CN117398389B - 负载乳香酸的间充质干细胞外泌体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，包括载体和活性成分，载体为间充质干细胞外泌体，所述活性成分为乳香酸；所述活性成分的载药率为5‑15％；所述活性成分被负载于外泌体的表面和装载在外泌体的内部。本发明将疏水亲脂性的乳香酸通过化学交联的方式负载到外泌体上，乳香酸和作为载体的间充质干细胞外泌体本身具有免疫调节和组织修复的作用，既可以利用外泌体递送特性实现药物的有效递送和定向集中，同时又可以充分发挥干细胞外泌体的免疫调节和组织修复功能，实现对痤疮边治疗边修复的良好治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及一种负载乳香酸的间充质干细胞外泌体及制备方法和应用。
背景技术
痤疮是以毛囊皮脂腺单位的慢性炎症为主要表现的皮肤疾病，截至2019年全球估计有23.1亿人患有痤疮。我国痤疮的患病率为8.1％，痤疮皮损会引发局部疼痛、瘙痒，但其对于患者最大的影响是随之而来的心理压力。痤疮的发病主要与雄激素水平升高、皮脂分泌过量、毛囊角化过度、痤疮丙酸杆菌增殖等因素有关，还与遗传、饮食、免疫相关。虽然随着医学研究不断深入，痤疮的治疗方法多种多样，但目前的治疗方法如外用和口服抗生素、外用维A酸类药物、激素治疗等方法，仍存在耐受性、抗生素耐药性等诸多问题。
间充质干细胞是来源于中胚层的一种多能干细胞,具有自我复制和强大的分化能力，可以从骨髓、脐带、胎盘、脂肪等多种材料中获得。间充质干细胞免疫源性低，主要通过旁分泌的方式发挥各种功能，其旁分泌所分泌的物质包括可溶性细胞因子、趋化因子、外泌体等。外泌体是纳米级别大小的囊泡，直径在30-150nm左右，密度约为1.10-1.14g/mL，电镜下呈“结构”，内部携带有多种生物活性物质，如蛋白质、脂质、RNA等。外泌体可以在细胞之间传递丰富的物质,外泌体输送到受体细胞是介导细胞行为变化的关键步骤。此外，它们在细胞间通讯中也发挥着重要作用。
乳香酸是从乳香中提取的一种物质，其主要成分为3α-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸，经临床实验证明能抑制5-脂氧化酶的活性，从而起到抗炎作用。乳香酸还被公开用于敏感皮肤的皮肤微生物组正常化。例如，中国专利申请CN116234554A，公开一种用于敏感皮肤的皮肤微生物组正常化的组合物，包含乳香酸、一种或多种乳香酸衍生物或其混合物的外用组合物，其中所述乳香酸、乳香酸衍生物或其混合物被封装在具有液体脂质核心和负表面电荷的纳米乳液中；纳米乳液的大小在50-200nm的范围内；表面电荷在-50至-90mV的范围内。该封装结构由乳化剂(甘油柠檬酸酯/乳酸酯/亚油酸酯/油酸酯)，辅助乳化剂(二甘油单油酸酯)溶于戊二醇，加入稳定剂，润肤剂和活性成分(乳香酸衍生物纯度超过40％的齿叶乳香树提取物)和去离子水等高压均质器(Microfluidizer)在700bar的压力下对进行2个循环处理所得到。虽然该方案公开以乳香酸或其衍生物制成用于敏感皮肤的皮肤微生物组正常化的组合物，但其不是以外泌体为载体所构建的，且该组合物主要被验证对敏感皮肤状况变化和微生物组谱的影响，并确认可使敏感皮肤组中明显使属于厚壁菌门的细菌、更具体地是表皮葡萄球菌的丰度正常化，使微生物组谱更接近健康皮肤的状况。经过检索，目前并未见到将以外泌体为载体以乳香酸为活性成分的药物相关报道，也不能预知以外泌体为载体以乳香酸为活性成分的药物有怎样的治疗活性。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，将疏水亲脂性的乳香酸通过化学交联的方式负载到外泌体上，能够提高乳香酸在缓冲溶液中的溶解度和生物利用率；乳香酸和作为载体的间充质干细胞外泌体本身具有免疫调节和组织修复的作用，既可以利用外泌体递送特性实现药物的有效递送和定向集中，同时又可以充分发挥干细胞外泌体的“免疫调节和组织修复”功能，实现对痤疮边治疗边修复的良好治疗效果。
