CN117377866A - 用于分析生物样品的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

一种用于分析生物样品(1002)的方法，包括：提供多种标记物(1612)，每种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)包含所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的荧光染料(1320)和所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的亲和试剂(1310至1319)，所述亲和试剂(1310至1319)被配置为附着至所述样品(1002)内的预定结构(1706至1714)。通过将所述多种标记物(1612)引入到所述样品(1002)中来对所述样品(1002)进行染色。将具有第一波长谱的第一激发光引导到所述样品(1002)上，以便激发第一标记物组(1614)的荧光染料(1320)。从所述第一组(1614)的受激发染料发射的荧光产生至少一个第一图像，所述第一图像包括至少两个通道，每个通道对应于所述第一标记物组(1614)的一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)。将具有第二波长谱的至少一个第二激发光引导到所述样品(1002)上，以便激发第二标记物组(1616)的荧光染料(1320)，所述第二组(1616)不同于所述第一组(1614)。从所述第二组(1616)的受激发染料发射的荧光产生至少一个第二图像，所述第二图像包括至少两个通道，每个通道对应于所述第二标记物组(1616)的一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)。

Description

用于分析生物样品的方法和装置
技术领域
本发明涉及一种用于分析生物样品的方法。此外，本发明涉及一种用于分析生物样品的装置。
背景技术
为了解决生命科学领域的关键问题，精确鉴定和定位生物样品(例如组织样品或细胞培养物)中的某些结构至关重要。这可以通过向样品中引入与特定结构(例如特定生物分子)结合的标记物来完成。这些标记物通常包含附着至所讨论的结构的亲和试剂和直接缀合至亲和试剂或通过第二亲和试剂附着至亲和试剂的荧光染料。它们是用于分析以此方式制备的生物样品的各种技术。已知技术具有高空间分辨率，或者可以识别大量不同的荧光染料。然而，没有技术允许以高空间分辨率对大量不同的荧光进行成像。
荧光显微镜允许以高空间分辨率对样品进行成像，但仅涉及少量不同的荧光染料，通常为1至5种。可用的标记物必须适应用于鉴定细胞类型的标记物、功能标记物(如感兴趣的蛋白质)和同一实验中的一般形态标记物。这意味着大多数成像实验中的细胞类型很难被鉴定。这意味着正在研究相当广泛的多细胞类型群体，这严重限制了所产生结果的预测能力和转化价值。虽然存在现代方法可以更可靠、更稳健地识别细胞类型，例如根据遗传调控网络(GRN)的分析，但是它们需要从样品中读出更多数量的不同标记物。
虽然在相邻的细胞计数领域，质谱流式细胞术和成像质谱流式细胞术技术可以区分大约12至30种不同的标记物，但它们具有低空间分辨率。
空间分析技术(Spatial profiling technique)可以区分高出几个数量级的许多不同的标记物，即使在甚至更低的空间分辨率下，这是因为它们基于将寡核苷酸与样品杂交，然后以区域选择性方式选择性地释放结合的寡核苷酸，然后对释放的寡核苷酸进行下一代测序。
发明内容
因此，一个目的是提供用于分析生物样品的方法和装置，其允许以高空间分辨率分析增加数量的标记物组。
上述目的通过独立权利要求的主题来实现。在从属权利要求和下面的描述中限定了有利的实施方案。
用于分析生物样品的方法包括以下步骤：a)提供多种标记物，每种标记物包含该标记物特有的荧光染料和该标记物特有的亲和试剂，该亲和试剂被配置成附着至样品内的预定结构。b)通过将多种标记物引入样品中来对样品进行染色。将具有第一波长谱的第一激发光引导到样品上以便激发第一标记物组的荧光染料。从第一组的受激发染料发射的荧光产生至少一个第一图像，该第一图像包括至少两个通道，每个通道对应于该标记物组中的一种标记物。将具有第二波长谱的至少一个第二激发光引导到样品上，以便激发第二标记物组的荧光染料，该第二组不同于第一组。从第二组的受激发染料发射的荧光产生至少一个第二图像，该第二图像包括至少两个通道，每个通道对应于第二标记物组中的一种标记物。
每种标记物将其特有的荧光染料靶向生物样品(例如特定生物分子)中的预定结构。因此，标记物使结构对于荧光成像可见。多种标记物被分成至少两组，即第一组，其包括由第一激发光激发的荧光染料，以及至少第二组，其包括由第二激发光激发的荧光染料。这意味着，每组可以被不同的激发光独立地激发，因此，每组发射的荧光也可以被独立地检测。这用于产生生物样品的至少两个图像，每个图像捕获由不同组发射的荧光。在每个图像中，不同的荧光染料被激发，因此可以看到样品的不同结构。每个图像中捕获的荧光被进一步分成不同的通道，每个通道对应于单一标记物。然后，可以将图像和/或通道组合成单个图像，该单个图像包括比用单个图像可能捕获的通道更多的通道。
因此，上述方法极大地增加了可成像的标记物的数量，而无需将先前的标记物去除或失活，并且无需额外的染色。如果例如每组包括y种标记物，并且使用n个不同的激发光来生成n个不同的图像，则可以成像的独特标记物的数量为n×y。此外，该方法很容易适用于荧光显微镜，从而能够以非常高的空间分辨率对生物样品进行成像。
该方法很容易适用于捕获样品的另外的图像。为此目的，将具有另外的波长谱的另外的激发光引导到样品上，以便激发另外的标记物组的荧光染料。另外的组与其它组不同。然后，从另外的组的受激发染料发射的荧光产生另外的图像。另外的图像包括至少两个通道，每个通道对应于另外的标记物组中的一种标记物。
亲和试剂特别可以是抗体、单域抗体(也称为纳米抗体)、至少两个单域抗体的组合、适体、与预定靶序列互补的寡核苷酸、配体或毒素，例如鬼笔环肽，其为与肌动蛋白丝结合的毒素。
