CN117402381B - 一种单分散中空聚合物微球的制备方法及应用于蛋白固定载量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单分散中空聚合物微球的制备方法及应用于蛋白固定载量的方法。本发明方法包括如下步骤：步骤A1，采用分散聚合法合成单分散线性聚苯乙烯种子微球；步骤A2，采用溶胀法将含有引发剂、单体、致孔剂的乳液使上一步得到的线性聚苯乙烯种子微球胀大到指定粒径；步骤A3，将溶胀液滴在引发温度下聚合，经过清洗后得到聚苯乙烯/聚二乙烯基苯中空微球；步骤A4，将上一步得到的聚苯乙烯/聚二乙烯基苯中空微球在乙腈中回流沉淀聚合聚丙烯酸得到中空羧基微球。本发明将经过干燥处理后的微球内部原有致孔剂及溶剂换成空气后，疏水的聚合物壳层会阻挡外加水相重新再进入微球内部空腔，微球内部可以保持长久性的空腔。
Description
技术领域
本发明的目的在于提供一种单分散中空结构聚合物微球的制备方法。本发明的目的还在于提供了一种中空结构聚合物微球用以显著提高其蛋白固定载量的方法。
背景技术
聚合物中空微球，一般是指采用聚合物作为构筑材料且内部含有空腔的微米级小球。聚合物中空微球在催化、药物缓释、颜料、光子晶体等领域都具有广泛应用，因为其内部含有的空腔往往能够在光学、负载、比表面积等方面具有独特优势。蛋白固相载体，一般是指能够用来固定酶或者抗体等蛋白的固相载体。在免疫学应用中，蛋白固相载体常常用来固定某种抗体，来捕获特异性的抗原，以实现特异性抗原的分离及分析。蛋白固相载体分聚合物类、硅胶类，其中聚合物类蛋白固相载体最为常见，目前已在药物分离及体外诊断中应用广泛。
从比表面积原理来说，实心微球的物质利用效率并未达到最高。实心微球只有最表层提供固定蛋白的功能，而内部含有的除了磁性、荧光性物质之外的成分并不能对微球的功能性产生任何影响，并会对比表面积造成负面影响，实心微球的物质利用效率存在冗余。结合双组分微球的比表面积计算进行上述观点的进一步阐述，以粒径1.5μm、密度为1.05g/cm3的聚苯乙烯实心微球为例，将微球内部20vol.%体积折算成空气，则折合密度会有所下降、且比表面积有所提升。具体计算结果列表如下：
表1 计算结果
| 物理性质 | 1.5 μm 实心微球 | 1.5 μm 中空微球 |
| 空腔体积占比 | 0 vol.% | 20 vol.% |
| 微球折合密度 | 1.05 g/cm3 | 0.84 g/cm3 |
| 比表面积 | 3.62 m2/g | 4.52 m2/g |
可见将1.5μm实心聚苯乙烯微球换成内部体积占比20vol.%中空微球后比表面积上升至原来的124.9%，可见替换中空的做法有助于显著提升单位质量微球的表面功能性。
聚合物中空微球的合成方法包括模板法、乳液法及悬浮聚合法等，其中模板法与乳液法合成的中空微球可以做到均一粒径，然而悬浮聚合法难以做到均一粒径的中空形态。模板法是先合成核壳型的微球，利用核壳在某些溶剂中的溶解性差异或者高温耐受差异去掉核心的模板，可以得到只保留壳层的中空微球。乳液法及悬浮聚合法则是一步合成微球，随后对微球进行特殊溶剂清洗即可获得中空结构，但乳液法合成的微球粒径在纳米级别、悬浮聚合法合成的微球难以做到均一粒径。因此，亟需一种新颖、可控、产出率高的方法合成中空聚合物微球，以便满足各种高要求应用场景。
已有一些新颖的方法用来合成均一粒径聚合物中空微球。如专利CN1303140C中提到：以溶胶-凝胶法合成纳米级二氧化硅球后，表面修饰一层硅烷偶联剂，再以种子乳液聚合法包覆一层聚苯乙烯，经过氢氟酸刻蚀后即可得到均一粒径的聚苯乙烯中空微球。该方法需要使用危害性较大的氢氟酸作为刻蚀剂，操作上风险性较大。
