CN117402614B - 一种碳点基纳米酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于先进材料技术领域，涉及发光及抗菌材料，具体涉及一种碳点基纳米酶及其制备方法与应用。将有机酸亚铁盐与含氮盐酸盐按照质量比为1:0.05～3混合均匀，加热至160～240℃进行固相反应1～10h，即得；其中，所述含氮盐酸盐的化学结构式为RCH2CH2NH2 .HCl，R为‑NH2、‑OH或‑SH；所述有机酸亚铁盐为甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁。本发明提供的碳点基纳米酶催化活性好、荧光强、稳定性好、抗菌能力强，其制备方法快速简单，反应物廉价易得。
Description
技术领域
本发明属于先进材料技术领域，涉及发光及抗菌材料，具体涉及一种碳点基纳米酶及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
碳点是一种小于10nm的超小尺寸的0维纳米材料，由于其优异的亲水性、稳定性、光学性能、低毒性能，良好的生物相容性，且表面容易功能化，是最具有前景的新一代碳纳米材料。然而，由于碳点结构内部电子传递效率较差，导致其催化效率有限，现有技术中制备出的碳点不具有明显的抗菌活性。纳米酶是通过模拟天然酶的催化位点或掺杂酶促反应必需元素而获得的具有类酶活性的纳米颗粒。纳米酶具有催化活性高，稳定性好、成本低、易于修饰等优点，在抗菌方面备受关注，但由于纳米酶没有优异的光学性能，限制了其进一步应用。因此，将碳点和纳米酶两者的性能结合，为开发具有优异催化性能的纳米酶提供了更多可能性。据发明人研究了解，目前将碳点和纳米酶结合的技术为，将钼酸铵与抗坏血酸通过水热法，200℃加热12h，所得的碳点基纳米酶虽有类酶活性，但该产物不仅量子产率低，蓝色荧光弱，且制备方法反应时间长，制备条件复杂，再者，该产物难以应用于抗菌方面。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种碳点基纳米酶及其制备方法与应用，本发明提供的碳点基纳米酶催化活性好、荧光强、稳定性好、抗菌能力强，其制备方法快速简单，反应物廉价易得。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种碳点基纳米酶的制备方法，将有机酸亚铁盐与含氮盐酸盐按照质量比为1:0.05～3混合均匀，加热至160～240℃进行固相反应1～10h，即得；
其中，所述含氮盐酸盐的化学结构式为RCH2CH2NH2 .HCl，R为-NH2、-OH或-SH；所述有机酸亚铁盐为甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁。
本发明中采用甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁等有机酸亚铁盐作为反应原料，首先，能够使得制成的碳点中掺杂亚铁离子，亚铁离子作为活性位点为碳点带来纳米酶活性，其次，与其他亚铁有机物(如乙酸亚铁)相比，制备条件不苛刻，廉价易得。另外，与葡萄糖酸亚铁相比，化合物结构相对简单，制成的碳点基纳米酶能够更好的使亚铁离子裸露，从而保证纳米酶活性。
经过研究发现，在采用甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁等有机酸亚铁盐作为反应原料的前提下，制成具有荧光的碳点比较困难，在前期研究中，本发明采用乙二醇、盐酸胍等与甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁等有机酸亚铁盐进行反应制备的碳点基纳米酶也不具有荧光，经过进一步实验意外地发现，当甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁等有机酸亚铁盐与含氮盐酸盐在160～240℃的条件下固相反应1～10h，可以获得具有强荧光的碳点基纳米酶，不仅存在荧光性能而且存在类酶活性，并且具有较强的抗菌能力。
另一方面，一种碳点基纳米酶，由上述制备方法获得。
第三方面，一种上述碳点基纳米酶在细胞成像中的应用。
