CN117398413A

CN117398413A - 无细胞脂肪提取物用于治疗卵巢功能不全

Info

Publication number: CN117398413A
Application number: CN202310662970.7A
Authority: CN
Inventors: 张文杰
Original assignee: Shanghai Seme Cell Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Seme Cell Technology Co Ltd
Priority date: 2022-07-15
Filing date: 2023-06-06
Publication date: 2024-01-16

Abstract

本发明涉及无细胞脂肪提取物用于治疗卵巢功能不全。具体地，本发明提供一种无细胞脂肪提取物的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症。本发明所述的无细胞脂肪提取物对卵巢功能不全具有优异的治疗效果。

Description

无细胞脂肪提取物用于治疗卵巢功能不全

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及无细胞脂肪提取物用于治疗卵巢功能不全。

背景技术

卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，又称“卵巢功能低下”，是指40岁以前的获得性高促性腺发育不良。女性从胎儿到老年是渐进的生理过程，卵巢作为性腺器官，行使着周期性***与分泌性激素的重要生理功能。其中，卵巢功能不全包括自然衰老导致卵巢功能不全。随着年龄增长，卵巢功能逐渐衰退，生殖器官亦开始萎缩、衰老，并影响身体其他***的功能。卵巢衰老是一个多因素相互作用、逐渐累积的复杂的生物过程。随着年龄渐长，卵泡不断消耗，卵泡数目下降是卵巢衰老的主因；而机体内代谢产物堆积，卵巢微环境改变，剩余卵泡质量的降低亦与衰老息息相关。目前，国内外主要应用激素替代疗法，但长期应用导致卵巢癌患病率增加，使得该疗法的应用存在较大争议。因此，尚未有可靠的治疗方法可以帮助恢复女性卵巢功能。

因此，本领域需要开发一种能够有效治疗卵巢功能不全的药物。

发明内容

本发明的目在于提供一种无细胞脂肪提取物在预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症方面中的用途。

本发明第一方面，提供一种无细胞脂肪提取物的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症。

在另一优选例中，所述的卵巢功能不全和/或其并发症的对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的卵巢功能不全并发症选自下组：继发性闭经、***水平下降、***水平上升、卵泡数目下降、卵泡质量降低、提前闭经、***，或其组合。

在另一优选例中，所述的卵巢功能不全包括自然衰老导致卵巢功能不全。

在另一优选例中，所述的自然衰老包括因高龄导致的自然衰老。

在另一优选例中，所述的卵巢功能不全为高龄对象的卵巢功能不全。

在另一优选例中，所述的高龄对象为中老年人或高龄非人哺乳动物，包括小鼠、大鼠、猪、牛、兔、狗、猩猩。

在另一优选例中，所述的高龄对象是指相比该对象物种的平均寿命A0，该高龄对象的年龄为A1达到了A0的45％以上，优选达到了50％以上，更优选达到了55％以上。

在另一优选例中，所述的高龄为45岁以上，优选50岁以上，更优选55岁以上。

在另一优选例中，所述的预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症包括选自下组的一个或多个特征：

(i)改善卵巢功能；

(ii)提升生育能力；

(iii)提升E2激素水平；

(iv)提升AMH激素水平；

(v)降低FSH激素水平；

(vi)减少卵巢组织的炎症细胞浸润。

在另一优选例中，所述的提升生育能力包括提高产仔数量。

在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物为从人或非人哺乳动物中的脂肪中提取制备获得的无细胞脂肪提取物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为猴、猩猩、牛、猪、狗、羊、鼠或兔。

在另一优选例中，所述的组合物或制剂包括药物组合物或制剂、食品组合物或制剂、保健品组合物或制剂或膳食补充剂。

在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括其它预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症的药物。

在另一优选例中，所述的其它预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症的药物选自下组：激素替代疗法(HRT)、脱氢表雄酮(DHEA)、克罗米芬，或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。