在本文件中，词语标记物用于表示用作标记物的单个分子和用作标记物的相同分子的集合。此外，术语“荧光染料”、“荧光团”、“荧色物”可互换使用以表示荧光化合物或结构。特别地，以下之一：有机荧光染料、荧光量子点、荧光碳点、石墨烯量子点或其它基于碳的荧光纳米结构、荧光蛋白、基于荧光DNA折纸的纳米结构。在有机荧光染料中，特别是指以下的衍生物：呫吨(例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、得克萨斯)、花青(例如花青(cyanine)、吲哚碳花青(indocarbocyanine)、氧杂碳花青(oxacarbocyanine)、硫碳花青(thiacarbocyanine)、部花青(merocyanine))、衍生物、方酸轮烷衍生物、萘、香豆素、噁二唑、蒽(蒽醌、DRAQ5、DRAQ7、CyTRAK橙)、芘(级联蓝)、噁嗪(尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)、吖啶(原黄素、吖啶橙、吖啶黄)、芳基次甲基(arylmethine)(金胺、结晶紫、孔雀石绿)、四吡咯(卟吩(porphin)、酞菁、胆红素)、二吡咯亚甲基(BODIPY、氮杂-BODIPY)。以下商标组表示市售荧光染料，其中可能包括属于不同化学家族的染料：CF染料(Biotium)、DRAQ和CyTRAK探针(BioStatus)、BODIPY(Invitrogen)、EverFluor(Setareh Biotech)、AlexaFluor(Invitrogen)、Bella Fluore(Setareh Biotech)、DyLight Fluor(ThermoScientific)、Atto和Tracy(Sigma-Aldrich)、FluoProbes(Interchim)、Abberior染料(Abberior Dyes)、Dy和MegaStokes染料(Dyomics)、Sulfo Cy染料(Cyandye)、HiLyteFluor(AnaSpec)、Seta、SeTau和Square染料(SETA BioMedicals)、Quasar和Cal Fluor染料(Biosearch Technologies)、SureLight染料(Columbia Biosciences)、Vio染料(MiltenyBiotec)。上述列表改编自en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore。在荧光蛋白的组中，绿色荧光蛋白(GFP)家族的成员，包括GFP和GFP样蛋白(例如DsRed、TagRFP)及它们的(单体化)衍生物(例如EBFP、ECFP、EYFP、Cerulaen、mTurquoise2、YFP、EYFP、mCitrine、Venus、YPet、Superfolder GFP、mCherry、mPlum)在本文的意义上特别是指术语“荧光染料”。此外，在荧光蛋白的组中，本文的意义上的术语“荧光染料”可以包括荧光蛋白，其吸光度或发射特性随着配体(例如BFPms1)的结合而变化，或者响应于环境的变化(例如氧化还原敏感的roGFP或pH敏感变体)而变化。此外，在荧光蛋白的组中，本文意义上的术语“荧光染料”可以包括蓝藻藻胆蛋白小超红色荧光蛋白smURFP的衍生物以及可以衍生自smURFP的荧光蛋白纳米颗粒。荧光蛋白的概述可以在Rodriguez等人Trends Biochem Sci.2017Feb；42(2):111-129中找到。在本文的意义上，术语“荧光染料”还可以指荧光量子点。本文意义上的术语“荧光染料”还可以指荧光碳点、荧光石墨烯量子点、荧光碳基纳米结构，如Yan等人2019年在Microchimica Acta(2019)186:583以及Iravani和Varma 2020年在Environ ChemLett.2020Mar 10:1-25中所述。
在一个优选实施方案中，至少一种标记物包含该标记物特有的荧光染料，其缀合至该标记物特有的亲和试剂。亲和试剂被配置为附着至样品内的预定结构。荧光染料直接附着(例如通过化学连接)至亲和试剂减少了在荧光染料与预定结构连接之前需要发生的反应的数量。从而节省了时间。它进一步降低了噪音并限制了交叉反应的可能性，交叉反应可能会给分析带来误差。在亲和试剂是抗体或单域抗体的情况下，这也称为初级或直接免疫荧光。
在另一个优选实施方案中，至少一种标记物包含该标记物特有的荧光染料、该标记物特有的第一亲和试剂以及该标记物特有的第二亲和试剂。荧光染料与第二亲和试剂缀合。第一亲和试剂被配置为附着至样品内的预定结构。第二亲和试剂被配置为附着至第一亲和试剂。这样，多个第二亲和试剂可以附着至单个第一亲和试剂上，从而增强整体信号强度并使分析更加可靠。如果亲和试剂是抗体或单域抗体，这也称为次级或间接免疫荧光。
在另一个优选实施方案中，将以下步骤重复至少两次，以便产生样品的一系列图像：对样品进行染色。将第一激发引导到样品上。生成第一图像。将第二激发引导到样品上。生成第二图像。权利要求1中定义的步骤描述了单轮图像采集。可以执行额外的轮次以便获取样品的一系列图像。特别地，可以使用一系列后续图像以便观察样品中随时间发生的变化。
在另一个优选实施方案中，该方法还包括使多种标记物、至少一个标记物组、至少一种标记物中的至少一者失活的步骤。在本文件中，使一种或多种标记物失活意味着防止相关的荧光染料将来从样品中发射荧光。这可以通过从样品中去除荧光染料或通过使荧光染料褪色来完成。因此，与不同标记物组相关的荧光染料之间的串扰大大减少。换句话说，通过使标记物组失活，由所述组标记的结构在未来的图像中将不可见。这意味着，例如，具有相似发射光谱的荧光染料可用于后续图像中，从而增加可在单轮、单次实验和/或单个生物样品中使用的总体标记物的数量。
优选地，失活步骤通过使至少一种标记物特有的荧光染料褪色和从样品中去除至少一种标记物中的至少一者来完成，优选地通过将荧光染料从亲和试剂解离或裂解或者将亲和试剂从靶结构解离中的至少一者来进行。
在另一优选实施方案中，生成通道的步骤基于光谱解混合、荧光染料的荧光寿命和荧光染料的激发指纹中的至少一者。光谱解混合(也称为光谱成像和线性解混合，或通道解混合)可以以各种方式执行，包括但不限于线性解混合、主成分分析、学习光谱的无监督方法、支持向量机、神经网络、(光谱)相量方法和蒙特卡罗解混合算法。为了减少与不同标记物相关的荧光染料之间的串扰，可以采用多种技术。解混合技术用于分离不同荧光染料对同一检测通道的贡献，即由于重叠的发射光谱而产生的串扰。采用这些技术由于降低的噪声可以大大提高该方法的灵敏度。此外，可以使用荧光染料的荧光寿命和激发指纹以便正确鉴定荧光染料。这可用于在每个图像中使用更多标记物组，即在一组中具有更多标记组。反过来，这大大增加了可被成像的标记物总数。
在另一个优选实施方案中，该方法还包括捕获样品的高光谱图像的步骤。与捕获有限数量的波长带(通常少于或约10个)的多光谱成像相反，高光谱图像每个像素捕获数十或数百个波长带。换句话说，高光谱图像具有非常高的光谱分辨率。这允许基于荧光染料的发射光谱更精细地区分荧光染料，从而提高该方法的灵敏度和可靠性。
在另一个优选实施方案中，该方法进一步包括在时间上在第一激发光之后施加第二激发光的步骤。优选地，施加第一激发光和施加第二激发光之间的时间长于第一组荧光染料的荧光寿命。这确保了仅捕获第二组荧光染料发射的荧光以生成第二图像。从而可以减少荧光染料之间的串扰，进一步提高方法的灵敏度。
在另一优选实施方案中，第一波长谱和第二波长谱中的至少一者包括小于50nm、小于30nm、小于10nm的波长范围或单个波长。这些波长带是例如用于荧光显微镜的二向色分束器或带通滤光片的典型范围。可以使用各种方法来生成用于样品照明或荧光染料激发的相应波长光谱。例如，滤除一定波长范围的带通滤波器可以与发射具有宽光谱波长的光的光源(例如汞灯或氙气灯)组合使用。替代地或附加地，可以使用发射超连续谱白光的白光激光器与用于选择所发射的光的单个波长的AOTF组合。
在另一个优选实施方案中，第一和/或第二子多个中的每种标记物特有的荧光染料可以由基本上一个波长谱或由相同波长谱激发。这允许单一子多个的荧光染料被具有例如窄发射光谱的单一光源激发。该方法的该实施方案可以容易地利用通常包括这种光源的现有荧光显微镜来实现。