如专利CN101250244B中提到：以乳液聚合法合成种子作为内核，种子乳液聚合法在种子表面包覆一层吸水性聚合物层，充分吸水后最外层再包覆一层非吸水性聚合物层，该三层结构经过加热喷雾干燥装置处理后中间层的水分去除，便可以得到中空聚合物微球。该方法对合成的参数控制较高，且最终产物粒径在10～100μm级别，粒径过大，限制了其应用范围。
《异相聚合物分散体：一种合成功能性中空聚合物微粒的绿色方法46-56》（Chemical Engineering Journal，348，2018，46～56）中提到：以分散聚合法合成聚苯乙烯微球后，将微球在乙醇溶液中热处理，可以使得聚苯乙烯微球发生轻微体积膨胀及内部出现空腔，该方法合成的中空微球因为缺乏交联度，在某些有机溶剂如四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺中微球结构会被破坏，因而限制了其表面修饰的方法及下游的应用场合。
《制备具有中空结构的微米级尺寸的单分散交联聚合物颗粒》（MacromolecularSymposia，101，1996，509～516）中提到：以分散聚合聚苯乙烯微球后，将单体、引发剂、制孔剂溶解在乙醇溶液中后与聚苯乙烯微球混合，以极缓慢的速率滴加水到体系中，能够使得聚苯乙烯微球溶胀较多单体并在升温聚合后可以得到中空结构的微球。该体系中使用的“动态溶胀法”最终分散液中固体含量较低，且对单体滴加的速率控制要求较高。其成本高、产量低及控制参数敏感限制了其在规模化合成中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种单分散中空聚合物微球的制备方法及应用于蛋白固定载量的方法，以解决或缓解现有技术中存在的技术问题，为上述技术问题至少提供一种有益的选择。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种单分散中空聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用分散聚合法合成单分散线性聚苯乙烯种子微球；
步骤二、将引发剂、单体和致孔剂加入含有表面活性剂的水溶液中进行乳化，乳化后的单体乳液加入到步骤一得到的线性聚苯乙烯种子微球，在室温下溶胀24～72h，直至微球溶胀到指定粒径；
步骤三、将步骤二得到的溶胀微球转移到预先加热至60～90℃的水浴锅中，加入稳定剂后，使稳定剂在水浴锅中进行聚合反应，持续反应4～24h，完成聚合反应后，使用离心机将中空微球与溶剂分离，同时去除未反应的单体和其他杂质，随后，使用乙醇和水进行多次清洗，去除残留的溶剂和杂质，得到中空微球；
步骤四、将步骤三得到的中空微球与乙腈混合，再加入引发剂和丙烯酸单体，升温到86～96℃回流聚合0.5～8h，经过离心分离，使用乙醇和水清洗数次，得到内部充斥溶剂的中空羧基聚合物微球；
步骤五、将步骤四将得到的内部充斥溶剂的中空羧基聚合物微球经过90～150℃热干燥1～6h，重新分散于水相后，即得到内部充斥空气的单分散中空聚合物微球。
步骤六、在上述步骤二中调节致孔剂的比例从0～80wt.%，即能调节空腔的大小从0～50vol.%。
作为本发明进一步的方案：稳定剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或者羟甲基纤维素多种高分子类非离子型表面活性剂；
所述引发剂包括但不限于偶氮二异丁腈或者过氧化苯甲酰；
所述单体包括但不限于二乙烯基苯或乙二醇二甲基丙烯酸酯；
所述致孔剂包括但不限于乙酸乙酯、乙酸丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、二甲苯、乙基苯、正己烷、正庚烷、正辛烷。
作为本发明再进一步的方案：所述中空微球的直径为1～5μm，且中空微球内部空腔的体积占比不大于50%。
其中，本发明提供了关于1.9μm空腔体积占比20%聚二乙烯基苯中空微球的制备步骤：
