，例如R12抗体的VH和VL。
在一些方面，抗ROR1抗原结合抗体片段(例如，scFv)缀合或融合到生物活性分子，例如以便形成本公开的CAR，其引导免疫细胞，例如T细胞向表达ROR1的细胞作出响应。
在一些方面，本公开的嵌合抗原受体(CAR)(即，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR)包含被称为UC-961(西姆单抗(Cirmtuzumab))的抗ROR1单克隆抗体或其抗原结合部分。参见例如临床试验标识符第NCT02222688号。西姆单抗可用于治疗癌症，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、卵巢癌和黑色素瘤。参见例如Hojjat-Farsangi等人PLoS One.8(4):e61167；和NCT02222688。
信号传导、跨膜、共刺激结构域
在一些方面，通过本公开的多核苷酸来编码的嵌合结合蛋白(例如，CAR)的细胞内结构域包含信号转导结构域，例如衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b，或CD66d的结构域。在一些方面，CAR还包含共刺激结构域，例如衍生自2B4、HVEM、ICOS、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、ICOS(CD278)、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的结构域。在一些方面，CAR包含4-1BB共刺激结构域。在一些方面，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:53阐述的序列。
在一些方面，通过本公开的多核苷酸来编码的嵌合结合蛋白(例如，CAR)包含跨膜结构域(TM)，例如选自由以下组成的组的结构域：T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、PD1、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152和CD154。跨膜结构域可衍生自天然或重组来源。当来源是天然来源时，所述域可衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些方面，每当本公开的CAR结合到靶标时，跨膜结构域能够向细胞内结构域进行信号转导。
在一些方面，跨膜结构域可至少包括例如以下的跨膜区：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19。
在一些方面，TM结构域衍生自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152，或它们的任何组合。在一些方面，TM结构域衍生自CD28。在一些方面，TM结构域包含与SEQ ID NO:54具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，TM结构域包含SEQID NO:54阐述的氨基酸序列。
在一些方面，通过本公开的多核苷酸编码的嵌合结合蛋白(例如，CAR)还包含编码共刺激结构域，例如本文所述的共刺激结构域的序列。在一些方面，共刺激结构域包含以下各者的共刺激结构域：白细胞介素-2受体(IL-2R)、白细胞介素-12受体(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck结合缺失CD28(ICA)、、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受体γ链、Fc受体ε链、与CD83特异性结合的配体，或它们的任何组合。
在一些方面，本公开的嵌合结合蛋白(例如，CAR)(例如，抗ROR1CAR)还包含编码细胞内信号转导结构域，例如本文所述的细胞内信号转导结构域的序列。在一些方面，细胞内信号转导结构域包含CD3ζ激活结构域、CD3δ激活结构域、CD3ε激活结构域、CD3η激活结构域、CD79A激活结构域、DAP 12激活结构域、FCER1G激活结构域、DAP10/CD28激活结构域、ZAP70激活结构域，或它们的任何组合。在一些方面，细胞内信号转导结构域包含CD3ζ激活结构域。在一些方面，CD3ζ激活结构域包含与SEQ ID NO:55具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，细胞内信号转导结构域包含SEQ IDNO:55阐述的序列。
在一些方面，本公开的嵌合结合蛋白(例如，CAR)(例如，靶向ROR1的CAR)的跨膜结构域包括通过连接子来连接到嵌合结合蛋白(例如，CAR)的细胞内结构域的跨膜结构域。
在一些方面，细胞内信号转导结构域包含4-1BB共刺激结构域。在一些方面，4-1BB共刺激结构域包含与SEQ ID NO:53具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:53阐述的序列。
如以上公开内容显而易知，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含(从5'到3')(i)编码c-Jun多肽的第一核苷酸序列，(ii)编码第一连接子(例如，P2A连接子)的第二核苷酸序列，(iii)编码第一信号肽(例如，hIgκ)的第三核苷酸序列，(iv)编码抗原结合结构域(例如，抗ROR1scFv)的第四核苷酸序列，(v)编码第二连接子(例如，GGGSG；SEQ ID NO:16)的第五核苷酸序列，(vi)编码间隔子(例如，IgG2铰链衍生间隔子)的第六核苷酸序列，(vii)编码跨膜结构域(例如，CD28)的第七核苷酸序列，(viii)编码共刺激结构域(例如，4-1BB)的第八核苷酸序列，(ix)编码细胞内信号转导结构域(例如，CD3ζ)的第九核苷酸序列，(x)编码第三连接子(例如，P2A连接子)的第十核苷酸序列，(xi)编码第二信号肽(例如，GMCSFRαSP)的第十一核苷酸序列，和(xii)编码EGFRt的第十二核苷酸序列。
双特异性CAR
在一些方面，本公开的CAR是双特异性CAR。因此，在一些方面，编码本公开的CAR的多核苷酸至少编码双特异性CAR(例如，靶向第一抗原和第二抗原的CAR)的多肽。
在一些方面，本公开的CAR的抗原结合结构域是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两个抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些方面，第一和第二表位在同一抗原，例如同一蛋白(或多聚体蛋白的亚基)上。在一些方面，第一和第二表位重叠。在一些方面，第一和第二表位不重叠。在一些方面，第一和第二表位在不同抗原，例如不同蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。
在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些方面，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案是本领域中已知的。
在双特异性抗体分子的各抗体或抗原结合抗体片段(例如，scFv)内，VH可在VL上游或下游。在一些方面，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)被配置成其VH(VH1)在其VL(VL1)上游并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)被配置成其VL(VL2)在其VH(VH2)上游，以使得整个双特异性抗体分子具有配置VH1-VL1-VL2-VH2。在一些方面，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)被配置成其VL(VL1)在其VH(VH1)上游并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)被配置成其VH(VH2)在其VL(VL2)上游，以使得整个双特异性抗体分子具有配置VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，连接子安置在两个抗体或抗体片段(例如，scFv)之间，例如如果构建体被配置成VH1-VL1-VL2-VH2，则连接子在VL1与VL2之间，或如果构建体被配置成VL1-VH1-VH2-VL2，则连接子在VH1与VH2之间。连接子可以是如本文所述的连接子，例如(Gly4Ser)n连接子，其中n是1、2、3、4、5，或6，例如4(SEQ ID NO:43)。通常，两个scFv之间的连接子应足够长来避免两个scFv的域之间的错配。任选地，连接子安置在第一scFv的VL与VH之间。任选地，连接子安置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个连接子的构建体中，任何两个或两个以上连接子可相同或不同。因此，在一些方面，双特异性CAR包含如本文所述的配置中的VL、VH，和任选地一个或多个连接子。
在一些方面，抗体分子是具有位于第一肿瘤抗原(例如，ROR1)上的第一表位和位于第二抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a上的第二表位的双特异性抗体分子。在一些方面，双特异性抗体结合到第一表位，其中第一表位位于CD19上，并且结合到第二表位，其中第二表位位于CD20上。在一些方面，双特异性抗体结合到第一表位，其中第一表位位于CD19上，并且结合到第二表位，其中第二表位位于CD22上。在一些方面，双特异性抗体结合到第一表位，其中第一表位位于CD20上，并且结合到第二表位，其中第二表位位于CD22上。在某些方面，抗体分子是对第一B细胞表位具有第一结合特异性和对另一B细胞抗原具有第二结合特异性的双特异性抗体分子。例如，在一些方面，双特异性抗体分子对第一B细胞表位，例如对ROR1具有第一结合特异性，并且对CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a B细胞表位中的一者或多者具有第二结合特异性。
在一些方面，第二抗原选自由以下组成的组：ROR1、HER2、AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮蛋白、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、***酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、***蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、***素、生存蛋白和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶反转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分，和它们的任何组合。
可诱导表达构建体
在一些方面，编码如本文所述的CAR(例如，抗ROR1 CAR)、c-Jun和/或EGFRt的本文中的多顺反子多核苷酸的表达通过组成性启动子来调控，所述组成性启动子如即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子、延长生长因子-1α(EF-1α)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、泛素启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。然而，通过本公开的多核苷酸来编码的多肽(例如，抗ROR1 CAR、c-Jun和/或EGFRt)的表达的调控不限于使用组成性启动子。
因此，在一些方面，通过本文所述的多核苷酸来编码的蛋白质(例如，抗ROR1 CAR、c-Jun、EGFRt蛋白、信号肽和/或间隔子)的表达是可诱导的。术语“可诱导”是指存在“可诱导启动子”，即，当与编码或指定基因产物，例如本公开的CAR、c-Jun、EGFRt的多核苷酸可操作地连接时，引起基本上仅当对应于启动子的诱导因子存在于细胞中时，基因产物在细胞中得以产生的核苷酸序列。使用可诱导启动子提供一种分子开关，它能够在需要该表达时启动可操作连接的多核苷酸序列的表达，或在不需要表达时关闭表达。可诱导启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子，和四环素启动子。
在一些方面，编码本公开的CAR、c-Jun和/或EGFRt的多核苷酸包含“组织特异性”启动子，即，当与编码或指定基因产物，例如本公开的CAR的多核苷酸可操作地连接时，引起基本上仅当细胞为对应于启动子的组织类型的细胞时，基因产物在细胞中得以产生的核苷酸序列。
载体
本公开还提供了载体，所述载体包含可操作地连接到调节元件的编码本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun和EGFRt蛋白(即，c-Jun-抗ROR1CAR构建体)的多核苷酸。在一些方面，编码本公开的CAR、c-Jun、EGFRt的多顺反子多核苷酸是DNA分子，或RNA分子。
在一些方面，载体是转移载体。术语“转移载体”是指包含分离的核酸(例如，本公开的多核苷酸)并且可用于将分离的核酸递送到细胞内部的组合物。许多载体是本领域中已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包含自主复制质粒或病毒。术语还应理解为还包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像多聚赖氨酸化合物、脂质粒等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等。
在一些方面，载体是表达载体。术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸(例如，本公开的多肽)的载体，所述多核苷酸包含可操作连接到待表达的核苷酸序列的表达控制序列。在一些方面，表达载体是多顺反子表达载体。表达载体包含足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞或体外表达***供应。表达载体包括并入重组多核苷酸的所有在本领域中已知的载体，包括粘接质粒、质粒(例如，裸的或包含于脂质粒中)和病毒(例如，慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在一些方面，载体是病毒载体、哺乳动物载体或细菌载体。在一些方面，载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、慢病毒、仙台病毒载体(Sendai virus vector)、杆状病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体(Epstein Barr viral vector)、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、混合载体和腺相关病毒(AAV)载体。
在一些方面，腺病毒载体是第三代腺病毒载体。ADEASYTM是产生腺病毒载体构建体的迄今最普及方法。该***由两种类型的质粒组成：穿梭(或转移)载体和腺病毒载体。将感兴趣的转基因克隆到穿梭载体中、验证、并且用限制酶PmeI来线性化。然后将该构建体转化至ADEASIER-1细胞中，该细胞是含有PADEASYTM的BJ5183大肠杆菌细胞。PADEASYTM是含有病毒产生必不可少的腺病毒基因的约33Kb腺病毒质粒。穿梭载体和腺病毒质粒具有匹配的左右同源性臂，促进转基因在腺病毒质粒中的同源重组。还可以用超螺旋PADEASYTM和穿梭载体来共转化标准BJ5183，但是该方法产生非重组腺病毒质粒的更高背景。然后，将重组腺病毒质粒针对大小和适当限制消化模式来验证，以便确定转基因***腺病毒质粒中，并且其它重组模式未发生。一旦验证，重组质粒用PacI线性化以便产生侧接有ITR的线性dsDNA构建体。将293或911细胞用线性化构建体来转染，并且可在约7-10天后收获病毒。除了该方法以外，在提交本申请时在本领域中已知的产生腺病毒载体构建体的其它方法可用于实践本文公开的方法。
在一些方面，病毒载体是反转录病毒载体，例如慢病毒载体(例如，第三或***慢病毒载体)。术语“慢病毒”是指反转录病毒科的属类。慢病毒由于能够传染非***细胞而在反转录病毒中为独特的；其可将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此其为基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV均为慢病毒的实例。术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)所提供的自身失活慢病毒载体。可用于临床中的慢病毒载体的其它实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体***等。也可利用非临床类型的慢病毒载体并且是本领域的技术人员已知的。
慢病毒载体通常在暂态转染***中产生，其中细胞系用三个单独质粒表达***转染。这些包括转移载体质粒(HIV前病毒的部分)、包装质粒或构建体和具有不同病毒的异源囊膜基因(env)的质粒。将载体的三个质粒组分置于包装细胞中，然后***HIV壳中。载体的病毒部分含有***序列以使得病毒不能在细胞***内部复制。当前第三代慢病毒载体仅编码九种HIV-1蛋白(Gag、Pol、Rev)中的三种，其从单独质粒中表达，避免重组介导的可复制病毒的产生。在***慢病毒载体中，反转录病毒基因组进一步减少(参见例如LENTI-XTM***包装***)。
在一些方面，本公开包含有包含多核苷酸序列的慢病毒载体，所述序列编码：(i)包含SEQ ID NO:52的R12 scFv；(ii)c-Jun多肽；(iii)截短EGF受体(EGFRt)。
在一些方面，本公开包含有包含多核苷酸序列的载体(例如，慢病毒载体)，所述序列编码：(i)包含SEQ ID NO:52的R12 scFv；(ii)c-Jun多肽；(iii)截短EGF受体(EGFRt)；(iv)跨膜结构域；(v)细胞内信号转导结构域；(vi)细胞内共刺激信号转导区域。在一些方面，载体(例如，慢病毒载体)包含特异性结合到ROR1的抗体或其抗原结合部分与TM结构域之间的间隔子。在一些方面，载体(例如，慢病毒载体)包含间隔子，其还包含连接子。在一些方面，载体(例如，慢病毒载体)包含编码c-Jun多肽与CAR肽之间的连接子的多核苷酸序列。在一些方面，载体(例如，慢病毒载体)包含编码CAR肽与EGFRt肽之间的连接子的多核苷酸序列。因此，在某些方面，本文所述的载体包含多核苷酸，其包含(从5'到3')(i)编码c-Jun多肽的第一核苷酸序列，(ii)编码第一连接子(例如，P2A连接子)的第二核苷酸序列，(iii)编码信号肽(例如，hIgκ)的第三核苷酸序列，(iv)编码抗原结合结构域(例如，抗ROR1scFv)的第四核苷酸序列，(v)编码第二连接子(例如，GGGSG；SEQ ID NO:16)的第五核苷酸序列，(vi)编码间隔子(例如，IgG2铰链衍生间隔子)的第六核苷酸序列，(vii)编码跨膜结构域(例如，CD28)的第七核苷酸序列，(viii)编码共刺激结构域(例如，4-1BB)的第八核苷酸序列，(ix)编码细胞内信号转导结构域(例如，CD3ζ)的第九核苷酸序列，(x)编码第三连接子(例如，P2A连接子)的第十核苷酸序列，(xi)编码信号肽(例如，GMCSFRαSP)的第十一核苷酸序列，和(xii)编码EGFRt的第十二核苷酸序列。
在一些方面，非病毒方法可用于将包含编码本公开的CAR和其它多肽的多核苷酸的核酸递送到受试者的细胞或组织。在一些方面，非病毒方法包括使用转位子。在一些方面，使用非病毒递送方法允许将细胞，例如T或NK细胞重新编程，和将细胞直接输注到受试者中。在一些方面，通过使用CRISPR/Cas***和基因组型式替代物如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和兆碱基大范围核酸酶(MN)，包含本公开的多核苷酸的核酸序列可***靶细胞(例如，T细胞)或宿主细胞(例如，用于重组表达CAR多肽的细胞)的基因组中。
在一些方面，通过使用双顺反子或多顺反子表达载体，本公开的构建体(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)可在细胞中表达。在一些方面，双顺反子或多顺反子载体包括但不限于，(1)融合到多个开放阅读框的多个启动子；(2)将剪接信号***开放阅读框之间；其表达受单一启动子驱动的蛋白融合物；(3)在通过构建体来表达的蛋白质之间***蛋白水解位点(自身裂解肽，例如P2A)；和(iv)***内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些方面，本文中的构建体的多个蛋白单元在单一开放阅读框(ORF)中表达，由此产生具有多个蛋白单元的单一多肽，其中至少一个单元是CAR并且一个单元是本公开的c-Jun多肽。在一些方面，含有高效率裂解位点的氨基酸序列或连接子安置在通过本文所述的表达构建体来表达的各蛋白之间。如本文所用，高裂解效率定义为大于50％、大于70％、大于80％或大于90％的翻译蛋白裂解。裂解效率可通过蛋白质印迹分析来测量。
高效率裂解位点的非限制性实例包括猪铁士古病毒-1 2A(P2A)、FMDV 2A(在本文中缩写为F2A)；马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)；和明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、细胞质多角体病病毒2A(BmCPV2A)和软化病病毒2A(BmIFV2A)，或它们的组合。在一些方面，高效率裂解位点为P2A。高效率裂解位点在Kim等人(2011)High Cleavage Efficiency of a 2APeptideDerived from Porcine Teschovirus-1in Human Cell Lines,Zebrafish and Mice.PLoSONE 6(4):el8556中描述，其内容以引用的方式并入本文中。
在一些方面，P2A包含或由衍生自猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)的自身裂解肽序列(登录#QKV27547.1，氨基酸#1-22(SEQ ID NO:56))组成。在一些方面，P2A序列进行密码子优化和密码子歧化以便防止重组。在一些方面，P2A序列安置在本文公开的多核苷酸的c-Jun和抗ROR1 CAR部分之后(例如，C端)。在一些方面，P2A在多肽水平下裂解。
在一些方面，多个蛋白在单一开放阅读框(ORF)中表达，并且在强启动子控制下表达。在一些方面，启动子包括骨髓增生性肉瘤病毒增强子、负控制区域缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子、EF1a启动子、泛素启动子。
在一些方面，本公开的载体还包含附加基因。在一些方面，附加基因是非免疫原性选择工具、追踪标志物或***基因。在一些方面，附加基因是截短EGFR基因(EGFRt)。可根据本文所述的方面来使用的截短EGFR(EGFRt)基因的实例包括SEQ ID NO:3。
多核苷酸修饰
在一些方面，编码本公开的蛋白(例如，c-Jun、抗ROR1 CAR和/或EGFRt)的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)可包含至少一个化学修饰核碱基、糖、主链，或它们的任何组合。因此，编码本公开的蛋白的多核苷酸可包含一个或多个修饰。在一些方面，编码本公开的CAR、c-Jun和/或EGFRt的多核苷酸包含至少一个核苷酸类似物。在一些方面，通过使用IVT(体外转录)或化学合成来引入的至少一个核苷酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE-RNA)单体、2'-氟-DNA单体、2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、锁核酸(LNA)单体、cEt单体、cMOE单体、5'-Me-LNA单体、2'-(3-羟基)丙基-RNA单体、***核酸(ANA)单体、2'-氟-ANA单体、失水己糖醇核酸(HNA)单体、嵌入核酸(INA)单体，和所述核苷酸类似物中的两者或两者以上的组合。在一些方面，优化核酸分子包含至少一个主链修饰，例如硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些方面，编码本公开的蛋白(例如，抗ROR1、c-Jun和/或EGFRt)的多核苷酸可在末端位置处，例如通过在相对于5’和/或3’端的位置1、2、3处引入M(2′-O-甲基)、MS(2′-O-甲基3′硫代磷酸酯)或MSP(2′-O-甲基3’硫代PACE，膦酰基乙酸酯)修饰，或它们的组合来化学修饰。