(二)技术方案
第一方面，本发明提供一种负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，其包括载体和活性成分，所述载体为间充质干细胞外泌体，所述活性成分为乳香酸；所述活性成分的载药率为5-15％；所述活性成分被负载于外泌体的表面和装载在外泌体的内部。优选地，活性成分载药率为10％-15％，更优选为14.1％。
在本申请中，乳香酸的定义为：从乳香中提取的一种物质，其主要成分为3α-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸，且该物质，包括但不限于β-乳香酸、乙酰基-β-乳香酸、11-酮-β-乳香酸和乙酰基-11-酮-β-乳香酸。
根据本发明的较佳实施例，乳香酸是通过NHS、EDC的组合试剂交联到外泌体上。
根据本发明的较佳实施例，所述间充质干细胞外泌体为脂肪间充质干细胞外泌体。
第二方面，本发明涉及上述负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的溶液，所述溶液的溶剂为PBS缓冲液，所述溶液中含有上述负载乳香酸的间充质干细胞外泌体。
优选地，在所述溶液中负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的浓度为1.0E-1.12E+10particles/mL，更优选为1.10E+10particles/mL。
第三方面，本发明还提供一种负载乳香酸的间充质干细胞外泌体溶液的制备方法，其包括：
S1、提取原代间充质干细胞并进行培养，分离、纯化细胞上清液中的外泌体，重悬，制得外泌体悬液；
S2、配制乳香酸溶液，加入含有NHS和EDC的溶液在室温下孵育反应，得到预修饰的乳香酸溶液；预修饰的乳香酸溶液中乳香酸的羧基被EDC和NHS活化，以便装载到外泌体表面和内部；
S3、将外泌体悬液与预修饰的乳香酸溶液混合，将混合液装入注射器，连接到过滤器单元；推动注射器的柱塞将混合液依次通过滤孔由400nm到100nm梯度减小的多级滤膜，制得含有负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的溶液；乳香酸被负载于外泌体的表面和装载在外泌体的内部。
根据本发明的较佳实施例，S1包括：收集间充质干细胞上清，进行多次离心，依次提高离心速度以分别从所述细胞上清中去除细胞、死细胞和细胞碎片；最后，取上清以80000-120000×g/min的离心速度离心5070min，得到外泌体沉淀，用无菌PBS重悬外泌体沉淀，再次以80000-120000×g/min的离心速度离心，即得外泌体；将外泌体重悬于PBS，得外泌体悬液。
优选地，收集间充质干细胞上清后，先以300×g/min低速离心10min，以分离出细胞；取上清以2000×g/min中速离心10min，去除死细胞；剩余上清以10000×g/min高速离心30min，去除细胞碎片；随后，再次取上清以100000×g/min超高速离心60min，得到外泌体沉淀，用无菌PBS重悬外泌体沉淀，再次以100000×g/min超高速离心70min，即得纯净的外泌体；为了便于后续负载乳香酸，可将其再次重悬于PBS，得外泌体悬液。
根据本发明的较佳实施例，S2包括：将乳香酸溶于DMSO中制备浓度为8-15mg/mL的乳香酸溶液，按照1:1质量称取NHS和EDC溶于PBS中，制成总浓度为0.95-1.2mg/mL的NHS-EDC溶液；将乳香酸溶液与NHS-EDC溶液等体积混合，室温孵育15-30min，得到预修饰的乳香酸溶液。
优选地，在将预修饰的乳香酸溶液与外泌体悬液混合用于负载过程中，使乳香酸质量为外泌体质量的1/2-1/5。