在另一个优选实施方案中，第一和/或第二子多个中的每种标记物特有的荧光染料包括至少部分不同波长范围的发射光谱。由此，单一子多个的标记物组可以通过它们相关的荧光染料的发射光谱容易地与另一标记物组区分开。这减少或消除了分离每个图像的通道所需的解混合的计算负载，并使该方法更快和更可靠。
在另一优选实施方案中，至少两种荧光染料(每种对于一种标记物是独特的)具有不同的荧光寿命。由此，至少两种荧光染料可以通过它们的寿命彼此区分。特别地，这可以用于增加每个图像的通道数量，即每个图像捕获更多标记物。因此，可被成像的标记物总数大大增加。另外，至少两种荧光染料的寿命可用于正确鉴定被成像的标记物组，从而使该方法更加稳健。特别地，通过修改基本结构或将荧光染料置于不同的分子环境中，可以对现有荧光染料进行工程改造以产生具有相似激发和/或发射光谱但具有不同荧光寿命的衍生荧光染料。
在另一个优选实施方案中，第一组和/或第二组中的至少两种荧光染料(每种对于一种标记物是独特的)在样品的第一条件下具有基本上相同波长范围和基本上相同荧光寿命的发射光谱，并且包括在第二条件下具有基本上相同波长范围和显著不同荧光寿命的发射光谱。第一和第二条件可以是样品的一定的pH值、一定的氧化还原水平、一定的温度、一定的配体浓度(例如以下Cu(II)、Zn(II)、小分子中的一者的较低浓度)。
在另一优选实施方案中，至少一种标记物内的标记物包含该组特有的非荧光染料。非荧光染料可以通过其特征性的光吸收行为来鉴定。例如，对于每个标记物组，可以使用一种非荧光染料，例如具有光吸收特性使得该标记物在简单透射光(即不在荧光)显微镜中显示为绿色或红色区域。从而，每轮可以使用的标记物总数进一步增加。
本发明还涉及一种用于分析生物样品的装置，其适合于执行上述用于分析生物样品的方法。该装置具有与方法相同的优点，并且可以使用方法从属权利要求的特征来补充。
在优选实施方案中，该装置包括至少一个被配置为发射第一激发光的第一光源和至少一个被配置为发射第二激发光的第二光源。替代地或附加地，该装置包括被配置为发射第一和第二激发光的可调光源。优选地，第一激发光和第二激发光中的至少一者是相干光。
在另一优选实施方案中，通过包括棱镜或光栅的光谱仪和至少一个检测器中的至少一者来完成将第一图像和/或第二图像分离到至少两个通道中。衍射元件可用于将捕获的荧光按波长光学分离到不同的通道中，例如通过将不同的波长引导到单个检测器的不同部分上或引导到不同的检测器上。由于这些通道是由检测器硬件产生的，因此它们在下面也称为检测通道。用于共焦扫描显微镜的这种光谱仪布置的示例例如在US 6,614,526 B1中公开。
在另一个优选实施方案中，通过至少一个时间敏感检测器将第一和/或第二图像分离到至少两个通道中。这种检测器不仅记录波长谱，还记录捕获的荧光的到达时间。它们还可以是时间门控的，即配置为记录离散的时间段(所谓的时间门)内的事件，从而使例如根据捕获的荧光的到达时间确定寿命信息。由此，可以将具有显著重叠的发射光谱但不同荧光寿命的荧光染料可靠地分离到不同的通道中。这进一步增加了可以被分组为单一子多个(即同时被成像)的标记物的数量。
本发明还涉及一种包括上述用于分析生物样品的装置的显微镜***。显微镜***优选为无透镜显微镜、光场显微镜、宽场显微镜、荧光宽场显微镜、光片显微镜、扫描显微镜或共焦扫描显微镜。
附图说明
下面参考附图对具体实施方案进行描述，其中：
图1是分析生物样品的方法的流程图；
图2是进一步详述根据图的方法的步骤的流程图；
图3示出了五种不同荧光染料的激发和发射光谱的两张图；
图4示出了具有不同斯托克斯位移量的五种荧光染料的不同激发和发射光谱的两张图；
图5为四种不同荧光染料的荧光发射衰减曲线图；
图6示出了根据其荧光寿命分为三类的十五种荧光染料的不同激发和发射光谱的两张图；
图7是显示能够被可靠地区分的标记物总数的图；
图8是列出不同市售荧光染料的特性的表格；
图9是显示不同荧光染料的荧光寿命的图；
图10示出了用于分析生物样品的装置的示意图；
图11是根据图10的装置的成像单元的实施方案的示意图；
图12是根据图10装置的成像单元的另一实施方案的示意图。
图13是六种标记物的示意图，每种标记物包含亲和试剂和荧光染料；
图14是十二种标记物的示意图，每种标记物包含亲和试剂和非荧光染料；
图15a是五种标记物的示意图，每种标记物包含第二亲和试剂；
图15b是由第二亲和试剂结合的第一亲和试剂的示意图，该第二亲和试剂由共价连接的寡核苷酸条码化，其用作滚环DNA扩增的模板，扩增多个染料缀合的寡核苷酸的靶序列；
图15c是由第二亲和试剂结合的第一亲和试剂的示意图，该第二亲和试剂携带共价连接的辣根过氧化物酶，其催化染料缀合的酪胺自由基的形成，由于其半衰期短，该自由基与靶蛋白上附近的酪氨酸残基共价偶联；
图16a是两种荧光染料的示意图；
图16b是多种标记物的示意图；和
图17是所有细胞的示意图。
具体实施方式
图1是用于分析生物样品1002的方法的流程图。
该过程从步骤S100开始。在步骤S102中，将多种标记物1612引入样品1002中(参见图10和16)。每种标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526(参见图13至15c)包含亲和试剂1310至1319，其被配置为附着至生物样品1002内的预定结构1706至1714。每种标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526进一步包含荧光染料1320。荧光染料1320直接结合至附着至预定结构1706至1714的亲和试剂1310至1319，或者结合至第二亲和试剂1510或1514。在后一种情况下，附着至预定结构1706至1714的亲和试剂1310至1319也被称为第一亲和试剂，并且第二亲和试剂1510至1518被配置为附着至第一亲和试剂1310至1319。下面参考图13至15c描述一些示例性标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526。亲和试剂1310至1319或亲和试剂1310至1319、1510至1518和荧光染料1320对于它们相应的标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526而言各自是独特的，使得每种标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526在多种标记物1612内是独特的。由此，与特定标记物相关的预定结构1706至1714可以通过特定标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526特有的荧光染料1320来鉴定。所有标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526被分类成至少两个不同的组1614至1620(参见图16)。优选地，一组1614至1620内的所有标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526包括具有显著重叠的激发光谱的荧光染料1320，即可以由相同激发光激发的荧光染料1320。
