CN117388227B - 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备 - Google Patents

使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括：提供微孔，至少一个检测微球的表面包含由第一配体‑目标分子‑报告分子形成的三明治结构；密封微孔并进行光漂白；获得微球图片，并对选定区域内的包含微球的微孔进行计数获得微孔总数；使隔离的微孔孵育预定的时间段，获得荧光图片；计算平均亮度值，作为特征值；获得特征值对浓度的标准曲线；根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。本发明还提供相应的计算机可读介质和分析设备。本发明的方法不需要判断每个微球是否连接有目标分子，简化了方法的复杂度，同时维持了高检测精确度。

Description

使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读 介质和分析设备
技术领域
本发明涉及测定生物样品中目标分子的浓度的方法，特别是极低浓度的目标分子的浓度的方法。本发明还涉及存储有执行该方法的指令的计算机可读介质以及相应的分析设备。
背景技术
能够测量来自生物样品的低丰度分析物对于包括临床诊断在内的数个领域都是非常重要的。许多蛋白和核酸诊断生物标记物以极低的浓度存在，这要求其分析方法具有非常低的检测极限。
然而，对于浓度在皮摩尔（pM）、飞摩尔（fM）、阿摩尔（aM）甚至介摩尔（zM）的目标分子而言，精确的浓度测定非常具有挑战性。已知的一种解决方案利用抗体标记微球，每个样品添加数千至数百万个微球来捕获样品中的目标分子，并以酶报告分子来标记目标分子。该方案将微球分散到空间上相互隔离的小孔中，并基于泊松分布来计算单个微球上的酶平均数量，该方案假设在低浓度下绝大多数微球上并不偶联酶分子（“off”球），所以利用偶联有酶分子的微球（“on”球）占所有微球的比例表征单个微球上的酶平均数量，这种算法也被称为数字算法。但在高浓度下，大多数微球上结合有多于1个酶分子，数字算法不再适用，因此转而通过计算包含偶联有酶分子的微球的小孔的平均荧光强度与单酶荧光强度的比值表征单个微球上的酶平均数量，这种算法也被称为模拟算法。在实际应用中，将70%的“on”球作为阈值，低于70%时使用数字算法，高于70%时使用模拟算法。
然而，数字算法和模拟算法在70%或其他阈值时的平滑衔接依赖于分子在微球上的完美的泊松分布。泊松分布假定所有分子和微球都是相同的，分子在微球上随机结合，没有偏差，结合亲和力在浓度变化时仍保持不变，并且检测出来的强度均一。然而，这在现实情况中是无法实现的，实际情况中有各种因素会导致微球和分子的结合不是随机分布或检测信号不均一，包括但不限于，酶和底物浓度的均一性、小孔体积的均一性、各仪器之间的差别、激发光的不均匀性、成像质量的不均匀性等等。实际上，最近的报道已经证实了模拟算法和数字算法之间的不连续性。
有鉴于此，有必要克服现有技术中的缺陷提供一种新的浓度测定方法，使其在所有浓度范围上具有测定连续性。
发明内容
本发明的一个方面提供一种使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括以下步骤：（a）提供微孔，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂；（b）密封微孔以使每个微孔之间流体隔离，并对密封后的微孔进行光漂白；（c）获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定区域内包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数；（d）使隔离的微孔孵育预定的时间段，然后获得对应第一荧光的第一荧光图片；（e）对第一荧光图片在所述选定区域内的包含微球的每个微孔的亮度值求和，以该亮度值之和除以所述微孔总数来计算平均亮度值，作为特征值；（f）获得特征值对浓度的标准曲线；（g）根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。
在一些实施方式中，步骤（a）中所述的提供微孔包括提供位于微流体装置的通道中的微孔。
在一些实施方式中，步骤（b）中所述密封包括使用油进行密封。
在一些实施方式中，步骤（b）包括使用波长为492~577 nm的光照射微孔10至100秒。
在一些实施方式中，步骤（d）进一步包括对第一荧光图片进行预处理以排除异常光斑。进一步地，在一些实施方式中，所述预处理包括基于深度学习的目标检测。
在一些实施方式中，在步骤（c）中，使用白光照射所述至少一部分检测微球以获得所述微球图片。
在一些实施方式中，在步骤（c）中，所述检测微球包含荧光染料，并且激发所述荧光染料以使检测微球发出第二荧光从而获得所述微球图片，所述第二荧光不同于所述第一荧光。
在一些实施方式中，在步骤（c）中，所述选定区域是微球图片的全部区域。
在一些实施方式中，在步骤（d）中，所述预定时间段为5至1000秒。在一些实施方式中，所述预定时间段为20至500秒。
在一些实施方式中，在步骤（e）中，所述每个微孔的亮度值是以9×9个像素显示的单个微孔的平均亮度值或是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度值总和。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（iii）加入报告分子；（iv）加入底物；（v）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii-iv-v或i/ii/iii/v-iv，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。在一些实施方式中，第一配体和第二配体是抗目标分子的不同抗体。在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷（CAS号：95079-19-9）。