CN117405877B - 一种elisa试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。该方法通过以下步骤:首先采用点包被模式,将包被液注入酶标板中,每孔注入包被液100±2μl;将包被好的酶标板进行温育;然后进行洗板封闭;二次温育、干燥:将封闭后的包被板在室温下进行温育,温育结束后,弃掉板中封闭液,干燥后即可。本发明提供的包被方法,提高了ELISA试剂盒的稳定性,包被效果好,能够节省原料(抗原),同时,检测区间线性系数R值更优,重复性好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。
背景技术
包被物质与板底表面的有效结合是ELISA中至关重要的一步。包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被,对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上,再通过特异性反应使抗原固相化)。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物,由于分子量太小,往往难于直接吸附在酶标板上,一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联,偶联物吸附于固相载体上。
蛋白质在固体表面吸附是现有的最简单的固定抗体的方法,但是,该方法中,抗原由于不是特异性固定,样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与酶标板结合,从而使得检测背景较高,且降低了检测的灵敏度。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明提供了一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为:
本发明提供了一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法,包括以下步骤:
(1)包被温育:采用点包被模式,将包被液注入酶标板中,每孔注入包被液100±2μl; 将包被好的酶标板进行温育;
(2)洗板封闭:洗板2次,每孔加封闭液110±2 uL;
(3)二次温育、干燥:将封闭后的包被板在室温下进行温育,温育结束后,弃掉板中封闭液,干燥后即可。
进一步的,步骤(1)中,所述包被液为浓度为1μg/ml的重组链酶亲和素(R-SA)溶液;所述溶液为包被缓冲液;所述包被缓冲液为10mM、pH7.4的PBS缓冲液。
进一步的,步骤(1)的具体过程为:将包被液注入到酶标板板孔内,在24±2℃下,温育4h;温育结束后,用洗涤液进行洗板2次,洗板后加入生物素化抗原,在24±2℃下,温育反应18-24h。
本发明提供的包被方法中,每1000mL封闭液的组成为:Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白 10g、改性贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g。
上述改性贻贝粘蛋白的制备方法为:将贻贝粘蛋白加入超纯水进行稀释,得贻贝粘蛋白混悬液,然后向混悬液中首先加入D-氨基半乳糖,升温至38-45℃,搅拌2h,然后逐滴加入单宁酸溶液,继续保温反应1h,反应结束后,恢复至室温,除去多余的D-氨基半乳糖和单宁酸,干燥即可。
进一步的,所述贻贝粘蛋白混悬液的浓度为1.5-2%;所述贻贝粘蛋白和D-氨基半乳糖的质量比为1:4;所述贻贝粘蛋白和单宁酸的质量比为1:1.5。
进一步的,所述单宁酸溶液的质量浓度为15%。
进一步的,步骤(3)中,所述室温下温育的时间为2-3h。
本发明所使用的洗涤液为pH7.4的PBS缓冲液。
本发明的有益效果为:本发明提供的包被方法,提高了ELISA试剂盒的稳定性,包被效果好,能够节省原料(抗原),同时,检测区间线性系数R值更优,重复性好。
附图说明
图1为标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
(1)包被温育:将重组链酶亲和素(R-SA)采用10mM的PBS缓冲液(pH7.4)稀释成浓度为1μg/ml,得包被液重组链酶亲和素(R-SA)溶液;采用点包被模式,将包被液注入酶标板中,每孔注入包被液100±2μl; 将包被好的酶标板进行在24±2℃下,温育4h;温育结束后,用洗涤液进行洗板2次,洗板后加入生物素化抗原,在24±2℃下,温育反应18-24h;
(2)洗板封闭:洗板2次,每孔加封闭液110±2 uL;
封闭液组成:Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白10g、改性贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶20mL、D-海藻糖 50g,补足超纯水至1000mL;
所述改性贻贝粘蛋白的制备方法为:将贻贝粘蛋白加入超纯水进行稀释,得质量浓度为1.5%的贻贝粘蛋白混悬液,然后向混悬液中首先加入4倍质量的D-氨基半乳糖,升温至38-45℃,搅拌2h,然后逐滴加入1.5倍的质量浓度为15%的单宁酸溶液,继续保温反应1h,反应结束后,恢复至室温,除去多余的D-氨基半乳糖和单宁酸,干燥即可
