CN117343179A - 检测抗bcma car表达水平的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
检测抗bcma car表达水平的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗BCMA抗体的单克隆抗体及其应用。该针对BCMA抗体的单克隆抗体,特异性高,亲和力强。基于本发明开发的BCMA CAR‑T细胞检测试剂,可针对BCMA CAR‑T细胞的胞外抗原结合区,且具备检测灵敏度高、特异性好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及一种检测抗BCMA CAR表达水平的单克隆抗体及其应用。
背景技术
随着肿瘤免疫治疗的发展,结合了抗体和免疫细胞优势的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞免疫治疗受到极大关注。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞是指经基因修饰后,能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原,并且持续活化扩增的T细胞。CAR主要由细胞膜外抗原结合区和细胞内信号转导区通过铰链区及跨膜区构成。膜外抗原结合区具有特异性识别并结合靶细胞表面抗原的功能,其构成源于单克隆抗体的单链可变区结构域(Single Chain Variable Fragment,scFv),由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。细胞内信号转导区主要由共刺激信号和T细胞受体(TCR)的CD3zeta链组成。表达CAR的T(CAR-T)细胞通过scFv与靶细胞抗原结合后,胞内信号转导区将信号传入T细胞,从而激活T细胞,分泌穿孔素、颗粒酶及细胞因子等,发挥杀伤作用。
B细胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen,BCMA)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员,可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。据报道,在正常细胞中,BCMA主要由浆细胞和一部分成熟B细胞表达,而在大部分B细胞以及其它器官上都不表达,所以是CAR-T免疫疗法抗MM比较理想的靶点。目前,百时美施贵宝(BMS)和Bluebird bio公司联合开发Abecma(idecabtagene viclecuel,ide-cel,bb2121)获得FDA的批准,成为首款靶向BCMA的细胞疗法;杨森(Janssen)/传奇生物也已经完成向FDA提交Anti-BCMA CAR-T细胞疗法的生物制品许可申请(BLA)。两款药物均针对BCMA阳性B细胞肿瘤,采用了相同的抗原结合区,即来源于鼠单克隆抗体C11D5.3克隆号的scFv。
构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或非病毒***转染并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达,在细胞膜上形成跨膜的CAR结构时,CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。因此,准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T药物质量控制的关键步骤,也是临床病人治疗剂量控制、过程监控及辅助诊断的重要环节。常见的检测方法有两种类型:检测CAR基因阳性T细胞和检测CAR蛋白阳性T细胞。
定量聚合酶联反应(Quantitative Real Time PCR,qPCR)是检测CAR基因阳性T细胞的主要方法。通过qPCR可以检测细胞基因组上整合的CAR基因,以及CAR基因的拷贝数。但该方法不能准确反映表达CAR的阳性T细胞,因为有一部分整合了CAR基因的T细胞没有正常表达CAR(Jennifer N.Brudno,et al.,Journal of Clinical Oncology,2016),这些T细胞带来的假阳性降低了qPCR方法应用的准确性。更为严重的是,qPCR方法无法分辨CAR阳性T细胞和CAR阳性B细胞,从而难以发现CAR阳性B细胞引发的治疗和复发风险(Marco Ruella,et al.,Nature Medicine,2018)。此外,qPCR方法无法满足对T细胞多种表面标志物(CD3、CD4、CD8等等)同时检测的需求,这进一步限制了qPCR方法的应用。
检测CAR蛋白阳性T细胞的现有检测试剂包括抗鼠IgG(Fab’)2(JacksonImmunoResearch公司)、Protein L(Zhili Zheng,et al.,Journal of TranslationalMedicine,2012)。而抗鼠IgG(Fab’)2和Protein L检测BCMA CAR的灵敏度较低,并且无法区分鼠源不同scFv构建的不同CAR(例如CD19 CAR、CD22 CAR等)。以上试剂因为各自难以克服的原因,导致其应用范围较小。
因此,本领域迫切需要开发检测灵敏度高、准确性高的抗BCMA-CAR阳性细胞检测试剂以及检测方法,以满足抗BCMA CAR-T药物质量控制、临床样本检测的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性结合BCMA CAR的单克隆抗体,及其在检测BCMACAR阳性细胞中的应用。