在步骤S104中，标记物组1614至1620随后被激发并且由荧光染料1320发射的荧光被捕获。从每组1614至1620捕获的荧光被进一步分离到通道，其中每个通道对应于单一标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526。分离到通道可以通过光学方式完成，例如以衍射光学和/或计算方式完成，例如通过通道解混合和/或光谱解混合。以光学方式(即通过检测器硬件而不是通过计算)产生的通道也称为检测通道。此外，分离到通道可以基于荧光寿命来完成，例如借助时间分辨检测器或时间门控检测器，或基于荧光染料1320的激发指纹来完成。因此，如果一个特定组1614至1620的荧光染料1320各自具有不同的寿命和/或发射光谱，则可以增加能够可靠地分离到通道的标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的数量。然后，将来自分离的通道的信息/数据组合成针对每组1614至1620的样品1002的一个图像。然后，这些图像可以进一步组合成包括在步骤S104中捕获的所有通道的样品1002的单个图像。下面结合图2对步骤S104进行进一步详细说明。
任选地，在捕获图像之后，在步骤S106中使荧光染料1320失活。进行失活是为了防止荧光染料1320将来发射荧光。用于使荧光染料1320失活的方法包括通过使荧光染料1320化学失活或通过光物理褪色来使荧光染料1320褪色；或者从样品1002去除荧光染料1320。为了从样品1002去除荧光染料1320，需要切断第一亲和试剂1310至1319与预定结构1706至1714之间的连接。在亲和试剂是抗体1310至1314的情况下，这可以例如通过抗体洗脱来完成。替代地，可以从第一亲和试剂1310至1319或第二亲和试剂1510至1518去除荧光染料1320。这可以例如通过酶促裂解连接荧光染料1320和亲和试剂1310至1319、1510至1518的肽或寡核苷酸结合来完成。还可以将荧光染料1320可逆地结合至亲和试剂1310至1319、1510至1518，例如通过寡核苷酸杂交和使用条码化抗体。
在荧光染料1320已失活之后，该过程在步骤S108中停止或者重复步骤S102至S106以便捕获样品1002的另外的图像。
图2是进一步详述图1所示的用于分析生物样品1002的方法的步骤S104的流程图。
该过程从步骤S200开始。在步骤S202中，将具有第一波长谱的第一激发光引导至样品1002处。选择第一波长谱使得第一标记物组1614的荧光染料1320被激发以发射荧光。然后在步骤S204中捕获发射的荧光并将其分离到不同的通道中。每个通道对应于单一标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526。通过组合这些通道来生成样品1002的第一图像。在步骤S206中，将具有第二波长谱的第二激发光引导至样品1002处，以便激发第二标记物组1616的荧光染料1320。步骤S206在时间上在步骤S202之后或在步骤S204之后。在步骤S208中，捕获第二组1616的荧光染料1320发射的荧光并将其分离到不同的通道中。通过组合在步骤S208中获取的通道，生成样品1002的第二图像。对于另外的激发光和标记物组1618至1620，重复将激发光引导至样品1002处并捕获来自由此激发的荧光染料1320的荧光的步骤。在步骤S210中，将具有第n波长谱的第n光引导至样品1002处。由此，第n标记物组1620的荧光染料1320被激发并开始发射荧光。在步骤S212中该荧光被捕获并分离到不同的通道中，并且这些通道被组合成样品1002的第n图像。在该步骤之后，该过程在步骤S214中结束。
图3示出了五种不同荧光染料1320的激发和发射光谱的两个图300、302。上面的图示出了五种荧光染料1320的五个激发光谱304至312。激发光谱304至312重叠但具有不同的最大值。因此，五种荧光染料1320可以被具有五种不同波长谱的五种不同激发光激发。下图示出了五种荧光染料1320的发射光谱314至322。五条线324连接上图300和下图302以表示下图302中的五个激发光谱304至322的最大值的位置。图3清楚地显示激发光谱304至322的最大值和发射光谱314至322的最大值被斯托克斯位移分开，如图3中双头箭头326所示。对于图3中所示的每种荧光染料1320，斯托克斯位移的量大约相等。
图4示出了具有不同斯托克斯位移量的五种荧光染料1320的不同激发和发射光谱的两个图400、402。上图示出了五种荧光染料1320的五个激发光谱。为了清楚起见，所有五个激发光谱在图4中由单个附图标记404表示。激发光谱404显著重叠并且它们的最大值聚集在单个波长周围。由于它们的激发光谱404的重叠，五种荧光染料1320可用具有窄波长谱或甚至单个波长的单个激发光来激发。下图402示出了五种荧光染料1320的发射光谱406至414。图4中的单线416表示下图中的五个激发光谱404的最大值的大致位置。如在下图402中可以看到的，尽管激发光谱404显著重叠，但是五种荧光染料1320由于它们不同的斯托克斯位移量而具有不同的发射光谱406至414，再次由双头箭头418表示。不同的发射光谱406至414可用于将五种荧光染料1320发射的荧光分离到五个分开的通道中，以便生成样品1002的图像。从图4中可以看出，具有不同斯托克斯位移量的荧光染料1320可用于用单一激发光产生多个通道。对于上面参考图1和图2描述的方法，这意味着，对于具有不同波长谱的n个激发光，每个激发与单个标志物组1614至1620相关的y个不同的荧光染料1320，可以可靠区分的标记物的总数为n×y。
图5是四种不同荧光染料1320的荧光发射衰减曲线500至506的图，其可用时间敏感检测器记录。第一轴t表示以ns为单位的荧光寿命τ，第二轴I表示以任意单位表示的强度。衰减曲线500至506部分重叠，但它们的最大值不同。图5示出了如何能够通过时间门控检测器来区分可能具有相同或相似发射光谱的四种不同荧光染料1320。时间门控检测器被配置为记录离散时间段(所谓的荧光寿命门或τ门)内的事件。四个荧光寿命门508至514在图5中由具有实线边框的矩形表示。荧光寿命是正交信息，其可以与来自激发或发射光谱的光谱信息结合使用以增加可以被可靠地分离到通道中的荧光染料1320的总数。下面将结合图6进一步解释这一点。