根据本发明的较佳实施例，S3中，负载时，将乳香酸与外泌体的混合液装入注射器，连接到过滤器单元；推动注射器的柱塞将混合液先过滤400nm膜，推阻10次，再过200nm膜，推阻10次，最后过100nm膜，推阻10次，制得含有负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的溶液。
第四方面，本发明还提供一种负载乳香酸的间充质干细胞外泌体在制备治疗痤疮或改善皮肤的药物中的应用。所述治疗和改善的功效包括但不限于：改善痤疮部位炎症环境，抑制痤疮丙酸杆菌(P.acne)繁殖及其导致的炎性浸润，治疗寻常痤疮，改善皮肤效果等作用。
(三)有益效果
本发明的技术效果包括：
(1)本发明负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，其乳香酸被负载于外泌体的表面和装载在外泌体的内部，MSCexo-Bos作用于皮肤后，随着MSCexo在皮下裂解，表面和内部携带的乳香酸随之释放出来，发挥抑制痤疮丙酸杆菌繁殖和改善病灶部位炎症环境的作用；与此同时，作为载体的间充质干细胞外泌体MSCexo本身也能够抑制促炎因子IL-6，促进抗炎因子IL-10的表达，具有抑制炎症反应、促进组织修复等作用，MSCexo和乳香酸的联合使用可发挥边治疗边修复巩固的协同功效，由此能够对痤疮发挥良好的治疗效果。
(2)本发明负载乳香酸的间充质干细胞外泌体用于注射痤疮模型大鼠，在本发明制备的复合物注射量(100μg/只，含17.5μg乳香酸)只有单独的间充质干细胞外泌体(200μg/只)或乳香酸(35μg/只)注射剂量一半时，实验结果显示，注射负载乳香酸的间充质干细胞外泌体使大鼠模型的促炎因子IL-6和CCL2水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，且负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的抗炎作用效果显著高于单独注射乳香酸BOS、外泌体MSCexo；由此说明，负载乳香酸的间充质干细胞外泌体中作为载体的外泌体与乳香酸活性成分之间产生协同增效作用。
此外，本发明还以相同来源的外泌体负载常见痤疮药异维A酸(MSCexo-SOT)用于注射痤疮模型大鼠，在相同注射剂量(100μg/只)的情况下，虽然MSCexo-SOT处理组小鼠促炎因子IL-6和CCL2水平有所降低，抗炎因子IL-10水平有所升高，但本发明负载乳香酸的间充质干细胞外泌体MSCexo-BOS的抗炎效果仍显著高于MSCexo-SOT组；由此说明，本发明提供的负载乳香酸的间充质干细胞外泌体中外泌体与乳香酸之间的协同增效作用显著优于MSCexo与SOT的协同作用。
(3)本发明的制备方法包括使用NHS和EDC为交联剂，同时配合注射器和滤膜反复推阻法将乳香酸装载在外泌体内部和连接在外泌体表面(由色谱实验检测证实)，通过间充质干细胞外泌体负载乳香酸前后的粒子粒径分析发现，负载乳香酸前后，外泌体的粒径分布和形状没有显著差异，表明MSCexo-BOS在制备过程中保持了外泌体的结构。
然而，目前常见的药物负载外泌体技术中，共孵育法快速简便，对外泌体的形态无影响，更利于疏水性分子的装载，但是装载效率较低。超声法相对高效，可装载疏水和亲水性分子，但会导致外泌体膜完整性受损。电穿孔法可以装载亲水和疏水性化合物，但是会导致外泌体聚集并影响外泌体膜完整性。挤压法能够相对高效的实现亲水和疏水化合物装载，但也会导致外泌体聚集，影响外泌体的尺寸。而本发明的方法可克服上述问题。
(4)将异维A酸溶液(10mg/mL)与外泌体悬液按照1：1的体积混合负载，将乳香酸溶液(10mg/mL)与外泌体悬液按照1：4的体积混合负载，最终载药率数值上，本发明MSCexo-BOS中BOS的载药率(14.1％)仅略低于MSCexo-SOT中SOT载药率(15.7％)，这说明当负载过程中BOS仅为SOT的0.4倍浓度条件下，仍可得到基本相当的载药率数值，证明了BOS与外泌体MSCexo的结合能力优于SOT与MSCexo的结合能力。在进一步实验中，异维A酸SOT在外泌体MSCexo上的负载量虽然略高于乳香酸BOS，但是在对痤疮小鼠模型相同注射剂量下，MSCexo-BOS的治疗功效仍高于MSCexo-SOT，这说明MSCexo与BOS的协同增效作用优于MSCexo与SOT；外泌体可有效提高BOS的生物利用率。