取聚乙烯吡咯烷酮K-30 5.0g，加入60mL无水乙醇、40mL纯化水溶解完全，转移到500mL三口瓶中，通氮气保护30min后加入去阻聚剂的苯乙烯10mL，缓慢升温到80℃后一次性加入偶氮二异丁腈0.2g，保温聚合24h。反应液降至室温后取出，以8000rpm进行6min离心分离，无水乙醇和纯化水分别洗3次，产物分散于40mL纯化水中，经过固含量测定后加水稀释将固含量调节到10wt.%，经过扫描电镜确认，测量其平均粒径为0.7μm，Cv=2.59%。取过氧化苯甲酰0.1g，溶解到含乙酸乙酯4g、二乙烯基苯4g中，溶解完全后油相全部加入到80g含0.25wt.%十二烷基硫酸钠的水溶液中，在冰水混合浴保护下超声乳化30min，乳化后的单体乳液加入上述含有2g粒径为0.7μm聚苯乙烯微球的种子乳液中，加入后在室温下缓慢搅拌24h。室温搅拌24h后加入含有4g聚乙烯吡咯烷酮的水溶液80mL，将反应瓶转移到水浴锅，升温到80℃聚合6h。反应液降至室温后取出，以6000rpm10min离心分离，无水乙醇和纯化水分别洗3次，最终将产物在120℃鼓风干燥2h，得到1.9μm聚二乙烯基苯中空微球。
优选地，在化学反应中，油相是指化学反应体系中的液体相态中的油状物质，油相通常是指具有较高的分子量和较低的极性的液体，其分子间力较大，导致其在反应体系中形成油滴或油层。
油相的形成通常与以下因素有关：
不溶性：油相通常是由于某些物质不溶于反应溶剂或媒介而形成，这些不溶性物质可能是有机化合物，如脂肪酸、脂肪醇等，也可能是某些无机物质。
极性差异：油相的形成还可能与反应体系中不同物质的极性差异有关，当反应溶剂或媒介较为极性，而待反应物质较为非极性时，待反应物质可能会形成油相。
温度和压力：反应温度和压力对油相的形成也有一定影响，在较高的温度下，某些原本是液体的物质可能会变得更加挥发，从而导致油相的形成。而在较高的压力下，一些原本不易溶解的物质可能会溶解于反应溶剂中形成油相。
需要注意的是，油相并不一定只指油状的有机物质，它可以涵盖任何在特定化学反应体系中以油滴或油层形式存在的液体相态；
优选地，中空微球折合密度的估计步骤：
取中空微球10mg，重分散于1mL纯化水后加入1mL透明可立样品管中，含中空微球的样品管置于室温下静置24h，分别于0/4/8/12/24h拍照，记录水与微球界面的位置及移动距离，对应移动距离除以测量时长即为该中空微球的沉降或上浮速率Vt，按照斯托克斯沉降公式，变换后按照下式可估算该中空微球的折合密度：
其中η为水的粘度，g为重力加速度，d为中空微球在光学显微镜下测量得到的实际直径，ρl代表悬浮液的密度，ρs代表微球的平均密度。
作为本发明再进一步的方案：在步骤二中，当聚苯乙烯种子微球溶胀后，观察到油滴的大小均匀，此外，聚苯乙烯种子的质量占据加入油相的质量的百分比范围在8%～80%wt.%之间，这一质量比是制备中空结构所必需的条件。
作为本发明再进一步的方案：在步骤A1中，分散聚合法制备的单分散线性聚苯乙烯种子微球，其分子量不得低于10KDa。
作为本发明再进一步的方案：步骤A2中致孔剂占加入油相总质量比在0～80wt.%。将致孔剂占比从0wt.%增大到80wt.%，可以将空腔体积占比从0vol.%增大到50vol.%，与之相应的微球功能性也有提升。
一种应用于蛋白的固定，采用上述单分散中空聚合物微球的制备方法所获得的中空结构聚合物微球，利用中空结构的比表面积来增加蛋白固定的有效接触面积。
本发明实施例由于采用以上技术方案，其具有以下优点：
本发明通过将经过干燥处理后的微球内部原有致孔剂及溶剂换成空气后，疏水的聚合物壳层会阻挡外加水相重新再进入微球内部空腔，微球内部可以保持长久性的空腔，本发明中空微球密度显著低于常规实心聚合物微球，因而比表面积大于常规实心微球，在大分子蛋白的固定方面具有载量提升的优势。
上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中空微球透射电镜成像图；