图6示出了根据荧光寿命分为三类612至616的十五种荧光染料1320的不同激发和发射光谱604至610的两个图600、602。每类包括具有不同斯托克斯位移量的五种荧光染料1320。上图示出了十五种荧光染料1320的激发光谱604。为了清楚起见，所有十五种激发光谱在图6中由单个附图标记604表示。如在上面结合图4描述的示例中，激发光谱604显著重叠，并且它们的最大值聚集在单个波长周围，并且所有十五种荧光染料1320可以被单个激发光激发。下图602示出了十五种荧光染料1320的发射光谱606至610。为了清楚起见，在图6中仅用附图标记表示所有十五个发射光谱中的前三个。下图602具有三个轴。第一轴表示以nm为单位的波长λ，第二轴表示强度，第三轴表示以ns为单位的荧光寿命τ。由于分组的荧光染料1320是根据荧光寿命分组的，因此它们的发射光谱606至610出现在下图中沿第三轴的三个不同类别612至616中。这三个类别612至616在下图中由第一轴和第三轴定义的平面中的具有实线边框的矩形表示，并且也可以被命名为τ门。可以用例如至少一个时间敏感检测器来分离类别612至616。这种检测器不仅记录波长谱，还记录被捕获的荧光的到达时间。替代地，检测器可以是时间门控的，即被配置为记录荧光寿命门508至514内的事件。在图6中，图5所示的寿命门508至514对应于下图中具有实线边框的矩形612至616。通过用合适的检测器分离类别612至616，具有显著重叠的发射光谱606至610但不同的荧光寿命的荧光染料1320——例如图6中具有虚线边框的矩形618表示的三个染料组——可以被可靠地分离到不同的通道。返回参考上面图4描述的示例：通过使用荧光寿命作为额外的可观察值，可以将更多标记物分组成单个组1614至1620。每组1614至1620现在可以包括按其荧光寿命分组的t类荧光染料1320，每类本身包括可以由单个激发光激发的y种不同的荧光染料1320。对于上面参考图1和图2描述的方法，这意味着可以被可靠地区分的标记物的总数是n×y×t。图7总结了之前参考图4至6进行讨论的结果。
图7是示出了可以利用上述方法的不同实施方案被可靠地区分的标记物总数的图。
该图包括三个子图700至704，每个子图示出了针对不同数量的检测通道(即光学分离的通道、激发光和寿命门)的可区分标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的总数。每个子图将可通过上述方法区分的标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的数量显示为实心黑色柱706至710。在实心黑色柱旁边，每个子图700至704示出了具有实线边框的白色柱712至716。白色柱712至716显示了如果标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526仅通过检测通道分离，可以被区分的标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的数量。
第一子图700，即最左边的子图，示出了针对5个检测通道(y＝5)和5个激发光(n＝5)的可区分标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的数量。通过上述方法，可区分标记物的总数为n×y＝25。在第二子图702中，即中间的子图，检测通道的数量增加到8(y＝8)。因此，利用上述方法，可区分标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的总数为n×y＝40。对于第三子图704，即最右边的子图，另外使用2个寿命门(t＝2)。由此，利用上述方法可区分的标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的总数增加至n×y×t＝80。如通过这些示例并通过比较实心黑色柱706至710与白色柱712至716可见，上述方法极大地增加了每个检测通道的可区分标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的数量。这在多重生物标记物分析中特别有利，其中大量标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的分析是期望的并且通过迭代过程来实现。例如，当标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526仅通过检测通道分离，对50种感兴趣的生物分子成像将需要10个迭代步骤或轮次，而不是使用本文件中描述的方法的2轮。重要的是注意到，通过添加进一步的寿命门(t>2)、发射光的更精细的光谱分离、激发指纹、使用专用的荧光染料组1320(其物理化学性质针对本文件中公开的方法进行了优化)中的至少一者时，用上述方法可区分的标记物1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526的总数可以显著高于80。
图8是显示不同市售荧光染料的平均荧光寿命、溶剂以及激发和发射最大值的位置的表格。该图改编自
http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/LifetimeDataFluorophores.html。
图9是显示不同市售荧光染料的荧光寿命的图。该图改编自http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/LifetimeDataFluorophores.html。从图9可以看出，可以选择可以按其荧光寿命分组的荧光染料1320。例如，虽然大多数荧光染料的寿命远低于5ns，但有两种染料(SeTau-404-NHS和SeTau-405-NHS)的寿命高于5ns但低于10ns。列出的四种染料(溴化乙锭+dsDNA/ssDNA、SeTau-380-NHS和SeTau-425-NHS)的寿命远高于10ns。即使从这个非常有限的列表中，可以选择至少三个不同的类别。在这方面，重要的是要知道荧光染料的荧光寿命可以通过向荧光染料1320的基本结构添加额外的基团或通过改变其环境来改变。两种策略都可以用来生成荧光染料1320的组，其在激发和发射光谱方面具有相似的光谱特性，但在它们的荧光寿命方面不同。可以以这种方式生成被优化以在本文件中描述的方法中工作的荧光染料1320。
图10示出了用于分析生物样品1002的装置1000的示意图。特别地，装置1000能够执行上面参考图1至图9描述的用于分析生物样品1002的方法。在图10中，装置1000示例性地示出为显微镜***1004的一部分。
装置1000包括用于将多种标记物1612引入到样品1002中的染色单元1006。出于该目的，染色单元1006可以包括一个或多个移液管，其可以是或可以不是自动化的。装置1000还包括用于激发荧光染料1320的激发单元1008。激发单元1008包括至少一个光源，优选相干光源。至少一个光源被配置为发射与每个标记物组1614至1620相关的激发光。为了发射不同波长或波长谱的激发光，光源可以是可调光源。替代地，装置1000可包括发射不同波长或波长谱的光的两个或更多个光源。在图10所示的实施方案中，由激发单元1008发射的激发光由分束单元1010引导到样品1002上。
装置1000的成像单元1012被配置为由受激发染料1310发射的荧光产生图像。成像单元1012包括指向样品1002用于捕获荧光的物镜1014。然后，所捕获的荧光被分束单元1010引导到检测单元1016上。检测单元1016包括至少一个检测器元件和用于将荧光拆分成不同检测通道的衍射元件。下面将结合图11和图12更详细地描述检测单元1016。