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体； （iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。在一些实施方式中，第一配体和第二配体是抗目标分子的不同抗体。在一些实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个。在一些实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷（CAS号：95079-19-9）。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述检测微球的表面修饰有第一亲和元件，第一配体通过第二亲和元件结合第一亲和元件，步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球；（iii）加入第一配体；（iv）加入报告分子；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。在一些实施方式中，第一配体和第二配体是抗目标分子的不同抗体。在一些实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个。在一些实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷（CAS号：95079-19-9）。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，所述检测微球的表面修饰有第三亲和元件，第一配体通过第四亲和元件结合第三亲和元件，所述第三亲和元件和第四亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，并且步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球、第一配体，并且在第一、第二亲和元件与第三、第四亲和元件之间存在交叉反应可能时加入封闭剂，所述封闭剂封闭第三亲和元件，在进行下一步之前去除过量封闭剂；（iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。在一些实施方式中，第一配体和第二配体是抗目标分子的不同抗体。在一些实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个。在一些实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。在一些实施方式中，第一亲和元件与第二亲和元件的组合，以及第三亲和元件与第四亲和元件的组合，独立地选自：（a）生物素和链霉亲和素；（b）生物素和亲和素。在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷（CAS号：95079-19-9）。
在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是荧光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷（FDG，CAS号：17817-20-8）。在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷（CAS号：95079-19-9）。在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷（CAS号：6160-78-7）。在其他实施方式中，催化剂可以是碱性磷酸酯酶，底物可为4-甲基伞形酮磷酸盐；或催化剂可为辣根过氧化物酶，底物可为对羟基苯乙酸。
在一些实施方式中，所述目标分子的浓度为0.1 zM至100 pM。在一些实施方式中，所述目标分子是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，所述微球是聚合物微球或磁珠。
在一些实施方式中，所述方法不包括单独对连接有目标分子的微球进行计数。
在一些实施方式中，所述目标分子包括多种类型，所述检测微球也包括对应的多种类型，并且所述报告分子也包括对应的多种类型。
本发明的另一个方面提供一种计算机可读介质，其上存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被执行时进行本发明所述的任何一种方法。
本发明的再一个方面提供一种分析设备，其包括计算机控制***和微流体设备，其中所述计算机控制***包含所述计算机可读介质。在一些实施方式中，其中所述微流体设备包含通道，所述通道包括复数个微孔，每个微孔用于容纳一个或多个微球。在一些实施方式中，其中每个微孔的体积为1飞升至1皮升。
本发明提供的方法对密封后的微孔进行荧光漂白，特征值和浓度成正比，浓度越大，特征值也越大。相邻的两个浓度有明显的区分度，例如一个实验中两倍梯度稀释的两个相邻浓度的特征值比值在1.4以上，特征值和浓度曲线趋势好。数据CV均在20%以下。特征值的范围更大，增加了信号响应的灵敏度。本发明提供的方法在所有测定浓度范围内具有极佳的连续性，特征值与浓度的标准曲线的相关系数极高，解决了现有技术中在高浓度和低浓度分别使用模拟算法和数字算法而带来的数据不连续问题。同时，本发明的方法不需要判断每个微球是否连接有目标分子（即“激活”或“on”），简化了方法的复杂度，同时维持了高检测精确度。此外，油封流程之前，底物已经与酶溶液混合一定时间，部分底物已被催化，生成荧光物质；油封流程之后，包含荧光物质的溶液进入微孔，此时微孔存在较高初始荧光信号，且不同微孔分布不均匀；通过光漂白，这些初始荧光信号能够被大幅消除，避免对于计算的干扰。
附图说明