(5)本发明制备的负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，其乳香酸于外泌体结合牢固、功效稳定性好，不易在储存过程中发生外泌体裂解问题，制备的试样经连续3周冷藏室放置后，外泌体复合物功效无降低，这一特点可有效增强乳酸集中到炎性部位效果和提高生物利用率，保证负载乳香酸的间充质干细胞外泌体外用或皮下注射治疗痤疮的功效。
附图说明
图1为纳米流式测得外泌体的粒径结果；
图2为透射电子显微镜观察间充质干细胞外泌体的典型形态。
图3为纳米流式检测间充质干细胞外泌体负载乳香酸前后的粒径分布和粒子浓度；
图4为纳米流式检测间充质干细胞外泌体负载异维A酸前后的粒径分布和粒子浓度；
图5为HPLC检测MSCexo-BOS的乳香酸载药率；
图6为HPLC检测MSCexo-SOT的异维A酸载药率；
图7为耳部注射MSCexo-BOS对痤疮的治疗效果；
图8为大鼠耳组织横切的HE染色结果；
图9为MSCexo-BOS对细胞IL-6分泌的影响；
图10为MSCexo-BOS对细胞CCL2分泌的影响；
图11为MSCexo-BOS对细胞IL-10分泌的影响。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例包括从商业购买原代间充质干细胞进行培养，并从细胞上清中分离、纯化外泌体两部分内容：
(1)商业化购买原代间充质干细胞(提供商：上海中乔新舟生物科技有限公司)，进行复苏培养。
(2)收集间充质干细胞上清，低速离心300×g/min，10min，分离出细胞；取上清以2000×g/min，离心10min，去除死细胞。剩余上清以10000×g/min离心30min，去除细胞碎片；随后再次取上清以100,000×g/min离心60min，得到外泌体沉淀，用无菌PBS重悬外泌体沉淀，再次100,000×g/min，离心70min，即可得到外泌体MSCexo。
利用纳米流式检测外泌体粒径，结果如图1；图1所示：收集的间充质干细胞外泌体平均粒径约为80.0nm，颗粒浓度为1.10E+10Particles/mL。利用透射电子显微镜(TEM)进行外泌体的形态观察，结果如图2；图2所示：间充质干细胞外泌体主要呈圆形或椭圆形的“茶托样”结构。
实施例2
本实施例采用外泌体MSCexo为载体分别负载乳香酸和异维A酸，得到负载乳香酸的外泌体MSCexo-BOS和负载异维A酸的外泌体MSCexo-SOT。并对粒子浓度及粒径、载药率等进行测试分析。
(1)制备负载乳香酸的外泌体MSCexo-BOS
为了便于将药物负载到外泌体上，可先将外泌体MSCexo重悬于PBS，制得外泌体悬液。
称取若干重量乳香酸，溶于DMSO中制备浓度为10mg/mL的溶液，称取等质量的NHS和EDC，溶于PBS中，制备2mg/mL的NHS/EDC溶液。
将乳香酸溶液和NHS/EDC溶液等体积混合，室温孵育20min。随后与外泌体悬液按照1：4的体积混合，用于负载。将混合液装入注射器，连接到过滤器单元(苏州微流纳米生物技术)，慢慢地推动注射器的柱塞以挤压将EV乳香酸的1ml水悬浮液,过400nm膜，推阻10次；过200nm膜，推阻10次；过100nm膜，推阻10次，滤液为负载乳香酸的外泌体MSCexo-BOS溶液。
(2)制备负载异维A酸的外泌体MSCexo-SOT
称取若干重量异维A酸，溶于甲醇中制备浓度为10mg/mL的溶液(现用现配)。称取等质量的NHS和EDC，溶于PBS中，制备2mg/mL的NHS/EDC溶液。将乳香酸溶液和NHS/EDC溶液等体积混合，室温孵育20min。随后与外泌体悬液按照1：1的体积混合，用于负载。将混合液装入注射器，连接到过滤器单元(苏州微流纳米生物技术)，慢慢地推动注射器的柱塞以挤压将EV乳香酸的1ml水悬浮液,过400nm膜，推阻10次；过200nm膜，推阻10次；过100nm膜，推阻10次；滤液为负载乳香酸的外泌体MSCexo-SOT溶液。