在另一优选例中，所述的注射制剂为腹腔注射剂、静脉注射剂或肌肉注射剂。

在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型。

在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。

在另一优选例中，所述的组合物或制剂通过外用、局部、或注射方式施用。

在另一优选例中，所述无细胞脂肪提取物从脂肪组织中提取，所述脂肪组织选自异种脂肪组织、同种异体脂肪组织或同种同体脂肪组织。

在另一优选例中，所述无细胞脂肪提取物不含有细胞且不含有脂滴。

在另一优选例中，所述脂滴为脂肪细胞破碎后释放的油滴。

在另一优选例中，所述“不含有脂滴”指所述无细胞脂肪提取物中，油滴体积占总液体百分比小于1％，优选地小于0.5％，更优选地小于0.1％。

在另一优选例中，所述细胞选自下组：内皮细胞、脂肪干细胞、巨噬血细胞、基质细胞。

在另一优选例中，所述“无细胞”指1ml无细胞脂肪提取物中的细胞平均数量≤1个，优选地≤0.5个，更佳地≤0.1个，或为0个。

在另一优选例中，所述无细胞脂肪提取物为天然获得的无添加成分的纳米脂肪提取物。

在另一优选例中，所述“无添加成分的”指除漂洗步骤外，在所述脂肪提取物的制备过程中未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂。

在另一优选例中，所述种无细胞脂肪提取物是通过将脂肪组织经过乳化后离心制备获得。

在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物含有一种或多种选自下组的组分：IGF-1、BDNF、GDNF、TGF-β1、HGF、bFGF、VEGF、TGF-β1、PDGF、EGF、NT-3、GH、G-CSF，或其组合。

在另一优选例中，所述的种无细胞脂肪提取物含有但不限于一种或多种选自下组的组分：IGF-1、BDNF、GDNF、bFGF、VEGF、TGF-β1、HGF、PDGF，或其组合。

在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物为无细胞脂肪提取液。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的IGF-1的浓度为5000-30000pg/ml，较佳地6000-20000pg/ml，更佳地7000-15000pg/ml，更佳地8000-12000pg/ml，更佳地9000-11000pg/ml，更佳地9500-10500pg/ml。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的BDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1850pg/ml。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的GDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1900pg/ml。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的bFGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地100-500pg/ml，更佳地120-400pg/ml，更佳地150-300pg/ml，更佳地200-280pg/ml，更佳地220-260pg/ml。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的VEGF的浓度为50-500pg/ml，较佳地100-400pg/ml，更佳地120-300pg/ml，更佳地150-250pg/ml，更佳地170-230pg/ml，更佳地190-210pg/ml。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的TGF-β1的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地800-1200pg/ml，更佳地800-1100pg/ml，更佳地900-1000pg/ml。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的HGF的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地600-1200pg/ml，更佳地800-1000pg/ml，更佳地850-950pg/ml。

在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的PDGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地80-400pg/ml，更佳地100-300pg/ml，更佳地140-220pg/ml，更佳地160-200pg/ml，更佳地170-190pg/ml。

在另一优选例中，所述的IGF-1与VEGF的重量比为20-100：1，较佳地30-70：1，更佳地40-60：1，最佳地45-55：1。

在另一优选例中，所述的BDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8-9.5：1。

在另一优选例中，所述的GDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8.5-9.5：1。

在另一优选例中，所述的bFGF与VEGF的重量比为0.2-8：1，较佳地0.5-5：1，更佳地0.6-2：1，更佳地0.8-1.6：1，最佳地1-1.5：1。

在另一优选例中，所述的TGF-β1与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-6：1。

在另一优选例中，所述的HGF与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-5.5：1。

在另一优选例中，所述的PDGF与VEGF的重量比为0.1-3：1，较佳地0.2-2：1，更佳地0.4-1.5：1，最佳地0.7-1.2：1。

在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：

(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；

(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；

(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；

(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；

(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和

(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。

本发明第二方面，提供一种制备无细胞脂肪提取物的方法，所述的方法包括步骤：

在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。

在另一优选例中，所述的离心的温度为2-6℃。

在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的乳化为机械乳化。

在另一优选例中，所述机械乳化为经注射器反复吹打(如吹打20-200次，较佳地20-150次，更佳地20-100次，更佳地30-50次)进行机械乳化。

在另一优选例中，所述的吹打的方式为2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打。

在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述乳化为通过组织匀浆机打碎的方法。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，在将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理前，还包括对所述乳化的脂肪混合物冷冻后解冻处理。