本发明的第一方面,提供了一种特异性靶向BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段,所述抗体的重链可变区包含以下三个互补决定区CDR:
如SEQ ID NO:4所示的H-CDR1,
如SEQ ID NO:5所示的H-CDR2,和
如SEQ ID NO:6所示的H-CDR3;以及
所述抗体的轻链可变区包含以下三个互补决定区CDR:
如SEQ ID NO:7所示的L-CDR1,
氨基酸序列为SAS的L-CDR2,和
如SEQ ID NO:8所示的L-CDR3。
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中,所述抗体包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区。
在另一优选例中,所述抗体的重链恒定区和轻链恒定区为兔源的。
在另一优选例中,所述抗体包括:单克隆抗体、单链抗体(scFv)、Fab或(Fab')2片段、双链抗体。
在另一优选例中,所述抗体为兔源的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述抗体特异性结合BCMA CAR中的scFv。
在另一优选例中,所述BCMA CAR中的scFv为C11D5.3,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中,所述抗体与BCMA CAR中的scFv的平衡解离常数KD≤1nM,更佳地,KD≤100pM,最佳地,KD≤50pM。
本发明的第二方面,提供了一种重组蛋白,所述重组蛋白包含:
(i)如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段;和
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中,所述的标签序列包括分泌肽标签。
在另一优选例中,所述的标签序列包括6*His标签和/或Fc标签。
在另一优选例中,所述的重组蛋白是特异性抗BCMA scFv的抗体。
本发明的第三方,提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码选自下组的多肽:如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段;或如本发明第二方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中,所述多核苷酸编码所述抗体的重链可变区,其序列如SEQ IDNO:9所示。
在另一优选例中,所述多核苷酸编码所述抗体的轻链可变区,其序列如SEQ IDNO:10所示。
本发明A3抗体的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:9):
CAGTCCCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGAGACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAATAGTTATGTAATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGGGGCTGGAATTTATCGGATGGATTAGTGGTGGTGGTACCTCATACTACGCGGGGTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGACTGGCATATGATGGTGGTGATTATTTAGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明A3抗体的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:10):
GCCCAAGGGCCAACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTGCCAATAACAAAAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGATTATAGTGGTAGCATTATTAGTTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGGAGATCCTA。
本发明的第四方面,提供了一种载体,所述载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等)、转座子或其他载体。
本发明的第五方面,提供了一种遗传工程化的宿主细胞,所述细胞含有如本发明第四方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述细胞包括:原核细胞或真核细胞。
本发明的第六方面,提供了一种免疫偶联物,所述免疫偶联物含有:
(a)如本发明第一方面所述的抗体;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、磁珠、琼脂糖等。
在另一优选例中,所述偶联部分选自:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、金纳米颗粒/纳米棒、任何形式的纳米颗粒,或其它尺寸的任何形式的颗粒(例如磁珠、琼脂糖颗粒)等。
本发明的第七方面,提供了一种制备如本发明第一方面所述的抗体的方法,包括步骤:
(a)提供BCMA CAR scFv重组蛋白;
(b)用所述的重组蛋白免疫兔,取免疫后兔的脾组织,提取其中的RNA并逆转录为cDNA;