本发明将参考附图进行更详细的描述。需要注意的是，图示的方案仅作为本发明实施方式的代表性示例，并且为更清楚地阐释示例性实施方式的细节，附图中的元件并非按实际尺寸等比例绘制，实际元件的数量可以变化，实际元件的相对位置关系与图示基本保持一致，并且某些元件并未示出。在存在多个实施例的情况下，当在之前实施例中已描述的一个或多个特征也可以适用于另一个实施例时，为简要起见，在后的一个或多个实施例不再赘述这些可重复适用的特征，该在后的一个或多个实施例应被理解为已描述了这些可重复适用的特征，除非另有说明。本领域技术人员在阅读本发明后将意识到，在一个图中显示的一个或多个特征可以与在另一个图中的一个或多个特征组合，以构建出一个或多个未在附图中具体示出的替代性实施方式，这些替代性实施方式也构成本发明的一部分。
图1示意性显示根据本发明的一个实施方式的测定样品中目标分子的方法的流程示意图。
图2根据本发明的一个实施例进行光漂白的效果示例。
图3中的A至D显示本发明的一个实施例激发荧光染料获得的微球荧光图片及其局部示意图。
图4中的A至D显示本发明的一个实施例催化底物发出荧光而获得的第一荧光图片及其局部示意图。
图5显示根据本发明的一个实施例获得的特征值和浓度的标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的示例性实施方式。需要理解的是，本发明的范围不限于所公开的实施方式，本领域技术人员在阅读本发明公开的内容后，基于本发明的启示，可对这些示例性实施方式进行修改和变化，而无需付出创造性劳动，这些修改与变化也被包含在所附权利要求书概括的范围内。
图1显示了根据本发明的方法的一个实施方式的流程示意图。方法100是一种测定目标分子的浓度的方法，该目标分子通常被包含在样品（例如生物样品）中。该方法用于检测样品中是否存在该目标分子，以及如果存在，以何种浓度存在该目标分子。因此，该方法100可用于目标分子的定性和定量测定。目标分子可以是化学或生物学分子，包括但不限于蛋白质分子，例如细胞因子（如IL-12、IL-6等）或抗体（如PD-1抗体等）；以及核酸分子，例如DNA或RNA。其他合适的目标分子例如是抗原分子（如Aβ1-42）、基因片段或融合蛋白。生物样品可以是例如来源于人体或动物体的血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织液或其他液体，也可以是来源于实验室的培养液、细胞或组织处理液（例如组织匀浆或细胞裂解液）。在这些生物样品中可能包含或不包含目标分子。
方法100开始于步骤102，其提供微孔，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂。
在步骤102中，提供微孔可通过提供微流体装置来实现，该微流体装置包括入口和出口以及流体连通入口和出口的通道。该通道可在其侧方或底部设置复数个微孔，例如数百至数万个微孔，每个微孔的尺寸可容纳一个或多个微球，因而将微球在空间上相互隔离。例如每个微孔的体积可为约1飞升至约1皮升。在本发明中，在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球。因此，一些微孔不含微球，而另一些微孔包含一个或多个微球。在包含微球的微孔中，该微球可能偶联有目标分子，也可能未偶联有目标分子。本发明的方法不涉及对偶联有目标分子的微球进行单独计数，如后详述。在其他实施方式中，每个微孔的尺寸仅可容纳一个微球，因而一些微孔不含微球，而另一些微孔仅包含一个微球。检测微球可以是本领域常用的任何微球，例如聚合物微球或磁珠。聚合物微球的例子可参见CN111318238 B中的复合微球。作为一个例子，该检测微球上偶联或编码有荧光染料，例如是CY5荧光染料。
在本发明中，在微孔中，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂。第一配体例如是特异性结合目标分子的配体，例如抗目标分子的抗体，第一配体直接或间接偶联至检测微球的表面。在本发明中报告分子能够特异性结合所述目标分子，并且直接或间接地偶联有催化剂，所述催化剂能够催化底物发出第一荧光。例如，报告分子包含第二配体，其特异性结合至目标分子，第二配体例如是抗目标分子的抗体，其与第一配体结合目标分子的不同表位。因此，在第一配体、目标分子和报告分子（第二配体）之间就形成了“三明治”结构（或称夹心结构），其中目标分子被第一配体和报告分子夹在中间。
有多种形成所述三明治结构的方式。在一些实施方式中，报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述第二配体不同于所述第一配体，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（iii）加入报告分子；（iv）加入底物；（v）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为i/ii/iii-iv-v或i/ii/iii/v-iv，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。例如，在顺序i/ii/iii-iv-v中，步骤（i）、（ii）和（iii）的顺序可任何调换，并在这三个步骤完成之后依次进行步骤（iv）和步骤（v）。
在另一些实施方式中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在另一些实施方式中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述检测微球的表面修饰有第一亲和元件，第一配体通过第二亲和元件结合第一亲和元件，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球；（iii）加入第一配体；（iv）加入报告分子；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在另一些实施方式中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，所述检测微球的表面修饰有第三亲和元件，第一配体通过第四亲和元件结合第三亲和元件，所述第三亲和元件和第四亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球、第一配体，并且在第一、第二亲和元件与第三、第四亲和元件之间存在交叉反应可能时加入封闭剂，所述封闭剂封闭第三亲和元件，在进行下一步之前去除过量封闭剂；（iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在上述任何一个实施方式中，步骤（i）至（v）或步骤（i）至（vi）的任何两个、三个、四个或全部步骤之间包括一个或多个洗涤步骤。