在另一优选例中，冷冻后解冻处理后，将解冻后的混合物用于离心。

在另一优选例中，所述的冷冻的温度为-50℃至-120℃，较佳地-60℃至-100℃，更佳地-70℃至-90℃。

在另一优选例中，所述的解冻的温度为20-40℃，较佳地25-40℃，更佳地37℃。

在另一优选例中，所述的冷冻后解冻的循环次数为1-5次(优选为1、2、3或4次)。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，离心后，所述乳化的脂肪混合物分层4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层(即为中间液体层)，第四层为细胞/组织碎片沉淀层。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地2-8min，最佳地3-7min。

在另一优选例中，所述的离心的温度为2-6℃。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，第一层、第二层、第三层和第四层从上到下依次排列。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的中间液体层为透明或基本透明层。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤包能够将脂肪初提物中的脂肪细胞除去。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是通过滤器(如0.22μm微孔滤膜)进行。

在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。

在另一优选例中，所述的微孔滤膜的孔径大小为0.05-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.4μm，更佳地0.15-0.3μm，更佳地0.2-0.25μm，最佳地0.22μm。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是先通过可滤去细胞的第一过滤器，然后再通过可滤去病原体(如细菌)的第二滤器(如0.22μm的滤器)进行的。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，还包括对所述脂肪提取物进行分装，形成分装的产品。(所述分装后的提取物可于-20℃保存待用；可低温(如-4℃)或常温解冻后直接使用，或解冻后置于低温(如4℃)保存一段时间，然后使用)。

本发明第三方面，提供一种无细胞脂肪提取物，所述的无细胞脂肪提取物通过如本发明第二方面所述的方法制备获得。

本发明第四方面，提供一种组合物或制剂，所述的组合物或制剂包含(a)如本发明第三方面所述的无细胞脂肪提取物；和(b)药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物或膳食补充剂。

在另一优选例中，所述的注射剂为腹腔注射剂、静脉注射剂或肌肉注射剂。

在另一优选例中，所述组合物或制剂通过口服、外用、腹腔注射、静脉注射或皮下注射方式施用。

在另一优选例中，在所述组合物或制剂中，无细胞脂肪提取物的质量百分比为5wt％，较佳地1-20wt％，以合物或制剂的总重量计。

本发明第五方面，提供一种制备如本发明第四方面所述的组合物或制剂的方法，所述的方法包括步骤：将如本发明第三方面所述的无细胞脂肪提取物与药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成组合物或制剂。

本发明第六方面，提供一种预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症的方法，对需要的对象施用如本发明第一方面或本发明第三方面所述的无细胞脂肪提取物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠。

在另一优选例中，所述的施用方式为口服、外用或注射施用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了正常卵巢切片照片。

图2显示了高龄小鼠的卵巢切片照片。

图3显示了经CEFFE局部注射治疗后的高龄小鼠的卵巢切片照片。

图4显示了E2激素检测结果。

图5显示了AMH激素检测结果。

图6显示了FSH激素检测结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了无细胞脂肪提取物对卵巢功能不全和/或其并发症(尤其是自然衰老导致卵巢功能不全和/或其并发症)具有优异的治疗作用。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。

如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如文本所用，术语“IGF-1”称为***1(insulin-like growthfactors-1)。

如文本所用，术语“BDNF”称为脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)。

如文本所用，术语“GDNF”称为胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derived neurotrophic factor)。

如文本所用，术语“bFGF”称为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor)。

如文本所用，术语“VEGF”称为血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor)。

如文本所用，术语“TGF-β1”称为转化生长因子-β1(transforming growthfactor-β1)。

如文本所用，术语“HGF”称为肝细胞生长因子

如文本所用，术语“PDGF”称为血小板衍生生长因子(Platelet derived growthfactor)

如文本所用，术语“EGF”称为表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor)