(3)对间充质干细胞外泌体负载乳香酸前后的粒子浓度及粒径分析：利用纳米流式检测了间充质干细胞外泌体(MSCexo)的粒径分布，以及负载乳香酸后的外泌体(MSCexo-BOS)和负载异维A酸的外泌体(MSCexo-SOT)的粒径分布和浓度(用于计算回收率)并对比负载前后外泌体平均粒径的变化。测试结果如图3-4所示。
回收率计算公式如下：
回收率＝负载后外泌体粒子浓度/负载前外泌体粒子浓度×100％。
由图3可知，所制备的MSCexo的平均粒径为77.7nm，负载乳香酸后的平均粒径为83.0nm，回收率为53.18％；由图4可知，所制备的MSCexo的平均粒径为77.9nm，负载异维A酸后的平均粒径为89.8nm，回收率为51.96％。负载乳香酸、异维A酸前后，外泌体的粒径分布没有显著差异，表明MSCexo-BOS和MSCexo-SOT在制备过程中保持了外泌体的结构。
(4)测试MSCexo-BOS中BOS和MSCexo-SOT中SOT的载药率
利用BCA蛋白检测试剂盒检测负载前的外泌体蛋白浓度，乘以回收率计算出负载后的外泌体蛋白浓度。利用超滤法提取、收集负载后悬液中的外泌体，PBS重悬后，将RIPA裂解液与外泌体悬液1：1混合均匀，4度静置15-20min，裂解完毕后摇匀备用。随后用HPLC蒸发散射检测器检测标准曲线及样品中的乳香酸和异维A酸含量。
①乳香酸检测条件：色谱柱：SymmetryC18 5μm，4.6×250mm Column；柱温：30℃，流动相：A：0.5％冰醋酸-水；B:甲醇；淋洗梯度如下：
检测波长：210nm；ELSD Detector设置：N2压力：50psi，雾化模式：加热，功率60％，漂移管温度：60℃，增益：1；样品制备：精密称取适量的乳香酸对照品，用甲醇溶解，制成80μg/mL的样液。
进样体积：分别进样2μL、4μL、8μL、16μL、32μL，考察线性关系，建立标准曲线，并检测样品中乳香酸含量。
测试结果如图5所示。按照计算公式：
乳香酸载药率计算：
载药率＝外泌体负载的乳香酸量/(外泌体总蛋白量×回收率+外泌体负载的乳香酸量)×100％，
经计算，乳香酸载药率为14.1％。
②异维A酸检测条件：色谱柱：Waters XBridge C18(4.6×250nm，5μm)
流动相：甲醇-水-冰醋酸(v/v/v:770/225/5)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：355nm；时间：60min；
测试结果如图6所示。按照计算公式：
异维A酸载药率计算：
载药率＝外泌体负载的异维A酸量/(外泌体总蛋白量×回收率+外泌体负载的异维A酸量)×100％，
经计算，异维A酸载药率为15.7％。
实施例3
本实施例构建大鼠痤疮模型，用于后续负载乳香酸的外泌体MSCexo-BOS和负载异维A酸的外泌体MSCexo-SOT的功效测试。
选用6-8周龄、生长状况良好的Wistar雄性成年大鼠，置于瑞沃德麻醉机中麻醉，待大鼠呼吸平稳后取出，抽取0.3mL油酸，均匀涂抹至大鼠右耳廓内侧(注意油酸不要流入大鼠耳道中，也不要涂抹过多导致油酸被大鼠蹭到头背部引起脱毛)，随后在尾部做标记；隔天注射痤疮丙酸杆菌，用1mL无菌注射器抽取总量为3×106CFU的痤疮丙酸杆菌，于右耳内廓皮下多点注射；连续进行21天完成造模。
实施例4
利用实施例3构建痤疮小鼠模型，本实施例测试向痤疮小鼠注射乳香酸BOS、外泌体MSCexo、MSCexo-BOS、MSCexo-SOT的治疗效果：