(3)二次温育、干燥:将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育,温育结束后,弃掉板中封闭液,干燥后即可。
对比例1
(1)包被温育:采用点包被模式,将10mM的PBS缓冲液(pH7.4)注入酶标板中,每孔注入PBS缓冲液100±2μl; 将处理的酶标板进行在24±2℃下,温育4h;温育结束后,用洗涤液进行洗板2次,洗板后加入生物素化抗原,在24±2℃下,温育反应18-24h;
(2)洗板封闭:洗板2次,每孔加封闭液(组成同实施例1)110±2 uL;
(3)二次温育、干燥:将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育,温育结束后,弃掉板中封闭液,干燥后即可。
对比例2
(1)包被温育:将重组链酶亲和素(R-SA)采用10mM的PBS缓冲液(pH7.4)稀释成浓度为1μg/ml,得包被液重组链酶亲和素(R-SA)溶液;采用点包被模式,将包被液注入酶标板中,每孔注入包被液100±2μl; 将包被好的酶标板进行在24±2℃下,温育4h;温育结束后,用洗涤液进行洗板2次,洗板后加入生物素化抗原,在24±2℃下,温育反应18-24h;
(2)洗板封闭:洗板2次,每孔加封闭液110±2 uL;
封闭液组成:Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白10g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g,补足超纯水至1000mL;
(3)二次温育、干燥:将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育,温育结束后,弃掉板中封闭液,干燥后即可。
对比例3
(1)包被温育:将重组链酶亲和素(R-SA)采用10mM的PBS缓冲液(pH7.4)稀释成浓度为1μg/ml,得包被液重组链酶亲和素(R-SA)溶液;采用点包被模式,将包被液注入酶标板中,每孔注入包被液100±2μl; 将包被好的酶标板进行在24±2℃下,温育4h;温育结束后,用洗涤液进行洗板2次,洗板后加入生物素化抗原,在24±2℃下,温育反应18-24h;
(2)洗板封闭:洗板2次,每孔加封闭液110±2 uL;
封闭液组成:Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白10g、贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g,补足超纯水至1000mL;
(3)二次温育、干燥:将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育,温育结束后,弃掉板中封闭液,干燥后即可。
效果实施例
(一)以狂犬抗体为例,将标准品的抗体效价值与对应的吸光值做曲线,导出线性回归方程:y=0.0210964+0.1230x;将待测样品吸光值代入方程,计算得到样品的抗体效价值。
具体结果见表1,标准曲线如图1所示。
表1
(二)以狂犬抗体为例,分别采用实施例1及对比例1-3提供的包被方法进行包被后,测试标准品(10IU/mL, 20IU/mL)及质控血浆(QC11.6IU/mL),进行准确度验证,具体检测结果参见表2。
表2
(三)以狂犬抗体为例(狂犬抗体国标10IU/mL),将实施例1及对比例2-3提供的包被方法处理酶标板后,对其稳定性进行相关检测,室温(25℃)下进行,具体结果见表3所示。
表3
Claims (2)
1.一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)包被温育:采用点包被模式,将包被液注入酶标板中,每孔注入包被液100±2 μL;将包被好的酶标板进行温育;
(2)洗板封闭:洗板2次,每孔加封闭液110±2 μL;
(3)二次温育、干燥:将封闭后的包被板在室温下进行温育,温育结束后,弃掉板中封闭液,干燥后即可;
步骤(1)的具体过程为:将包被液注入到酶标板板孔内,在24±2 ℃下,温育4h;温育结束后,用洗涤液进行洗板2次,洗板后加入生物素化抗原,在24±2 ℃下,温育反应18-24h;
步骤(2)中,每1000mL封闭液的组成为:Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白 10g、改性贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g;
所述改性贻贝粘蛋白的制备方法为:将贻贝粘蛋白加入超纯水进行稀释,得贻贝粘蛋白混悬液,然后向混悬液中首先加入D-氨基半乳糖,升温至38-45 ℃,搅拌2h,然后逐滴加入单宁酸溶液,继续保温反应1h,反应结束后,恢复至室温,除去多余的D-氨基半乳糖和单宁酸,干燥即可;
所述贻贝粘蛋白混悬液的浓度为1.5-2%;所述贻贝粘蛋白和D-氨基半乳糖的质量比为1:4;所述贻贝粘蛋白和单宁酸的质量比为1:1.5;
所述单宁酸溶液的质量浓度为15%;
步骤(3)中,所述室温下温育的时间为2-3h。
2.根据权利要求1所述的包被方法,其特征在于,步骤(1)中,所述包被液为浓度为1 μg/mL的重组链酶亲和素溶液;所述溶液为包被缓冲液;所述包被缓冲液为10 mM、pH7.4的PBS缓冲液。
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