如文本所用，术语“NT-3”称为神经营养因子3(neurotrophins-3)。

如文本所用，术语“GH”称为生长激素(Growth Hormone)。

如文本所用，术语“G-CSF”称为粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor)。

无细胞脂肪提取物(Cell free fat extract，CEFFE)及其制备方法

如本文所用，术语“本发明的无细胞脂肪提取物”、“本发明提取物”、“本发明的脂肪提取物”等可互换使用，指在脂肪提取物制备过程中(除漂洗步骤外)未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂所制备的源自脂肪组织的提取物(或提取液)。一种典型的制备本发明提取物的方法如上本发明第二方面中所述。此外，应理解，虽然本发明提取物在制备过程中不必添加任何添加剂(或添加成分)，但是也可以添加一些或少量的对本发明提取物的活性无负面或不利影响的安全的物质(如少量水)。

本发明的无细胞脂肪提取物可来源于人类脂肪组织，它是通过离心后除去油和细胞/细胞外基质部分而从纳米脂肪中提纯出来的，是一种无细胞、易于制备、富含各种生长因子的液体。

本发明的无细胞脂肪提取物与脂肪源性干细胞(ADSCs，例如脂肪间充质干细胞)的分泌物完全不同。

首先，脂肪源性干细胞的分泌物是ADSCs体外培养过程中获得的细胞培养上清液，通过离心过滤，去除细胞，保留了细胞释放到上清液中的蛋白、核酸等成分；而本发明的CEFFE是对脂肪组织破碎后进一步离心过滤，保留了可溶性成分，包括蛋白、核酸、脂肪酸等，是直接提取自脂肪组织的物质，而不是分泌的产物。两者的原料来源完全不同，所含蛋白、核酸等成分的种类和浓度也完全不同。

其次，本发明的无细胞脂肪提取物是通过物理手段，在不添加任何化学试剂的情况下，通过破碎脂肪组织进而提取制备出含有多种细胞因子的活性蛋白复合物；而脂肪源性的干细胞及其分泌物则需要通过化学方法进行分离培养，存在试剂残留等风险。同时，脂肪源性的干细胞的分泌物的提取量无法确定、活性因子浓度低，且需要添加冻存保护剂以实现长期保存，而本发明的无细胞脂肪提取物的活性因子含量可控且浓度高，无需添加冻存保护剂即可实现长期保存，临床转化的优势较其他技术更为明显。

在本发明的一个优选例中，所述的无细胞脂肪提取物为无细胞脂肪提取液。

在本发明所述的无细胞脂肪提取物，可以包括多种细胞因子。代表性地，所述的无细胞脂肪提取物包括IGF-1、BDNF、GDNF、TGF-β、HGF、bFGF、VEGF、TGF-β1、PDGF、EGF、NT-3、GH和G-CSF中的一种或多种。

优选地，本发明所述的无细胞脂肪提取物通过如上述本发明第二方面所述的方法制备获得。

代表性地，本发明所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：

在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。

用途

本发明提供一种无细胞脂肪提取物的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症。

在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。本文中使用的"预防"还包括延迟疾病和/或它的附随症状的发作和降低对象的得病的风险。

本发明所述的“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的无细胞脂肪提取物观相比，本发明所述无细胞脂肪提取物减轻、抑制和/或逆转了卵巢功能不全例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。

本发明所述的某一指标的“提升”、“提高”是指与不存在本发明所述的无细胞脂肪提取物相比，本发明所述无细胞脂肪提取物将所述指标提高了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。

本发明所述的某一指标的“下降”、“减少”是指与不存在本发明所述的无细胞脂肪提取物相比，本发明所述无细胞脂肪提取物将所述指标降低了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。

本发明还提供一种预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症的方法，对需要的对象施用如本发明所述的无细胞脂肪提取物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。

组合物和施用

本发明所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、保健组合物、膳食补充剂等。

代表性地，可将本发明的无细胞脂肪提取物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。

本发明的组合物还可以包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。“药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用，优选的施用方式为口服施用和注射施用。

本发明所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。代表性地，用于口服施用或给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂。

用于口服施用或给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部施用或给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明无细胞脂肪提取物可以单独施用或给药，或者与其它预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症的药物联合施用或给药。

施用组合物时，是将安全有效量的本发明无细胞脂肪提取物适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上、食品上或保健品上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次发现无细胞脂肪提取物对卵巢功能不全和/或其并发症具有优异的预防和治疗效果。

2.本发明所述的无细胞脂肪提取物是一种无细胞组分，可以避免临床应用中与细胞相关的问题，例如包括细胞加工后的遗传稳定性，注射后的细胞活性和存活率，细胞的多次给药储存，以及使用同种异体脂肪时细胞的免疫原性，本发明所述的无细胞脂肪提取物在防治卵巢功能不全和/或其并发症中有着较高的安全性和较低副作用的优势。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1无细胞脂肪提取液(CEFFE)的制备

脂肪由自愿者在获得知情同意的条件下获得。无细胞脂肪组织提取液的制备方法如下：

(1)脂肪组织获取自6名常规脂肪抽吸术的健康女性，平均年龄31岁(24-36岁)。局部注射肿胀液麻醉后，使用具有大侧孔(2mm x 7mm)的3mm吸脂抽脂套管连接20mL注射器，人工负压下放射状抽吸，将获得的脂肪直立静止，去除肿胀液后，用生理盐水漂洗3遍。

(2)取经漂洗后的脂肪组织，置于离心管中，放入离心机中以1200g 4℃离心3分钟后，获得分层的混合物。

(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)。

(4)对所述中间层，用2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打30次，从而进行机械乳化，并获得经机械乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)。

(5)将所述经机械乳化的脂肪混合物置入-80℃冰箱冷冻，再进行37℃水浴解冻，单次冻融循环后，将解冻后的脂肪混合物以1200g 4℃离心5分钟，获得分层的混合物，分层的混合物共分为4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层，第四层为细胞/组织碎片沉淀层，去除油层和残余脂肪组织层，吸取液体层，吸取过程中避免细胞/组织碎片沉淀层污染，从而得到脂肪初提取液。

(6)将得到的脂肪初提取液经0.22μm滤器过滤除菌，从而灭菌并去除可能混有的活细胞，从而获得无细胞脂肪提取液(CEFFE)，分装冻存于-20℃保存，使用时4℃解冻。

对制备得到的无细胞脂肪提取液，使用ELISA免疫吸附测定试剂盒检测细胞因子含量，包括IGF-1、BDNF、GDNF、bFGF、VEGF、TGF-β1、HGF和PDGF等细胞因子。6例样本检测平均浓度如下：IGF-1(9840.6pg/ml)、BDNF(1764.5pg/ml)、GDNF(1831.9pg/ml)、bFGF(242.3pg/ml)、VEGF(202.9pg/ml)、TGF-β1(954.5pg/ml)、HGF(898.4pg/ml)和PDGF(179.9pg/ml)。

实施例2CEFFE对高龄小鼠的卵巢的组织学检测

(1)建立小鼠模型

20只8月龄的高龄C57小鼠与10只8周龄C57小鼠纳入组内，作为自然衰老的小鼠模型进行实验。高龄C57小鼠中随机选择10只小鼠作为实验组，10只作为高龄对照组，10只8周龄C57作为空白对照组，小鼠正常饲养。

(2)体内实验

对实验组的10只高龄小鼠进行CEFFE治疗。选择蛋白含量3.0以上的CEFFE制剂对进行腹腔注射，每2周注射一次，每次0.1mL，连续处理12周。给药结束后对所有小鼠取材血清与卵巢，进行包括性激素水平、卵巢组织学的检测。

(3)结果

结果如图1-图3所示，可以看出高龄小鼠的卵巢切片相比正常卵巢切片的***结构异常，大量***可见空泡样变性，组织中可见少量炎症细胞浸润。而在经过12周CEFFE的局部注射治疗后，高龄小鼠卵巢内可见大量腺体增生，如红色箭头和星形标记所示；***结构正常，未见细胞变性；组织中未见炎症细胞浸润；黄色箭头和三角形标记表示表面上皮。

实施例3CEFFE对高龄小鼠的激素水平检测

方法同实施例2

E2(***)激素水平结果如图4所示，可以看出，高龄导致卵巢功能不全的小鼠E2激素水平大幅下降，经腹腔注射CEFFE 12周后，E2激素水平有明显提高。注射CEFFE前后的激素水平差异具有统计学意义。该结果证明，CEFFE对于高龄导致的卵巢功能不全小鼠E2激素水平具有明显的提升作用，有利于卵巢功能的恢复。(*P<0.05)