在一些实施方式中，可在步骤（i）至（v）或步骤（i）至（vi）的每个步骤之间进行一个或多个洗涤步骤。在一些实施方式中，可在步骤（i）至（v）或步骤（i）至（vi）中的其中两个步骤之间进行一个或多个洗涤步骤。洗涤步骤可通过导入与样品相溶的缓冲液（例如PBS或生理盐水）来洗涤微球和/或微孔，以去除与微球所偶联的配体非特异性结合或未与其结合的成分和/或非特异性结合或未结合的报告分子，以尽可能排除非特异性结合或目标分子之外的成分对测定造成的干扰。例如，在使用磁珠的情况下，可在磁珠与样品混合后通过施加磁场以固定磁珠（因而固定了与磁珠上的第一配体特异性结合的目标分子），通过导入PBS缓冲液以清除样品中未与磁珠上的配体特异性结合的成分（例如血浆中的非目标分子蛋白）。
在上述任何一个实施方式中，第一配体和第二配体可以是抗目标分子的不同抗体。例如在目标分子是IL-15分子时，第一配体是抗IL-15的第一抗体，第二配体是抗IL-15的第二抗体，第一抗体和第二抗体结合IL-15的不同表位。
在上述任何一个实施方式中，所述第一亲和元件可以是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个。在上述任何一个实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。在上述任何一个实施方式中，所述第三亲和元件可以是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第四亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个。在上述任何一个实施方式中，所述第三亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第四亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。在一个实施方式中，第一亲和元件与第二亲和元件的组合，以及第三亲和元件与第四亲和元件的组合，独立地选自：（a）生物素和链霉亲和素；和（b）生物素和亲和素。
在一些实施方式中，所述封闭剂是亲和素封闭剂，例如偶联生物素的牛血清白蛋白（BSA）或聚乙二醇（PEG）。在一些实施方式中，所述封闭剂是生物素封闭剂，例如偶联亲和素或链霉亲和素的BSA或PEG。
在步骤102中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷（CAS号：95079-19-9）。如前文所述，其他合适的催化剂和底物对包括催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是荧光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷（FDG，CAS号：17817-20-8）或催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷（CAS号：6160-78-7）等等。
在步骤104中，密封微孔以使每个微孔之间流体隔离，并对密封后的微孔进行光漂白。密封可包括对上述每个单独的微孔进行密封，从而流体隔离每个微孔，因此微孔中的缓冲液以及微球之间彼此隔离，以尽可能屏蔽微孔/微球之间荧光污染。在一些实施例中，密封可包括将密封油导入微流体装置中，密封油一方面清除通道中残留的微球和/或报告分子，另一方面因与微孔中的缓冲液不互溶而密封各个微孔。合适的密封油可以是矿物油、氟化油或硅油。如上所述，在一些微孔中存在微球，而在另一些微孔中不存在微球。本发明的光漂白步骤不区分微孔中是否存在微球，两种微孔均被光漂白。光漂白可以在密封微孔之后立刻进行，例如在1至30秒之内进行，也可以在密封预定一段时间后（例如30至100秒或更长时间段）进行。在优选的实施方式中，光漂白在密封微孔后立刻进行。任何合适的光漂白手段在本发明中都是合适的，只要能够消除密封后微孔中的荧光。光漂白可通过调节光的波长、强度、功率和照射时间来实现。例如光漂白可以是以波长为492~577nm的光照射微孔10至100秒，例如以520 nm波长、40 mW的光，照射60秒。通常，更高的功率使得需要较短的时间。本领域技术人员可以通过简单的实验确定合适的功率、波长、强度和/或时间，以实现光漂白。
在本发明中，光漂白的效率可以为至少30%，其表示为因漂白而减少的荧光亮度与漂白前的荧光亮度的比率。例如，所述荧光亮度可基于选定区域的荧光亮度总和。例如，光漂白的效率为至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、或约100%。在优选的实施方式中，光漂白的效率为至少80%至约100%。
图2显示了验证本发明光漂白的效果的一个示例。以520 nm波长、40 mW的光，间隔1秒连续曝光50次，每次照射约4.5秒，计算含微球微孔的亮度均值，以曝光后的亮度均值为纵坐标，曝光次数为横坐标，绘制曲线。可见，每次曝光都导致含微球的微孔的亮度均值持续下降，且基本呈线性，因此曝光导致的漂白效果基本一致。基于该验证实验，在本发明的一个实施例中，以520 nm波长、40 mW的光，照射60秒来进行光漂白。单个微孔亮度均值或多个微孔亮度均值的计算方法将在下文详细叙述。
在方法100中，步骤106包括获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定区域内的包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数。在一个实施方式中，检测微球编码或偶联有荧光染料，荧光染料可被激发而发射荧光，通过例如荧光照相机可采集荧光信号而形成荧光图片，用于定位荧光微球，例如使用激光光源激发荧光染料（如CY5荧光染料），以获得微球荧光图片，并基于该荧光图片定位含有微球的每个微孔。在另一个实施方式中，检测微球不编码或偶联有荧光染料，使用白光照射微球，通过常规照相机以获得微球图片，并基于该微球图片定位含有微球的每个微孔。在一些实施方式中，可将CY5荧光图片进行高斯模糊处理分析其轮廓，并获取每个微孔的坐标位置。在一些实施例中，对于CY5荧光图片的处理可通过计算机软件实现，例如OpenCV 2.0及以上。在本文中，为方便表述，在检测微球偶联或编码荧光染料的情况下，其被激发而发出的荧光称为第二荧光，而报告分子催化底物发出的荧光被称为第一荧光，所述第二荧光和第一荧光不同。