将造模成功的大鼠随机分为五组：模型组、BOS组、MSCexo组、MSCexo-BOS组和MSCexo-SOT组，BSA检测MSCexo-Bos和MSCexo-Sot中蛋白浓度后，对MSCexo-Bos和MSCexo-Sot进行分装。将大鼠置于瑞沃德麻醉机中麻醉，待大鼠呼吸平稳后取出，拍照记录并测量耳厚度。用1mL无菌注射器抽取总蛋白量为200μg的MSCexo、200μgBOS的PBS溶液(含35μg乳香酸)、100μg的MSCexo-SOT(含19.4μg的SOT)、MSCexo-BOS(含17.5μg乳香酸)和1mL体积的PBS(Model组)，分别于五组大鼠右耳皮下多点注射。连续给药3次后取材，用于HE染色。测试结果如图7、图8所示。
由图7可知，MSCexo-BOS对小鼠痤疮的治疗效果较BOS、MSCexo和MSCexo-SOT更加明显，表现为大鼠耳廓皮肤症状明显减轻，颜色较之前变淡，触之质地***，皮温下降，表皮厚度明显变薄，部分痂皮脱落；其中Sham组为空白对照组。由图8可知，MSCexo-BOS的抗炎作用较BOS、MSCexo和MSCexo-SOT更加明显，表现为MSCexo-BOS处理后大鼠耳部的毛囊扩张程度明显减轻,炎性细胞浸润减少,且角化层逐步恢复其完整性。
实施例5
本实施例基于HacaT细胞炎症模型，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测试MSCexo-BOS、BOS、MSCexo、MSCexo-SOT等的抗炎性能。
(1)制备HacaT细胞炎症模型
选用生长状况良好的HacaT细胞用于种板。将细胞接种于12孔板，每孔10万细胞。待细胞融合度达到70-80％时进行造模。
将细胞分为6组：空白对照组、模型组、BOS组、MSCexo组、MSCexo-SOT组和MSCexo-BOS组，每组各4个复孔，共24个孔。各组处理方式如下(LPS为细菌脂多糖)：
①空白对照组：DMEM基础培养基培养24h；
②模型组：LPS(1μg/mL)+DMEM基础培养基培养24h；
③BOS组：BOS(9.4μg/mL)+DMEM基础培养基预培养6h，之后LPS(1μg/mL)+DMEM基础培养基培养24h；
④MSCexo组：MSCexo(100μg/mL)+DMEM基础培养基预培养6h，之后LPS(1μg/mL)+DMEM基础培养基培养24h；
⑤MSCexo-BOS组：MSCexo-BOS(100μg/mL)+DMEM基础培养基预培养6h，之后LPS(1μg/mL)+DMEM基础培养基培养24h；
⑥MSCexo-SOT组：MSCexo-SOT(100μg/mL)+DMEM基础培养基预培养6h，之后LPS(1μg/mL)+DMEM基础培养基培养24h。
上述第③-⑥是在使用BOS、MSCexo、MSCexo-BOS、MSCexo-SOT预先培养6h后，再使用LPS和DMEM培养。造模/给药结束后，收集清液用于检测炎症因子和抗炎因子。本实施例中使用的MSCexo-BOS和MSCexo-SOT为实施例2所制备。
(2)采用双抗体夹心法测定HacaT细胞上清液IL-6和CCL2的水平。
①促炎因子IL-6：将100μL测定稀释剂加入到96孔板中，之后加入标准品或样品，室温孵育2h。将96孔板用洗涤缓冲液(含0.05％的吐温-20的PBS缓冲液)洗涤3次，加入200μL的Human IL-6检测抗体溶液，室温孵育2h。重复洗涤步骤，随后加入200μL显色液，室温孵育20min，避光。相应地，避光条件下向每个孔中加入50μL TMB底物。使用酶标仪在450nm处测量吸光度。
②促炎因子CCL2：将200μL标准品或样品加入到96孔板中，室温孵育2h。将96孔板用洗涤缓冲液(含0.05％的吐温-20的PBS缓冲液)洗涤3次，加入200μL的Human CCL2检测抗体溶液，室温孵育1h。重复洗涤步骤，随后加入200μL显色液，室温孵育30min，避光。相应地，避光条件下向每个孔中加入50μLTMB底物。使用酶标仪在450nm处测量吸光度。
③抗炎因子IL-10：采用化学发光法测定HacaT细胞上清液中IL-10的水平。将条形码扫入仪器识别录入，定标品中各加入500μL稀释液，轻轻晃动混匀，平衡30min。在试剂条中加入100μL定标品，上机检测。