编码本公开的c-Jun、CAR和/或EGFRt蛋白的修饰多核苷酸(即，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)不一定沿着分子的整个长度均匀地修饰。不同核苷酸修饰和/或主链结构可存在于核酸中的各个位置处。本领域的一般技术人员认识到核苷酸类似物或其它修饰可位于核酸的任何位置处以使得核酸的功能大致上不降低。修饰也可以是5'或3'端修饰。核酸可含有最小一个和最大100％修饰核苷酸，或任何介于中间的百分比，例如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％，或至少约99％修饰核苷酸。
在一些方面，编码本公开的CAR、c-Jun和/或EGFRt的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)可包括修饰来防止通过内核酸酶和核酸外切酶的快速降解。修饰包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5'端修饰(磷酸化脱磷酸化、缀合、反向键等)，3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向键等)，(b)碱基修饰，例如置换成修饰碱基、稳定化碱基、去稳定化碱基或与扩大的搭配物谱系进行碱基配对的碱基，或缀合碱基，(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处)或糖的置换，以及(d)核苷间键修饰，包括磷酸二酯键的修饰或置换。
适用于本文描述的方法的本公开的合成、修饰多核苷酸(即，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的特定实例包括但不限于含有修饰或非天然核苷酸间键的多核苷酸。具有修饰核苷酸间键的合成、修饰多核苷酸尤其包括在核苷间键中不具有磷原子的多核苷酸。在一些方面，合成、修饰多核苷酸在其核苷间键中具有磷原子。
修饰核苷酸间键的非限制性实例包括具有正规3'-5'键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酰酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硼酸磷酸酯，这些键的T-5'键联类似物，和具有反向极性的那些键，其中相邻成对的核苷单元呈3'-5'至5'-3'或T-5'至5'-T连接。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
其中不包含磷原子的修饰核苷酸间键具有由短链烷基来形成的核苷酸间键或环烷基核苷酸间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间键。这些键包括具有以下各者的键：吗啉代键(部分地由核苷的糖部分来形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰和硫代甲乙酰主链；亚甲基甲乙酰和硫代甲乙酰主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合N、O、S和CH2组成部分的其它键。
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)可通过引入一个或多个同义密码子变化来密码子优化。如本文所用，术语“密码子优化”、“密码子进行优化”和其语法变体是指通过置换同义密码子来修饰核酸的一级序列以便增加其翻译效率。因此，密码子优化包含转换用于多核苷酸中的密码子而不改变其编码的氨基酸序列，通常极大地增加密码子优化基因所编码的蛋白的丰度，因为其通常去除“罕见”密码子并且将其用丰富密码子来置换，或去除具有较低tRNA补给速率的密码子与具有较高tRNA补给速率的密码子。该密码子优化可例如(i)改良重组蛋白表达中的蛋白产率，或(ii)改良编码本文公开的结合分子的mRNA或DNA的稳定性、半衰期或其它合意性质，其中将该mRNA或DNA施用于有需要的受试者。
本公开的多核苷酸的编码序列(例如，c-Jun、抗ROR1 CAR或EGFRt)中的一者或多者可使用在提交本申请时在本领域中已知的任何方法来密码子优化。
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)进行序列优化。如本文所用，术语“序列优化”是指修饰核酸的序列以便引入增加其翻译效率的特征，去除减少其翻译效率的特征，或通常改良与体内施用之后的表达功效相关的性质。这类性质包括但不限于改良核酸稳定性(例如，mRNA稳定性)、增加目标组织中的翻译功效、减少所表达截短蛋白的数目、改良所表达蛋白的折叠或防止错误折叠、减少表达产物的毒性、减少由表达产物导致的细胞死亡，或增加和/或降低蛋白聚集。
本公开涵盖整个构建体的修饰，例如CAR、c-Jun、EGFRt构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列的修饰以便产生在功能上等效的分子。构建体可被修饰成保持本文公开的起始表达构建体(例如SEQ ID NO:58提供的构建体)的至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％同一性。本公开还涵盖构建体的特定区域的修饰，所述修饰例如引起CAR或c-Jun结构域或EGFRt构建体的一个或多个CDR的一个或多个氨基酸序列的修饰，从而产生在功能上等效的分子。
细胞
本公开还提供了包含本公开的多核苷酸构建体(即，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的基因修饰细胞。在一些方面，c-Jun、抗ROR1CAR和EGFRt通过进行基因修饰以表达所述构建体的细胞来重组表达，其中细胞包含编码本公开的c-Jun、CAR或EGFRt的多核苷酸序列或载体中的一者或多者。
在一些方面，本文公开的基因修饰细胞用编码本公开的蛋白组分(例如，抗ROR1CAR、c-Jun和/或EGFRt)的多核苷酸或载体来转染。术语“转染”(或等效术语“转化”和“转导”)是指将外源核酸，例如编码本公开的蛋白(例如，抗ROR1、c-Jun和/或EGFRt)的多核苷酸或载体转移或引入宿主细胞，例如T细胞的基因组中的过程。“转染”细胞是用外源核酸，例如编码本公开的蛋白的多核苷酸或载体来转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代标的细胞和其子代。
在一些方面，本文所述的细胞用转录激活剂修饰，该激活剂能够诱导和/或增加感兴趣的蛋白质(例如，c-Jun)在细胞中的内源性表达。如本文所用，术语“转录激活剂”是指增加基因或一组基因的转录的蛋白质(例如，通过结合到核酸序列的增强子或启动子近端元件并且由此诱导其转录)。可用于本公开的这类转录激活剂的非限制性实例包括：基于转录激活剂样效应物(TALE)的转录激活剂、基于锌指蛋白(ZFP)的转录激活剂、基于规律间隔重复短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)***的转录激活剂，或它们的组合。参见例如Kabadi等人，Methods 69(2):188-197(2014年9月)，其以全文引用的方式并入本文中。
在一些方面，本文所述的细胞用基于CRISPR/Cas***的转录激活剂，例如CRISPR激活(CRISPRa)来修饰。参见例如Nissim等人，Molecular Cell 54:1-13(2014年5月)，其以全文引用的方式并入本文中。CRISPRa是一种类型的CRISPR工具，它包括使用缺少内核酸酶活性但是保持结合到其向导RNA和靶标DNA核酸序列的能力的修饰Cas蛋白。可用于本公开的这些修饰Cas蛋白的非限制性实例是本领域中已知的。参见例如Pandelakis等人，CellSystems 10(1):1-14(2020年1月)，其以全文引用的方式并入本文中。在一些方面，修饰Cas蛋白包含修饰Cas9蛋白(在本领域中又被称为“dCas9”)。在一些方面，修饰Cas蛋白包含修饰Cas12a蛋白。在一些方面，适用于本公开的修饰Cas蛋白结合到向导多核苷酸(例如，小向导RNA)(“修饰Cas-向导复合物”)，其中向导多核苷酸包含与编码感兴趣的蛋白质(例如，c-Jun)的核酸序列的区域互补的识别序列。在一些方面，向导多核苷酸包含与编码感兴趣的蛋白质的内源性核酸序列的启动子区域互补的识别序列。在一些方面，一种或多种转录激活剂附接到修饰Cas-向导复合物(例如，修饰Cas蛋白的N和/或C端)，以使得当将修饰Cas-向导复合物引入细胞中时，一种或多种转录激活剂可结合到核酸序列的调节元件(例如，启动子区域)，并且由此诱导和/或增加所编码蛋白(例如，c-Jun)的表达。在一些方面，一种或多种转录激活剂可结合到内源性基因的调节元件(例如，启动子区域)，并且由此诱导和/或增加所编码蛋白(例如，c-Jun)的表达。可使用的常见一般激活剂的非限制性示例性实例包括RNAP、VP16、VP64和p65的Ω亚基。参见例如Kabadi和Gersbach，Methods 69:188-197(2014)，其以全文引用的方式并入本文中。
在一些方面，一种或多种转录抑制剂(例如，Kruppel相关盒域(KRAB))可附接到修饰Cas-向导复合物(例如，修饰Cas蛋白的N和/或C端)，以使得在引入细胞中时，一种或多种转录抑制剂可抑制或减少基因，例如例如可干扰c-Jun的表达的那些基因(例如，Bach2)的转录。参见例如US20200030379A1和Yang等人，J Transl Med19:459(2021)，其各自以全文引用的方式并入本文中。在一些方面，适用于本公开的修饰Cas蛋白可附接到一种或多种转录激活剂和一种或多种转录抑制剂。
不受任何一种理论束缚，在一些方面，这类修饰Cas蛋白的使用可允许感兴趣的基因的条件性转录和表达。例如，在一些方面，细胞(例如，T细胞)被修饰成包含配体结合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)，所述配体结合蛋白连接到蛋白酶(例如，烟草蚀刻病毒(TEV))和靶向c-Jun的启动子区域的单一向导RNA(sgRNA)。在一些方面，细胞被修饰成还包含T细胞激活衔接因子(LAT)，所述T细胞激活衔接因子经由连接子(例如，TEV-可裂解连接子)与附接到转录激活剂的修饰Cas蛋白(例如，dCas9-VP64-p65-Rta转录激活剂(VPR))复合。在配体结合蛋白激活后，修饰Cas蛋白被释放，进行细胞核定位并且有条件地和可逆诱导c-Jun的表达。Yang等人，J Immunother Cancer 9(增刊2):A164(2021)，其以全文引用的方式并入本文中。
如本领域的技术人员显而易知，在一些方面，本文所述的细胞使用多个方法的组合来修饰。例如，在一些方面，细胞用外源的本文所述的多核苷酸(例如，编码c-Jun蛋白、ROR1结合蛋白和EGFRt)来修饰。在一些方面，该细胞进一步用能够增加内源性c-Jun蛋白的表达的外源性转录激活剂(例如，CRISPRa)来修饰。不受任何一种理论束缚，在一些方面，这样的组合方法可允许免疫细胞具有甚至更大水平的c-Jun蛋白表达(例如，通过外源核苷酸序列来编码并且通过免疫细胞来内源性地表达)。
如本公开显而易知，本文所述的免疫细胞表现出与参考细胞(例如，存在于自然界中的对应细胞)相比，极好的一个或多个性质。例如，在一些方面，与参考细胞相比，本文提供的免疫细胞。
除非另外指示，一个或多个外源核苷酸序列和/或转录激活剂可使用在本领域中已知的任何合适方法来引入细胞中。将一个或多个外源核苷酸序列递送到细胞的合适方法的非限制性实例包括：转染(又称为转化和转导)、电穿孔、非病毒递送、病毒转导、脂质纳米颗粒递送，和它们的组合。
在一些方面，细胞(例如，T细胞)用本公开的载体，例如腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体来转染。在一些这样的方面，细胞可稳定地表达本公开的蛋白。
在一些方面，细胞(例如，T细胞)用编码本公开的蛋白(例如，抗ROR1、c-Jun和/或EGFRt)的核酸，例如mRNA、cDNA、DNA来转染。在这样的方面，细胞可瞬时表达本公开的蛋白。例如，RNA构建体可直接转染到细胞中。产生用于转染的mRNA的方法涉及用特别设计的引物来体外转录(IVT)模板，随后添加聚A，以便产生含有3′和5′未翻译序列(UTR)、5′帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和聚A尾的构建体，通常50-2000个碱基长度。由此产生的RNA可有效地转染不同种类的细胞。在一些方面，所述模板包含CAR、c-Jun、EGFRt和本公开的其它蛋白的序列。在某些方面，RNA载体通过电穿孔来转导到T细胞中。
在一些方面，本文所述的蛋白(例如，CAR多肽和c-Jun多肽)的编码序列可安置于分开的表达构建体上。在一些方面，本文所述的蛋白(例如，CAR多肽、c-Jun蛋白和如果存在的EGFRt)的编码序列可安置于单一表达构建体上。编码序列可安置于构建体上的一个或多个表达盒中，每个盒是其自身的转录单元(例如，具有其自身启动子和聚腺苷酸化位点和其它转录控制元件)。在某些方面，三个编码序列(例如，分别编码CAR、c-Jun和EGFRt)可安置于单一表达盒(例如，三顺反子表达盒)上，其中三个编码序列在共有启动子下转录。
在一些方面，细胞是免疫效应细胞。如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指涉及免疫反应，例如促进免疫效应反应的细胞。“免疫效应功能”或“免疫效应反应”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应功能或反应是指促进靶细胞的杀灭或抑制其生长或增殖的T或NK细胞的性质。在T细胞的情况下，一级刺激和共刺激是免疫效应功能或反应的实例。
术语“效应功能”是指细胞的特殊功能。例如T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。CAR的细胞内信号转导结构域可产生促进含有CAR的细胞，例如CAR T细胞的免疫效应功能的信号。例如，CAR T细胞中的免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。在一些方面，细胞内信号结构域是转导效应功能信号并且向导细胞执行特殊功能的CAR的部分。虽然可使用整个细胞内信号转导结构域，但是在许多情况下不需要使用整条链。就使用细胞内信号转导结构域的截短部分来说，该截短部分可代替完整链来使用，只要其转导效应功能信号。因此，术语细胞内信号转导结构域意图包括足以转导效应功能信号的细胞内信号转导结构域的任何截短部分。
在一些方面，细胞内信号转导结构域可包含一级细胞内信号转导结构域。示例性一级细胞内信号转导结构域包括衍生自负责一级刺激或抗原依赖性刺激的分子的结构域。在一些方面，细胞内信号转导结构域可包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号转导结构域包括衍生自负责共刺激信号或不依赖于抗原的刺激的分子的结构域。例如，在CAR T细胞的情况下，一级细胞内信号转导结构域可包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号转导结构域可包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
一级细胞内信号转导结构域可包含被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号转导基序。含有ITAM的一级细胞质信号转导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10和DAP12的序列。
免疫效应细胞的实例包括，例如T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥胖细胞和骨髓来源吞噬细胞。先天淋巴细胞(ILC)是衍生自共同淋巴祖细胞(CLP)并且属于淋巴谱系的一组先天免疫细胞。因为缺少重组激活基因(RAG)，这些细胞通过不存在抗原特异性B或T细胞受体来定义。ILC不表达骨髓性或树突细胞标志物。ILC具有不同生理功能；一些功能与辅助T细胞类似，同时该组还包括细胞毒性NK细胞。因此，在一些方面，被基因修饰成表达本公开的CAR的细胞是例如T细胞、NK细胞、NKT细胞或ILC细胞。
T细胞可获自许多来源，包括末梢血液单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜腔积液、脾脏组织和肿瘤。
本公开的工程化免疫细胞的来源可以是待治疗的患者(即，自体细胞)或来自不是待治疗的患者的供体(例如，同种异体细胞)。在一些方面，工程化免疫细胞是工程化T细胞。本文中的工程化T细胞可以是CD4+CD8-(即，CD4单一阳性)T细胞、CD4-CD8+(即，CD8单一阳性)T细胞或CD4+CD8+(双重阳性)T细胞。在功能上，T细胞可以是细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞、抑制T细胞，或它们的混合物。待工程化的T细胞可以是自体或同种异体的。
原代免疫细胞，包括原代T细胞，可获自许多组织来源，包括末梢血液单核细胞(PBMC)、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜腔积液、脾脏组织和/或肿瘤组织。白细胞，包括PBMC，可通过众所周知的技术例如FICOLLTM分离和白细胞分离术而与其它血球分离。白细胞分离产物通常含有淋巴细胞(包括T和B细胞)、单核细胞、粒细胞和其它有核白细胞。T细胞进一步与其它白细胞分离，例如通过经由PERCOLLTM梯度的离心或逆流离心淘析。T细胞的特定亚群，例如CD3+、CD25+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、GITR+和CD45RO+T细胞，可通过正向或负向选择技术(例如，使用基于荧光或基于磁性的细胞分选)来进一步分离。例如，T细胞可通过与例如CELLectionTM、DETACHaBEADTM(Thermo Fisher)或/>细胞分离产品(Miltenyi Biotec)的各种商购抗体缀合珠粒中的任一者一起培养足以正向选择所需T细胞或负向选择来去除不当细胞的一段时间来分离。
在一些情况下，自体T细胞获自直接癌症治疗之后的癌症患者。观察到在某些癌症治疗，尤其削弱免疫***的治疗之后，治疗之后不久收集的T细胞的质量可具有改良的离体扩增和/或在离体工程化之后移植的能力。
不论在基因修饰之前还是之后，T细胞均可通常使用如例如以下中所描述的方法来激活并扩增：美国专利5,858,358；5,883,223；6,352,694；6,534,055；6,797,514；6,867,041；6,692,964；6,887,466；6,905,680；6,905,681；6,905,874；7,067,318；7,144,575；7,172,869；7,175,843；7,232,566；7,572,631；和10,786,533，所述专利各自明确地以引用的方式整体并入本文中。总体上，T细胞可通过与表面接触来体外或离体扩增，所述表面具有与其附接的刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。具体地说，T细胞群体可例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定于表面上的抗CD3抗体接触，或通过与钙离子载体结合在一起的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓虫素)接触来加以刺激。对于T细胞表面上的附加分子的共刺激，可使用结合附加分子的配体。例如，T细胞群体可在适合于刺激T细胞的增殖的条件下，与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。
细胞培养条件可包括以下中的一者或多者：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、如营养物、氨基酸、抗生素、离子等剂，和/或如细胞因子、趋化因子、抗原、结合搭配物、融合蛋白、重组可溶性受体等刺激因子，和被设计用来激活细胞的任何其它剂。在一些方面，培养条件包括添加IL-2、IL-7和/或IL-15。
在一些方面，待工程化的细胞可以是在工程化之后，分化成成熟T细胞的多能或多潜能细胞。这些非T细胞可以是同种异体的并且可以是例如人类胚胎干细胞、人类诱导性多能干细胞或造血干细胞或祖细胞。为了便于描述，多能和多潜能细胞在本文中被统称为“祖细胞”。
当使用同种异体细胞，在某些方面，其被工程化成减少移植物抗宿主排斥反应(例如，通过敲除内源性B2M和/或TRAC基因)。
药物组合物
本公开还提供了适合于施用于受试者的药物组合物，所述药物组合物包含：本文公开的组合物，例如编码本公开的蛋白(例如，c-Jun、抗ROR1 CAR、EGFRt)的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1构建体)，包含编码本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun和EGFRt蛋白的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的载体，或包含编码本公开的抗ROR1CAR、c-Jun和EGFRt蛋白的多核苷酸构建体或载体的基因修饰细胞。
药物组合物通常包含：编码或包含本公开的抗ROR-1CAR、c-Jun和EGFRt蛋白的多核苷酸、载体或细胞，和呈适合于施用于受试者的形式的药学上可接受赋形剂或运载体。药学上可接受的赋形剂或运载体部分地由所施用的特定组合物，以及用于施用组合物的特定方法决定。
本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含用本文所述的表达构建体(例如，本文所述的c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)来修饰的工程化T细胞。药物组合物可包含适合于在引入患者之前保持细胞的健康状况的药学上可接受的运载体。
在一些方面，工程化细胞可从培养基中收获，并且以治疗有效量来洗涤并且浓缩至运载体中。示例性运载体包括盐水、缓冲盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水)、生理盐水、水、汉克斯溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、Nonnosol-R(AbbottLabs)、Plasma-Lyte A(R)(Baxter Laboratories公司,Morton Grove,IL)、甘油、乙醇，和它们的组合。优选运载体是等渗的。在一些方面，运载体可补充有例如人类血清白蛋白(HSA)或其它人类血清组分、5％葡萄糖或右旋糖的成分。额外等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更高糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露醇也可包含在内。
药物T细胞组合物可以治疗有效量来全身(例如，通过静脉内或门静脉注射)或局部(例如，通过肿瘤内注射)施用于癌症患者。在一些方面，例如靶向ROR1的组合物用于治疗患有已知表达ROR1的肿瘤的患者。在一些方面，例如靶向ROR1的组合物用于治疗患有选自以下的癌症的患者：转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、骨髓瘤、食管癌、滑膜肉瘤、胃癌、乳腺癌、肝细胞癌、头颈癌、卵巢癌、***癌，和膀胱癌。如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”是指在所治疗受试者中获得有益或所需结果的方法。这些结果包括但不限于：减轻由疾病产生的一个或多个症状、减弱疾病程度(例如，减少肿瘤体积)、稳定疾病(例如，防止或延缓疾病恶化)、防止或延缓疾病扩散(例如，转移)、防止或延缓疾病再发或复发、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、降低治疗疾病所需要的一种或多种其它药物的剂量、改善生活质量、恢复体重，和/或延长生存期(例如，总生存期或无进展生存期)。
组合物的治疗有效量是指足以达成所需临床端点的工程化T细胞的数目。在一些方面，治疗有效量含有大于约104、大于约105、大于约106、大于约107、大于约108或大于约109个工程化细胞。
在一些方面，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病状的量，例如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些方面，治疗或预防功效通过定期评定所治疗受试者来监测。对于几天或更长时间内的重复施用，根据病状，治疗将重复，直到出现所需疾病症状抑制。然而，其它剂量方案可以是有用的并且可加以确定。所需剂量可通过组合物的单次推注施用、通过组合物的多次推注施用或通过组合物的连续输注施用来递送。