在对样品1002成像之后，可能需要使荧光染料1320失活。这可以例如通过利用由激发单元1008的至少一个光源发射的相干光对荧光染料1320进行光褪色(bleach)来完成。替代地，可以用染色单元1006将用于使荧光染料1320化学失活的褪色剂引入到样品1002中。进一步地，可以从第一或第二亲和试剂1510至1518中去除荧光染料1320。这可以例如通过用染色单元1006将酶切割剂引入到样品1002中来完成。替代地或另外地，在荧光标记的寡核苷酸1309的情况下，荧光染料1320可以通过抗体洗脱或通过去杂交(即解链)和洗脱来失活。因此，激发单元1008和/或染色单元1006形成标记物失活单元，其被配置为使样品1002中存在的至少一个标记物组1614至1620失活。
装置1000还包括连接到染色单元1006、激发单元1008和检测单元1016的处理器1018。处理器1018被配置为控制装置1000的各元件以便执行用于分析生物样品1002的方法。特别地，处理器1018被配置为基于至少一个用户输入来执行该方法。
图11是根据图10的装置1000的成像单元1100的实施方案的示意图。根据该实施方案的成像单元1100包括六个检测器元件1102和棱镜1104。棱镜1104拆分入射荧光1106并根据其波长将其引导到检测器元件1102上。由此，入射荧光1106按波长被分离到六个检测通道中。
图12是根据图10的装置1000的成像单元1200的另一实施方案的示意图。根据该实施方案的成像单元1200包括六个检测器元件1202和衍射光栅1204。在该实施方案中，衍射光栅1204充当衍射元件，拆分入射荧光1106并根据其波长将其引导到检测器元件1202上。由此，入射荧光1106按波长被分离到六个检测通道中。
图13是六种标记物1300至1309的示意图，每种标记物包含亲和试剂1310至1319和荧光染料1320。标记物1300至1309将从左到右称为第一至第六标记物。
第一标记物1300包含单域抗体1310(也称为纳米抗体)作为其亲和试剂。此类单域抗体1310天然存在于骆驼科物种以及某些软骨鱼中。它们也可以从常规抗体1314进行生物工程改造。与常规抗体1314相比，它们具有低得多的分子量。第二标记物1302包含两个单域抗体的组合1312作为其亲和试剂。此类组合1312可被工程改造以获得以其它方式无法获得的特异性亲和力(双特异性反应性)或增加亲合力。在本文件的意义上，1312不仅代表二聚体，而且代表一般的多聚化单域抗体。第三标记物1304包含常规抗体1314作为其亲和试剂。所有三种标记物1300至1304与抗原的特定预定表位1706至1710结合(参见图17)。第四标记物1306包含适体1316作为其亲和试剂。第五标记物1308包含寡核苷酸序列1318作为其亲和试剂。适体1316和寡核苷酸序列1318都与预定的靶序列1712、1714(参见图17)互补并且将自身附着至其上。第六标记物具有配体，例如药物分子或毒素1319，作为其亲和试剂，例如鬼笔环肽，这是一种与肌动蛋白丝结合的毒素。
图14是十二种标记物1400至1422的示意图，每种标记物包含亲和试剂1310至1316和亲和标签1438至1442，亲和标签1438至1442用作第二亲和试剂的靶标，第二亲和试剂由荧光染料直接标记、被荧光染料缀合的第三亲和试剂识别、或者携带寡核苷酸条形码或用于标记扩增的酶，如图15b和15c所示。标记物1400至1422被布置成三行1424至1428，从上到下标记为第一至第三行，以及四列1430至1436，从左到右标记为第一至第四列。
相同列1430至1436中的三种标记物包含相同的亲和试剂1310至1316，而相同行1424至1428中的标记物包含相同的亲和标签1438至1442。第一列1430中的标记物1400至1404包含单域抗体1310作为其亲和试剂。第二列1432中的标记物1406至1410包含单域抗体的二聚体或多聚体1312作为其亲和试剂。第三列1434中的标记物1412至1416包含常规抗体1314作为其亲和试剂。第四列1436中的标记物包含适体1316作为其亲和试剂。第一行1424中的标记物包含寡核苷酸条形码1438作为其亲和标签。第二行1426中的标记物包含肽标签1440作为其亲和标签。第三行1428中的标记物包含半抗原标签1442作为其亲和标签。
图15a是五种标记物的示意图，每种标记物包含第一亲和试剂1310至1314、第二亲和试剂1510至1516、以及荧光染料1320。这些标记物将从左到右称为第一至第五标记物。
第一标记物1500包含单域抗体1310作为其第一亲和试剂，和另一单域抗体1510作为其第二亲和试剂。另一单域抗体1510缀合至荧光染料1320。第二至第五标记物1502至1508、1518、1526各自包含常规抗体1314作为其第一亲和试剂。第二标记物1502包含与荧光染料1320缀合的单域抗体1510，作为其第二亲和试剂。第三标记物1504的第二亲和试剂是具有寡核苷酸条形码1438的单域抗体1512。荧光染料1320附着至与条形码互补的寡核苷酸1308。第四和第五标记物1506、1508各自包含常规抗体1514、1516作为其第二亲和试剂。第四标记物1506的荧光染料1320直接附着至抗体1514，而第五标记物1508的荧光染料1320经由寡核苷酸条形码1438附着至抗体1516。
替代地或另外地，荧光染料1320可与第三亲和试剂结合，第三亲和试剂与第二亲和试剂1512和1516结合，而第二亲和试剂1512和1516与第一亲和试剂1314或1308结合。
图15b示出了标记物1518的示意图，其荧光信号通过免疫滚环扩增被放大。第二亲和试剂1516包含寡核苷酸条形码1438。环状序列1520结合至寡核苷酸条形码1438。在启动滚环扩增反应后，条形码1438的寡核苷酸序列被扩增，即重复复制以形成包含多个拷贝的寡核苷酸条形码1438的DNA长链1522。然后这些拷贝结合多个荧光标记的寡核苷酸1524。
图15c是标记物1526，其荧光信号通过酪胺信号放大被放大，作为被称为催化报道分子沉积的过程中酶促反应的示例。标记物1526包含具有萝卜过氧化物酶1530的第二亲和试剂1528。萝卜过氧化物酶1530将与荧光染料1320共价连接的酪胺1532转化成酪胺自由基1534，其具有非常短的半衰期并快速偶联至靶蛋白上的酪氨酸侧链1536或另一预定结构1706至1714。
图16a示出了两种荧光染料1320a、1320b。每种荧光染料1320a、1320b被描绘为具有实线边框的圆圈1600、1602。每个圆1600、1602被分成具有不同阴影线的两个半圆1604至1610。左半圆1604、1608的阴影线类型表示可以被激发各个荧光染料1320a、1320b的激发光，即具有具相同类型阴影线的左半圆1604、1608的荧光染料1320a、1320b可用具有相同波长谱或相同单一波长的激发光来激发。右半圆1606、1610的阴影线类型指示可用于鉴定荧光染料1320a、1320b的相应荧光染料1320a、1320b的特征性质。特征性质包括例如相应荧光染料1320a、1320b的发射光谱、荧光寿命和激发指纹。这意味着，具有具相同类型阴影线的右半圆1606、1610的荧光染料1320a、1320b具有相同或基本相同(即，不可区分)的特征。