第四方面，一种上述碳点基纳米酶在杀菌中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明利用甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁等有机酸亚铁盐和化学结构式为RCH2CH2RNH2 .HCl的含氮盐酸盐进行固相合成能够获得性能更高的碳点基纳米酶，其制备过程迅速，无溶剂消耗，能耗低，污染小，解决了水热法制备碳点基纳米酶材料存在的反应时间长、制备条件复杂等问题。采用固相碳点基纳米酶的合成方法，操作简便、成本低、实用性强、无需任何溶剂的参与，摆脱了对反应溶剂的依赖，适于大量生产和工业推广。
(3)本发明在RCH2CH2NH2 .HCl的含氮盐酸盐的选择范围内，通过不同种类含氮盐酸盐的选择，能够获得荧光强的碳点基纳米酶材料，从而能够应用于荧光成像。
(2)本发明在RCH2CH2NH2 .HCl的含氮盐酸盐的选择范围内，通过不同种类含氮盐酸盐的选择，能够获得不同催化活性的碳点基纳米酶材料，从而能够应用于抗菌应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶的透射电镜图；
图2为本发明实施例2制备的碳点基纳米酶的X射线粉末衍射图；
图3为本发明实施例1制备的碳电极纳米酶的红外光谱图；
图4为本发明实施例3制备的碳点基纳米酶的紫外-可见吸收光谱；
图5为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶的荧光激发/发射光谱；
图6为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶的催化TMB的紫外-可见吸收光谱；
图7为本发明实施例2制备的碳点基纳米酶的催化TMB的紫外-可见吸收光谱；
图8为本发明实施例3制备的碳点基纳米酶的催化TMB的紫外-可见吸收光谱；
图9为本发明实施例2制备的碳点基纳米酶的电子自旋共振共振谱；
图10为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶孵育后邻苯二胺溶液的紫外-可见吸收光谱；
图11为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶在不同处理下，细胞荧光成像图。
图12为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶在不同处理下，细菌菌落的琼脂平板数码照片。
图13为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶、对比例1和对比例2制备的碳点的荧光激发-发射光谱。
图14为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶、对比例3制备的碳点和对比例4制备的产物催化TMB的紫外-可见吸收光谱。
图15为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶催化TMB的紫外-可见吸收光谱。
图16为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶荧光激发-发射光谱。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，钼酸铵与抗坏血酸采用水热法制备的碳点基纳米酶存在反应时间长，制备条件复杂，所得产物不仅量子产率低且难以应用于抗菌领域等问题。本发明提出了一种碳点基纳米酶及其制备方法与应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种碳点基纳米酶的制备方法，将有机酸亚铁盐与含氮盐酸盐按照质量比为1:0.05～3混合均匀，加热至160～240℃进行固相反应1～10h，即得；
其中，所述含氮盐酸盐的化学结构式为RCH2CH2NH2 .HCl，R为-NH2、-OH或-SH；所述有机酸亚铁盐为甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁。
本发明采用的固相反应是在未添加溶剂的条件下，直接采用烘箱等加热器对固相的原料进行处理反应的过程。采用固相的反应，本发明能够减少反应溶剂的使用。
在一些实施例中，有机酸亚铁盐和乙二胺盐酸盐的质量比为1:0.1～2。研究表明，当含氮盐酸盐为乙二胺盐酸盐时，该条件下制成的碳点基纳米酶的效果更好。
在一些实施例中，有机酸亚铁盐和乙醇胺盐酸盐的质量比为1:0.3～2。研究表明，当含氮盐酸盐为乙醇胺盐酸盐时，该条件下制成的碳点基纳米酶的效果更好。
在一些实施例中，有机酸亚铁盐和半胱胺盐酸盐的质量比为1:0.5～3。研究表明，当含氮盐酸盐为半胱胺盐酸盐时，该条件下制成的碳点基纳米酶的效果更好。