图2为本发明对比例1中空微球透射电镜成像图；
图3为本发明对比例2中空微球透射电镜成像图；
图4为本发明对比例3中空微球透射电镜成像图；
图5为本发明致孔剂占比与光学显微镜测量空腔体积占比的关系图；
图6为本发明致孔剂占比与羧基修饰量的关系图；
图7为本发明致孔剂占比与沉降或上浮速率的关系图；
图8为本发明致孔剂占比与链霉亲和素结合载量的关系图；
图9为本发明实施例5烘干前效果示意图，图中白色长方形为比例尺，光学显微镜照片中比例尺长度为5 μm；
图10为本发明实施例5烘干后效果示意图，图中白色长方形为比例尺，光学显微镜照片中比例尺长度为5 μm；
图11为本发明实施例6烘干前效果示意图，图中白色长方形为比例尺，光学显微镜照片中比例尺长度为5 μm；
图12为本发明实施例6烘干后效果示意图，图中白色长方形为比例尺，光学显微镜照片中比例尺长度为5 μm；
图13为本发明实施例7烘干前效果示意图，图中白色长方形为比例尺，光学显微镜照片中比例尺长度为5 μm；
图14为本发明实施例7烘干后效果示意图，图中白色长方形为比例尺，光学显微镜照片中比例尺长度为5 μm。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
需要注意的是，术语“第一”、“第二”、“对称”、“阵列”等仅用于区分描述与位置描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“对称”等特征的可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征；同样，对于未以“两个”、“三只”等文字形式对某些特征进行数量限制时，应注意到该特征同样属于明示或者隐含地包括一个或者更多个特征数量；
如图1-14所示，本发明一种单分散中空聚合物微球的制备方法及应用于蛋白固定载量的方法，包括如下步骤：
步骤A1，采用分散聚合法合成单分散线性聚苯乙烯种子微球。在乙醇/水混合溶剂中加入引发剂，苯乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，将体系升温到80℃并保持24h，能获得粒径均一的聚苯乙烯种子微球，其中，乙醇/水混合溶剂中乙醇体积占比不低于30%，乙醇的引入能够增加单体在连续相中的溶解度，并且降低微球与溶剂之间的表面张力，得到粒径更大的聚苯乙烯种子微球；
步骤A2，将引发剂、单体和致孔剂加入含有表面活性剂的水溶液中进行乳化，乳化后的单体乳液加入到上一步得到的线性聚苯乙烯种子微球，在室温下溶胀24h，微球长大到指定粒径。此外，聚苯乙烯种子的质量占据加入油相的质量的百分比范围在8%～80% wt.%之间，这一质量比是制备中空结构所必需的条件；增加致孔剂占比可以有效增加空腔占微球的体积比，也可以伴随着增加微球的比表面积、表面功能性，当致孔剂占比为0%时，微球为实心球结构、此时微球的表面功能性最低；
本领域人员可以理解的，溶胀后聚合的壳层必须含有较高的交联度，一般聚合物壳层交联度必须高于60%，高交联度下已经聚合成型的中空微球聚合物壳层不易发生形变，能够有效保留中空的结构，通过高交联度的壳层可以增加微球的强度，使微球更耐用，且由于强度变高，能使微球不易发生形变，能够有效保留中空的结构；
步骤A3，将上一步溶胀的微球转移到预先加热至80℃的水浴锅中，使其在水浴锅中进行聚合反应，持续反应6h，完成聚合反应后使用离心机将中空微球与溶剂分离，以去除未反应的单体和其他杂质，随后，使用乙醇和水进行多次清洗，以彻底去除残留的溶剂和杂质，即能得到中空微球，聚合的温度和时间能根据实际情况调整，需达到单体转化率>80%的程度。首先，通过将微球转移到水浴锅中，可以增加反应物分子的热运动能量，促进反应物之间的碰撞和反应速率，其次，多次清洗可以进一步去除残留的溶剂和杂质，确保得到纯净的中空微球；