图3A显示了通过以上方法获得的CY5荧光图片，该图片覆盖了所有微孔的80%至90%。在其他实施例中，可以使图片覆盖所有微孔的100%。在其他实施例中，可以使图片覆盖少于所有微孔的80%。图3B是图3A的图中虚线部分的局部放大图，一个白色亮点表示存在微球（亦即对应的微孔，下同），未显示亮点的位置表示对应微孔不存在微球。图3C是图3B的进一步局部放大图。图3D是单个微孔（亮点）的最大像素放大图。在图3D中，单个微孔以9×9个像素显示。可以预期的是，使用不同分辨率的相机可使得单个微孔以更高或更低像素显示。
在本发明的一个实施例中，对于单个微孔，以9×9个像素的亮度均值作为其荧光亮度。例如，对于图3D所示的单个微孔，以9×9个像素的亮度值总和除以81以获得该单个微孔的亮度均值。以同样的方法可以获得图片中选定区域内的所有包含微球的微孔的亮度均值。例如，对于选定区域内所有包含微球的微孔，分别按上述方法求出每个包含微球的微孔的亮度均值，再将选定区域内所有包含微球的微孔的亮度均值求和并除以选定区域内所有包含微球的微孔的个数，作为选定区域内包含微球的微孔的平均亮度值。在本发明的另一个实施例中，对于单个微孔，以9×9个像素的亮度总和作为其荧光亮度。在本发明的优选实施例中，该选定区域覆盖图片的整个区域。在其他实施例中，该选定区域可占据图片的整个区域的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。在其他实施例中，该选定区域可占据图片的整个区域的少于50%、少于40%、少于30%或更少。
在本发明中，利用软件对微孔进行计数，而不论该微孔中的微球是否偶联有目标分子。在一些实施方式中，对微球图片（例如荧光微球图片）的整个区域的包含微球的微孔进行计数。在另一些实施方式中，对微球图片的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的区域的包含微球的微孔进行计数。
步骤108在步骤106之后进行，其使隔离的微孔孵育预定的时间段，然后获得对应于第一荧光的第一荧光图片。在一个实施例中，所述预定时间段为5至1000秒。在优选的实施方式中，所述预定时间段为300至500秒，例如300秒、400秒或500秒。在一些实施方式中，微球图片和第一荧光图片对齐，以使得第一荧光图片中采集位置与微球图片的采集位置相同，从而方便后续计算。
图4A显示了催化底物后获得的第一荧光图片，其具有与微球图片相同的像素，并与微球图片对齐，以使得相应像素所对应的微孔位置是相同的。图4B和4C是图4A中虚线区域的局部放大图，其中箭头表示部分在漂白后经孵育又发出荧光的微孔。这些微孔的荧光亮度值将被作为计算总亮度值的基础，详见下文。
在一些实施方式中，步骤108可进一步包括对第一荧光图片进行预处理以排除异常光斑，例如因气泡、杂质等引起的异常光斑。所述预处理可包括基于深度学习的目标检测。
在步骤108之后进行步骤110，其中对第一荧光图片选定区域内的每个包含微球的微孔的亮度值求和，以该亮度值之和除以微球图片的对应选定区域内的所述微孔总数来计算平均亮度值，作为特征值。在一个实施例中，平均亮度值是第一荧光图片中所有包含微球的微孔的亮度值总和除以根据微球图片所计数的微孔总数。例如，在微球图片中（例如CY5荧光图片），包含微球的微孔计数为2000个。这2000个微孔在步骤104被光漂白时无可检测荧光，但经步骤108的孵育时间段后，微孔中的报告分子持续催化底物以生成荧光物质，而能够在步骤108时被检测到，这样的报告分子对应的微孔可被称为“再发光微孔”，其数量通常少于前述2000个，例如1000、500、300、100或更少。在步骤108中，按上述针对单个微孔的方法（例如图4D的9×9像素的单个再发光微孔）将第一荧光图片中的所有再发光微孔的亮度值逐个相加以获得总亮度值，再将总亮度值除以2000（即微球图片中计数的包含微球的微孔总数），得到平均亮度值，以该平均亮度值作为特征值。
在其他实施例中，也可以仅对第一荧光图片中的局部区域进行再发光微孔的总亮度值计算，例如可仅对第一荧光图片中的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的区域进行再发光微孔的总亮度值计算。但需要注意的是，这种情况下获得的总亮度值需要除以对应局部区域在微球图片中所计数的包含微球的微孔总数，以获得平均亮度值作为特征值。例如，当以第一荧光图片中的50%的区域进行再发光微孔的总亮度值计算时，该总亮度值应除以微球图片中对应50%区域的计数的包含微球的微孔总数以获得平均亮度值作为特征值。
在步骤112中，获得上述特征值对浓度的标准曲线。该标准曲线可以预先以已知浓度的目标分子或其他分子按照步骤102至112所述的方法建立。下表1和2显示了一个建立标准曲线的示例。
表1. 标准曲线的建立及评价
/>
。
表2. 该标准曲线的特征值的评价
。
标准曲线可以6个逐渐递增的浓度，每个浓度设置8个复孔，以蛋白质分子（如Aβ1-42）作为目标分子来建立。在上述实施例中，标准曲线的数据变异系数（CV），除浓度为0的组（S0）外，均在20%以下。在上述实施例中，相邻的两个浓度有明显的区分度，比值在1.4以上。图5显示了根据该实施例获得的特征值和浓度的标准曲线。
在获得标准曲线后，进行步骤114，根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。在一些实施方式中，目标分子的浓度在样品中处于极低水平，例如0.1 zM至100 pM，例如1 zM至100 fM，甚至更低。