存在包含本公开的CAR的药物组合物的多种合适调配物(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.第18版(1990))。药物组合物通常无菌地并且完全符合美国食品药品管理局的所有良好制造规范(GMP)条例来配制。
在某些方面，药物组合物在药学上可接受的运载体中与一种或多种额外治疗剂一起共同施用。在一些方面，包含本文所述的多核苷酸(例如，编码抗ROR1 CAR、c-Jun和/或EGFRt)的药物组合物在施用额外治疗剂之前施用。在某些方面，包含本公开的多核苷酸(例如，编码抗ROR1 CAR、c-Jun和/或EGFRt)的药物组合物在施用额外治疗剂之后施用。在其它方面，包含本公开的多核苷酸(例如，编码抗ROR1 CAR、c-Jun和/或EGFRt)的药物组合物与额外治疗剂同时施用。
可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者(例如动物或人)无毒性，并且包括：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
运载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人类血清白蛋白。这些介质和化合物用于药学上活性物质的用途是本领域中众所周知的。除非任何常规介质或化合物与本公开的组合物(例如，多核苷酸、载体或细胞)不相容，否则涵盖其在组合物中的用途。
适应症
在一些方面，本文公开的组合物(例如，过表达c-Jun的抗ROR1CAR T细胞)可用于治疗疾病或病状，例如增生性疾病，例如癌症或恶性肿瘤，或癌前期病状，例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或早期白血病。
“癌症”是指一组涵盖较广的以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的各种增生疾病。不受调控的细胞***和生长导致侵入邻近组织的恶性肿瘤的形成，还可能通过淋巴***或血流转移到身体的远端部位。如本文所用，术语“增生性”病症或疾病是指一个或多个细胞亚群在多细胞生物中的不当细胞增殖，导致对于多细胞生物的损害(即，不适或预期寿命减少)。例如，如本文所用，增生性病症或疾病包含赘瘤性病症和其它增生性病症。如本文所用，“赘瘤”是指导致异常组织生长的任何形式的失调或不受调控的细胞生长，不论恶性还是良性。因此，“赘瘤性细胞”包括具有失调或不受调控的细胞生长的恶性和良性细胞。在一些方面，癌症是肿瘤。如本文所用，“肿瘤”是指所有赘瘤性细胞生长和增殖，不论恶性还是良性，和所有癌前期和癌性细胞和组织。
在一些方面，过表达c-Jun的工程化抗ROR1 CAR T细胞可用于治疗ROR1阳性的复发或难治性恶性实体瘤。在某些方面，待治疗的疾病是乳腺癌，例如三阴性乳腺癌，或非小细胞肺癌。在一些方面，疾病是实体瘤或液体肿瘤。在一些方面，癌症是胰腺癌。在一些方面，疾病是血液癌症。在一些方面，血液癌症是白血病。
在一些方面，本文公开的组合物(例如，被工程化成表达编码本公开的c-Jun和CAR的多核苷酸的细胞、包含编码本公开的c-Jun和CAR的多核苷酸的载体、本公开的c-Jun和CAR，或表达本公开的c-Jun和CAR的细胞，例如CAR T细胞)用于在有需要的受试者中减少或降低肿瘤大小或抑制肿瘤生长。在一些方面，肿瘤是癌瘤(即，上皮来源的癌症)。在一些方面，肿瘤例如选自由以下组成的组：胃癌、胃食管连接部癌(GEJ)、食管癌、结直肠癌、肝癌(肝细胞癌，HCC)、卵巢癌、乳腺癌、NSCLC、膀胱癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、淋巴瘤、子宫癌、肾脏或肾癌、胆管癌、***癌、睾丸癌、尿道癌、***癌、胸腺癌、直肠癌、脑癌(神经胶质瘤和成胶质细胞瘤)、***、腮腺癌、喉癌、甲状腺癌、腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤和默克尔细胞癌(Merkel Cell carcinoma)。
“癌症”或“癌症组织”可包括各个阶段的肿瘤。在某些方面，癌症或肿瘤是0期，以使得例如癌症或肿瘤处于发育极早期并且尚未转移。在一些方面，癌症或肿瘤是I期，以使得例如癌症或肿瘤尺寸相对较小，未扩散到相邻组织中，并且尚未转移。在一些方面，癌症或肿瘤是II期或III期，以使得例如癌症或肿瘤大于0期或I期，并且其生长到相邻组织中但是其尚未转移，除了可能转移到***以外。在一些方面，癌症或肿瘤是IV期，以使得例如癌症或肿瘤已经转移。IV期也可被称为晚期或转移性癌症。
在一些方面，癌症可以包括但不限于肾上腺皮质癌、晚期癌症、***癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑瘤、脑癌、乳腺癌、儿童期癌症、原发性不明的癌症、卡斯特曼病(Castleman disease)、***、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏家族肿瘤(Ewing family of tumor)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾细胞癌、喉和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓单核细胞白血病、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、垂体瘤、***癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、威尔姆氏瘤(Wilms tumor)和癌症治疗引起的继发性癌症。
在一些方面，肿瘤是实体瘤。“实体瘤”包括但不限于肉瘤、黑色素瘤、癌瘤，或其它实体瘤癌。“肉瘤”是指由类似于胚胎***的物质组成并且通常由嵌入纤丝状或均匀物质中的紧密填充细胞组成的肿瘤。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、亚伯迈西肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、肺泡软组织肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆氏肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞性肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森肉瘤(Jensen'ssarcoma)、卡波西肉瘤、枯氏细胞肉瘤(Kupffercell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间充质肉瘤、骨旁肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆囊性肉瘤、滑膜肉瘤或毛细管扩张性肉瘤。
术语“黑色素瘤”是指由皮肤和其它器官的黑素细胞***产生的肿瘤。黑色素瘤包括例如肢端小痣性黑色素瘤、无黑素黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年黑色素瘤、恶性雀斑样黑色素瘤、恶性黑色素瘤、转移性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
术语“癌瘤”是指倾向于浸润周围组织并且引起转移的由上皮细胞组成的恶性新生物。示例性癌包括例如腺泡癌、腺泡状癌、腺囊性癌、腺样囊性癌、腺瘤性癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞癌、基底样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、圆柱形癌、圆柱形细胞癌、导管癌、硬膜癌、胚胎癌、脑样癌、表皮样癌、腺样上皮癌、外生性癌、溃疡性癌、纤维癌、明胶状癌、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、颗粒细胞癌、毛基质癌、血样癌、肝细胞癌、许特莱氏细胞癌(Hurthle cellcarcinoma)、透明细胞癌、肾上腺样癌、婴儿胚胎癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克朗佩彻氏癌(Krompecher's carcinoma)、库尔奇茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌、豆状细胞癌、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、痣癌、粘液素癌、粘液癌、粘细胞癌、粘液表皮样癌、粘液性癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌、类骨质癌、***状癌、门静脉周围癌、浸润前癌、刺细胞癌、浆状癌、肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤癌、施耐德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、茄类癌、球形细胞癌、梭形细胞癌、海绵状细胞癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、串状癌、毛细血管扩张癌、毛细血管瘤、移行细胞癌、结节性皮癌、结节癌、疣状癌或绒毛状癌。
可用本文公开的组合物(例如，被工程化成表达编码本公开的c-Jun和CAR的多核苷酸的细胞、包含编码本公开的c-Jun和CAR的多核苷酸的载体、本公开的c-Jun和CAR，或表达本公开的c-Jun和CAR的细胞，例如CAR T细胞)治疗的额外癌症包括例如白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、***状甲状腺癌、成神经细胞瘤、神经内分泌癌、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、***、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、***癌、苗勒管癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫***状浆液性癌。
方法
本公开还提供了使用本文所述的组合物(例如，编码c-Jun和抗ROR1 CAR的多核苷酸；包含多核苷酸的载体；或用载体来转导的细胞，例如如本文所述的过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞)中的一者或多者用于过继性疗法的方法。虽然以下提供的公开内容主要涉及施用细胞(例如，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞)，但本领域的技术人员显而易知所描述的方法可达成向受试者施用本文所述的任何其它组合物(例如，编码c-Jun和抗ROR1CAR的多核苷酸或包含多核苷酸的载体)。
在一些方面，本公开提供了刺激受试者的T细胞介导的对于靶细胞群体或组织的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的表达抗ROR1 CAR并且过表达本公开的c-Jun多肽的细胞。还提供了在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的表达抗ROR1 CAR并且过表达本公开的c-Jun多肽的细胞给受试者。
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的表达抗ROR1 CAR并且过表达本公开的c-Jun多肽的细胞。在一些方面，治疗癌症的方法包括向有需要的受试者施用免疫细胞，所述免疫细胞过表达c-Jun多肽并且包含嵌合抗原受体(CAR)和截短EGF受体(EGFRt)，其中CAR对在肿瘤中表达的抗原具有特异性。这类免疫细胞的非限制性实例在整个本公开中描述。如本公开显而易知，这些方法可适用于治疗与ROR1表达相关的任何癌症。这些癌症的非限制性实例在本公开中别处提供。
如在本文中证明，在一些方面，向受试者施用本文所述的修饰免疫细胞(例如，过表达c-Jun多肽并且包含CAR(例如，抗ROR1 CAR)和EGFRt)可减少或减轻癌症的一个或多个症状或方面。例如，在一些方面，与参照肿瘤大小相比，施用本文所述的修饰免疫细胞可引起肿瘤大小降低。在一些方面，参照肿瘤大小包括：(i)施用之前的肿瘤大小，(ii)未接受施用(例如，接受不过表达c-Jun多肽的对应免疫细胞的施用)的对应受试者中的肿瘤大小，或(iii)同时(i)和(ii)。在一些方面，与参照肿瘤大小相比，施用本文提供的修饰免疫细胞可减少受试者中的肿瘤的大小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些方面，施用本文所述的修饰免疫细胞可改良受试者的生存持续时间。在一些方面，与参照生存持续时间相比，生存持续时间增加了至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约一年。在一些方面，参照生存持续时间包含未接受施用(例如，接受不过表达c-Jun多肽的对应免疫细胞的施用)的对应受试者的生存持续时间。
如在本公开中别处进一步描述，在一些方面，与参考细胞(例如，未被修饰成过表达c-Jun的对应细胞)相比，本文所述的修饰免疫细胞展现杀灭肿瘤细胞的改良能力。因此，在一些方面，本文提供了杀灭肿瘤细胞的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与免疫细胞接触，所述免疫细胞过表达c-Jun多肽并且包含嵌合抗原受体(CAR)和截短EGF受体(EGFRt)，其中CAR对在肿瘤细胞中表达的抗原具有特异性。这些免疫细胞的非限制性实例在整个本公开中提供。在一些方面，与参考细胞(例如，如本文所述的未修饰的对应细胞)相比，肿瘤细胞的杀灭增加了至少约0.5倍、1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
如本公开显而易知，与参考细胞(例如，未被修饰成过表达c-Jun的对应细胞)相比，本公开的修饰免疫细胞表现出各种极好的性质。例如，在一些方面，在用抗原刺激时，本文所述的修饰细胞能够产生增加量的细胞因子(例如，IFN-γ、IL-2，或两者)。因此，在一些方面，本文提供了增加响应于抗原刺激的免疫细胞的细胞因子产生的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽。在一些方面，ROR-1结合蛋白特异性地结合到与R12抗体相同的表位。在一些方面，与对应免疫细胞相比，响应于抗原刺激的细胞因子产生增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。在一些方面，细胞因子的产生增加了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，或至少约100％或更大。
在一些方面，与参考细胞(例如，未被修饰成过表达c-Jun的对应免疫细胞)相比，本文所述的修饰免疫细胞表现出增加的响应于抗原刺激的增殖。因此，本文还提供了增加免疫细胞响应于抗原刺激的增殖的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽。在一些方面，ROR-1结合蛋白特异性地结合到与R12抗体相同的表位。在一些方面，与对应免疫细胞相比，在修饰之后，响应于抗原刺激的免疫细胞的增殖增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。在一些方面，增殖增加了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％或更大。
如本公开显而易知，本文提供的方法也可用于增加响应于持续抗原刺激的免疫反应的一个或多个效应功能。可改良的效应功能的非限制性实例包括以下能力：(i)杀灭肿瘤细胞，(ii)在进一步抗原刺激后产生细胞因子，或(iii)同时(i)和(ii)。在一些方面，这类方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽。在一些方面，ROR-1结合蛋白特异性地结合到与R12抗体相同的表位。
在一些方面，如与对应免疫细胞相比，在修饰之后，免疫细胞保持效应功能达至少一轮、至少两轮或至少额外三轮的抗原刺激测定。
在一些方面，与对应免疫细胞相比，在修饰之后，免疫细胞的效应功能增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。在一些方面，效应功能增加了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％或更大。
在一些方面，本文提供的方法也可用于减少或防止持续抗原刺激之后的免疫细胞(例如，T细胞)的耗竭。在一些方面，这类方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的c-Jun多肽。在一些方面，ROR-1结合蛋白特异性地结合到与R12抗体相同的表位。
在一些方面，如与对应免疫细胞相比，在修饰之后，响应于持续抗原刺激，免疫细胞表达：(i)降低水平的与耗竭相关的基因，(ii)增加水平的与激活相关的基因，或(iii)同时(i)和(ii)。这些基因的非限制性实例在本公开中别处描述。
本公开还提供了制备用于疗法的细胞，例如过表达c-Jun多肽的抗ROR1 CAR T细胞的群体的方法，所述方法包括将从受试者分离的细胞群体用本公开的多核苷酸或载体来转导。在一些方面，转导包括将细胞在合适条件下培养。
本公开还提供了在经诊断患有癌症的受试者中产生基因工程化细胞的持续群体的方法，所述方法包括向受试者施用被基因工程化成表达抗ROR1 CAR并且过表达本公开的c-Jun多肽的细胞。不受任何一种理论束缚，如在本公开中别处描述，c-Jun的过表达可有助于减少或防止耗竭，以使得与参考细胞(例如，未被修饰成过表达c-Jun的对应细胞)相比，当将本公开的修饰免疫细胞施用于受试者时，其能够在受试者中持续更长时间。在一些方面，当施用于受试者时，本公开的修饰免疫细胞能够在受试者中持续比对应免疫细胞长至少约1周、至少约2周、至少约三周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约1年，或更长。因此，在一些方面，与施用参照受试者的对应免疫细胞相比，施用之后约1个月，存在于受试者中的修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，施用之后约2个月，与参照受试者中的对应免疫细胞相比，修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，施用之后约3个月，与参照受试者中的对应免疫细胞相比，修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，施用之后约4个月，与参照受试者中的对应免疫细胞相比，修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，施用之后约5个月，与参照受试者中的对应免疫细胞相比，修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，施用之后约6个月，与参照受试者中的对应免疫细胞相比，修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，施用之后约7个月，与参照受试者中的对应免疫细胞相比，修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，施用之后约8个月，与参照受试者中的对应免疫细胞相比，修饰免疫细胞的数目大了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
本公开还提供了在经诊断患有癌症的受试者中扩增基因工程化细胞(例如，T细胞)的群体的方法，所述方法包括向受试者施用被基因工程化成表达抗ROR1 CAR并且过表达本公开的c-Jun多肽的细胞(例如，T细胞)。在一些方面，细胞是T细胞，例如自体T细胞。在一些方面，T细胞是异源T细胞。在本文公开的方法的一些方面，受试者是人类受试者。
在一些方面，与施用包含抗ROR1 CAR(例如不过表达c-Jun)代替本公开的CAR的对应组合物之后观察到的白细胞介素分泌相比，施用包含本公开的抗ROR1 CAR(例如c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的组合物引起白细胞介素(例如白细胞介素-2)分泌增加了至少约0.01倍、至少约0.02倍、至少约0.03倍、至少约0.04倍、至少约0.05倍、至少约0.06倍、至少约0.07倍、至少约0.08倍、至少约0.09倍、至少约0.1倍、至少约0.2倍、至少约0.3倍、至少约0.4倍、至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。
在一些方面，与施用包含抗ROR1 CAR(例如不过表达c-Jun)代替本公开的CAR的对应组合物之后观察到的干扰素(例如干扰素-γ)分泌相比，施用包含本公开的抗ROR1 CAR(例如c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的组合物引起干扰素(例如干扰素-γ)分泌增加了至少约0.01倍、至少约0.02倍、至少约0.03倍、至少约0.04倍、至少约0.05倍、至少约0.06倍、至少约0.07倍、至少约0.08倍、至少约0.09倍、至少约0.1倍、至少约0.2倍、至少约0.3倍、至少约0.4倍、至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。
在一些方面，与施用包含抗ROR1 CAR(例如不过表达c-Jun)代替本公开的CAR的对应组合物之后观察到的TNFα分泌相比，施用包含本公开的抗ROR1 CAR(例如c-Jun-抗ROR1CAR构建体)的组合物引起TNFα分泌增加了至少约0.01倍、至少约0.02倍、至少约0.03倍、至少约0.04倍、至少约0.05倍、至少约0.06倍、至少约0.07倍、至少约0.08倍、至少约0.09倍、至少约0.1倍、至少约0.2倍、至少约0.3倍、至少约0.4倍、至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。
在一些方面，本公开提供了作为药物来使用的本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、试剂盒、细胞或药物组合物。在一些方面，本公开提供了作为用于治疗有需要的受试者的癌症的药物来使用的本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、试剂盒、细胞或药物组合物。在一些方面，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、试剂盒、细胞或药物组合物。在一些方面，本公开提供了本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、试剂盒、细胞或药物组合物用于制造药物的用途。在一些方面，本公开提供了本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、试剂盒、细胞或药物组合物用于制造供治疗有需要的受试者的癌症的药物的用途。
本公开还提供了用于治疗需要CAR疗法的受试者的包含多核苷酸构建体(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的组合物、包含构建体(例如，编码c-Jun、CAR或EGFRt)的载体或包含构建体或载体的基因修饰细胞。本公开还提供了作为药物来使用的包含本公开的多核苷酸构建体(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的组合物、包含多核苷酸构建体的载体或包含编码c-Jun、CAR或EGFRt的多核苷酸或载体的基因修饰细胞。还提供了作为需要CAR疗法的受试者的癌症的治疗剂来使用的包含本公开的多核苷酸构建体(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的组合物、包含多核苷酸构建体的载体或包含编码c-Jun、CAR或EGFRt的多核苷酸或载体的基因修饰细胞。还提供了用于制造供治疗需要CAR疗法的受试者的癌症的药物的包含多核苷酸构建体(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)的组合物、包含编码c-Jun、CAR或EGFRt的多核苷酸的载体或包含编码c-Jun、CAR或EGFRt的多核苷酸或载体的基因修饰细胞。