(c)扩增步骤(b)获得的cDNA中的抗体可变区序列连接至噬菌体载体上,并将所述载体转入大肠杆菌菌株中从而构建噬菌体抗体库;
(d)从构建的噬菌体抗体库中筛选出BCMA CAR scFv特异性的阳性单克隆;
(e)对所述的阳性单克隆进行测序,获得单克隆抗体的轻/重链基因序列;
(f)应用所述单克隆抗体轻/重链基因序列构建表达质粒,转染真核宿主细胞,从而获得经转染的真核宿主细胞;
(g)在适合表达的条件下,培养所述经转染的真核宿主细胞,从而表达所述单克隆抗体;和
(h)从所述培养体系中分离和/或纯化所述的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的表达包括分泌型表达(即分泌到细胞培养液)。
在另一优选例中,所述的真核宿主细胞选自下组:CHO细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、HEK-293T细胞。
在另一优选例中,所述真核宿主细胞为CHO细胞,具体地为ExpiCHO-S细胞。
在另一优选例中,所述的BCMA CAR scFv重组蛋白为C11D5.3-hFc单链,其中C11D5.3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中,所述方法还包括任选的步骤:
(h)对所述经分离和/或纯化的单克隆抗体进行性能测定。
在另一优选例中,所述的性能测定包括选自下组的一种或多种检测:
(1)特异性检测;
(2)效价检测;
(3)灵敏度检测;
(4)精密度检测;
(5)中和阻断检测;和
(6)结合动力学检测。
本发明的第八方面,提供了一种用于检测BCMA CAR阳性细胞的检测试剂,所述检测试剂包括:
第一检测试剂,所述第一检测试剂是如本发明第一方面所述抗体作为第一抗体。
在另一优选例中,所述检测试剂还包括第二检测试剂,所述第二检测试剂特异性结合于第一抗体或偶联于第一抗体的标记物。
在另一优选例中,所述的第一抗体是偶联荧光或发光标记物的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的第一抗体是未经修饰的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的第二检测试剂是特异性针对所述第一抗体的第二抗体。
在另一优选例中,所述的第一抗体是生物素化的单克隆抗体,而且所述的第二检测试剂是带有可检测标记的链霉抗生物素蛋白。
在另一优选例中,所述第二抗体带有可检测标记,所述的可检测标记包括荧光或发光标记物。
在另一优选例中,所述检测试剂的检测灵敏度≥1个BCMA CAR阳性细胞/1000个细胞,更佳地≥5个BCMA CAR阳性细胞/10000个细胞,更佳地≥1个BCMA CAR阳性细胞/10000个细胞,更佳地≥2个BCMA CAR阳性细胞/100000个细胞。
在另一优选例中,所述的单克隆抗体为兔源单克隆抗体。
在另一优选例中,所述第一抗体和第二抗体来自不同的哺乳动物物种。
在另一优选例中,所述的第一抗体是兔源的,而第二抗体是驴源或羊源的。
在另一优选例中,所述的CAR阳性细胞包括CAR免疫细胞和CAR非免疫细胞。
在另一优选例中,所述的CAR阳性细胞选自下组:T细胞、NK细胞、CIK细胞、NKT细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述的CAR阳性细胞包括:HEK-293T细胞、Jurkat细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述的单克隆抗体特异性识别和结合于基于抗BCMA单克隆抗体C11D5.3的scFv构建的BCMA CAR。
在另一优选例中,所述的BCMA CAR scFv重组蛋白为C11D5.3-hFc单链,其中C11D5.3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第九方面,提供了一种用于检测BCMA CAR阳性细胞的试剂盒,所述试剂盒包含:
(t1)第一容器,所述第一容器内含有如本发明第一方面所述的抗体,并且所述抗体特异性结合于BCMA CAR的胞外的抗原结合域,
以及任选的(t0)说明书。
在另一优选例中,所述抗体为单克隆抗体,所述单克隆抗体带有可检测标记。
在另一优选例中,所述的可检测标记包括荧光或发光标记物。
在另一优选例中,所述的抗体是荧光标记的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述检测试剂盒还含有(t2)第二容器,所述第二容器内含有特异性针对所述单克隆抗体的第二抗体。
在另一优选例中,所述的第二抗体是抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中,所述的第二抗体选自下组:羊抗兔IgG的抗体、驴抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中,所述的第二抗体带有可检测标记。
在另一优选例中,所述的可检测标记包括荧光或发光标记物。
在另一优选例中,所述的第二抗体是荧光标记的二抗。
在另一优选例中,所述第一容器和第二容器可以是一体的,也可以是分开的。
在另一优选例中,所述检测试剂盒还包括含有一种或多种选自下组的额外的检测试剂:
(t3)第三容器,以及位于所述第三容器内的封闭剂;和
(t4)第四容器,以及位于所述第四容器内的阳性对照(如BCMA CAR scFv重组蛋白);和
(t5)第五容器,以及位于所述第五容器内的阴性对照试剂。
在另一优选例中,所述的额外的检测试剂位于相同或不同的容器中。
在另一优选例中,所述的说明书记载了检测BCMA CAR阳性细胞的方法。
