CN117363530B - 一种复合益生菌及其在制备治疗便秘产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合益生菌及其在制备治疗便秘产品中的应用，属于益生菌加工技术领域，该复合益生菌包括益生菌组合物和辅料，其中益生菌组合物包括卷曲乳杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种；所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.23186，所述乳酸乳球菌乳酸亚种的保藏编号为CGMCC No.16647。该复合益生菌产品能够显著缩短小鼠便秘模型的排便时间，增加粪便重量，降低粪便钙卫蛋白含量，调控MTL、GAS、ET、AChE、SP和VIP水平，且显著提升小肠推进率，对便秘具有有效地改善和治疗效果，且有效预防肠道器质性疾病或炎症，以及改善胃肠道运动功能紊乱；本发明为便秘治疗及肠道健康保护提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌加工技术领域，特别是涉及一种复合益生菌及其在制备治疗便秘产品中的应用。
背景技术
便秘是一种常见的肠道疾病，主要表现为排便困难、粪便干硬和每周排便次数小于3次，发病率呈现逐年上升的趋势。短期便秘影响人们的正常工作和生活，长期便秘甚至会导致肾病、心血管疾病的发生，因此对便秘的预防和治疗应引起人们的重视。便秘的产生受多种因素的影响，包括生活和饮食习惯的改变、心理状态的变化等。临床上常使用大黄、泻剂等治疗便秘，长期使用会带来很大的依赖性。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，益生菌是近几年研究比较多的肠道微生态调整产品，是定植于人体肠道、生殖***内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以下各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。对人体有益的益生菌大概有十几种，主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。益生菌的功效：预防或改善腹泻；缓解不耐乳糖症状；预防***感染；增强人体免疫力；促进肠道消化***健康；降低血清胆固醇等。目前市场上已有不少含有益生菌的膳食补充剂和微生物药品，然而益生菌的活力和有效率会因菌株选择、剂量和载体的不同而产生较大差异。因此筛选制备一种有效且长期改善便秘的益生菌产品仍是当下的研究热点。为此，本发明特开发一种有效防治便秘的复合益生菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合益生菌及其在制备治疗便秘产品中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备的复合益生菌产品对便秘具有有效地改善和治疗效果，且有效预防肠道器质性疾病或炎症，以及改善胃肠道运动功能紊乱，本发明为便秘治疗及肠道健康保护提供了新思路。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种改善便秘的复合益生菌，包括益生菌组合物和辅料，其中益生菌组合物包括卷曲乳杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种；所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.23186，所述乳酸乳球菌乳酸亚种的保藏编号为CGMCC No.16647。
进一步地，所述卷曲乳杆菌和所述乳酸乳球菌乳酸亚种的质量比为1:1。
进一步地，所述卷曲乳杆菌和所述乳酸乳球菌乳酸亚种的活菌数为1.0×108-1.0×1011cfu/g。
进一步地，所述辅料包括麦芽糊精、赤藓糖醇和红茶粉。
进一步地，所述麦芽糊精、所述赤藓糖醇和所述红茶粉的质量比为(3-5)：(1-2)：(1-2)。
进一步地，所述益生菌组合物和所述辅料的质量比为(10-20)：(1-3)。
本发明还提供一种所述复合益生菌在制备治疗便秘产品中的应用。
本发明还提供一种所述复合益生菌在制备改善肠道器质性疾病或炎症产品中的应用，所述复合益生菌通过抑制钙卫蛋白水平，改善肠道器质性疾病或炎症。
本发明还提供一种所述复合益生菌在制备预防或治疗胃肠运动功能紊乱产品中的应用。
进一步地，所述复合益生菌通过调控胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、内皮素(ET)、生长抑素(SS)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、P物质(SP)和血管活性肠(VIP)的表达水平，发挥改善机体胃肠运动功能紊乱的效果。
卷曲乳杆菌是一种重要的益生菌，其主要作用是维护肠道菌群平衡，促进食物消化吸收，增强免疫力，预防肠道疾病，该菌株能够抑制有害菌的生长和繁殖，防止肠道感染和炎症，还能够促进肠道黏膜细胞的增殖和修复，维持肠道屏障功能，预防肠道渗透性增加，有助于缓解便秘，增加排便次数；乳酸乳球菌乳酸亚种是从天然发酵牦牛酸奶中分离出的一株新型乳酸杆菌，属于益生菌，可用于调节肠道功能，改善肠道内环境，调节肠道微生态平衡，促进肠道蠕动功能，缓解便秘。
麦芽糊精具有调节肠道蠕动的作用，可以增加肠管内的粪便体积，促进肠胃蠕动，有效改善肠胃功能，从而促进消化***的功能，减轻便秘的症状；赤藓糖醇是益生菌中的一种成分，能够促进益生菌的生长繁殖，抑制有害菌的生长，调节肠道菌群平衡，同时能够增强肠道蠕动，促进食物消化吸收，改善便秘问题；红茶粉含有丰富的茶碱和咖啡碱等物质，可以刺激肠胃蠕动，缓解便秘症状；同时，红茶粉中的茶多酚还具有抗菌作用，可以抑制肠道有害菌的生长，保护肠道健康。本发明将三种辅料合理组合，协同发挥调节肠道菌群平衡，保护肠道健康，促进肠道蠕动，缓解便秘症状的功效；并且将辅料与益生菌组合物混合使用，助力于活性益生菌在肠道的定植和增殖，长效保护肠道健康，从根本上预防和改善便秘、肠道器质性疾病或炎症，以及胃肠运动功能紊乱。
本发明公开了以下技术效果：
本发明制备的复合益生菌产品能够显著缩短小鼠便秘模型的排便时间，增加粪便重量，降低粪便钙卫蛋白含量，调控MTL、GAS、ET、AChE、SP和VIP水平，且显著提升小肠推进率，实验结果证实，采用本发明益生菌和辅料以特定配比组合的益生菌产品，对便秘具有有效地改善和治疗效果，且有效预防肠道器质性疾病或炎症，以及改善胃肠道运动功能紊乱。可见，本发明为便秘治疗及肠道健康保护提供了新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为各组复合益生菌对小鼠排便时间的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图2为各组复合益生菌对小鼠粪便重量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图3为各组复合益生菌对小鼠粪便钙卫蛋白含量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图4为各组复合益生菌对小鼠血清指标MTL含量的影响的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图5为各组复合益生菌对小鼠血清指标GAS含量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图6为各组复合益生菌对小鼠血清指标ET含量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图7为各组复合益生菌对小鼠血清指标SS含量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图8为各组复合益生菌对小鼠血清指标AChE含量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图9为各组复合益生菌对小鼠血清指标SP含量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图10为各组复合益生菌对小鼠血清指标VIP含量的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)；
图11为各组复合益生菌对小鼠小肠推进率的影响；图中不同小写字母柱形间差异显著(P＜0.05)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明以下实施例采用的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)CP515，于2021年08月24日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23186，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)HFY14，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16647，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2018年10月29日。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)H6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18205，保藏时间为2019年07月10日。
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ441，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014249，保藏日期为2014年6月9日。
麦芽糊精、赤藓糖醇和红茶粉均购自江苏恩鸣生物工程科技有限公司。
实施例1制备益生菌菌剂
1益生菌菌剂的制备
将保存好的卷曲乳杆菌CP515，乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14，植物乳杆菌H6和德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441分别按如下操作培养：
(1)菌种活化：将卷曲乳杆菌CP515，乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14，植物乳杆菌H6和德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441分别以5mL/100mL的接种量接种至MRS液体培养基中，在37℃下，培养18h，得到活化的菌种，连续活化2代。
(2)将活化好的卷曲乳杆菌CP515，乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14，植物乳杆菌H6和德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441培养物按5mL/100mL的接种量接种至MRS培养基中，在37℃下，培养18h，4℃下5000g离心10min取沉淀，用无菌PBS洗涤3次后收集沉淀，预冻2h后，放入冷冻干燥机中干燥48h得到菌粉，冻干菌粉活菌量达1010cfu/g。
(3)将制备好的四种冻干菌粉按1:1质量比两两混合后，再加入10wt％辅料(由麦芽糊精、赤藓糖醇和红茶粉以质量比3:1:1混合组成)，得到如表1所示的，A-F的组合菌剂和G-J的单一菌剂。
表1益生菌菌剂组合
| 组别 | 益生菌菌剂组合 |
| A | 卷曲乳杆菌CP515+乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14+辅料 |
| B | 卷曲乳杆菌CP515+植物乳杆菌H6+辅料 |
| C | 卷曲乳杆菌CP515+德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441+辅料 |
| D | 乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14+植物乳杆菌H6+辅料 |
| E | 乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14+德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441+辅料 |
| F | 植物乳杆菌H6+德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441+辅料 |
| G | 卷曲乳杆菌CP515+辅料 |
| H | 乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14+辅料 |
| I | 植物乳杆菌H6+辅料 |
| J | 德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441+辅料 |
实施例2益生菌菌剂对小鼠便秘模型的改善效果
1分组造模
选取120只6周龄雌性ICR小鼠(18-22g)，购自重庆医科大学实验动物中心。小鼠饲养于温度20～25℃、湿度50～60％的洁净室内。小鼠随机均分为12组，其中一组为对照组，一组为模型组，其余十组为实验组，模型组和实验组小鼠均每天灌胃10mg/kg的盐酸洛哌丁胺，构建小鼠便秘模型，对照组小鼠每天灌胃10mg/kg的生理盐水；自第二周起十组实验组小鼠分别对应灌胃A-J组的益生菌菌剂(灌胃活菌数108cfu/kg体重)，灌胃15d，模型组和对照组灌胃等量的生理盐水，灌胃15d。实验期间观察各组小鼠的毛发、活跃程度、精神状态等变化。
2指标测定
实验组小鼠末次给药后禁食24h，早上7:00模型组和实验组小鼠给予盐酸洛哌丁胺灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃，30min后各组给予墨汁灌胃，其中，模型组、实验组和对照组各5只小鼠开展小肠推进率测定，剩余小鼠开展粪便和血清指标测定。
粪便指标测定：模型组、实验组和对照组小鼠单笼饲养，正常饮食，记录首粒黑便时间。随后每隔30min收集一次粪便，共收集6h。于电子天平上称重，记录粪便重量。
将收集的粪便采用钙卫蛋白检测试剂盒(胶体金法)(贝析尔)进行检测，记录各组小鼠粪便中钙卫蛋白含量。
血清指标测定：收集小鼠血液，在4℃下以4000r/min离心10min，收集血清。按照试剂盒说明(ABCAM，Cambridge，MA，USA)测定血清中胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、内皮素(ET)、生长抑素(SS)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、P物质(SP)和血管活性肠(VIP)的水平。
小肠推进率测定：25min后脱颈椎处死小鼠，取小肠铺于白纸上，用直尺分别测量幽门至墨水前端(L1)以及幽门至盲肠(L2)的距离，计算肠推进率。小肠推进率＝L1/L2×100％。
3实验结果
3.1各组小鼠的毛发、活跃程度和精神状态
对照组和实验组小鼠毛发色泽状态良好，比较活跃，精神状态正常；而模型组小鼠毛发色泽明显暗沉，精神不振，嗜睡。
3.2指标测定结果
3.2.1各组小鼠粪便指标
根据图1和图2实验数据可以看出，模型组小鼠较对照组小鼠的首次排黑便时间显著延长，且粪便重量显著下降，证明模型组小鼠出现便秘现象。而给予小鼠益生菌菌剂后，均能显著缩短排便时间，增加粪便重量。并且采用A-F组的益生菌组合菌剂的小鼠的便秘改善效果明显优于单一菌剂，从数据中还可以得知，在组合菌剂中，A组的卷曲乳杆菌CP515和乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14组合的菌剂改善效果最为明显，在单一菌剂中，H组的乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14效果最突出，但仍低于A组组合菌剂效果，可见，特定的乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14和卷曲乳杆菌CP515复配使用才能充分发挥协同增效作用，高效改善便秘。
为进一步确定辅料药效，特设定一组实验组，依照“1分组造模方法”，选取5只实验小鼠，进行造模后，再灌胃乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14和卷曲乳杆菌CP515冻干菌粉以1：1质量比混合组成的菌剂(省略辅料)。结果显示，灌胃去除辅料的组合菌剂的实验小鼠的排便时间是70.29min，粪便重量为0.71g，与A组菌剂药效仍有明显差距。可见，本实验所使用的辅料能够进一步促进组合菌粉的益生效果，有效缩短便秘小鼠排便时间和提高排便量，进而改善便秘症状。
3.2.2各组小鼠粪便钙卫蛋白检测结果
钙卫蛋白(Calprotetin)是一种来源于中性粒细胞和巨噬细胞的含钙蛋白，其表达具有组织或细胞特异性，可作为急性炎性细胞活化的标志物，是鉴别肠道器质性疾病和功能性疾病的一线指标。
各组小鼠粪便钙卫蛋白检测结果如图3所示，结果显示，模型组小鼠较对照组小鼠的粪便钙卫蛋白含量显著升高，证实小鼠便秘模型可能存在肠道器质性疾病或炎症，导致便秘症状加重。而给予小鼠益生菌菌剂后，在组合菌剂中，A组的卷曲乳杆菌CP515和乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14组合的菌剂表达的钙卫蛋白含量最低，单一菌剂中，H组的乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14表达的钙卫蛋白含量最低，可见，乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14是促使钙卫蛋白含量降低，缓解肠道炎症及便秘的优势菌株。然而，D组乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14和植物乳杆菌H6组合以及乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14和德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441组合表现的钙卫蛋白含量降低程度远远不及A组的卷曲乳杆菌CP515和乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14组合的菌剂，可见，只有特定的乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14和卷曲乳杆菌CP515复配使用才能充分发挥协同增效作用，有效预防肠道炎症，高效改善便秘。
3.2.3各组小鼠血清指标检测结果
血清中胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、内皮素(ET)、生长抑素(SS)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、P物质(SP)和血管活性肠(VIP)的表达水平对机体胃肠运动功能具有重要的调节作用。根据图4-图10实验数据可以看出，对照组正常小鼠的MTL、GAS、ET、AChE、SP和VIP水平在所有组中最高，而SS水平最低。模型组小鼠与对照组小鼠呈现相反趋势，且与对照组小鼠相比，各血清指标均具有显著差异，证实模型组小鼠的正常胃肠运动功能紊乱，致使便秘加重。而组合菌剂A-F组与模型组相比，显著提高MTL、GAS、ET、AChE、SP和VIP水平，降低SS水平，其中A组改善效果尤为显著。说明采用卷曲乳杆菌CP515和乳酸乳球菌乳酸亚种HFY14组合的菌剂能够有效缓解小鼠胃肠运动功能紊乱，改善便秘症状。
3.2.4各组小鼠小肠推进率测定结果
根据图11结果可以得知，模型组较对照组小鼠的小肠推进率显著下降，证实小鼠便秘模型造模成功。与模型组相比，给予益生菌组合菌剂或单一菌剂的各组小鼠的小肠推进率均显著提升，且采用A组组合菌剂对便秘的改善作用最为明显，证实本发明采用特定菌种配合的卷曲乳杆菌CP515和乳酸乳球菌乳酸亚种及辅料协同增效，发挥对便秘显著地改善和治疗效果。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种改善便秘的复合益生菌，其特征在于，由益生菌组合物和辅料组成，其中益生菌组合物由卷曲乳杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种组成；所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.23186，所述乳酸乳球菌乳酸亚种的保藏编号为CGMCC No.16647；
所述卷曲乳杆菌和所述乳酸乳球菌乳酸亚种的质量比为1:1。
2.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述卷曲乳杆菌和所述乳酸乳球菌乳酸亚种的活菌数为1.0×108-1.0×1011 cfu/g。
3.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述辅料包括麦芽糊精、赤藓糖醇和红茶粉。
4.根据权利要求3所述的复合益生菌，其特征在于，所述麦芽糊精、所述赤藓糖醇和所述红茶粉的质量比为（3-5）：（1-2）：（1-2）。
5.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述益生菌组合物和所述辅料的质量比为（10-20）：（1-3）。
6.一种如权利要求1-5任一项所述复合益生菌在制备治疗便秘药品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述复合益生菌通过调控胃动素、胃泌素、内皮素、生长抑素、乙酰胆碱酯酶、P物质和血管活性肠的表达水平，发挥改善和治疗便秘的效果。
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| Inhibitory Effect of Lactococcus lactis subsp. lactis HFY14 on Diphenoxylate-Induced Constipation in Mice by Regulating the VIP-cAMP-PKA-AQP3 Signaling Pathway;Qian Tan 等;Drug Design, Development and Therapy;20211231;第1971-1980页 * |
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