在一些方面，本公开提供了制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括将细胞用本文公开的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1CAR构建体)来转染。在一些方面，细胞包括T细胞、B细胞、调控T细胞(Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、干细胞、诱导性多能干细胞，和它们的任何组合。
在一些方面，本公开提供了扩增表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括在合适条件下培养包含本文公开的多核苷酸或本文公开的载体或本文公开的多肽的细胞。
在一些方面，本文公开的治疗方法还包括施用至少一种额外治疗剂。在一些方面，额外治疗剂包括化疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子激活剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法，或它们的任何组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体，或它们的任何组合。
试剂盒
本公开还提供了试剂盒或制品，所述试剂盒或制品包括(i)编码本公开的抗ROR1CAR、c-Jun和/或EGFRt蛋白的一个或多个多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR构建体)，编码一个或多个本文所述的多核苷酸(例如，抗ROR1 CAR、c-Jun和/或EGFRt)的一个或多个载体，或包含所述多核苷酸或所述载体的组合物，和任选地(ii)使用说明书，例如根据本文公开的方法的使用说明书。
本公开还提供了试剂盒，所述试剂盒包括(i)被基因修饰成表达本公开的抗ROR1CAR、c-Jun和EGFRt蛋白的细胞，即，包含编码本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun多肽和/或EGFRt蛋白的一个或多个多核苷酸，或包含一个或多个本文所述的多核苷酸的一个或多个载体的细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞，或ILC细胞)，或包含细胞的药物组合物，和任选地(ii)使用说明书。
在一些方面，试剂盒或制品包括一个或多个容器中的编码本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun多肽和/或EGFRt蛋白的至少一个多核苷酸或载体，被基因修饰成表达本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun多肽和/或EGFRt蛋白的细胞，或包含本文公开的多核苷酸、载体或细胞的组合物(例如，药物组合物)。
在一些方面，试剂盒或制品包括编码本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun多肽和EGFRt蛋白的至少一个多核苷酸或载体，被基因修饰成表达本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun和EGFRt的细胞，或包含本文公开的多核苷酸、载体或细胞的组合物(例如，药物组合物)，和任选地手册。
本领域的技术人员容易认识到本公开的多核苷酸、载体、细胞和组合物，包含本公开的多核苷酸、载体或细胞的药物组合物，或它们的组合可容易并入在本领域中众所周知的既定试剂盒格式中的一者中。
在一些方面，试剂盒或制品包括容器(例如，玻璃小瓶)中的呈干燥形式的例如编码本公开的抗ROR1 CAR、c-Jun多肽和EGFRt蛋白的多核苷酸或载体，或包含多核苷酸、载体的组合物(例如，药物组合物)，和任选地具有溶剂的小瓶。
在一些方面，试剂盒或制品包括至少一个容器中的例如编码本公开的抗ROR1CAR、c-Jun肽和EGFRt蛋白的多核苷酸或载体，或包含多核苷酸、载体的组合物(例如，药物组合物)，和具有转染试剂的另一个或更多个容器。
***
除非另外指示，否则本公开的实践将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。这类技术在文献中有充分说明。参见例如Sambrook等人编(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover编(1985)DNA Cloning,第I卷和第II卷；Gait编(1984)OligonucleotideSynthesis；Mullis等人美国专利第4,683,195号；Hames和Higgins编(1984)Nucleic AcidHybridization；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss公司)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；专著，Methods In Enzymology(Academic Press公司,N.Y.)；Miller和Calos编(1987)GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人编,Methods In Enzymology,第154卷和第155卷；Mayer和Walker编(1987)ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；Manipulating the MouseEmbryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；)；Crooke,Antisense drug Technology:Principles,Strategies and Applications，第2版CRC Press(2007)和Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley and Sons,Baltimore,Md.)。
提供了以下实施例用来说明而非用来限制。
实施例
表7.c-Jun-抗ROR1 CAR序列
/>
/>
/>
/>
/>
实施例1：分析过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞杀灭肿瘤细胞的能力
为了开始表征本文所述的抗ROR1 CAR T细胞(例如，过表达c-Jun)的ROR1依赖性生物活性，评定CAR T细胞杀灭肿瘤细胞的能力。简单地说，将过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞(在本文中称为“c-Jun过表达的抗ROR1 CAR T细胞”)与ROR1+NSCLC细胞系(“H1975”)或经由规律间隔重复短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)来敲除人ROR1的H1975(“H1975-ROR1KO”)共孵育。作为比较，不溶解肿瘤细胞的未转导“模拟”T细胞(即，不表达抗ROR1scFv)，和不过表达c-Jun的“对照”抗ROR1 CAR T细胞也与H1975或H1975-ROR1KO细胞共孵育。H1975和H1975-ROR1KO细胞均表达NucLight Red(NLR；核限制性mKate2)，以使得未溶解细胞可加以定量。将不同CAR T细胞以1:1的效应物与靶标(E:T)细胞比率孵育120小时。
如图1A示出，与对照抗ROR1 CAR T细胞类似，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞以ROR1表达依赖性方式来介导肿瘤细胞的细胞溶解。重要地，未观察到抗ROR1 CAR T细胞对于靶标阴性H1975-ROR1敲除细胞的杀灭(图1B)。这些结果证明与更传统的抗ROR1 CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞同样有效杀灭肿瘤细胞。
实施例2：分析过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞产生选择性细胞因子分泌的能力
为了进一步表征本文所述的抗ROR1 CAR T细胞的功能性能力，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞或对照抗ROR1 CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)以1:1的效应物与靶标(E:T)细胞比率24小时，与H1975或H1975-ROR1KO肿瘤细胞共孵育24小时。然后，收集来自不同培养条件的上清液以便进行IL-2和IFN-γ定量。细胞因子的浓度使用Meso ScaleDiscovery(MSD)U-Plex来测量。
如图2A和2C示出，响应于ROR1抗原，对照抗ROR1 CAR T细胞和过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞均产生大量的IL-2和IFN-γ。然而，细胞因子产生在过表达c-Jun的抗ROR1CAR T细胞中大得多。当在H1975-ROR1KO细胞存在下培养时(图2B和2D)，对照抗ROR1 CAR T细胞或过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T不分泌细胞因子。
总的来说，这些数据证明过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的选择性生物活性，因为过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞仅以抗原依赖性方式来溶解肿瘤细胞和分泌细胞因子。另外，与不过表达c-Jun的对照抗ROR1 CAR-T细胞相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌得到增强。
实施例3：分析过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的细胞因子依赖性增殖
为了判定是否c-Jun的过表达对抗ROR1 CAR T细胞对于细胞因子的敏感性具有任何作用，对照抗ROR1 CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)和过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞分别在以下条件中的一者下，在Grex 24孔板(1×106细胞/孔)中培养：(i)仅T细胞培养基(OpTmizer基础培养基、OpTmizer细胞补充物、免疫细胞血清替代物、2mM L谷氨酰胺、1×GlutaMAX)，(ii)补充有200IU/ml的IL-2的T细胞培养基，或(iii)补充有1200IU/ml IL-7和200IU/mL IL-15的T细胞培养基。未转导(“模拟”)细胞也在这些条件下培养并且用作对照。第7天和第14天，将每个培养条件下的T细胞的总数计数，然后将来自第7天的细胞以1×106细胞/孔来重新接种以便用于后续数轮培养。在测定的整个持续时间内保持每个样品的培养基条件。
如图3A示出，在不存在细胞因子时，T细胞中没有一个能够扩增。与在细胞因子支援下瞬时扩增到有限数目的模拟或对照抗ROR1CAR T细胞相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CART细胞表现出在整个研究中保持的极好增殖能力(图3B和3C)。这些结果进一步证明c-Jun的过表达可改良抗ROR1 CAR T细胞的各种功能性质(例如，细胞因子敏感性)。
实施例4：分析在长期抗原刺激之后，c-Jun过表达对于抗ROR1 CART细胞的抗肿瘤性质的作用
在慢性感染和癌症中，T细胞可通过持续抗原刺激而变得耗竭，导致例如细胞溶解活性和细胞因子分泌的T细胞效应功能的逐渐损失。因此，为了评估是否在延长的抗原刺激之后，c-Jun的过表达对于抗ROR1 CAR T细胞的效应功能具有任何作用，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞和对照抗ROR1 CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)通过重复暴露于ROR1+A549 NSCLC肿瘤细胞来长期刺激。通过每2天，以1:1E:T比率用新鲜靶细胞来重新涂铺CART细胞，确保长期抗原暴露。长期刺激后第7天，将CAR T细胞收集并且与A549-NLR(E:T细胞比率1:1)或H1975-NLR(E:T 1:5)共孵育。靶细胞的溶解通过追踪相对于测定设置的时间0小时来归一化的总NLR强度来评估。收集24小时上清液以便通过MSD来进行IFN-γ、IL-2和TNF-α的定量。
如图4A示出，与对照抗ROR1 CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)相比，甚至在重复抗原刺激之后，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞也能够有效地溶解ROR1+肿瘤细胞。类似地，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞也至少产生增加水平的IFN-γ(图4B)。这些结果证明c-Jun的过表达可有助于CAR T细胞在长期抗原刺激存在下保持效应功能。
实施例5：分析长期刺激的过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞中的耗竭相关转录概况
为了进一步理解c-Jun过表达对于T细胞耗竭的作用，对于来自7天长期刺激时间点的CAR+T细胞(n＝3个供体，在图5A中描述)执行整体RNA测序并且鉴别在对照抗ROR1 CART细胞(例如，不过表达c-Jun)与过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞之间差异性表达的基因。使用来自文献(Beltra JC,等人,Immunity.2020；52(5):825-841.e8；Zhang L,等人,Nature.2018；564(7735):268-272)的T细胞耗竭模型的基因集，对于差异表达基因的基因集富集分析(GSEA)显示，在过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞中下调的基因对于在(Texterm_UP[来自Beltra 2020的基因集]和Tex_multiTumors[来自Zhang 2018的基因集])中上调的基因集而言为显著富集的。相反地，在过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞中上调的基因对于含有T细胞增殖基因的基因集(TexProg2_UP[来自Beltra 2020的基因集])和在终末耗竭表型方面下调的基因集(Texterm_DOWN[来自Beltra 2020的基因集])而言为显著富集的(图5A)。总之，这些数据表明c-Jun对于减少耗竭基因表达印记和保持与T细胞增殖相关的基因的表达的效果。
为了更好地理解c-Jun的效果，还对2个供体中的第7天CAR+T细胞执行单细胞的转录体和表位的细胞索引(CITE)-seq(图5B-图5D)。基于转录(和蛋白)概况的细胞的聚类有助于鉴别其中细胞主要基于文献的耗竭标志物来富集的丛集3(图5B)。随着添加c-Jun，丛集3的频率在两个供体中降低，说明c-Jun对于耗竭的作用(图5D)。另外，对于更大分化/激活标志物(例如4-1BB，颗粒酶A[GZMA](图5C))来富集的丛集0和5(图5B)也随着添加c-Jun而在频率方面降低(图5D)。
实施例6：分析过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞对于表达低水平ROR1的NSCLC细胞系的反应性
为了评估是否c-Jun过表达对于抗ROR1 CAR T细胞识别抗原具有任何作用，将过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞和对照抗ROR1CAR T细胞(即，不过表达c-Jun)与被工程化成表达不同水平细胞表面ROR1的H1975细胞共孵育(图6)。具有不同强度的一组突变脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点元件用于控制人ROR1在广泛范围内的相对表达并且引入H1975-ROR1KO细胞系(Koh 2013.PLoS One,8(12):e82100.doi:10.1371)中。按照细胞系的ROR1的表达水平表示为几何MFI(图6)。将细胞在148小时的过程中共孵育，并且在各个时间点，计数NLR阳性细胞的总数并且相对于时间点0小时的计数来归一化，以便计算归一化靶标杀灭。初始抗原刺激后24小时，收集上清液并且IL-2和IFN-γ的量也使用Meso ScaleDiscovery(MSD)U-Plex来定量。
如图7示出，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞和对照抗ROR1CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)以类似比率来溶解H1975细胞，不论ROR1抗原密度为何。在将IL-2和IFN-γ水平定量时，观察到类似结果(图8A和8B)。这些结果表明c-Jun过表达基本上不改变抗ROR1CAR T细胞发挥效应功能所需要的抗原密度临限值。
实施例7：分析过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的体内抗肿瘤功效
为了评估是否c-Jun的过表达也可改良体内CAR T细胞的各种功能性质，在异种移植物动物模型中测试过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的抗肿瘤活性。简单地说，将肿瘤细胞(即，ROR1阳性H1975NSCLC细胞系)皮下植入NOD scidγ；NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠的侧腹。当肿瘤达到约100mm3时，向小鼠静脉内输注以下中的一者：(i)未转导的模拟T细胞，(ii)对照抗ROR1 CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)，或(iii)过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞。抗肿瘤活性通过使用卡尺测量肿瘤体积来评定并且治疗相关毒性通过测量动物体重来评定。另外，T细胞的扩增使用T细胞输注之后24小时开始每周收集的末梢血液的流式细胞术来评定，总计6周。
如图9A和9C示出，用对照抗ROR1 CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)来治疗的动物似乎最初控制肿瘤生长但是最终死于肿瘤，其中仅约40％动物生存到实验结束。相比之下，用过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞(例如，过表达c-Jun)来治疗的动物显示显著更大的肿瘤控制并且在实验的整个持续时间内生存。与改良的抗肿瘤数据一致，与对照抗ROR1 CART细胞(例如，不过表达c-Jun)相比，过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞(例如，过表达c-Jun)也表现出大得多的持久性和扩增(图10)。这些结果证实先前体外数据并且证明与更传统的抗ROR1 CAR T细胞(例如，不过表达c-Jun)相比，本文所述的过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞表现出改良得多的抗肿瘤效应。
实施例8：临床开发
进行一项FIH、阶段1、单臂、开放标签、剂量递增和扩展、多中心研究，被设计用来评估过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞在患有ROR1阳性复发和/或难治性TNBC和NSCLC的患者中的安全性、PK和抗肿瘤活性。阶段1研究的主要目标是评估过表达c-Jun的抗ROR1 CART细胞在患有复发/难治性TNBC和NSCLC的患者中的安全性和耐受性，并且测定过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的RP2D。阶段1研究的次要目标是评估过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的抗肿瘤活性和评估过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞在末梢血液样品中的PK(例如，扩增和持久性)。
建议阶段1设计
这是一项单臂、开放标签、剂量递增和扩展、多中心研究，被设计用来评估过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞在患有复发和/或难治性TNBC和NSCLC的患者中的安全性、PK和抗肿瘤活性。在剂量递增阶段期间，仅招入患有TNBC的参与者；在扩展阶段期间，招入TNBC和NSCLC研究群组两者。
除了其它合格性标准以外，患有包括检查点抑制剂和亚伯杉烷(abraxane)的2种疗法失败的TNBC，或患有包括EGFR+和ALK+疾病靶向疗法的2种疗法失败的NSCLC的免疫组织化学ROR1阳性的参与者适合于招入。满足所有合格性标准的参与者将入组并且经历白细胞分离以便实现产物产生。成功制造产物之后，参与者进入治疗阶段并且接受1个治疗循环。治疗循环包括使用氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)进行淋巴耗竭化学疗法3天，随后以方案规定剂量水平中的一者来IV施用单一剂量的细胞产物。在淋巴耗竭化学疗法完成之后几天施用细胞产物，除非在与医学监查员讨论之后，临床或后勤形势需要将该时间更改至较晚日期。
在施用细胞产物之后，针对安全性、疾病状态、额外抗癌疗法和生存，跟踪参加者长达2年。要求接受过表达c-Jun的抗ROR1 CAR T细胞的所有参与者在此研究完成或中止时参加所发起的长期随访(LTFU)研究。
序列表
<110> 莱尔免疫制药公司
<120> 靶向ROR1的嵌合抗原受体
<130> 4385.042PC04
<150> US 63/153,878
<151> 2021-02-25
<150> US 63/263,229
<151> 2021-10-28
<150> US 63/309,393
<151> 2022-02-11
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 野生型人c-Jun蛋白
<400> 1
Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys
20 25 30
Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser
35 40 45
Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro
50 55 60
Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile
65 70 75 80
Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln
85 90 95
Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu
100 105 110
Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro
115 120 125
Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala
130 135 140
Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe
165 170 175
Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala
180 185 190
Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro
195 200 205
His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala
210 215 220
Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro
225 230 235 240
Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu
245 250 255
Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg
260 265 270
Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys
275 280 285
Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys
305 310 315 320
Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe
325 330
<210> 2
<211> 3257
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 野生型人c-Jun基因
<400> 2
gctcagagtt gcactgagtg tggctgaagc agcgaggcgg gagtggaggt gcgcggagtc 60
aggcagacag acagacacag ccagccagcc aggtcggcag tatagtccga actgcaaatc 120
ttattttctt ttcaccttct ctctaactgc ccagagctag cgcctgtggc tcccgggctg 180
gtgtttcggg agtgtccaga gagcctggtc tccagccgcc cccgggagga gagccctgct 240
gcccaggcgc tgttgacagc ggcggaaagc agcggtaccc acgcgcccgc cgggggaagt 300
cggcgagcgg ctgcagcagc aaagaacttt cccggctggg aggaccggag acaagtggca 360
gagtcccgga gccaactttt gcaagccttt cctgcgtctt aggcttctcc acggcggtaa 420
agaccagaag gcggcggaga gccacgcaag agaagaagga cgtgcgctca gcttcgctcg 480
caccggttgt tgaacttggg cgagcgcgag ccgcggctgc cgggcgcccc ctccccctag 540
cagcggagga ggggacaagt cgtcggagtc cgggcggcca agacccgccg ccggccggcc 600
actgcagggt ccgcactgat ccgctccgcg gggagagccg ctgctctggg aagtgagttc 660
gcctgcggac tccgaggaac cgctgcgcac gaagagcgct cagtgagtga ccgcgacttt 720
tcaaagccgg gtagcgcgcg cgagtcgaca agtaagagtg cgggaggcat cttaattaac 780
cctgcgctcc ctggagcgag ctggtgagga gggcgcagcg gggacgacag ccagcgggtg 840
cgtgcgctct tagagaaact ttccctgtca aaggctccgg ggggcgcggg tgtcccccgc 900
ttgccacagc cctgttgcgg ccccgaaact tgtgcgcgca gcccaaacta acctcacgtg 960
aagtgacgga ctgttctatg actgcaaaga tggaaacgac cttctatgac gatgccctca 1020
acgcctcgtt cctcccgtcc gagagcggac cttatggcta cagtaacccc aagatcctga 1080
aacagagcat gaccctgaac ctggccgacc cagtggggag cctgaagccg cacctccgcg 1140
ccaagaactc ggacctcctc acctcgcccg acgtggggct gctcaagctg gcgtcgcccg 1200
agctggagcg cctgataatc cagtccagca acgggcacat caccaccacg ccgaccccca 1260
cccagttcct gtgccccaag aacgtgacag atgagcagga gggcttcgcc gagggcttcg 1320
tgcgcgccct ggccgaactg cacagccaga acacgctgcc cagcgtcacg tcggcggcgc 1380
agccggtcaa cggggcaggc atggtggctc ccgcggtagc ctcggtggca gggggcagcg 1440
gcagcggcgg cttcagcgcc agcctgcaca gcgagccgcc ggtctacgca aacctcagca 1500
acttcaaccc aggcgcgctg agcagcggcg gcggggcgcc ctcctacggc gcggccggcc 1560
tggcctttcc cgcgcaaccc cagcagcagc agcagccgcc gcaccacctg ccccagcaga 1620
tgcccgtgca gcacccgcgg ctgcaggccc tgaaggagga gcctcagaca gtgcccgaga 1680
tgcccggcga gacaccgccc ctgtccccca tcgacatgga gtcccaggag cggatcaagg 1740
cggagaggaa gcgcatgagg aaccgcatcg ctgcctccaa gtgccgaaaa aggaagctgg 1800
agagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg 1860
cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaacc 1920
acgttaacag tgggtgccaa ctcatgctaa cgcagcagtt gcaaacattt tgaagagaga 1980
ccgtcggggg ctgaggggca acgaagaaaa aaaataacac agagagacag acttgagaac 2040
ttgacaagtt gcgacggaga gaaaaaagaa gtgtccgaga actaaagcca agggtatcca 2100
agttggactg ggttgcgtcc tgacggcgcc cccagtgtgc acgagtggga aggacttggc 2160
gcgccctccc ttggcgtgga gccagggagc ggccgcctgc gggctgcccc gctttgcgga 2220
cgggctgtcc ccgcgcgaac ggaacgttgg acttttcgtt aacattgacc aagaactgca 2280
tggacctaac attcgatctc attcagtatt aaagggggga gggggagggg gttacaaact 2340
gcaatagaga ctgtagattg cttctgtagt actccttaag aacacaaagc ggggggaggg 2400
ttggggaggg gcggcaggag ggaggtttgt gagagcgagg ctgagcctac agatgaactc 2460
tttctggcct gccttcgtta actgtgtatg tacatatata tattttttaa tttgatgaaa 2520
gctgattact gtcaataaac agcttcatgc ctttgtaagt tatttcttgt ttgtttgttt 2580
gggtatcctg cccagtgttg tttgtaaata agagatttgg agcactctga gtttaccatt 2640
tgtaataaag tatataattt ttttatgttt tgtttctgaa aattccagaa aggatattta 2700
agaaaataca ataaactatt ggaaagtact cccctaacct cttttctgca tcatctgtag 2760
atactagcta tctaggtgga gttgaaagag ttaagaatgt cgattaaaat cactctcagt 2820
gcttcttact attaagcagt aaaaactgtt ctctattaga ctttagaaat aaatgtacct 2880
gatgtacctg atgctatggt caggttatac tcctcctccc ccagctatct atatggaatt 2940
gcttaccaaa ggatagtgcg atgtttcagg aggctggagg aaggggggtt gcagtggaga 3000
gggacagccc actgagaagt caaacatttc aaagtttgga ttgtatcaag tggcatgtgc 3060
tgtgaccatt tataatgtta gtagaaattt tacaataggt gcttattctc aaagcaggaa 3120
ttggtggcag attttacaaa agatgtatcc ttccaatttg gaatcttctc tttgacaatt 3180
cctagataaa aagatggcct ttgcttatga atatttataa cagcattctt gtcacaataa 3240
atgtattcaa ataccaa 3257
<210> 3
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 表皮生长因子受体蛋白opt (EGFRopt)
<400> 3
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg
325 330 335
Arg Arg
<210> 4
<400> 4
000
<210> 5
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot: P01876, IGHA1_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定α1
<400> 5
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr
1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr
<210> 6
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01877, IGHA2_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定α2
<400> 6
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr
1 5 10 15
Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro
100 105 110
Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser
115 120 125
Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly
130 135 140
Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly
145 150 155 160
Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu
165 170 175
Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr
180 185 190
Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys
195 200 205
Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser
210 215 220
Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg
225 230 235 240
Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro
260 265 270
Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala
275 280 285
Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His
290 295 300
Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp
325 330 335
Gly Thr Cys Tyr
340
<210> 7
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01665, GCAM_MOUSE, 免疫球蛋白γ2A链C区域
<400> 7
Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp
1 5 10 15
Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
50 55 60
Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr
65 70 75 80
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
85 90 95
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
145 150 155 160
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
165 170 175
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
180 185 190
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
195 200 205
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
210 215 220
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
245 250 255
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
260 265 270
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
290 295 300
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
305 310 315 320
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Leu Asp Leu Asp Asp Val Cys Ala
325 330 335
Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile
340 345 350
Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ser Val Thr
355 360 365
Leu Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Glu Leu Lys Gln
370 375 380
Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
385 390 395
<210> 8
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01857, IGHG1_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定γ1
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 9
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01859, IGHG2_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定γ2
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 10
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01860, IGHG3_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定γ3
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 11
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01861, IGHG4, 免疫球蛋白重链恒定γ4
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 12
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01880, IGHD_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定δ
<400> 12
Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg
1 5 10 15
His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly
20 25 30
Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser
35 40 45
Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr
50 55 60
Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu
85 90 95
Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro
100 105 110
Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala
115 120 125
Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys
130 135 140
Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu
145 150 155 160
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala
165 170 175
Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val
180 185 190
Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly
195 200 205
Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser
210 215 220
Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu
225 230 235 240
Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro
260 265 270
Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala
275 280 285
Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile
290 295 300
Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe
305 310 315 320
Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala
325 330 335
Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr
340 345 350
Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala
355 360 365
Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys
370 375 380
<210> 13
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01854, IGHE_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定ε
<400> 13
Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys
1 5 10 15
Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr
20 25 30
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly
50 55 60
His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys
65 70 75 80
Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp
85 90 95
Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro
100 105 110
Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro
115 120 125
Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr
130 135 140
Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser
165 170 175
Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr
180 185 190
Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
195 200 205
Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro
210 215 220
Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu
225 230 235 240
Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser
245 250 255
Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys
260 265 270
Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr
275 280 285
Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro
290 295 300
His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro
305 310 315 320
Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly
325 330 335
Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro
340 345 350
Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp
355 360 365
Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe
370 375 380
Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys
385 390 395 400
Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln
405 410 415
Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
420 425
<210> 14
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Uniprot P01871, IGHM_HUMAN, 免疫球蛋白重链恒定μ
<400> 14
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln
180 185 190
Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val
210 215 220
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
245 250 255
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala
405 410 415
His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr
435 440 445
Ala Gly Thr Cys Tyr
450
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 间隔子1
<400> 15
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 16
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 人Ig κ信号肽
<400> 17
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> GM-CSF信号肽
<400> 18
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> EGFR信号肽
<400> 19
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala
20
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 人CD33信号肽
<400> 20
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 21
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中Gly可以1至100的整数重复。
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 其中序列可以1至100的整数重复。
<400> 21
Gly Ser
1
<210> 22
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)..(1)
<223> 其中Ser可以1至100的整数重复。
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中Gly可以1至4的整数重复。
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 其中序列可以1至50的整数重复。
<400> 22
Gly Ser
1
<210> 23
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中Gly可在1至100之间重复。
<400> 23
Gly
1
<210> 24
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 其中Gly Ala可在1与100之间重复。
<400> 24
Gly Ala
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 25
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 26
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 其中序列可以1与100之间的整数重复。
<400> 27
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 其中序列可以1与100之间的整数重复。
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 其中序列可以1与100之间的整数重复。
<400> 29
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 其中序列可以1与100之间的整数重复。
<400> 30
Gly Gly Ser
1
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 31
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 32
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 33
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 34
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 35
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> P2A
<400> 37
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> T2A
<400> 38
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 39
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> F2A
<400> 39
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> E2A
<400> 40
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 弗林蛋白酶裂解位点
<400> 41
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 其中序列可以等于或大于1的正整数重复
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VH
<400> 44
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VH CDR1
<400> 45
Ala Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VH CDR2
<400> 46
Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn
1 5 10 15
Gly
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VH CDR3
<400> 47
Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile
1 5 10
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VL
<400> 48
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
100 105 110
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VL CDR1
<400> 49
Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VL CDR2
<400> 50
Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 VL CDR3
<400> 51
Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val
1 5
<210> 52
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> R12 scFv
<400> 52
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu
145 150 155 160
Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln
165 170 175
Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr
180 185 190
Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
195 200 205
Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
245
<210> 53
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 53
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 54
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 54
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> CD3ζ激活结构域
<400> 55
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 56
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> p2A
<400> 56
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 57
<211> 1198
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> c-jun-抗ROR1 CAR
<400> 57
Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys
20 25 30
Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser
35 40 45
Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro
50 55 60
Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile
65 70 75 80
Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln
85 90 95
Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu
100 105 110
Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro
115 120 125
Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala
130 135 140
Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe
165 170 175
Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala
180 185 190
Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro
195 200 205
His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala
210 215 220
Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro
225 230 235 240
Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu
245 250 255
Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg
260 265 270
Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys
275 280 285
Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys
305 310 315 320
Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe Gly Ser Gly Ala Thr
325 330 335
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
340 345 350
Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile
355 360 365
Ser Gly Ala Tyr Gly Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu
370 375 380
Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe
385 390 395 400
Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
405 410 415
Gly Leu Glu Trp Ile Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr
420 425 430
Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala
435 440 445
Gln Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg
450 455 460
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu
465 470 475 480
Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly
485 490 495
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val
500 505 510
Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys
515 520 525
Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp
530 535 540
Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln
545 550 555 560
Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
565 570 575
Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln
580 585 590
Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly
595 600 605
Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly Gly Gly Gly
610 615 620
Ser Gly Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Met Phe Trp Val Leu
625 630 635 640
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
645 650 655
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
660 665 670
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
675 680 685
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
690 695 700
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
705 710 715 720
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
725 730 735
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
740 745 750
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
755 760 765
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
770 775 780
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
785 790 795 800
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
805 810 815
Arg Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
820 825 830
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu
835 840 845
Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys
850 855 860
Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala
865 870 875 880
Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu
885 890 895
His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro
900 905 910
Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile
915 920 925
Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu
930 935 940
His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His
945 950 955 960
Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly
965 970 975
Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly
980 985 990
Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe
995 1000 1005
Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
1025 1030 1035
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys
1040 1045 1050
Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
1055 1060 1065
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile
1070 1075 1080
Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys
1085 1090 1095
Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile
1100 1105 1110
Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly
1115 1120 1125
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
1130 1135 1140
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
1145 1150 1155
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
1160 1165 1170
Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala
1175 1180 1185
Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg
1190 1195
<210> 58
<211> 4022
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> DNA构建体
<400> 58
tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca gagagacagc 60
agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 120
aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 180
cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga 240
gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga 300
actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata 360
aaagagccca caacccctca ctcggcgcga tcagaacctc ttacgagtcg gctagcgccg 420
ccaccatgac agccaagatg gaaaccacat tctacgacga cgccctgaac gcctcattcc 480
tgccttctga gagcggacct tacggctaca gcaatcctaa gatcctgaaa cagagcatga 540
cccttaacct ggctgatcct gttggaagcc tgaaacctca cctgagagcc aaaaacagcg 600
acctgctcac cagccctgat gtgggcctgc tgaagctggc ctctccagag ctggaacggc 660
tgatcatcca gagcagcaac ggccacatca caaccacccc tacccctaca caattcctgt 720
gccctaagaa cgtgaccgac gagcaggagg gcttcgccga aggctttgtg cgggccctgg 780
cagaactgca ctctcagaac accctgccta gcgtgacctc cgccgcccag cctgtcaacg 840