在一些实施方式中，本发明的方法可同时分析样品中可能存在的两种或两种以上不同类型的目标分子，例如IL-12和IL-10。在这样的实施方式中，该方法使用对应于不同类型目标分子的不同类型的微球及不同类型的荧光染料，以及不同类型的报告分子，经由不同的荧光通道识别各不同类型的微球和报告分子。制备两种不同的荧光编码微球的方法可参见CN 111218498 A。
作为一个例子，按本发明所述的方法测试未知浓度的含Aβ1-42血清样品。测定其特征值为13.0883，CV为4.98%，按照相应标准曲线获得其对应浓度为0.7861 pg/ml。
本发明的另一个方面提供计算机可读介质，其上存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被执行时进行本发明以上所述的任何一种方法。该计算机可读介质可以包括作为包括磁盘（包括软盘）、光盘（包括CD-ROM（光盘只读存储器）和DVD（数字通用光盘））、磁光盘（包括MD（小型盘））或半导体存储器的封装介质的可移除介质。
本发明的另一个方面提供一种分析设备，其包括计算机控制***和微流体设备，其中所述计算机控制***包含本发明的计算机可读介质。
在一个实施例中，所述微流体设备包含通道，所述通道包括复数个微孔，每个微孔用于容纳至多一个微球。在一些实施方式中，每个微孔的体积为1飞升至1皮升。所述分析设备被配置以执行本发明所述的任何一种方法。
以上所述皆为本发明实施方式的代表性示例，且仅为说明性目的提供。本发明预期在一个实施方式中使用的一个或多个技术特征，在不违背实施方式的目的的情况下，可以添加至另一个实施方式中，以形成改进或替代的实施方式。同理，在一个实施方式中使用的一个或多个技术特征，在不违背实施方式的目的的情况下可以被省略或替代，以形成替代的或简化的实施方式。此外，在一个实施方式中使用的一个或多个技术特征，在不违背实施方式的目的的情况下，可与另一个实施方式中的一个或多个技术特征组合，以形成改进的或替代的实施方式。本发明意在包括所有以上改进的、替代的、简化的技术方案。

Claims (30)

1.一种使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括以下步骤：
（a）提供微孔，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂；
（b）密封微孔以使每个微孔之间流体隔离，并对密封后的微孔进行光漂白；
（c）获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定区域内包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数；
（d）使隔离的微孔孵育预定时间段，然后获得对应第一荧光的第一荧光图片；
（e）对第一荧光图片在所述选定区域内的包含微球的微孔的亮度值求和，以该亮度值之和除以所述微孔总数来计算平均亮度值，作为特征值；
（f）获得特征值对浓度的标准曲线；
（g）根据所述标准曲线以及目标分子的所述特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（a）中所述的提供微孔包括提供位于微流体装置的通道中的微孔。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b）中所述密封包括使用油进行密封。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b）包括使用波长为492~577 nm的光照射微孔10至100秒。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（d）进一步包括对第一荧光图片进行预处理以排除异常光斑。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述预处理包括基于深度学习的目标检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）中，使用白光照射所述至少一部分检测微球以获得所述微球图片。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）中，所述检测微球包含荧光染料，激发所述荧光染料以使检测微球发出第二荧光从而获得所述微球图片，所述第二荧光不同于所述第一荧光。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）中，所述选定区域是微球图片的全部区域。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（d）中，所述预定时间段为5至1000秒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤（d）中，所述预定时间段为20至500秒。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（e）中，所述每个微孔的亮度值是以9×9个像素显示的单个微孔的平均亮度值或是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度值总和。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；
（iii）加入报告分子；
（iv）加入底物；
（v）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii-iv-v或i/ii/iii/v-iv，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；
（iii）加入报告分子的所述第一部分；
（iv）加入报告分子的所述第二部分；
（v）加入底物；
（vi）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述检测微球的表面修饰有第一亲和元件，第一配体通过第二亲和元件结合第一亲和元件，步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球；
（iii）加入第一配体；