步骤A4，将步骤A3得到的中空微球与乙腈中混合，加入引发剂和丙烯酸单体，升温到90℃回流聚合1h，经过离心分离，乙醇和水清洗数次，即能得到内部充斥溶剂，表面PAA修饰、羧基功能化的中空羧基微球。在该回流沉淀聚合步骤中，微球占溶液的体积比在0.2～2%，引发剂占单体的质量比在0.5～10%，单体占溶液的体积比在0.5%～10%；
步骤A5，将步骤A4得到的中空羧基聚合物微球经过热处理干燥，重新分散于水相后可以得到内部充斥空气的低密度中空微球。聚合后的中空羧基聚合物微球壳层与致孔剂接触而具有一定的渗透性，参与微球内-外溶剂的交换，显微镜下可以观察到内部充斥溶剂，当经过干燥处理后，微球内部原有致孔剂及溶剂换成空气后，疏水的聚合物壳层会阻挡外加水相重新再进入微球内部空腔，且可以在长时间下保持该低密度空腔结构。从热处理前分散在水里的中空羧基微球匀速下沉，而热处理干燥后重分散在水里的中空微球会匀速上浮的现象可以佐证这一形成内部空气腔道的形成，并且可以精确测定微球的上浮速率以及推测该微球的平均密度。热处理干燥后的中空羧基聚合物微球在观测2个月后，仍旧具有上浮的特性，说明内部空腔无法被溶剂进一步渗透；
步骤A6，在上述步骤A3中调节致孔剂与单体交联剂的比例，即可调节空腔的大小，其中，致孔剂占加入油相总质量比在0～80%。将致孔剂占比从0%增大到80%，可以将空腔体积占比从0%增大到50%，与之相应的微球功能性也有提升。通过调节致孔剂的加入比例与形成空腔的对应关系，可以确定内部空腔大小主要由致孔剂占比控制，经过清洗后的微球内部致孔剂被清除，因此得到不同内部空腔大小的中空微球；
稳定剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或者羟甲基纤维素多种高分子类非离子型表面活性剂；
本实施例的，引发剂包括但不限于偶氮二异丁腈或者过氧化苯甲酰；
本实施例的，单体包括但不限于二乙烯基苯或乙二醇二甲基丙烯酸酯；
本实施例的，致孔剂包括但不限于乙酸乙酯、乙酸丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、二甲苯、乙基苯、正己烷、正庚烷、正辛烷。
表2 实施例数据
从上述数据可以看出，随着致孔剂加入量的增加，中空聚合物微球的空腔体积更大，随之羧基修饰量也会增加，折合密度会显著下降，能够共价修饰蛋白的载量也随之提升，同时本方案的中空微球密度显著低于常规实心聚合物微球，因而比表面积大于常规实心微球，在大分子蛋白的固定方面具有载量提升的优势。
本发明提供了多个实例：
实施例1：1.9μm空腔体积占比20%聚二乙烯基苯中空微球的制备；
取聚乙烯吡咯烷酮K-30 5.0g，加入60mL无水乙醇、40mL纯化水溶解完全，转移到500mL三口瓶中，通氮气保护30min后加入去阻聚剂的苯乙烯10mL，缓慢升温到80℃后一次性加入偶氮二异丁腈0.2g，保温聚合24h。反应液降至室温后取出，以8000rpm进行6min离心分离，无水乙醇和纯化水分别洗3次，产物分散于40mL纯化水中，经过固含量测定后加水稀释将固含量调节到10wt.%，经过扫描电镜确认，测量其平均粒径为0.7μm，Cv=2.59%。取过氧化苯甲酰0.1g，溶解到含乙酸乙酯4g、二乙烯基苯4g中，溶解完全后油相全部加入到80g含0.25wt.%十二烷基硫酸钠的水溶液中，在冰水混合浴保护下超声乳化30min，乳化后的单体乳液加入上述含有2g粒径为0.7μm聚苯乙烯微球的种子乳液中，加入后在室温下缓慢搅拌24h。室温搅拌24h后加入含有4g聚乙烯吡咯烷酮的水溶液80mL，将反应瓶转移到水浴锅，升温到80℃聚合6h。反应液降至室温后取出，以6000rpm进行10min离心分离，无水乙醇和纯化水分别洗3次，最终将产物在120℃鼓风干燥2h，得到1.9μm聚二乙烯基苯中空微球。