样品检测：细胞上清离心处理，取100μL加入试剂条中，上机检测。当受到LPS的刺激时，细胞的炎症信号通路会被激活，随后分泌炎症相关因子IL-6和CCL2等，进而诱导细胞发生炎症反应，测试结果如图9、图10、图11所示(M表示模型组，S表示空白对照组或假手术组)。在1μg/mL LPS刺激下，HacaT产生大量IL-6和CCL2，与空白对照组相比有极显著差异，说明细胞表现出较强的炎症反应。在给予BOS、MSCexo、MSCexo-BOS和MSCexo-SOT后，促炎因子IL-6和CCL2水平有所降低，抗炎因子IL-10水平升高，且MSCexo-BOS的作用效果显著高于BOS、MSCexo和MSCexo-SOT等处理；说明MSCexo-BOS中MSCexo和BOS产生协同增效作用，而这种协同增效作用优于MSCexo与SOT之间的协同效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种治疗痤疮的负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，其特征在于，其包括载体和活性成分，所述载体为间充质干细胞外泌体，所述活性成分为乳香酸；所述活性成分的载药率为5-15%；所述活性成分被负载于外泌体的表面和装载在外泌体的内部；所述间充质干细胞外泌体为脂肪间充质干细胞外泌体；所述负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的制备方法包括：
S1、提取原代间充质干细胞并进行培养，分离、纯化细胞上清液中的外泌体，重悬，制得外泌体悬液；
S2、配制乳香酸溶液，加入含有NHS和EDC的溶液在室温下孵育反应，得到预修饰的乳香酸溶液；预修饰的乳香酸溶液中乳香酸的羧基被EDC和NHS活化，以便装载到外泌体表面和内部；
S3、将外泌体悬液与预修饰的乳香酸溶液混合，将混合液装入注射器，连接到过滤器单元；推动注射器的柱塞将混合液依次通过滤孔由400nm到100nm梯度减小的多级滤膜，制得含有负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的溶液；乳香酸被负载于外泌体表面和装载在外泌体的内部。
2.根据权利要求1所述的负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，其特征在于，S1还包括：收集间充质干细胞上清，进行多次离心，依次提高离心速度以分别从所述细胞上清中去除细胞、死细胞和细胞碎片；最后，取上清以80000-120000×g/min的离心速度离心50-70min，得到外泌体沉淀，用无菌PBS重悬外泌体沉淀，再次以80000-120000×g/min的离心速度离心，即得外泌体；将外泌体重悬于PBS，得外泌体悬液。
3.根据权利要求1所述的负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，其特征在于，S2包括：将乳香酸溶于DMSO中制备浓度为8-15mg/mL的乳香酸溶液，按照1:1质量称取NHS和EDC溶于PBS中，制成总浓度为0.95-1.2mg/mL的NHS-EDC溶液；将乳香酸溶液与NHS-EDC溶液等体积混合，室温孵育15-30min，得到预修饰的乳香酸溶液。
4.根据权利要求1所述的负载乳香酸的间充质干细胞外泌体，其特征在于，S3中，将预修饰的乳香酸溶液与外泌体悬液混合用于负载过程，混合时使乳香酸质量为外泌体质量的1/3-1/5；负载时，将乳香酸与外泌体的混合液装入注射器，连接到过滤器单元；推动注射器的柱塞将混合液先过滤400nm膜，推阻10次，再过200nm膜，推阻10次，最后过100nm膜，推阻10次，制得含有负载乳香酸的间充质干细胞外泌体的溶液。
5.一种权利要求1-4任一项所述的负载乳香酸的间充质干细胞外泌体在制备治疗痤疮的药物中的应用。
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