图16b示出了多种标记物1612。多种标记物1612被进一步分为n个标记物组1614至1620。为了清楚起见，在图16中仅示出了第一组1614、第二组1616、第三组1618和第n组1620。每个组1614至1620包括y个标记物，在图6中仅示出了其中的前四个标记物和第y个标记物。
为了清楚起见，仅单个标记物1622被标记有附图标记。一组1614至1620内的所有标记物1622可用具有相同波长谱或相同单一波长的激发光来激发。这在图16b中通过单组1614至1620的所有荧光染料1320具有具相同类型的阴影线的左半圆1604、1608(参见图16a)来描绘。与此相反，一组1614至1620内的所有标记物1622可以由用于步骤S104中的数据采集的成像***基于它们的发射光谱、荧光寿命、激发指纹中的至少一者来区分。清晰可区分的标记物y的最大数量取决于荧光染料1320的特性和用于步骤S104中的数据采集的成像***的特性，其包括但不限于可用检测通道的数量、光谱分辨率以及时间敏感检测和脉冲光源的可用性。
这在图16b中通过具有具不同类型的阴影线的右半圆1606、1610(参见图16a)的单组1614至1620的所有荧光染料1320来描绘。此外，所示的所有标记物1622都包含亲和试剂1624，其与各个标记物1622特有的特定结构1706至1714结合。这在图16b中通过具有不同类型的阴影线的每个亲和试剂1624来描绘。
图17是作为生物样品1002的示例的所有细胞1700的示意图。细胞包括细胞核1702和细胞质1704，其各自包含被称为表位1706、1708、1710的结构，抗体自身附着于所述结构。这示例性地示出了两个标记物1402，其分别包含与位于细胞核1702和细胞质1704中的表位1706结合的单域抗体1300。两个单域抗体1300与相同荧光染料1320的分子缀合，因此属于相同的标记物组1614至1620。另一个标记物1304包含与相同荧光染料1320的两个分子缀合的单个抗体1314。该标记物1704附着于细胞质1704中的表位1708。又一标记物1506包含与相同荧光染料1320的两个分子缀合的第一抗体1314和第二抗体1514。第一抗体1314附着于细胞质1704中的表位1710，并且第二抗体1514附着于第一抗体1314。此外，图17显示了包含荧光标记的寡核苷酸序列1309作为其亲和剂的两个标记物1309。这两个标记物1309各自附着至互补序列1712、1714。这两个标记物1309中的第一个附着至细胞质1704中的RNA序列1712。两个标记物1309中的第二个附着至细胞核1702中的DNA序列1714。包含毒素1319(例如鬼笔环肽)作为其亲和剂的标记物1309附着至肌动蛋白丝1716。
如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合并且可以缩写为“/”。
尽管已经在装置的上下文中描述了一些方面，但是显然，这些方面也表示相应方法的描述，其中块或设备对应于方法步骤或方法步骤的特征。类似地，在方法步骤的上下文中描述的方面也表示对相应装置的相应块或项目或特征的描述。
附图标记列表
300、302 图
304、306、308、310、312 光谱
314、316、318、320、322 光谱
324 线
326 箭头
400、402 图
404、406、408、410、412、414 光谱
416 线
418 箭头
500、502、504、506 衰减曲线
508、510、512、514 寿命门
600、602 图
604、606、608、610 光谱
612、614、616 类别
618 组
700、702、704 图
706、708、710、712、714、716 柱
1000 装置
1002 样品
1004 显微镜***
1006 染色单元
1008 激发单元
1010 分束单元
1012 成像单元
1014 物镜
1016 检测单元
1018 处理器
1100 成像单元
1102 检测器元件
1104 棱镜
1106 荧光
1200 成像单元
1202 检测器元件
1204 衍射光栅
1300至1309 标记物
1310、1312、1314 抗体
1316 适体
1318 寡核苷酸
1319 毒素
1320 荧光染料
1400至1422 标记物
1424、1426、1428 行
1430、1432、1434、1436 列
1438 寡核苷酸条形码
1440 肽标签
1442 半抗原标签
1500、1502、1504、1506、1508 标记物
1510、1512、1514、1516 抗体
1518 标记物
1520 序列
1522 DNA
1524 寡核苷酸
1526 标记物
1528 亲和试剂
1530 萝卜过氧化物酶
1532 酪胺
1534 酪胺自由基
1536 酪氨酸侧链
1600、1602 圆
1604、1606、1608、1610 半圆
1612 多个
1614、1616、1618、1620 组
1622 标记物
1624 亲和试剂
1700 细胞
1702 细胞核
1704 细胞质
1706、1708、1710 表位
1712 DNA序列
1714 RNA序列
1716 肌动蛋白丝

Claims (21)

1.一种用于分析生物样品(1002)的方法，包括：
a)提供多种标记物(1612)，每种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)包含所述标记物特有的荧光染料(1320)和所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的亲和试剂(1310至1319)，所述亲和试剂(1310至1319)被配置为附着至所述样品(1002)内的预定结构(1706至1714)；
b)通过将所述多种标记物(1612)引入到所述样品(1002)中来对所述样品(1002)进行染色；
c)将具有第一波长谱的第一激发光引导到所述样品(1002)上，以便激发第一标记物组(1614)的荧光染料(1320)；
d)由所述第一组(1614)的受激发染料发射的荧光产生至少一个第一图像，所述第一图像包括至少两个通道，每个通道对应于所述第一标记物组(1614)的一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)；
e)将具有第二波长谱的至少一个第二激发光引导到所述样品(1002)上，以便激发第二标记物组(1616)的荧光染料(1320)，所述第二组(1616)不同于所述第一组(1614)；和