AMH(抗缪勒氏管激素)激素水平结果如图5所示，可以看出，高龄导致卵巢功能不全的小鼠AMH激素水平大幅下降，经腹腔注射CEFFE后，AMH激素水平有明显提高。注射CEFFE前后的激素水平差异具有统计学意义。该结果证明，CEFFE对于高龄导致的卵巢功能不全小鼠AMH激素水平具有明显的提升作用，有利于卵巢功能的恢复。(*P<0.05)

FSH(促卵泡激素)激素水平结果如图6所示，可以看出，高龄导致卵巢功能不全的小鼠FSH激素水平大幅升高，经腹腔注射CEFFE后，FSH激素水平有明显下降。注射CEFFE前后的激素水平差异具有统计学意义。该结果证明，CEFFE对于高龄导致的卵巢功能不全小鼠FSH激素水平具有明显的提升作用，有利于卵巢功能的恢复。(*P<0.05)

综上所述，CEFFE可促进因自然衰老导致的卵巢功能不全的卵巢功能恢复和提升因自然衰老导致的卵巢功能不全的产仔数量。因此，CEFFE对自然衰老导致的卵巢功能不全和其并发症具有优异的治疗效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种无细胞脂肪提取物的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的卵巢功能不全并发症选自下组：继发性闭经、***水平下降、***水平上升、卵泡数目下降、卵泡质量降低、提前闭经、***，或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的卵巢功能不全包括自然衰老导致卵巢功能不全。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的自然衰老包括因高龄导致的自然衰老。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物或制剂包括药物组合物或制剂、食品组合物或制剂、保健品组合物或制剂或膳食补充剂。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的无细胞脂肪提取物含有一种或多种选自下组的组分：IGF-1、BDNF、GDNF、TGF-β1、HGF、bFGF、VEGF、TGF-β1、HGF、PDGF、EGF、NT-3、GH、G-CSF，或其组合。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所示的无细胞脂肪提取物包括选自下组的一种或多种特征：

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的IGF-1的浓度为5000-30000pg/ml，较佳地6000-20000pg/ml，更佳地7000-15000pg/ml，更佳地8000-12000pg/ml，更佳地9000-11000pg/ml，更佳地9500-10500pg/ml；

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的BDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1850pg/ml；

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的GDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1900pg/ml；

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的bFGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地100-500pg/ml，更佳地120-400pg/ml，更佳地150-300pg/ml，更佳地200-280pg/ml，更佳地220-260pg/ml；

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的VEGF的浓度为50-500pg/ml，较佳地100-400pg/ml，更佳地120-300pg/ml，更佳地150-250pg/ml，更佳地170-230pg/ml，更佳地190-210pg/ml；

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的TGF-β1的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地800-1200pg/ml，更佳地800-1100pg/ml，更佳地900-1000pg/ml；

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的HGF的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地600-1200pg/ml，更佳地800-1000pg/ml，更佳地850-950pg/ml；和/或

在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的PDGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地80-400pg/ml，更佳地100-300pg/ml，更佳地140-220pg/ml，更佳地160-200pg/ml，更佳地170-190pg/ml。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所示的无细胞脂肪提取物包括选自下组的一种或多种特征：

所述的IGF-1与VEGF的重量比为20-100：1，较佳地30-70：1，更佳地40-60：1，最佳地45-55：1；

所述的BDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8-9.5：1；

所述的GDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8.5-9.5：1；

所述的bFGF与VEGF的重量比为0.2-8：1，较佳地0.5-5：1，更佳地0.6-2：1，更佳地0.8-1.6：1，最佳地1-1.5：1；

所述的TGF-β1与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-6：1；

所述的HGF与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-5.5：1；和/或

所述的PDGF与VEGF的重量比为0.1-3：1，较佳地0.2-2：1，更佳地0.4-1.5：1，最佳地0.7-1.2：1。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：

10.一种预防和/或治疗卵巢功能不全和/或其并发症的方法，其特征在于，对需要的对象施用无细胞脂肪提取物。