（iv）加入报告分子；
（v）加入底物；
（vi）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
16.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，所述检测微球的表面修饰有第三亲和元件，第一配体通过第四亲和元件结合第三亲和元件，所述第三亲和元件和第四亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，并且步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球、第一配体，并且在第一、第二亲和元件与第三、第四亲和元件之间存在交叉反应可能时加入封闭剂，所述封闭剂封闭第三亲和元件，在进行下一步之前去除过量封闭剂；
（iii）加入报告分子的所述第一部分；
（iv）加入报告分子的所述第二部分；
（v）加入底物；
（vi）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
17.根据权利要求13、14或15任一项所述的方法，其中步骤（i）至（vi）的任何两个、三个、四个或全部步骤之间包括一个或多个洗涤步骤。
18.根据权利要求13、14、15或16任一项所述的方法，其中第一配体和第二配体是抗目标分子的不同抗体。
19.根据权利要求14或15任一项所述的方法，其中：
（a）所述第一亲和元件是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个；或者
（b）所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。
20.根据权利要求16所示的方法，其中第一亲和元件与第二亲和元件的组合，以及第三亲和元件与第四亲和元件的组合，独立地选自：
（a）生物素和链霉亲和素；
（b）生物素和亲和素。
21.根据权利要求1、13、14、15或16任一项所述的方法，其中所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子的浓度为0.1 zM至100 pM。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子是蛋白质或核酸。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测微球是聚合物微球或磁珠。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括单独对连接有目标分子的微球进行计数。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子包括多种类型，所述检测微球也包括对应的多种类型，并且所述报告分子也包括对应的多种类型。
27.一种计算机可读介质，其上存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被执行时进行权利要求1至26任一项所述的方法。
28.一种分析设备，其包括计算机控制***和微流体设备，其中所述计算机控制***包含权利要求27所述的计算机可读介质。
29.根据权利要求28所述的分析设备，其中所述微流体设备包含通道，所述通道包括复数个微孔，每个微孔用于容纳一个或多个检测微球。
30.根据权利要求28所述的分析设备，其中每个微孔的体积为1飞升至1皮升。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117871418A (zh) * 2024-03-13 2024-04-12 彩科(苏州)生物科技有限公司 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144815A (zh) * 2006-09-13 2008-03-19 广州市达瑞抗体工程技术有限公司 一种液相蛋白芯片的制备方法
CN103837675A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 常艳敏 多组分同时定量分析的均相发光免疫分析方法及其所使用的试剂盒
WO2015122835A1 (en) * 2014-02-13 2015-08-20 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for protein analysis
CN105137079A (zh) * 2015-07-22 2015-12-09 田峰 鳞状细胞癌抗原测定***
CN109374903A (zh) * 2018-10-08 2019-02-22 杭州康知生物科技有限公司 一种超灵敏il-6荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法
CN110361370A (zh) * 2019-07-31 2019-10-22 深圳中山泌尿外科医院 一种基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法
JP2020000197A (ja) * 2018-06-29 2020-01-09 キヤノン株式会社 計数方法、濃度測定装置及び濃度測定システム
CN111060482A (zh) * 2019-12-09 2020-04-24 彩科(苏州)生物科技有限公司 一种基于微球和微孔板的检测设备及其使用方法
CN111273000A (zh) * 2020-02-21 2020-06-12 东南大学 一种数字elisa检测装置与检测方法
CN112229774A (zh) * 2020-12-17 2021-01-15 生物岛实验室 一种检测分子的方法和装置
WO2021114040A1 (zh) * 2019-12-09 2021-06-17 彩科(苏州)生物科技有限公司 一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法