gcgccggaat ggtggcccct gccgtggctt ctgtggccgg cggcagcggc agcggcggat 900
tcagcgcctc tctgcactct gagcctcctg tctacgccaa tctgtctaat ttcaaccccg 960
gagccctgtc cagcggcggc ggagctccta gctacggcgc tgctggactg gccttccccg 1020
cccagcccca gcaacagcag cagcctccac accacctgcc ccagcagatg cccgtgcagc 1080
accctagact gcaggccctg aaggaagaac cccaaacagt gcctgagatg cctggcgaga 1140
cacctccact gagccccatc gacatggaaa gccaggagcg gatcaaggcc gagagaaaga 1200
gaatgcggaa cagaatcgcc gctagcaagt gcagaaagcg gaagctggaa agaatcgcca 1260
gactggaaga gaaggtgaag accctgaaag cccaaaatag cgagctggcc agcaccgcca 1320
acatgctgcg ggaacaggtg gcccagctga agcagaaggt gatgaaccac gtgaactctg 1380
gttgtcagct gatgctgacc cagcagctcc agaccttcgg ctccggtgca acgaacttca 1440
gcctgctgaa gcaggccgga gatgttgagg aaaatccagg tcccatggtc ttgcagactc 1500
aagtatttat atcccttttg ctctggatct ctggagctta cggccaggaa cagctcgtcg 1560
aaagcggcgg cagactggtg acacctggcg gcagcctgac cctgagctgc aaggccagcg 1620
gcttcgactt cagcgcctac tacatgagct gggtccgcca ggcccctggc aagggactgg 1680
aatggatcgc caccatctac cccagcagcg gcaagaccta ctacgccacc tgggtgaacg 1740
gacggttcac catctccagc gacaacgccc agaacaccgt ggacctgcag atgaacagcc 1800
tgacagccgc cgaccgggcc acctactttt gcgctcggga cagctacgcc gacgacggcg 1860
ccctgttcaa catctggggc cctggcaccc tggtgacaat ctctagcggc ggaggcggat 1920
ctggtggcgg aggaagtggc ggcggaggat ctgagctggt gctgacccag agcccctctg 1980
tgtctgctgc cctgggaagc cctgccaaga tcacctgtac cctgagcagc gcccacaaga 2040
ccgacaccat cgactggtat cagcagctgc agggcgaggc ccccagatac ctgatgcagg 2100
tgcagagcga cggcagctac accaagaggc caggcgtgcc cgacaggttc agcggatcta 2160
gctctggcgc cgaccgctac ctgatcatcc ccagcgtgca ggccgatgac gaggccgatt 2220
actactgtgg cgccgactac atcggcggct acgtgttcgg cggaggcacc cagctgaccg 2280
tgaccggtgg cggaggttca ggcaaaccgt gccctccgtg caagtgtcct atgttctggg 2340
tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc gtggccttca 2400
tcatcttttg ggtgaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta 2460
tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag 2520
aagaaggagg atgtgaactg cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc 2580
agcagggcca gaatcagctg tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg 2640
tcctggataa gcggagaggc cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc 2700
cccaggaagg cctgtataac gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga 2760
tcggcatgaa gggcgagcgg aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt 2820
ccaccgccac caaggatacc tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaaggtccg 2880
gagccactaa cttctccctg ttgaaacaag caggggatgt cgaagagaat cccgggccaa 2940
tgcttctcct ggtgacaagc cttctgctct gtgaattacc acacccagca ttcctcctga 3000
tcccacgcaa agtgtgcaac ggaataggta ttggtgaatt taaggactca ctctccataa 3060
atgctacgaa tattaaacac ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc 3120
tgccggtggc atttaggggt gactccttca cacatactcc tcctctggac ccacaagaac 3180
tggatattct gaaaaccgta aaggaaatca cagggttttt gctgattcaa gcttggcctg 3240
aaaacaggac ggacctccat gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc 3300
agcatggaca gttttctctt gctgtcgtga gcctgaacat aacatccttg ggattacgct 3360
ccctcaagga gataagtgat ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg 3420
caaatacaat aaactggaaa aaactgtttg ggacctccgg ccagaaaacc aaaattataa 3480
gcaacagagg cgaaaacagc tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc 3540
ccgagggctg ctggggcccg gagcccaggg attgcgtgtc ttgccggaat gtcagccgag 3600
gcagggaatg cgtggacaag tgcaaccttc tggaaggcga gccaagggag tttgtggaga 3660
actctgagtg catacagtgc cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca 3720
caggacgggg accagacaac tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg 3780
tcaagacctg cccggcagga gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag 3840
acgccggcca tgtgtgccac ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag 3900
gtcttgaagg ctgtccaacg aacgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg 3960
gggccctcct cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg cgccgaaggt 4020
ga 4022
<210> 59
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> P2A裂解之后的c-Jun
<400> 59
Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys
20 25 30
Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser
35 40 45
Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro
50 55 60
Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile
65 70 75 80
Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln
85 90 95
Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu
100 105 110
Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro
115 120 125
Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala
130 135 140
Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe
165 170 175
Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala
180 185 190
Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro
195 200 205
His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala
210 215 220
Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro
225 230 235 240
Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu
245 250 255
Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg
260 265 270
Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys
275 280 285
Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys
305 310 315 320
Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe Gly Ser Gly Ala Thr
325 330 335
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
340 345 350
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> P2A裂解之后的hIgK
<400> 60
Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile
1 5 10 15
Ser Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 61
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> P2A裂解之后的CD3z
<400> 61
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
115 120 125
Glu Asn Pro Gly Pro
130
<210> 62
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> P2A裂解之后的GMCSFR-α-SP
<400> 62
Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His
1 5 10 15
Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 63
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接子
<400> 63
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 64
<211> 386
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> MND启动子
<400> 64
tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca gagagacagc 60
agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 120
aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 180
cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga 240
gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga 300
actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata 360
aaagagccca caacccctca ctcggc 386

Claims (147)

1.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含c-Jun多肽(c-jun)、ROR1结合蛋白和截短EGF受体(EGFRt)的嵌合多肽。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述c-Jun多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中当所述嵌合多肽在所述细胞中表达时，所述c-Jun多肽能够防止或减少细胞的耗竭。
4.如权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述ROR1结合蛋白包含特异性结合到ROR1的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述CAR包含特异性结合到ROR1的抗体或其抗原结合部分。
6.如权利要求4或5所述的多核苷酸，其中所述ROR1结合蛋白特异性结合到与R12抗体相同的表位。
7.如权利要求6所述的多核苷酸，其中所述ROR1结合蛋白包含有包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。
8.如权利要求7所述的多核苷酸，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO:45，VH CDR2包含SEQ ID NO:46，并且VH CDR3包含SEQ ID NO:47。
9.如权利要求7或8所述的多核苷酸，其中所述VL CDR1包含SEQ ID NO:49，VL CDR2包含SEQ ID NO:50，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:51。
10.如权利要求6或7所述的多核苷酸，其中所述ROR1结合部分的VH包含SEQ ID NO:44并且所述ROR1结合部分的VL包含SEQ ID NO:48。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述ROR1结合部分包含与SEQ ID NO:52具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
12.如权利要求4至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR还包含跨膜(TM)结构域。
13.如权利要求12所述的多核苷酸，其中所述TM结构域衍生自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152，或它们的任何组合。
14.如权利要求12所述的多核苷酸，其中所述TM结构域衍生自CD28。
15.如权利要求14所述的多核苷酸，其中所述TM结构域包含与SEQ ID NO:54具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求12至15中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR还包含所述特异性结合到ROR1的抗体或其抗原结合部分与所述TM结构域之间的间隔子。
17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述间隔子衍生自免疫球蛋白铰链区或CD8。
18.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述间隔子包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列。
19.如权利要求16至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述间隔子还包含连接子。
20.如权利要求19所述的多核苷酸，其中所述连接子包含GGGSG(SEQ ID NO:16)。
21.如权利要求4至20中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR还包含细胞内信号转导结构域。
22.如权利要求21所述的多核苷酸，其中所述细胞内信号转导结构域包含CD3ζ激活结构域、CD3δ激活结构域、CD3ε激活结构域、CD3η激活结构域、CD79A激活结构域、DAP 12激活结构域、FCER1G激活结构域、DAP10/CD28激活结构域、ZAP70激活结构域，或它们的任何组合。
23.如权利要求21所述的多核苷酸，其中所述细胞内信号转导结构域包含CD3ζ激活结构域。
24.如权利要求23所述的多核苷酸，其中所述CD3ζ激活结构域包含与SEQ ID NO:55具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。
25.如权利要求4至23中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR包含细胞内共刺激信号转导区域。
26.如权利要求25所述的多核苷酸，其中所述细胞内共刺激信号转导结构域包含以下各者的共刺激结构域：白细胞介素-2受体(IL-2R)、白细胞介素-12受体(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck结合缺失CD28(ICA)、OX40、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受体γ链、Fc受体ε链、与CD83特异性结合的配体，或它们的任何组合。
27.如权利要求25所述的多核苷酸，其中所述细胞内信号转导结构域包含4-1BB共刺激结构域。
28.如权利要求27所述的多核苷酸，其中所述4-1BB共刺激结构域包含与SEQ ID NO:53具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。
29.一种包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含(i)ROR1结合蛋白、(ii)包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列的间隔子、(iii)CD28跨膜蛋白、(iv)4-1BB共刺激区域和(v)CD3ζ激活结构域。
30.一种包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含(i)包含有包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)的ROR1结合蛋白；(ii)包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列的间隔子；和(iii)编码截短EGF受体(EGFRt)的核苷酸序列。
31.如权利要求30所述的多核苷酸，其中所述ROR1结合部分的VH包含SEQ ID NO:44并且所述ROR1结合部分的VL包含SEQ ID NO:48。
32.如权利要求30或31所述的多核苷酸，其中所述EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
33.如权利要求29至32中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码c-Jun多肽的核苷酸序列。
34.如权利要求1至28和33中任一项所述的多核苷酸，其中编码c-jun多肽的核苷酸序列和编码所述CAR的核苷酸序列在同一载体上。
35.如权利要求34所述的多核苷酸，其中所述c-jun多肽和所述CAR通过连接子来连接。
36.如权利要求35所述的多核苷酸，其中所述连接子是可裂解连接子。
37.如权利要求35所述的多核苷酸，其中所述连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。
38.如权利要求1至28和33中任一项所述的多核苷酸，其中编码c-jun多肽的核苷酸序列和编码所述CAR的核苷酸序列在不同载体上。
39.如权利要求1至28和33至38中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码截短EGF受体(EGFRt)的核苷酸序列。
40.如权利要求39所述的多核苷酸，其中编码截短EGF受体(EGFRt)的核苷酸序列和编码所述CAR的核苷酸序列在同一载体上。
41.如权利要求40所述的多核苷酸，其中所述EGFRt和所述CAR通过连接子来连接。
42.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述连接子是可裂解连接子。
43.如权利要求42所述的多核苷酸，其中所述连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。
44.如权利要求1至43中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR还包含信号肽。
45.如权利要求44所述的多核苷酸，其中所述信号肽衍生自hIgK。
46.如权利要求45所述的多核苷酸，其中所述hIgK信号肽包含如SEQ ID NO:17阐述的氨基酸序列。
47.如权利要求1-46中任一项所述的多核苷酸，其中所述EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
48.如权利要求1至47中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸还包含骨髓增生性肉瘤病毒增强子、负控制区域缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子、EF1a启动子和/或泛素启动子。
49.如权利要求48所述的多核苷酸，其中所述MND启动子包含与SEQ ID NO:64具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