在一些实施例中，将有机酸亚铁盐与含氮盐酸盐混合的方式为研磨。通过研磨能够将两种不同原料粉体进行混合，达到均匀一致的状态，提高固相反应的效率。
本发明的另一种实施方式，提供了一种碳点基纳米酶，由上述制备方法获得。
在一些实施例中，所述碳点基纳米酶为球形结构，尺寸为2～5nm。
在一些实施例中，激发波长为420～450nm，发射波长为490～520nm。激发波长优选为430～445nm。发射波长优选为500～510nm。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述碳点基纳米酶在细胞成像中的应用。
具体地，将所述碳点基纳米酶作为染色剂对细胞进行培养。
本发明的第四种实施方式，提供了一种上述碳点基纳米酶在杀菌中的应用。
具体地，所述杀菌包括但不限于饮用水处理过程中的杀菌。
具体地，在杀菌过程中添加过氧化氢。研究表明，本发明提供的碳点基纳米酶本身可以杀菌，在加入过氧化氢之后，由于碳点基纳米酶的催化作用，产生的活性氧使得杀菌效果增强。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
称取1.0g甘氨酸亚铁和1.5g乙二胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，180℃、4h可制得兼具荧光性能和类酶活性的碳点基纳米酶，记为CDNEs1。
实施例2
称取1.0g甘氨酸亚铁和0.8g乙醇胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，200℃、2h可制得兼具荧光性能和类酶活性的碳点基纳米酶，记为CDNEs2。
实施例3
称取1.0g甘氨酸亚铁和2.0g半胱胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，240℃、8h可制得兼具荧光性能和类酶活性的碳点基纳米酶，记为CDNEs3。
实施例4
先用PBS冲洗六孔板中细胞2次，然后在37℃下，用碳点基纳米酶孵育六孔板中细胞30min，后移去碳点基纳米酶，再用PBS冲洗3次，将六孔板放于荧光显微镜下，利用荧光显微镜，在激光下捕获碳点基纳米酶在细胞内的荧光图像。
实施例5
以实施例1获得材料进行抗菌应用。首先将在固体培养基上培养的细菌单菌落转接到装有5mL液体培养基的摇瓶中，放入恒温摇床中进行培养(37℃，200rpm)，培养12～24h后，将菌液拿出稀释到一定浓度，用于后续实验。通过平板计数法来测定碳点基纳米酶对细菌的杀伤效果。实验在HAc/NaAc缓冲液中完成。将培养好的细菌用水分散，并逐次稀释；将碳点基纳米酶溶于水中，配成5mg/mL；将30％的H2O2原液稀释成5mM。抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌实验各分为4组：(1)细菌，(2)细菌+H2O2，(3)细菌+CDNEs，(4)细菌+H2O2+CDNEs。将混合体系放入恒温摇床中(37℃)孵育30min。30min后，按照稀释涂布平板法，吸取100μL混合体系接种到琼脂平板上，涂匀后放入恒温培养箱中(37℃)，倒转平板以防污染。18h后对培养皿拍照，并记录各个琼脂平板上细菌生长情况，最后通过计数菌落数量获得相对细菌活力。
如图1所示为实施例1制备的碳点基纳米酶材料的透射电镜图，该图显示碳点基纳米酶呈现球形结构；球形颗粒平均直径在3nm左右，高分辨率透射电镜结果显示，碳点基纳米酶的晶格间距为0.34nm，这与石墨碳的(002)衍射面相匹配。
如图2所示为实施例2制备的碳点基纳米酶材料的X射线粉末衍射图，在25°左右存在包峰，说明亚铁离子均匀分散在碳点上。
如图3所示为实施例1制备的碳点基纳米酶材料的红外光谱图，该图表明亚铁离子的成功掺杂。
如图4所示为实施例3制备的碳点基纳米酶材料的紫外-可见吸收光谱，在250nm处的吸收可归属于π-π*跃迁，在370nm峰是反射n-π*跃迁引起的。
如图5所示为实施例1制备的碳点基纳米酶材料的荧光激发-发射光谱，最佳激发波长为434nm，发射峰在510nm，呈现绿色荧光。
如图6～8所示为实施例1～3制备的碳点基纳米酶材料的催化TMB的紫外-可见吸收光谱，说明三者都具有较好的酶催化活性。
如图9为实施例2制备的碳点基纳米酶的电子自旋共振共振谱，从图中可以看出存在三种自由基。