f)由所述第二组(1616)的受激发染料发射的荧光产生至少一个第二图像，所述第二图像包括至少两个通道，每个通道对应于所述第二标记物组(1616)的一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)包含所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的至少一种荧光染料(1320)，所述至少一种荧光染料(1320)缀合至所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的亲和试剂(1310至1319)，其中所述亲和试剂(1310至1319)被配置为附着至所述样品(1002)内的预定结构(1706至1714)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)包含所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的至少一种荧光染料(1320)、所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的第一亲和试剂(1310至1319)、和所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的第二亲和试剂(1510至1518)，其中所述至少一种荧光染料(1320)缀合至所述第二亲和试剂(1510至1518)，其中所述第一亲和试剂(1310至1319)被配置为附着至所述样品(1002)内的预定结构(1706至1714)，并且其中所述第二亲和试剂(1510至1518)被配置为附着至所述第一亲和试剂(1310至1319)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括使所述多种标记物(1612)、至少一个标记物组(1614至1620)和至少一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)中的至少一者失活的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述失活步骤通过使所述至少一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的荧光染料(1320)褪色和从所述样品(1002)中去除所述至少一种标记物中的至少一者来完成，优选地通过将所述荧光染料(1320)从所述亲和试剂(1310至1319)解离或裂解或者将所述亲和试剂(1310至1319)从靶结构解离中的至少一者来完成。
6.根据权利要求4和5所述的方法，其中将以下步骤重复至少两次，以便产生所述样品(1002)的一系列图像：
提供另外的多种标记物(1612)；
通过将所述另外的多种标记物(1612)引入到所述样品(1002)中来对所述样品(1002)进行染色；
将第一激发引导到所述样品(1002)上，以便激发另外的第一标记物组(1614)的荧光染料(1320)；
由所述另外的第一组(1614)的受激发染料发射的荧光产生另外的第一图像，所述另外的第一图像包括至少两个通道，每个通道对应于所述另外的第一标记物组(1614)的一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)；或者
其中将权利要求1的步骤a)至d)重复至少两次。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将以下步骤重复至少两次，以便产生所述样品(1002)的一系列图像：
将第二激发引导到所述样品(1002)上，以便激发另外的第二标记物组(1614)的荧光染料(1320)；
由所述另外的第二组(1614)的受激发染料发射的荧光产生另外的第二图像，所述另外的第二图像包括至少两个通道，每个通道对应于所述另外的第二标记物组(1614)的一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)；或者
其中将权利要求1的步骤e)和f)重复至少两次。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中生成所述通道的步骤基于通道解混合、光谱解混合、所述荧光染料(1320)的荧光寿命和所述荧光染料(1320)的激发指纹中的至少一者。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括捕获所述样品(1002)的高光谱图像的步骤。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在时间上在所述第一激发光之后施加所述第二激发光的步骤。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一波长谱和所述第二波长谱中的至少一者包括小于50nm、小于30nm、小于10nm的波长范围或单个波长。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二标记物组(1614、1616)中的每种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的荧光染料(1320)能够由基本上一个波长谱或由相同波长谱激发。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二标记物组(1614、1616)中的每种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的荧光染料(1320)包括至少部分不同波长范围的发射光谱。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中各自对于一种标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)而言特有的至少两种荧光染料(1320)具有不同的荧光寿命。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种标记物包含所述标记物(1300至1309、1400至1422、1500至1508、1518、1526)特有的非荧光染料(1438至1442)。
16.一种用于分析生物样品(1002)的装置(1000)，其适合于执行根据权利要求1至14中任一项所述的方法。
17.根据权利要求16所述的装置(1000)，包括被配置为发射第一激发光的第一光源、被配置为发射第二激发光的至少一个第二光源、和被配置为发射所述第一和第二激发光的可调光源中的至少一种。
18.根据权利要求17所述的装置(1000)，其中所述第一激发光和所述第二激发光中的至少一者是相干光。
19.根据权利要求16至17中任一项所述的装置(1000)，其中通过包括棱镜(1104)或光栅(1204)的光谱仪和至少一个检测器(1202)中的至少一者来完成将第一图像和/或第二图像分离到至少两个通道中。
20.根据权利要求16至18中任一项所述的装置(1000)，其中通过至少一个时间敏感检测器来完成将第一图像和/或第二图像分离到至少两个通道中。
21.一种显微镜***(1004)，包括根据权利要求16至20中任一项所述的装置(1000)，其中所述显微镜***(1004)优选地是无透镜显微镜、光场显微镜、宽场显微镜、荧光宽场显微镜、光片显微镜、扫描显微镜或共焦扫描显微镜。
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