实施例2：1.9μm聚二乙烯基苯中空微球表面聚丙烯酸功能化修饰；
取1g实施例1得到的1.9μm聚二乙烯基苯，重悬浮于100mL无水乙腈中，加入偶氮二异丁腈0.12g，丙烯酸1.5g。反应液在500mL三口瓶中混合并置于水浴锅中，装配好回流冷凝管后在反应瓶封闭的条件下升温到90℃聚合1h。加热结束后取出产物，以6000rpm进行10min离心分离，无水乙醇和纯化水分别洗3次，最终产物在120℃鼓风干燥2h，得到聚丙烯酸修饰的1.5μm聚二乙烯基苯中空微球。
实施例3：聚丙烯酸修饰的1.5μm聚二乙烯基苯中空微球的链霉亲和素固定；
取3.6mg实施例2中得到的聚丙烯酸修饰的1.5μm聚二乙烯基苯中空微球，重悬于0.12mL0.1M MES缓冲液（pH=5.0）中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.6mg，N-羟基丁二酰亚胺0.6mg，混合均匀后在室温下活化30min。结束后离心分离，用0.1MMES缓冲液（pH=5.0）洗3次后重悬于0.12mL0.1M MES缓冲液（pH=5.0）中，加入链霉亲和素72μg，混匀后在37℃下孵育2h。孵育结束后离心分离，用50mM PBS缓冲液（pH=7.4）洗3次后重悬于0.36mL含0.5wt.%BSA水溶液中，混匀后在37℃下封闭22h。孵育结束后离心分离，用50mM PBS缓冲液（pH=7.4）洗3次后重悬于0.36mL含0.5wt.%BSA水溶液中，最终得到固含量为1wt.%的链霉亲和素修饰中空微球。
实施例4：聚丙烯酸修饰的1.5μm聚二乙烯基苯中空微球折合密度的估计；
取10mg实施例2中得到的聚丙烯酸修饰的1.5μm聚二乙烯基苯中空微球微球，重分散于1mL纯化水后加入1mL透明可立样品管中。含中空微球的样品管置于室温下静置24h，分别于0/4/8/12/24h拍照，记录水与微球界面的位置及移动距离，对应距离除以测量时长即为该中空微球的沉降或上浮速率Vt，按照斯托克斯沉降公式，变换后按照下式可以估计该中空微球的折合密度：
其中η为水的粘度，g为重力加速度，d为中空微球在光学显微镜下测量得到的实际直径，ρl代表悬浮液的密度，ρs代表微球的平均密度。
实施例5：2.4μm空腔体积占比20%聚二乙烯基苯中空微球的制备；
将实施例1中0.7μm线性聚苯乙烯种子微球改成1.2μm线性聚苯乙烯种子微球，如图9为烘干前效果示意图，图10为烘干后效果示意图，相较于实施例1，本实施例的中空微球粒径等比例放大。
实施例6：2.4μm空腔体积占比20%聚苯乙烯-二乙烯基苯中空微球的制备；
将实施例1中0.7μm线性聚苯乙烯种子微球改成1.2μm线性聚苯乙烯种子微球，并且将使用的4g二乙烯基苯单体换成2g苯乙烯加2g二乙烯基苯，如图11为烘干前效果示意图，图12为烘干后效果示意图，相较于实施例1，本实施例的中空微球，因为引入第二单体，导致中空微球的形态出现变形，但不影响实验的正常进行。
实施例7：3.0μm空腔体积占比45%聚二乙烯基苯多腔-中空微球的制备；
将实施例1中0.7μm线性聚苯乙烯种子微球改成1.2μm线性聚苯乙烯种子微球，并且将线性聚苯乙烯种子微球的用量降低到原来的1/4，如图13为烘干前效果示意图，图14为烘干后效果示意图，相较于实施例1，本实施例的中空微球，将种球的比例降低，空腔体积得到显著提高。
对比例1：1.5μm空腔体积占比7%聚二乙烯基苯中空微球的制备；
将实施例1中乙酸乙酯加入量改成2g，二乙烯基苯加入量改成6g。
对比例2：1.5μm实心微球的制备；
将实施例1中乙酸乙酯加入量改成4g，二乙烯基苯加入量改成4g。
对比例3：1.5μm空腔体积占比25%聚二乙烯基苯中空微球的制备；
将实施例1中乙酸乙酯加入量改成6g，二乙烯基苯加入量改成2g。