50.如权利要求1至49中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:58具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
51.一种编码CAR的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:57具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
52.一种载体，所述载体包含如权利要求1至51中任一项所述的多核苷酸。
53.一种通过如权利要求1至51中任一项所述的多核苷酸或如权利要求52所述的载体来编码的多肽。
54.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述多肽包含(i)ROR1结合抗体或其抗原结合部分、(ii)包含如SEQ ID NO:15中所阐述的氨基酸序列的间隔子、(iii)CD28跨膜蛋白、(iv)4-1BB共刺激区域和(v)CD3ζ激活结构域。
55.如权利要求54所述的多肽，其中所述ROR1结合抗体或其抗原结合部分特异性结合到与R12抗体相同的表位。
56.如权利要求55所述的多肽，其中所述ROR1结合抗体或其抗原结合部分包含有包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含R12抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。
57.如权利要求56所述的多肽，其中所述VH CDR1包含SEQ ID NO:45，VH CDR2包含SEQID NO:46，并且VH CDR3包含SEQ ID NO:47。
58.如权利要求56或57所述的多肽，其中所述VL CDR1包含SEQ ID NO:49，VL CDR2包含SEQ ID NO:50，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:51。
59.如权利要求57或58所述的多肽，其中所述ROR1结合抗体或其抗原结合部分的所述VH包含SEQ ID NO:44并且所述ROR1结合部分的所述VL包含SEQ ID NO:48。
60.如权利要求53至59所述的多肽，其中所述ROR1结合抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:52具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
61.如权利要求53至60中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含跨膜(TM)结构域。
62.如权利要求61所述的多肽，其中所述CD28 TM结构域包含与SEQ ID NO:54具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
63.如权利要求53至62中任一项所述的多肽，其中所述CD3ζ激活结构域包含与SEQ IDNO:55具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。
64.如权利要求53至63中任一项所述的多肽，其中所述4-1BB共刺激结构域包含与SEQID NO:53具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。
65.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽包含c-Jun多肽(c-jun)、CAR多肽和截短EGF受体(EGFRt)。
66.如权利要求65所述的嵌合多肽，其中所述CAR多肽包括权利要求53至64中的任一项。
67.如权利要求65或66所述的嵌合多肽，其中所述c-Jun多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
68.如权利要求65至67中任一项所述的嵌合多肽，其中当所述嵌合多肽在所述细胞中表达时，所述c-Jun多肽能够防止或减少细胞的耗竭。
69.如权利要求65至68中任一项所述的嵌合多肽，其中所述c-jun多肽和所述CAR多肽在同一载体上。
70.如权利要求69所述的嵌合多肽，其中所述c-jun多肽和所述CAR多肽通过连接子来连接。
71.如权利要求70所述的嵌合多肽，其中所述连接子是可裂解连接子。
72.如权利要求71所述的嵌合多肽，其中所述连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。
73.如权利要求65至67中任一项所述的嵌合多肽，其中所述c-jun多肽和所述CAR多肽在不同载体上。
74.如权利要求65至73所述的嵌合多肽，其中所述截短EGF受体(EGFRt)和所述CAR在同一载体上。
75.如权利要求74所述的嵌合多肽，其中所述EGFRt和所述CAR通过连接子来连接。
76.如权利要求75所述的嵌合多肽，其中所述连接子是可裂解连接子。
77.如权利要求76所述的嵌合多肽，其中所述连接子包含P2A连接子、T2A连接子，或它们的任何组合。
78.如权利要求65至77中任一项所述的嵌合多肽，其中所述EGFRt包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
79.如权利要求65至78中任一项所述的嵌合多肽，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
80.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
81.如权利要求65至80中任一项所述的嵌合多肽，其中所述CAR多肽还包含信号肽。
82.如权利要求81所述的嵌合多肽，其中所述信号肽衍生自hIgK。
83.如权利要求82所述的嵌合多肽，其中所述hIgK信号肽包含如SEQ ID NO:17阐述的氨基酸序列。
84.一种经修饰的细胞，所述经修饰的细胞包含如权利要求1至51中任一项所述的多核苷酸、如权利要求52所述的载体、如权利要求53至64中任一项所述的多肽、如权利要求65至83中任一项所述的嵌合多肽，或它们的任何组合。
85.一种经修饰的细胞，所述经修饰的细胞包含c-jun多肽、嵌合抗原受体(CAR)多肽和截短EGF受体(EGFRt)。
86.如权利要求85所述的经修饰的细胞，其中所述CAR多肽包含如权利要求53至64中任一项所述的多肽。
87.如权利要求85或86所述的经修饰的细胞，其中所述CAR多肽和所述EGFRt在细胞表面上表达。
88.如权利要求84至87中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
89.如权利要求88所述的经修饰的细胞，其中所述细胞是T细胞、B细胞、调控T细胞(Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、干细胞、诱导性多能干细胞，和它们的任何组合。
90.如权利要求83至89中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞在体外或离体工程化。
91.如权利要求83至90中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞在体外或离体培养。
92.如权利要求84至91中任一项所述的经修饰的细胞，其中与未被修饰成包含如权利要求1至51中任一项所述的多核苷酸、如权利要求52所述的载体、如权利要求53至64中任一项所述的多肽，或如权利要求65至83中任一项所述的嵌合多肽的对应细胞相比，所述c-Jun多肽的表达增加。
93.如权利要求92所述的经修饰的细胞，其中与所述对应细胞相比，所述c-Jun多肽的表达增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍，或更大。
94.一种包含c-Jun多肽、嵌合抗原受体(CAR)多肽和截短EGF受体(EGFRt)的免疫细胞的群体，其中如与不包含所述c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，所述群体包含减少数目的TIGIT阳性免疫细胞。
95.如权利要求94所述的免疫细胞的群体，其中与所述参照群体相比，在所述抗原刺激之后存在于所述群体中的TIGIT阳性免疫细胞的数目减少了至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％或至少约60％。
96.如权利要求94或95所述的免疫细胞的群体，所述免疫细胞的群体在所述抗原刺激之后，包含少于约15％、少于约14％、少于约13％、少于约12％、少于约11％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％或少于约5％的TIGIT阳性免疫细胞。
97.一种包含c-Jun多肽、嵌合抗原受体(CAR)多肽和截短EGF受体(EGFRt)的免疫细胞的群体，其中如与不包含所述c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，所述群体包含减少数目的TNFRSF9阳性免疫细胞。
98.如权利要求97所述的免疫细胞的群体，其中与所述参照群体相比，在所述抗原刺激之后存在于所述群体中的TNFRSF9阳性免疫细胞的数目减少了至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％或至少约70％。
99.如权利要求97或98所述的免疫细胞的群体，所述免疫细胞的群体在所述抗原刺激之后，包含少于约5％、少于约4.5％、少于约4％、少于约3.5％或少于约2％的TNFRSF9阳性免疫细胞。
100.一种包含c-Jun多肽、嵌合抗原受体(CAR)多肽和截短EGF受体(EGFRt)的免疫细胞的群体，其中如与不包含所述c-Jun多肽的对应细胞的参照群体相比，在抗原刺激之后，所述群体包含减少数目的GZMA阳性免疫细胞。
101.如权利要求100所述的免疫细胞的群体，其中与所述参照群体相比，在所述抗原刺激之后存在于所述群体中的GZMA阳性免疫细胞的数目减少了至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％或至少约20％。
102.如权利要求100或101所述的免疫细胞的群体，所述免疫细胞的群体在所述抗原刺激之后，包含少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％或少于约10％的GZMA阳性免疫细胞。
103.如权利要求94至102中任一项所述的免疫细胞的群体，其中所述CAR多肽包括如权利要求54至64中任一项所述的CAR多肽。
104.如权利要求94至103中任一项所述的免疫细胞的群体，其中所述c-Jun多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
105.如权利要求94至104中任一项所述的免疫细胞的群体，其中所述EGFRt包含与SEQID NO:3具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
106.如权利要求94至105中任一项所述的免疫细胞的群体，其中所述免疫细胞包含T细胞、B细胞、调控T细胞(Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、干细胞、诱导性多能干细胞，或它们的组合。
107.如权利要求106所述的免疫细胞的群体，其中所述免疫细胞是T细胞。
108.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至51中任一项所述的多核苷酸、如权利要求52所述的载体、如权利要求53至64中任一项所述的多肽、如权利要求65至83中任一项所述的嵌合多肽或如权利要求84至93中任一项所述的经修饰的细胞和药学上可接受的运载体。
109.一种制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括将细胞用如权利要求1至51中任一项所述的多核苷酸或如权利要求52所述的载体来转染。
110.一种制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括在细胞中表达如权利要求53至64中任一项所述的多肽或如权利要求65至83中任一项所述的嵌合多肽。
111.如权利要求109或110所述的方法，其中所述细胞包括T细胞、B细胞、调控T细胞(Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、干细胞、诱导性多能干细胞，和它们的任何组合。
112.如权利要求109至111中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外或离体培养。
113.一种扩增表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括在合适条件下培养细胞，所述细胞包含如权利要求1至51中任一项所述的多核苷酸或如权利要求52所述的载体，或表达如权利要求53至64中任一项所述的多肽或如权利要求65至83中任一项所述的嵌合多肽。
114.一种治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫细胞，所述免疫细胞过表达c-Jun多肽并且包含嵌合抗原受体(CAR)和截短EGF受体(EGFRt)，其中所述CAR对于在所述肿瘤上表达的抗原具有特异性。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述免疫细胞包含如权利要求84至93中任一项所述的经修饰的细胞。
116.如权利要求114或115所述的方法，其中所述肿瘤衍生自癌症，包括乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结直肠癌、***癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃癌、胃肠癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，或它们的组合。
117.如权利要求114至116中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
118.如权利要求114至117中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种额外治疗剂。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述至少一种额外治疗剂包括化疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子激活剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法，或它们的任何组合。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体，或它们的任何组合。
121.如权利要求114至120中任一项所述的方法，其中与参照肿瘤大小相比，在所述施用之后，所述肿瘤的大小(肿瘤大小)减小。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述参照肿瘤大小包括：(i)所述施用之前的肿瘤大小，(ii)未接受所述施用(例如，接受不过表达所述c-Jun多肽的对应免疫细胞的施用)的对应受试者中的肿瘤大小，或(iii)同时(i)和(ii)。
123.如权利要求121或122所述的方法，其中与所述参照肿瘤大小相比，所述肿瘤大小减小了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
124.如权利要求114至123中任一项所述的方法，其中与参照生存持续时间相比，在所述施用之后，所述受试者的生存持续时间增加。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述参照生存持续时间包含未接受所述施用(例如，接受不过表达所述c-Jun多肽的对应免疫细胞的施用)的对应受试者的生存持续时间。
126.如权利要求124或125所述的方法，其中与所述参照生存持续时间相比，所述生存持续时间增加了至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约一年。
127.如权利要求114至126中任一项所述的方法，其中与不过表达所述c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，在所述施用之后，所述免疫细胞能够在所述受试者中持续更长时间。
128.如权利要求127所述的方法，其中在所述施用之后，所述免疫细胞能够在受试者中持续比所述对应免疫细胞长至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。
129.如权利要求127或128所述的方法，其中在所述施用之后约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月或约八个月，如与存在于接受所述对应免疫细胞的施用的参照受试者中的所述对应免疫细胞相比，存在于所述受试者中的所述免疫细胞为约1倍与约10倍之间。
130.一种杀灭肿瘤细胞的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与免疫细胞接触，所述免疫细胞过表达c-Jun多肽并且包含嵌合抗原受体(CAR)和截短EGF受体(EGFRt)，其中所述CAR对于在所述肿瘤细胞上表达的抗原具有特异性。
131.如权利要求129所述的方法，其中所述免疫细胞包含如权利要求84至93中任一项所述的经修饰的细胞。
132.如权利要求129或130所述的方法，其中与所述肿瘤细胞与不过表达所述c-Jun多肽的对应免疫细胞接触的参照方法相比，所述肿瘤细胞的杀灭增加。
133.如权利要求131所述的方法，其中与所述参考细胞相比，所述肿瘤细胞的杀灭增加了至少约0.5倍、1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
134.一种增加响应于抗原刺激的免疫细胞的细胞因子产生的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-Jun多肽，其中所述ROR-1结合蛋白特异性结合到与所述R12抗体相同的表位。
135.如权利要求133所述的方法，其中所述细胞因子包括IFN-γ、IL-2，或两者。
136.如权利要求134或135所述的方法，其中与所述对应免疫细胞相比，在所述修饰之后，响应于所述抗原刺激的所述细胞因子的产生增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
137.如权利要求134至136中任一项所述的方法，其中所述细胞因子的产生的增加使用Meso Scale Discovery(MSD)U-Plex测定来测量。
138.一种增加响应于抗原刺激的免疫细胞增殖的方法，所述方法包括修饰所述免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-Jun多肽，其中所述ROR-1结合蛋白特异性结合到与所述R12抗体相同的表位。
139.如权利要求137所述的方法，其中与所述对应免疫细胞相比，在所述修饰之后，响应于抗原刺激的所述免疫细胞的增殖增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
140.如权利要求137或138所述的方法，其中增殖增加引起更大数目的所述免疫细胞。
141.一种增加响应于持续抗原刺激的免疫细胞的效应功能的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-Jun多肽，其中所述ROR-1结合蛋白特异性结合到与所述R12抗体相同的表位。
142.如权利要求140所述的方法，其中如与所述对应免疫细胞相比，所述免疫细胞保持效应功能达至少一轮、至少两轮或至少额外三轮的抗原刺激测定。
143.如权利要求140或141所述的方法，其中所述效应功能包括以下能力：(i)杀灭肿瘤细胞，(ii)在进一步抗原刺激后产生细胞因子，或(iii)同时(i)和(ii)。
144.如权利要求140至142中任一项所述的方法，其中如与所述对应免疫细胞相比，所述免疫细胞的效应功能增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
145.一种减少或防止响应于持续抗原刺激的免疫细胞的耗竭的方法，所述方法包括修饰免疫细胞以(i)表达ROR-1结合蛋白并且(ii)如与未被修饰成具有增加水平的c-Jun多肽的对应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-Jun多肽，其中所述ROR-1结合蛋白特异性结合到与所述R12抗体相同的表位。
146.如权利要求144所述的方法，其中如与所述对应免疫细胞相比，在所述修饰之后，响应于所述持续抗原刺激，所述免疫细胞表达：(i)降低水平的与耗竭相关的基因，(ii)增加水平的与激活相关的基因，或(iii)同时(i)和(ii)。
147.如权利要求133至145中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞被修饰成包含如权利要求6至51中任一项所述的多核苷酸。
CN202280016400.4A 2021-02-25 2022-02-24 靶向ror1的嵌合抗原受体 Pending CN117412985A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63/153,878 2021-02-25
US63/263,229 2021-10-28
US202263309393P 2022-02-11 2022-02-11
US63/309,393 2022-02-11
PCT/US2022/017738 WO2022182891A1 (en) 2021-02-25 2022-02-24 Ror1 targeting chimeric antigen receptor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117412985A true CN117412985A (zh) 2024-01-16

Family

ID=89493037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280016400.4A Pending CN117412985A (zh) 2021-02-25 2022-02-24 靶向ror1的嵌合抗原受体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117412985A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11866725B2 (en) Optimized lentiviral transfer vectors and uses thereof
AU2023201162A1 (en) Compositions and methods for immunooncology
JP6538716B2 (ja) Ｍｎｄプロモーターのキメラ抗原受容体
JP2019535275A (ja) ＴＧＦβシグナルコンバーター
US11851659B2 (en) Compositions and methods for immunooncology
WO2019237035A1 (en) Compositions and methods for immunooncology
AU2019396553A1 (en) Dimerizing agent regulated immunoreceptor complexes
CN113412276A (zh) 二聚化剂调节的免疫受体复合物
JP2023539591A (ja) Ｂｃｍａキメラ抗原受容体
KR20230005147A (ko) 변형된 ccr 폴리펩티드 및 이의 용도
CN116096739A (zh) 嵌合抗原受体间隔物
CN117412985A (zh) 靶向ror1的嵌合抗原受体
TW202246504A (zh) 靶向嵌合抗原受體之ｒｏｒ１
US20220307039A1 (en) Codon-optimized nucleotide sequences encoding an ap-1 transcription factor
CN117980326A (zh) 与来自抗体的结合结构域融合的经工程化的t细胞受体
CN117157407A (zh) 编码ap-1转录因子的密码子优化的核苷酸序列

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination