CN117347450A - 一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体pd-l1的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD‑L1的试剂盒及其制备方法,属于外泌体检测技术领域。本发明在电极上修饰识别PD‑L1蛋白的核酸序列,使其具有可以特异性识别靶标的性能,在特异性识别外泌体PD‑L1后,发生DNA滚环复制反应,在柱状的生物同轴材料上自组装形成有序的核酸结构,在电极上原位生成具有独特结构的CBCMs,实现了对信号分子的聚集放大,从而成功构筑识别靶标的同轴双路径化学生物传感检测技术。这种信号放大传感器具有优异的化学生物相容性、同轴空间效应和生物化学稳定性,展现了优良的特异性和高灵敏度,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于外泌体检测技术领域,具体涉及一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒及其制备方法。
背景技术
肿瘤是全球范围内的重大公共卫生问题,危害人类生命健康。近几十年来,肿瘤的发病率和死亡率逐年攀升,对患者和社会都造成了极为严重的负担。外泌体是指由细胞分泌的小囊泡,通过内吞体途径形成,直径约为30-150nm,具有典型的脂质双分子层结构,包含有原始细胞的许多成分组成,除了DNA、RNA、氨基酸以及蛋白质外,还包括一些参与细胞间通讯的胞质和细胞表面信号蛋白等。癌细胞的外泌体与肿瘤的发生、转移、耐药性有关,在外泌体表面表达的一些蛋白质信息与原发肿瘤密切相关,可以在一定层面上反映肿瘤特有的生物学信息,为肿瘤的精准治疗提供有效的信息。癌细胞来源的外泌体,在细胞内运输产生,在细胞膜和血液中释放后广泛分布于机体的体液中,参与细胞之间的通讯、生物体分化发育等相关的生理过程。在体液活检中,相比于循环肿瘤细胞,外泌体在绝对数量上具有一定的优势,外泌体可以提供较多数量的生物信息,检测肿瘤源性的外泌体具有较好的临床应用前景。研究发现,程序性死亡配体-1(PD-L1)在肺癌等癌细胞来源的外泌体上表达,是一种非常重要的免疫检查点分子。肿瘤外泌体PD-L1非常有可能成为免疫治疗预后的监测标志物,目前所面临的挑战是肿瘤来源外泌体PD-L1在人体血液中的浓度含量很低,因此需要开发高灵敏、高稳定性的肿瘤外泌体PD-L1检测方法,并避免假阳性。
近年来,电化学生物传感器由于具有高灵敏、操作便捷、测量范围大、仪器轻型方便使用等优势,在人体血液、细胞等生命相关物质的研究中受到越来越多的关注。纳米材料也可以应用到构建电化学生物传感器中,用于超灵敏测定少量目标分子,不仅能有效提高分析检测的能力,并且还能增强生物传感器的功能和结构稳定性。纳米技术与化学生物传感器的协同组合不仅增大了电化学活性区域,还在工作电极与纳米材料区间内增加了它们的电子转移效率,改进了化学生物传感层的识别性能和传感输出信号的强度。这些显著的特性使电化学生物传感检测具有超高灵敏度和高稳定性。
核酸序列因为具有可编程和特异识别的特性,在设计模块用来构筑各种各样有序结构和装置中的多种尺寸和多域空间结构,具有良好的应用前景,如硅化的折纸DNA,化合物组装框架核酸,多晶格DNA,折纸DNA结构,四面体DNA结构,纳米管DNA等。这些创新结构的核酸纳米技术在检测各种蛋白质、miRNA或DNA等生物标志物方面具有重要科学意义和临床价值。DNA滚环扩增(RCA)技术是在等温条件下对DNA信号的一种放大方法,将实验生成的DNA扩增产物固着到具有固体性质的支持物上,比如纳米材料表面、载玻片、微孔等,RCA结合纳米材料的信号放大技术在保持立体分析功能性的同时,还能提高科学研究和分析的灵敏度和特异性,可用于极低含量生物大分子和生物标记物的检测和分析研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒。该试剂盒具有优异的化学生物相容性、同轴空间效应和生物稳定性、灵敏度高、特异选择性好,普适于多种肿瘤外泌体PD-L1的快速识别检测。
本发明涉及一种基于化学生物同轴材料(Chemical biological coaxialmaterials,CBCMs)化学生物传感检测肿瘤外泌体PD-L1的技术,以肺癌为例,其他癌症的检测,可选取其他癌症标志蛋白进行替换。脱氧核糖核酸(简称DNA)循环放大技术,具体地说是利用核酸序列可以特异性识别靶标的性能,并且在特异性识别外泌体PD-L1后,发生DNA滚环复制放大反应,基于柱状支架的生物同轴材料可有序动态自组装核酸结构,在电极上原位生成具有独特结构的CBCMs,实现了对信号分子的聚集放大。
为实现上述技术目的,本发明所采用的技术方案为:
一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒,试剂盒包括电极、ITO/Pt同轴纳米材料和功能核酸序列。
进一步的,所述功能核酸序列为PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列中的一种。
一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)ITO/Pt同轴纳米材料的制备方法:将3.815g PVP,0.221g SnCl4·5H2O和1.0gIn(NO3)3溶解在18-25g的DMF中,在室温下磁力搅拌18-20小时,变成均匀透明DMF溶胶;将3.815gPVP和0.912g K2PtCl6溶解在18-25g的DMF中,在室温下磁力搅拌18-20小时,得到均匀澄清的DMF溶胶,将两种溶胶分别转移到两支5mL的透明注射器里,在提前安装调试好的静电纺丝机上组合装配不锈钢材质的双驱动直列式的针头,将两支5mL注射器放置到电驱动智能化注射泵中,然后将双驱动直列式针头连接到静电纺丝金属电极上,接收装置由锡纸和接地铁板组成,接地铁板与双驱动直列式针头之间的距离固定调整为180mm,设置静电纺丝的流动速度10μL/min,静电纺丝的电压为17kV(DMF溶胶)。纺丝8-10小时,停止电动智能注射泵,将锡箔与静电纺丝材料一起取出,放入65℃的烘箱干燥16-18小时,取出纺丝物质再转入马弗炉中,以3℃/min速度升温至900℃,将混合物煅烧120分钟后自然冷却至室温取出,经过机械研磨后得到ITO/Pt同轴纳米材料;
(2)链霉生物素SA修饰ITO/Pt同轴纳米材料的组装合成:在1.5mL、2mM巯基乙酸(TA)水溶液中均匀分散步骤(1)所得3mg ITO/Pt同轴纳米材料,得到的混合物溶液需用超声设备处理15-16小时之后再用水反复洗涤,制备获得羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料(ITO/Pt-TA);将羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料与SA按照1:(3-6)的质量比分散在10mMPBS缓冲溶液中,在37℃振荡器内反应2小时,用超纯水反复清洗和离心3次,制备得到ITO/Pt-SA同轴纳米材料;
(3)化学生物传感器的制备:将工作电极用氧化铝粉末抛光3次,水和乙醇全面冲洗3次,使用超声设备处理用以除去过量的氧化铝,在氮气下干燥;将工作电极置于0.01MKCl和0.05M H2SO4的混合溶液中做氧化还原循环操作,激活电极用于后期电极修饰;在室温下,将10μLTCEP和H1序列的混合溶液滴加在工作电极表面17-20小时,TCEP用于激活DNA序列中的巯基,破坏DNA序列中的二硫键,在Au工作电极上形成Au-S键,并将DNA序列探针修饰在Au电极表面,然后用PBST洗涤电极3次,除去非特异性吸附的DNA序列,再将修饰的工作电极浸入1mM MCH中70分钟以封闭表面,然后用PBST冲洗工作电极表面,并在修饰电极表面滴涂10μL、5μM功能核酸序列,在保持37℃下与DNA探针杂交反应200分钟,用PBST再次冲洗修饰电极3次,得到三种核酸序列修饰三个电极,即可作为试剂盒进行后续检测。
进一步的,TCEP和H1序列的混合溶液中,TCEP的浓度为2μM,H1序列的浓度为5mΜ。
检测时,检测的缓冲溶液中加入浓度均为5mΜ的H3H4序列和0.5U·μL-1phi29 DNA聚合酶,在肿瘤外泌体PD-L1靶标存在情况下,置入所得化学生物传感器(即经过修饰的电极,)使溶液中的H3H4序列与修饰电极上的H1序列发生DNA滚环复制反应(RCR)、再次用PBST冲洗修饰电极3次,在37℃下,在检测溶液中加入5mL ITO/Pt-H5同轴纳米材料分散液孵育反应60分钟后得到ITO/Pt-RCR,用PBST冲洗后,在O2饱和的pH=7.5、100mM的PBS缓冲溶液中检测肿瘤外泌体PD-L1的电化学转导信号即可。
ITO/Pt-H5同轴纳米材料分散液的制备方法为:将ITO/Pt-SA同轴纳米材料与H5按照1:(5-10)的质量比分散在10mM PBS缓冲溶液中,固液质量比为1:(10-20),在37℃振荡器内反应2小时,用超纯水反复清洗和离心3次,成功获得H5-同轴纳米材料。
所用核酸序列具体为:
H1:SH-TTT TTT GTT GGA GCT A
H2(PDL1 aptamer included):ACG GGC CAC ATC AAC TCA TTG ATA GAC AAT GCGTCC ACT GCC CGT TAG CTC CAA C
H3:P-TAG GT TGT ATA T AGC TCC AAC AAA ACT TTG CTC GCT ACG TAG TGA GGTG
H4:TAT ACA ACC TA C ACC TCA CTA C-NH2
H5:CG TAG TGA GGT GTA GGT TGT-biotin
H6(CD63 aptamer included):CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TATAGC TCC AAC
H7(EGFR aptamer included):TAC CAG TGC GAT GCT CAG TGC CGT TTC TTC TCTTTC GCT TTT TTT GCT TTT GAG CAT GCT GAC GCA TTC GGT TGA CTA GCT CCA AC
其中H2、H6、H7为功能核酸序列,分别为PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列。
进一步的,工作电极为金电极。
进一步的,步骤(2)中羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料ITO/Pt-TA和SA与PBS缓冲溶液的的固液质量比为1:(10-20)。
进一步的,步骤(2)PBS缓冲溶液内含有10mM EDC。EDC在制备中作为羧基的胺反应交联剂,可促进ITO/Pt同轴纳米材料和SA之间的氨基键形成。
本发明的试剂盒基于一种基于化学生物同轴材料(Chemical biologicalcoaxial materials,CBCMs)化学生物传感检测肿瘤外泌体PD-L1的技术,在电极上修饰PD-L1蛋白的核酸序列,使其具有特异性识别靶标的性能。在特异识别肿瘤来源外泌体PD-L1蛋白后,发生DNA滚环复制反应,基于柱状支架的生物同轴材料可有序动态自组装核酸结构,在电极上原位生成独特结构的化学生物同轴材料CBCMs,实现对信号分子的聚集放大,从而成功构筑可以识别靶标的信号放大器,该信号放大器具有双通路同轴传感效应。以肺癌为例,用识别PD-L1、肺癌标志蛋白EGFR、外泌体标志蛋白CD63的三种核酸序列修饰三个电极芯片,基于CBCMs用于识别传感,若三者同时有信号输出,则进一步说明靶标为肺癌来源的外泌体PD-L1。其他癌症的检测,可选取其他癌症标志蛋白替换肺癌标志蛋白EGFR。
有益效果
1.本发明采用同轴双路径化学生物传感器检测肿瘤外泌体PD-L1,这种信号放大传感器具有优异的化学生物相容性、同轴空间效应和生物稳定性。
2.本发明以特定PD-L1核酸序列和滚环引物为识别探针,可以高特异选择性检测肿瘤外泌体PD-L1。
3.通过同轴导电纳米柱和滚环DNA的化学生物结合材料,在电极上原位生成CBCMs,具有显著的电化学信号放大作用。
4.以肺癌为例,通过依次使用PD-L1、EGFR、CD63的核酸序列,若三者都存在且有信号输出,进一步证明靶标为肺癌来源的外泌体PD-L1,说明该试剂盒具有优异的特异性。其他癌症的检测,可选取其他癌症标志蛋白替换肺癌标志蛋白EGFR,该试剂盒可适用于其他肿瘤外泌体PD-L1的特异性识别。
附图说明
图1为本发明构建的基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的原理图;
图2为本发明所使用的ITO/Pt同轴纳米材料扫描电镜SEM及透射电镜TEM的表征图,平均直径约为180nm:其中(A)为ITO/Pt同轴纳米材料的SEM图像;(B)为ITO/Pt同轴纳米材料的TEM图;(C)为ITO/Pt同轴纳米材料的TEM放大图;
图3,A为琼脂糖凝胶电泳法分析DNA滚环复制反应的RCR产物结果图;B为zeta电位对比分析图,其中,(a)ITO/Pt同轴纳米材料,(b)ITO/Pt-TA,(c)ITO/Pt-SA,(d)ITO/Pt-H5,(e)ITO/Pt-RCR;
图4为实施例1中肿瘤外泌体的透射电镜表征图;
图5为为实施例1中ITO/Pt同轴纳米材料的电化学表征及其检测肺癌外泌体PD-L1的分析性能图:(A)在0.1M KOH的氧饱和度中的CV对比图;(B)ITO/Pt同轴纳米材料在0.1MKOH氧气饱和溶液中的CV曲线;(C)在氧饱和的PBS中记录的阻抗图;(D)对不同浓度(a-h分别为:0,6×102,6×103,6×104,6×105,6×106,6×107,and 6×108particles/mL)的外泌体PD-L1的DPV响应变化图;(E)DPV峰值电流强度对氧饱和PBS中的外泌体PD-L1浓度的相应校准曲线;(F)通过DPV电化学生物传感方法在PBS和人血清中检测外泌体PD-L1的峰电流强度;
图6为检测中,不同聚合酶用量下的电化学信号强度图;
图7为检测中,不同检测温度下的电化学信号强度图;
图8为检测中,不同pH的PBS缓冲溶液下的电化学信号强度图;
图9为检测中,不同反应时间下的电化学信号强度图;
图10为实施例中基于“AND”级联逻辑策略的靶标识别分析:(A)基于三种适配体的细胞识别和分离逻辑装置的一般原理;(B)三种适配体结合靶标激活机制;(C-D)布尔逻辑“和”策略的真值表;只有在EGFR、CD63和PD-L1同时存在时,才能有信号输出。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但不限于此。
实施例1
一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒,试剂盒包括电极、ITO/Pt同轴纳米材料和功能核酸序列。
所述功能核酸序列为PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列中的一种。
一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)ITO/Pt同轴纳米材料的制备方法:将3.815g PVP,0.221g SnCl4·5H2O和1.0gIn(NO3)3溶解在18g的DMF中,在室温下磁力搅拌18小时,变成均匀透明DMF溶胶;将3.815gPVP和0.912g K2PtCl6溶解在18g的DMF中,在室温下磁力搅拌18-20小时,得到均匀澄清的DMF溶胶,将两种溶胶分别转移到两支5mL的透明注射器里,在提前安装调试好的静电纺丝机上组合装配不锈钢材质的双驱动直列式的针头,将两支5mL注射器放置到电驱动智能化注射泵中,然后将双驱动直列式针头连接到静电纺丝金属电极上,接收装置由锡纸和接地铁板组成,接地铁板与双驱动直列式针头之间的距离固定调整为180mm,设置静电纺丝的流动速度10μL/min,静电纺丝的电压为17kV(DMF溶胶)。纺丝8-10小时,停止电动智能注射泵,将锡箔与静电纺丝材料一起取出,放入65℃的烘箱干燥16小时,取出纺丝物质再转入马弗炉中,以3℃/min速度升温至900℃,将混合物煅烧120分钟后自然冷却至室温取出,经过机械研磨后得到ITO/Pt同轴纳米材料;
(2)链霉生物素SA修饰ITO/Pt同轴纳米材料的组装合成:在1.5mL、2mM巯基乙酸(TA)水溶液中均匀分散步骤(1)所得3mg ITO/Pt同轴纳米材料,得到的混合物溶液需用超声设备处理15-16小时之后再用水反复洗涤,制备获得羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料(ITO/Pt-TA);将羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料与SA按照1:3的质量比、1:10的固液比分散在10mMPBS缓冲溶液中,在37℃振荡器内反应2小时,用超纯水反复清洗和离心3次,制备得到ITO/Pt-SA同轴纳米材料;
(3)化学生物传感器的制备:将工作电极用氧化铝粉末抛光3次,水和乙醇全面冲洗3次,使用超声设备处理用以除去过量的氧化铝,在氮气下干燥;将工作电极置于0.01MKCl和0.05M H2SO4的混合溶液中做氧化还原循环操作,激活电极用于后期电极修饰;在室温下,将10μLTCEP和H1序列的混合溶液滴加在工作电极表面17小时,TCEP用于激活DNA序列中的巯基,破坏DNA序列中的二硫键,在Au工作电极上形成Au-S键,并将DNA序列探针修饰在Au电极表面,然后用PBST洗涤电极3次,除去非特异性吸附的DNA序列,再将修饰的工作电极浸入1mM MCH中70分钟以封闭表面,然后用PBST冲洗工作电极表面,并在修饰电极表面滴涂10μL、5μM功能核酸序列,在保持37℃下与DNA探针杂交反应200分钟,用PBST再次冲洗修饰电极3次,得到三种核酸序列修饰三个电极,即可作为试剂盒进行后续检测。
TCEP和H1序列的混合溶液中,TCEP的浓度为2μM,H1序列的浓度为5mΜ。
检测时,检测的缓冲溶液中加入H3H4序列(5mM)和0.5U·μL-1phi29 DNA聚合酶,在肿瘤外泌体PD-L1靶标存在情况下,置入所得化学生物传感器(即经过修饰的电极,)使溶液中的H3H4序列与修饰电极上的H1序列发生DNA滚环复制反应(RCR)、再次用PBST冲洗修饰电极3次,在37℃下,在检测溶液中加入5mL ITO/Pt-H5同轴纳米材料分散液孵育反应60分钟后得到ITO/Pt-RCR,用PBST冲洗后,在O2饱和的pH=7.5、100mM的PBS缓冲溶液中检测肿瘤外泌体PD-L1的电化学转导信号即可。
ITO/Pt-H5同轴纳米材料分散液的制备方法为:将ITO/Pt-SA同轴纳米材料与H5按照1:5的质量比、1:10的固液比分散在10mM PBS缓冲溶液中,在37℃振荡器内反应2小时,用超纯水反复清洗和离心3次,成功获得H5-同轴纳米材料。
所用核酸序列具体为:
H1:SH-TTT TTT GTT GGA GCT A
H2(PDL1 aptamer included):ACG GGC CAC ATC AAC TCA TTG ATA GAC AAT GCGTCC ACT GCC CGT TAG CTC CAA C
H3:P-TAG GT TGT ATA T AGC TCC AAC AAA ACT TTG CTC GCT ACG TAG TGA GGTG
H4:TAT ACA ACC TA C ACC TCA CTA C-NH2
H5:CG TAG TGA GGT GTA GGT TGT-biotin
H6(CD63 aptamer included):CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TATAGC TCC AAC
H7(EGFR aptamer included):TAC CAG TGC GAT GCT CAG TGC CGT TTC TTC TCTTTC GCT TTT TTT GCT TTT GAG CAT GCT GAC GCA TTC GGT TGA CTA GCT CCA AC
其中H2、H6、H7为功能核酸序列,分别为PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列。
工作电极为金电极。
步骤(2)PBS缓冲溶液内含有10mM EDC。EDC在制备中作为羧基的胺反应交联剂,可促进ITO/Pt同轴纳米材料和SA之间的氨基键形成。
实施例2
一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒,试剂盒包括电极、ITO/Pt同轴纳米材料和功能核酸序列。
所述功能核酸序列为PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列中的一种。
一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)ITO/Pt同轴纳米材料的制备方法:将3.815g PVP,0.221g SnCl4·5H2O和1.0gIn(NO3)3溶解在25g的DMF中,在室温下磁力搅拌20小时,变成均匀透明DMF溶胶;将3.815gPVP和0.912g K2PtCl6溶解在25g的DMF中,在室温下磁力搅拌20小时,得到均匀澄清的DMF溶胶,将两种溶胶分别转移到两支5mL的透明注射器里,在提前安装调试好的静电纺丝机上组合装配不锈钢材质的双驱动直列式的针头,将两支5mL注射器放置到电驱动智能化注射泵中,然后将双驱动直列式针头连接到静电纺丝金属电极上,接收装置由锡纸和接地铁板组成,接地铁板与双驱动直列式针头之间的距离固定调整为180mm,设置静电纺丝的流动速度10μL/min,静电纺丝的电压为17kV(DMF溶胶)。纺丝10小时,停止电动智能注射泵,将锡箔与静电纺丝材料一起取出,放入65℃的烘箱干燥18小时,取出纺丝物质再转入马弗炉中,以3℃/min速度升温至900℃,将混合物煅烧120分钟后自然冷却至室温取出,经过机械研磨后得到ITO/Pt同轴纳米材料;
(2)链霉生物素SA修饰ITO/Pt同轴纳米材料的组装合成:在1.5mL、2mM巯基乙酸(TA)水溶液中均匀分散步骤(1)所得3mg ITO/Pt同轴纳米材料,得到的混合物溶液需用超声设备处理15-16小时之后再用水反复洗涤,制备获得羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料(ITO/Pt-TA);将羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料与SA按照1:6的质量比、1:20的固液质量比分散在10mM PBS缓冲溶液中,在37℃振荡器内反应2小时,用超纯水反复清洗和离心3次,制备得到ITO/Pt-SA同轴纳米材料;
(3)化学生物传感器的制备:将工作电极用氧化铝粉末抛光3次,水和乙醇全面冲洗3次,使用超声设备处理用以除去过量的氧化铝,在氮气下干燥;将工作电极置于0.01MKCl和0.05M H2SO4的混合溶液中做氧化还原循环操作,激活电极用于后期电极修饰;在室温下,将10μLTCEP和H1序列的混合溶液滴加在工作电极表面17-20小时,TCEP用于激活DNA序列中的巯基,破坏DNA序列中的二硫键,在Au工作电极上形成Au-S键,并将DNA序列探针修饰在Au电极表面,然后用PBST洗涤电极3次,除去非特异性吸附的DNA序列,再将修饰的工作电极浸入1mM MCH中70分钟以封闭表面,然后用PBST冲洗工作电极表面,并在修饰电极表面滴涂10μL、5μM功能核酸序列,在保持37℃下与DNA探针杂交反应200分钟,用PBST再次冲洗修饰电极3次,得到三种核酸序列修饰三个电极,即可作为试剂盒进行后续检测。
TCEP和H1序列的混合溶液中,TCEP的浓度为2μM,H1序列的浓度为5mΜ。
检测时,检测的缓冲溶液中加入H3H4序列(5mM)和0.5U·μL-1phi29 DNA聚合酶,在肿瘤外泌体PD-L1靶标存在情况下,置入所得化学生物传感器(即经过修饰的电极,)使溶液中的H3H4序列与修饰电极上的H1序列发生DNA滚环复制反应(RCR)、再次用PBST冲洗修饰电极3次,在37℃下,在检测溶液中加入5mL ITO/Pt-H5同轴纳米材料分散液孵育反应60分钟后得到ITO/Pt-RCR,用PBST冲洗后,在O2饱和的pH=7.5、100mM的PBS缓冲溶液中检测肿瘤外泌体PD-L1的电化学转导信号即可。
ITO/Pt-H5同轴纳米材料分散液的制备方法为:将ITO/Pt-SA同轴纳米材料与H5按照1:10的质量比、1:20的固液质量比分散在10mM PBS缓冲溶液中,在37℃振荡器内反应2小时,用超纯水反复清洗和离心3次,成功获得H5-同轴纳米材料。
所用核酸序列具体为:
H1:SH-TTT TTT GTT GGA GCT A
H2(PDL1 aptamer included):ACG GGC CAC ATC AAC TCA TTG ATA GAC AAT GCGTCC ACT GCC CGT TAG CTC CAA C
H3:P-TAG GT TGT ATA T AGC TCC AAC AAA ACT TTG CTC GCT ACG TAG TGA GGTG
H4:TAT ACA ACC TA C ACC TCA CTA C-NH2
H5:CG TAG TGA GGT GTA GGT TGT-biotin
H6(CD63 aptamer included):CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TATAGC TCC AAC
H7(EGFR aptamer included):TAC CAG TGC GAT GCT CAG TGC CGT TTC TTC TCTTTC GCT TTT TTT GCT TTT GAG CAT GCT GAC GCA TTC GGT TGA CTA GCT CCA AC
其中H2、H6、H7为功能核酸序列,分别为PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列。
工作电极为金电极。
步骤(2)PBS缓冲溶液内含有10mM EDC。EDC在制备中作为羧基的胺反应交联剂,可促进ITO/Pt同轴纳米材料和SA之间的氨基键形成。
实施例3
进一步对实施例1所得材料进行辩证和实验结果优化
所用实验材料和仪器如下:
水合氯化锡,聚乙烯吡咯烷酮(PVP,分子量130万),三(2-羧基-乙基)磷(TCEP),6-巯基-1-己醇(MCH)、巯基乙酸(TA)购买于中国上海的阿拉丁生物技术公司。在上海麦克林生化有限公司订购六氯合铂酸钾和醋酸铟(III)。所用的实验试剂都是分析级,密理博超纯水(≥18.25MΩ)在整个实验过程中被使用。DNA序列和PBS购自上海生工生物工程技术有限公司(中国)。
透射电子显微镜(TEM,JEOLJEM-2100)提供TEM图像和能量分散X射线光谱(EDX)光谱数据。Zeta电位由Nano ZS90(Malvern,美国)测量。尼康660E的倒置荧光显微镜用于细胞图像。饱和甘汞电极(上海仪电科学仪器股份公司)作为参比电极测量ITO/Pt同轴纳米材料的电化学表征。铂丝电极(上海仪电科学仪器公司)作为***的辅助电极和ITO/Pt同轴纳米材料改性Au电极作为工作电极。基于ITO/Pt同轴纳米材料的循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)和电化学阻抗谱(EIS)所有测量均在正常室温下在CHI 660E电化学分析仪(上海辰华仪器有限公司)上进行,采用功能核酸序列修饰的金电极为化学生物传感的工作电极。肿瘤外泌体提取使用超高速离心机(Beckman,美国)。
具体操作过程:
1.ITO/Pt同轴纳米材料的电化学表征
依次用0.1cm和0.03cm的氧化铝粉末对实验电极进行快速抛光,接着分别用水和乙醇全面冲洗,然后用超声设备进行处理除去其过量的氧化铝。在氮气环境下进行干燥,使用电化学工作站表征测试制备的化学生物传感材料。将2mg ITO/Pt同轴纳米材料加入2mL乙醇中并超声处理50-60分钟,得到1mg/mL的ITO/Pt同轴纳米材料。在0.1M氢氧化钾溶液(氧气饱和)中以100mV/s的扫描速率在-0.9V-0.2V范围内扫描测试电化学数据,进行CV、DPV等表征。
2.外泌体的提取和鉴定
利用超速离心法提取肿瘤细胞来源的外泌体:1)将肿瘤细胞离心分离收集上清液;2)4℃条件下,2000g离心15分钟除去死细胞,收集上清液;3)10000g离心30分钟除去细胞碎片,收集的上清液用0.22μm无菌滤器过滤,过滤后的上清液移入超高速离心管中;5)4℃条件下,100000g超高速离心80分钟,得到杂蛋白和外泌体沉淀;6)4℃条件下,将沉淀重悬于PBS中,100000g再次离心80分钟,除去杂蛋白。最后将肿瘤外泌体沉淀重悬于PBS中,并保存在-80℃冰箱中。用透射电子显微镜(TEM)对外泌体进行鉴定,TEM观察外泌体形态与数量。用RIPA裂解缓冲液裂解所提取的肿瘤外泌体,Western Blot验证相关蛋白的表达。
实验结果:
以肺癌A549细胞提取的外泌体为例,通过透射电镜对肺癌来源提取的外泌体进行图像表征,实验数据显示肺癌来源的外泌体形态和数量(图4A),对外泌体进行放大成像(图4B),粒径范围在50-150nm。通过Western Blot实验验证了外泌体标志蛋白CD63以及TSG101的表达,同时也验证肿瘤外泌体上PD-L1的表达(图4C)。
使用1.0%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭(EB)染色分析靶标外泌体PD-L1蛋白激活了DNA滚环复制反应(图3A),为RCR-ITO/Pt(CBCMs)的生成提供了有效的技术支持。在图3B中,Zeta电位分别表征了ITO/Pt同轴纳米材料、ITO/Pt-TA、ITO/Pt-SA、ITO/Pt-H5和ITO/Pt-RCR,实验数据显示CBCMs(ITO/Pt-RCR)成功实现了自组装,DNA滚环复制产物作为外轴,ITO/Pt同轴纳米材料作为内轴,形成了双轴的构型材料。
使用1.0%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭(EB)染色分析靶标外泌体PD-L1蛋白激活了DNA滚环复制反应(图3A),为RCR-ITO/Pt(CBCMs)的生成提供了有效的技术支持。在图3B中,Zeta电位分别表征了ITO/Pt同轴纳米材料、ITO/Pt-TA、ITO/Pt-SA、ITO/Pt-H5和ITO/Pt-RCR,实验数据显示CBCMs(ITO/Pt-RCR)成功实现了自组装,DNA滚环复制产物作为外轴,ITO/Pt同轴纳米材料作为内轴,形成了双轴的构型材料。
ITO/Pt同轴纳米材料的催化性能使用电化学循环伏安曲线实验进行表征。在Au电极上修饰Pt纳米颗粒使用循环伏安法测量(图5A,a曲线),在-0.4V出现了明显的氧化还原峰,而在-0.43V处可以清楚地观察到用ITO/Pt同轴纳米材料改性的氧化还原峰(图5A,b曲线),这表明ITO/Pt同轴纳米材料具有较强的氧化还原电催化活性。在0.1M氢氧化钾的氧饱和度条件下,使用100个CV循环(10mV/s)验证ITO/Pt同轴纳米柱的电化学稳定性,实验数据表明:100次循环后电流密度变化很小,几乎不影响ITO/Pt同轴纳米材料的催化活性(图5B,a和b曲线)。对比ITO/Pt同轴纳米材料(图5C,a曲线),化学生物同轴材料CBCMs显示出更大的电化学阻抗(EI)(图5C,b曲线),实验数据证明了RCR核酸外壳已被成功修饰在ITO/Pt同轴纳米材料表面。
聚合酶是影响电化学传感信号放大的重要因素之一,比较Phi 29DNA聚合酶用量在0.2U·μL-1-0.7U·μL-1时的电化学信号,结果显示聚合酶0.5U·μL-1是最佳的剂量(图6)。在不同温度条件下评估化学生物传感器的电化学信号,实验数据显示获取信号的最佳反应温度为37℃(图7),因此选择37℃为反应温度进行后续实验。
为了得到化学生物放大器的最优性能,通过试验对要检测的外泌体PD-L1的酸碱度pH和反应时间进行了对比。图8展示了酸碱度pH对DPV电化学反应信号的影响,ΔI在pH=7.5时获得最佳值,因此后续实验选择pH=7.5的缓冲溶液。同时,反应时间也是影响酶的生物活性和DNA杂交的重要因素之一。实验研究发现:培养时间对放大信号有正相关作用,实验进行过程中,生物放大器的信号快速增加,在实验反应到200分钟之后达到高峰值(图9)。根据这个实验结果,后续的实验中设计反应时间应该选择200分钟。
为了对该生物传感器在检测外泌体PD-L1的有效性进行评估,在对反应条件进行优化之后,对不同浓度肺癌来源外泌体PD-L1检测DPV峰电流的强度变化。构筑的同轴双路径生物传感器能够高选择性、高灵敏的检测肺癌来源外泌体PD-L1蛋白,动态检测范围为6×102–6×107粒/mL(图5D)。线性回归遵循等式I-I0=3.066lgC–4.944(图5E),校准曲线的相关系数R2为0.997(3σ),并且检测极限估算为310粒/毫升。图5F表示人血清中的背景信号通过DPV对外泌体PD-L1的检测信号反应轻微下降,与PBS中不同,这可能是由于人血清中复杂成分的干扰造成的。
需要注意的是,为了进一步确认靶标是肺癌来源的外泌体PD-L1,需额外加入两个探针,分别是肺癌标志蛋白EGFR探针(H6)和外泌体标志蛋白CD63的探针(H7)(图10A-B)。EGFR、CD63和PD-L1是三个独立的可变输入,当它们存在时定义为“1”,当它们不存在时定义为“0”。只有当三者均存在即都为“1”时,才会有输出信号,输出信号为“1”,进而才能进一步确认靶标是肺癌来源的外泌体PD-L1。根据级联反应的逻辑序列,我们得到了如图10C-D所示的真值表。
需要说明的是,上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例,而非全部实施例。显然,基于本发明的上述实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例,都应当属于本发明保护的范围。
Claims (6)
1.一种利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒,其特征在于,试剂盒包括电极、ITO/Pt同轴纳米材料和功能核酸序列。
2.根据权利要求1所述利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒,其特征在于,所述功能核酸序列为PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列中的一种。
3.一种权利要求1或2所述利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)ITO/Pt同轴纳米材料的制备方法:将3.815g PVP,0.221g SnCl4·5H2O和1.0g In(NO3)3溶解在18-25g的DMF中,在室温下磁力搅拌18-20小时,变成均匀透明DMF溶胶;将3.815gPVP和0.912g K2PtCl6溶解在18-25g的DMF中,在室温下磁力搅拌18-20小时,得到均匀澄清的DMF溶胶,将两种溶胶分别转移到两支5mL的注射器里,在提前安装调试好的静电纺丝机上组合装配双驱动直列式的针头,将两支注射器放置到电驱动智能化注射泵中,然后将双驱动直列式针头连接到静电纺丝金属电极上,进行静电纺丝后得到ITO/Pt同轴纳米材料;
(2)链霉生物素SA修饰ITO/Pt同轴纳米材料的组装合成:在1.5mL、2mM巯基乙酸TA水溶液中均匀分散步骤(1)所得3mg ITO/Pt同轴纳米材料,得到的混合物溶液需用超声设备处理15-16小时之后再用水反复洗涤,制备获得羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料ITO/Pt-TA;将羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料ITO/Pt-TA与SA按照1:(3-6)的质量比分散在10mM PBS缓冲溶液中,在37℃振荡器内反应2小时,用超纯水反复清洗和离心3次,制备得到ITO/Pt-SA同轴纳米材料;
(3)化学生物传感器的制备:将工作电极用氧化铝粉末抛光3次,水和乙醇全面冲洗3次,使用超声设备处理用以除去过量的氧化铝,在氮气下干燥;将工作电极置于0.01M KCl和0.05M H2SO4的混合溶液中做氧化还原循环操作,激活电极用于后期电极修饰;在室温下,将10μLTCEP和H1序列的混合溶液滴加在工作电极表面17-20小时,然后用PBST洗涤电极3次,再将修饰的工作电极浸入1mM MCH中70分钟以封闭表面,然后用PBST冲洗工作电极表面,并在修饰电极表面滴涂10μL、5μM功能核酸序列,在保持37℃下与DNA探针杂交反应200分钟,用PBST再次冲洗修饰电极3次,得到三种核酸序列修饰三个电极,即可作为试剂盒进行后续检测。
4.根据权利要求3所述利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒的制备方法,其特征在于,静电纺丝的接收装置由锡纸和接地铁板组成,接地铁板与双驱动直列式针头之间的距离固定调整为180mm;静电纺丝方法为:设置静电纺丝的流动速度10μL/min,静电纺丝的电压为17kV;纺丝时间8-10小时,停止电动智能注射泵,将锡箔与静电纺丝材料一起取出,放入65℃的烘箱干燥16-18小时,取出纺丝物质再转入马弗炉中,以3℃/min速度升温至900℃,将混合物煅烧120分钟后自然冷却至室温,取出,经过机械研磨后得到ITO/Pt同轴纳米材料。
5.根据权利要求3所述利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒的制备方法,其特征在于,步骤(2)中羧基化的ITO/Pt同轴纳米材料ITO/Pt-TA和SA与PBS缓冲溶液的的固液质量比为1:(10-20)。
6.根据权利要求3所述利用基于同轴双路径的电化学传感器检测肿瘤外泌体PD-L1的试剂盒的制备方法,其特征在于,步骤(2)PBS缓冲溶液内含有10mM EDC。
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