将碳点基纳米酶，碳点基纳米酶及邻苯二胺，碳点基纳米酶及过氧化氢，碳点基纳米酶、邻苯二胺及过氧化氢分别放于缓冲中孵育几分钟后放于紫外-可见分光光度计中测量吸光度。如图10为实施例1制备的碳点基纳米酶孵育后邻苯二胺溶液的紫外-可见吸收光谱，从图中看出，只有碳点基纳米酶、邻苯二胺及过氧化氢组在450nm处有峰值，这是由于在碳点基纳米酶的催化下，产生的活性氧将无色的邻苯二胺氧化成黄色。
图11为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶在不同处理下，细胞荧光成像图。由图说明碳点基纳米酶可以很容易地扩散到细胞内，并在蓝光的激发下发射出绿色荧光。
图12为本发明实施例1制备的碳点基纳米酶在不同处理下，细菌的琼脂平板数码照片，从图中可以看出，碳点基纳米酶本身可以抗菌，但是在加入过氧化氢之后，由于碳点基纳米酶的催化作用，产生的活性氧使得抗菌效果增强。
对比例1
称取1.0g甘氨酸亚铁和1.0g乙二醇，充分搅拌混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，180℃、5h制得碳点，记为CDNEs4。
如图13所示，本对比例制备的碳点没有荧光性能。
对比例2
称取1.0g甘氨酸亚铁和1.0g盐酸胍，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，180℃、4h制得碳点，记为CDNEs5。
如图13所示，本对比例制备的碳点没有荧光性能。
对比例3
称取1.0g葡萄糖酸亚铁和1.5g乙二胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，180℃、4h制得碳点，记为CDNEs6。
虽然该反应可以制备成碳点，但是由于其结构复杂，亚铁离子不能很好的发挥作用，导致酶活性较低，如图14所示。
对比例4
称取1.0g乙酸亚铁和1.5g乙二胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，180℃、4h制得产物，记为CDNEs7。
虽然乙酸亚铁结构简单，但是其价格昂贵，且在180℃、4h条件下反应后，不仅没有荧光性能，而且催化活性较低，如图14所示。
实施例6
称取1.0g富马酸亚铁和2.0g乙二胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到25mL内胆中，置于烘箱中固相反应，240℃、4h可制得兼具荧光性能和类酶活性的碳点基纳米酶，记为CDNEs8。
图15表明实施例6制备的碳点基纳米酶具有较好的酶催化活性。
图16表明实施例6制备的碳点基纳米酶具有荧光性能，最佳激发波长为445nm，发射峰波长在500nm，呈现绿色荧光。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种碳点基纳米酶的制备方法，其特征是，将有机酸亚铁盐与含氮盐酸盐按照质量比为1:0.05~3混合均匀，加热至160~240 ℃进行固相反应1~10 h，即得；
其中，所述含氮盐酸盐的化学结构式为RCH2CH2NH2 .HCl，R为-NH2、-OH或-SH；所述有机酸亚铁盐为甘氨酸亚铁和/或富马酸亚铁。
2.如权利要求1所述的碳点基纳米酶的制备方法，其特征是，有机酸亚铁盐和乙二胺盐酸盐的质量比为1:0.1~2；
或，有机酸亚铁盐和乙醇胺盐酸盐的质量比为1:0.3~2；
或，有机酸亚铁盐和半胱胺盐酸盐的质量比为1:0.5~3。
3.如权利要求1所述的碳点基纳米酶的制备方法，其特征是，将有机酸亚铁盐与含氮盐酸盐混合的方式为研磨。
4.一种碳点基纳米酶，其特征是，由权利要求1~3任一所述的制备方法获得。
5.如权利要求4所述的碳点基纳米酶，其特征是，所述碳点基纳米酶为球形结构，尺寸为2~5 nm。
6.如权利要求4所述的碳点基纳米酶，其特征是，激发波长为420~450 nm，发射波长为490~520 nm。
7.如权利要求6所述的碳点基纳米酶，其特征是，激发波长为430~445 nm。
8.如权利要求6所述的碳点基纳米酶，其特征是，发射波长为500~510 nm。
9.一种权利要求4~8任一所述的碳点基纳米酶在细胞成像中的应用。
10.如权利要求9所述的碳点基纳米酶在细胞成像中的应用，其特征是，将所述碳点基纳米酶作为染色剂对细胞进行培养。
11.一种权利要求4~8任一所述的碳点基纳米酶在杀菌中的应用；所述杀菌为饮用水处理过程中的杀菌。
12.如权利要求11所述的碳点基纳米酶在杀菌中的应用，其特征是，在杀菌过程中添加过氧化氢。
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