US11053540B1 (en) * 2020-01-17 2021-07-06 Element Biosciences, Inc. High performance fluorescence imaging module for genomic testing assay
CN113189074A (zh) * 2021-05-11 2021-07-30 深圳技术大学 一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法
CN214097087U (zh) * 2020-12-17 2021-08-31 生物岛实验室 一种检测装置
CN114441483A (zh) * 2020-10-30 2022-05-06 京东方科技集团股份有限公司 检测装置、芯片的制造方法及蛋白质类标志物的检测方法
CN116590147A (zh) * 2023-05-25 2023-08-15 上海相宜本草化妆品股份有限公司 体外类皮肤组织培养多因子检测的装置、***和方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7622294B2 (en) * 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
EP2930497A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-14 Institut Pasteur Enzyme-independent photon emission
EP4165389A1 (en) * 2020-07-24 2023-04-19 Bioland Laboratory Methods and apparatus for detecting molecules

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144815A (zh) * 2006-09-13 2008-03-19 广州市达瑞抗体工程技术有限公司 一种液相蛋白芯片的制备方法
WO2015122835A1 (en) * 2014-02-13 2015-08-20 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for protein analysis
CN103837675A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 常艳敏 多组分同时定量分析的均相发光免疫分析方法及其所使用的试剂盒
CN105137079A (zh) * 2015-07-22 2015-12-09 田峰 鳞状细胞癌抗原测定***
JP2020000197A (ja) * 2018-06-29 2020-01-09 キヤノン株式会社 計数方法、濃度測定装置及び濃度測定システム
CN109374903A (zh) * 2018-10-08 2019-02-22 杭州康知生物科技有限公司 一种超灵敏il-6荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法
CN110361370A (zh) * 2019-07-31 2019-10-22 深圳中山泌尿外科医院 一种基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法
WO2021114040A1 (zh) * 2019-12-09 2021-06-17 彩科(苏州)生物科技有限公司 一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法
CN111060482A (zh) * 2019-12-09 2020-04-24 彩科(苏州)生物科技有限公司 一种基于微球和微孔板的检测设备及其使用方法
US11053540B1 (en) * 2020-01-17 2021-07-06 Element Biosciences, Inc. High performance fluorescence imaging module for genomic testing assay
CN111273000A (zh) * 2020-02-21 2020-06-12 东南大学 一种数字elisa检测装置与检测方法
CN114441483A (zh) * 2020-10-30 2022-05-06 京东方科技集团股份有限公司 检测装置、芯片的制造方法及蛋白质类标志物的检测方法
CN112229774A (zh) * 2020-12-17 2021-01-15 生物岛实验室 一种检测分子的方法和装置
CN214097087U (zh) * 2020-12-17 2021-08-31 生物岛实验室 一种检测装置
CN113189074A (zh) * 2021-05-11 2021-07-30 深圳技术大学 一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法
CN116590147A (zh) * 2023-05-25 2023-08-15 上海相宜本草化妆品股份有限公司 体外类皮肤组织培养多因子检测的装置、***和方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A high sensitivity method for detecting IL-4 and IL-6 in serum of uremic patients;Shuang-song Lv et al.;Proc. of SPIE;20221231;全文 *
刘民 ; 汤华 ; 杨洋 ; 浦永 ; 董卓亮 ; 李欣 ; .促甲状腺激素液相芯片检测法的建立和方法学评价.检验医学.2009,(第01期),全文. *
新型分子印迹荧光传感器的构建与应用;贾梦凡;张忠;杨兴斌;李金花;陈令新;;中国科学:化学;20170320(第03期);全文 *

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