由实施例1和对比例1-3所得中空聚合物微球可知，空腔体积随着致孔剂比例的增大而增大，本发明通过将经过干燥处理后的微球内部原有致孔剂及溶剂置换成空气后，疏水的聚合物壳层会阻挡外加水相重新再进入微球内部空腔，微球内部可以保持长久性的空腔。本发明中空微球密度显著低于常规实心聚合物微球，因而比表面积大于常规实心微球，在用于大分子蛋白的固定方面具有载量提升的优势。
一种单分散中空聚合物微球可以在药物传递和控释领域发挥重要作用，其对载药量增加的有益效果主要包括以下几点：
（1）增强药物负载能力：中空聚合物微球具有较大的表面积和孔隙结构，可以提高药物的负载能力，药物可以通过吸附、物理包封或化学修饰等方式被载入微球中，其中的多孔性结构可以提供更多的负载位点，从而增强载药能力。
（2）提高控释效率：由于中空聚合物微球的含药量较高，因此可以通过调整微球结构和材料属性来实现药物释放速率的控制，中空聚合物微球可以通过改变孔径大小、壁厚、孔隙度等参数来影响药物的释放，这种控释方式可以使药物的释放速率更加稳定和可控，从而提高药物治疗的效果。
（3）增加溶解度和生物利用度：中空聚合物微球载药后，药物分子往往处于非晶态或亚胶态状态，在这种状态下药物的溶解度和生物利用度都会得到提高，这是因为微球结构中的孔隙可以提供更多的表面积，从而促进药物分子与水的接触，增加药物的溶解度，此外，药物在非晶态或亚胶态状态下的生物利用度也往往更高。
（4）提高药物稳定性：中空聚合物微球可以提高药物的稳定性，降低药物因氧化、光照、酸碱等因素而发生分解或降解的风险，药物被包裹在微球内部，可以减少药物与环境的接触，从而减少药物因外界因素而发生降解或分解的可能性。
以上仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种单分散中空聚合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采用分散聚合法合成单分散线性聚苯乙烯种子微球；
步骤二、将引发剂、单体二乙烯基苯和致孔剂乙酸乙酯加入含有表面活性剂的水溶液中进行乳化，乳化后的单体乳液加入到步骤一得到的线性聚苯乙烯种子微球，在室温下溶胀24～72h，直至微球溶胀到指定粒径；致孔剂占加入油相总质量比为40～80wt.%；所述聚苯乙烯种子微球的质量占加入油相的质量的百分比为8～80wt.%；
步骤三、将步骤二得到的溶胀微球预先加热至60～90℃，加入稳定剂后进行聚合反应，持续反应4～24h，完成聚合反应后，将中空微球与溶剂分离，同时去除未反应的单体和其他杂质，得到中空微球；
步骤四、将步骤三得到的中空微球与乙腈混合，再加入丙烯酸单体，升温到86～96℃回流聚合0.5～8h，得到内部充斥溶剂的中空羧基聚合物微球；
步骤五、将步骤四将得到的内部充斥溶剂的中空羧基聚合物微球经过90～150℃热干燥1～6h，重新分散于水相后，即得到内部充斥空气的单分散中空聚合物微球；所述单分散中空聚合物微球经光学显微镜测量，空腔体积占比为20%～50%。
2.根据权利要求1所述的一种单分散中空聚合物微球的制备方法，其特征在于：所述引发剂为偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰中的任意一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的一种单分散中空聚合物微球的制备方法，其特征在于：所述中空微球的直径为1～5μm。
4.根据权利要求1所述的一种单分散中空聚合物微球的制备方法，其特征在于：在步骤一中，还包括单分散线性聚苯乙烯种子微球的分子量不低于10Kda。
5.一种应用于蛋白固定的方法，其特征在于，采用权利要求1～4任一项所述的单分散中空聚合物微球的制备方法所制备得到的单分散中空聚合物微球。
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