本发明的第十方面,提供了一种如本发明第一方面所述的抗体的用途,用于制备检测BCMA CAR阳性细胞的检测试剂或试剂盒。
在另一优选例中,所述的CAR阳性细胞包括CAR免疫细胞和CAR非免疫细胞。
在另一优选例中,所述的CAR阳性细胞选自下组:T细胞、NK细胞、CIK细胞、NKT细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述的CAR阳性细胞包括:HEK-293T细胞、Jurkat细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述的BCMA CAR阳性细胞包含基于抗BCMA单克隆抗体C11D5.3的scFv构建的BCMA CAR。
本发明的第11方面,提供了一种检测BCMA CAR阳性细胞的方法,包括步骤:
(I)提供如本发明第八方面所述的检测试剂;
(II)用所述的检测试剂对待检测的细胞群进行检测,从而获得BCMA CAR阳性细胞的定性或定量检测结果。
在另一优选例中,所述的方法包括步骤:
(1)取1×105-1×106待测细胞,用缓冲液(如FACS)洗涤1-3次,并重悬于50-200μL的缓冲液中;
(2)用50-200μL含第一抗体(本发明第一方面所述的抗体)的缓冲液(如FACS)于2-15℃下孵育10-60分钟,较佳地4±2℃下孵育15-45分钟;
(3)用预冷的缓冲液(如FACS)洗涤细胞1-3次;
(4)用50-200μL含带有可检测标记物(如荧光基团)的第二抗体的缓冲液(如FACS)重悬细胞,2-15℃下孵育10-60分钟,较佳地4±2℃下孵育15-45分钟;
(5)用预冷的缓冲液(如FACS)洗涤细胞1-3次;
(6)用一定量(如100-500μL)缓冲液(如FACS)重悬细胞,并在流式细胞仪上机进行检测。
在另一优选例中,所述的可检测标记包括荧光或发光标记物。
在另一优选例中,所述方法为体外检测方法。
在另一优选例中,所述方法是非诊断性和非治疗性方法。
在另一优选例中,所述方法是质控方法。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了流式检测噬菌体单克隆上清的部分结果。
图2显示了SDS-PAGE检测兔单抗rA3的纯度。
图3显示了ELISA检测rA3抗体结合C11D5.3蛋白的特异性。
图4显示了兔单抗rA3在免疫荧光试验中检测BCMA CAR阳性细胞的结果。
图5显示了兔单抗rA3检测BCMA CAR-Jurkat细胞具有高特异性和高准确性。
图6显示了兔单抗rA3检测BCMA CAR-Jurkat细胞具有高灵敏度。
图7显示了兔单抗rA3检测BCMA CAR-Jurkat细胞具有高准确度。
图8显示了兔单抗rA3检测BCMA CAR-Jurkat细胞具有高精密度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,通过大量的实验筛选,意外地获得了一株能够特异性结合BCMA CAR的单克隆抗体(rA3)。实验结果表明,该针对BCMA CAR的单克隆抗体,特异性高,亲和力强。本发明还提供了一种对CAR阳性细胞(例如CAR-T细胞)的检测灵敏度高、准确性好且特异性好的检测试剂,基于本发明检测试剂的检测方法,不仅可直接针对CAR阳性细胞上的胞外抗原结合区,而且检测灵敏度远高于目前现有的各类检测试剂,此外,本发明的检测试剂对于阳性CAR细胞和阴性CAR细胞的区分度非常高,检测结果更为准确。
在此基础上,完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用,术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体,即该群体中包含的单个抗体是相同的,除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且,与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们可以通过真核细胞重组表达来合成,不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从基本均一的抗体群中获得的,这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段,如单链抗体;Fab或(Fab')2片段;抗体重链;抗体轻链。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用,术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
H-CDR1,其氨基酸序列为GIDLNSYV(SEQ ID NO:4);
H-CDR2,其氨基酸序列为ISGGGTS(SEQ ID NO:5);
H-CDR3,其氨基酸序列为ARLAYDGGDYLDI(SEQ ID NO:6)。
在另一优选例中,所述重链可变区的氨基酸序列为:
QSLEESGGRLVTPGTPLRLTCTVSGIDLNSYVMAWVRQAPGEGLEFIGWISGGGTSYYAGWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARLAYDGGDYLDIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.:2)。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区,所述重链恒定区可以为兔源、鼠源或人源。优选地为兔源。
如本文所用,术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,根据本发明的抗体的轻链可变区,具有选自下组的互补决定区CDR:
L-CDR1,其氨基酸序列为QNVANNKN(SEQ ID NO:7);
L-CDR2,其氨基酸序列为SAS;
L-CDR3,其氨基酸序列为AGDYSGSIIS(SEQ ID NO:8)。
在另一优选例中,所述的轻链可变区的氨基酸序列为:
AQGPTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQNVANNKNLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGDYSGSIISFGGGTELEIL(SEQ ID NO:3)。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区,所述轻链恒定区可以为兔源、鼠源或人源。优选地为兔源。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地,本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
如本文所用,术语“CAR”是指嵌合抗原受体,包括胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
在本发明中,提供了一种特异性结合于BCMA CAR的胞外抗原结合域的兔源单克隆抗体。其中,所述BCMA CAR为基于抗BCMA单克隆抗体C11D5.3的scFv构建的BCMA CAR,所述C11D5.3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
检测试剂和试剂盒
本发明还提供了一种用于检测BCMA CAR阳性细胞的检测试剂,所述检测试剂包括第一检测试剂,所述检测试剂是本发明第一方面的抗体作为第一抗体。所述第一抗体可以是未经修饰的单克隆抗体,也可以是偶联荧光或发光标记物的单克隆抗体。进一步地,所述检测试剂还包括第二检测试剂,所述第二检测试剂特异性结合于第一抗体或偶联于第一抗体的标记物。在另一优选例中,所述第二抗体带有可检测标记,例如荧光或发光标记物。
在本发明的一个优选实施方式中,所述检测试剂包括:第一抗体,所述第一抗体是未经修饰的单克隆抗体;和第二抗体,所述第二抗体带有可检测标记,优选地,所述可检测标记为荧光标记,例如Cy3、Alexa Fluor 647等。
还可以将所述检测试剂制备为用于检测BCMA CAR阳性细胞的试剂盒,所述试剂盒(直标法):
(t1)第一容器,以及位于所述第一容器内的带有可检测标记的单克隆抗体,并且所述单克隆抗体特异性结合于BCMA CAR的胞外的抗原结合域。
(t0)说明书。
在另一优选例中,所述的可检测标记包括荧光或发光标记物。
在另一优选例中,所述的单克隆抗体是荧光标记的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述试剂盒(二抗法)包含:
(t1)第一容器,以及位于所述第一容器内的第一抗体,所述第一抗体为单克隆抗体,并且所述单克隆抗体特异性结合于BCMA CAR的胞外的抗原结合域;和
(t2)第二容器,以及位于所述第二容器的特异性针对所述单克隆抗体的第二抗体;以及
(t0)说明书。
在另一优选例中,所述的第二抗体是抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中,所述的第二抗体选自下组:羊抗兔IgG的抗体、驴抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中,所述的第二抗体带有可检测标记。
在另一优选例中,所述的可检测标记包括荧光或发光标记物。
在另一优选例中,所述的第二抗体是荧光标记的二抗。
在另一优选例中,所述检测试剂盒还包括含有一种或多种选自下组的额外的检测试剂:
(t3)第三容器,以及位于所述第三容器内的封闭剂;和
(t4)第四容器,以及位于所述第四容器内的阳性对照(如BCMA CAR scFv重组蛋白);和
(t5)第五容器,以及位于所述第五容器内的阴性对照试剂。
在另一优选例中,所述的额外的检测试剂位于相同或不同的容器中。
在另一优选例中,所述的说明书记载了检测BCMA CAR阳性细胞的方法。
检测方法
本发明还提供了一种基于本发明第一方面所述的抗体,对CAR阳性细胞进行检测的方法。由于本发明的单抗对于相匹配或相应的CAR的抗原结合区有高亲和力和高特异性,因此本发明的单抗可用于高效、灵敏而准确地检测CAR阳性细胞。
对于可用本发明方法检测的CAR阳性细胞,代表性的例子包括(但并不限于):T细胞、NK细胞、NKT细胞、CIK细胞等多种不同细胞。例如,以本发明针对BCMA scFv的兔单克隆抗体rA3为例,可以用于相应的BCMA CD19 CAR阳性细胞的检测(包括T、NK、NKT或CIK细胞)。
本发明的检测方法,可用于科研、细胞药品研发、细胞药品质量控制,细胞药品临床治疗监测、临床病人辅助诊断等方面。
本发明的主要优点包括:
(a)本发明兔单抗rA3在流式细胞实验中测定BCMA CAR阳性细胞时的检测灵敏度达到1:2048000,因此后续基于本发明单抗开发的BCMA CAR阳性细胞的检测试剂盒,将会具备检测灵敏度高、特异性好等特点。
(b)本发明的检测试剂和方法对于CAR阳性细胞和CAR阴性细胞的区分度非常高,检测结果更为准确性。
(c)本发明兔单抗相比抗人IgG(Fab’)2、Protein L、BCMA/Fc等现有检测试剂,能更加特异、灵敏、准确的检测BCMA CAR阳性细胞,满足CAR-T药物生产质量控制,以及临床治疗监控、辅助诊断的需求。
(d)本发明兔单抗的生产成本显著降低,因此用于CAR-T药物质量控制以及临床治疗监控和辅助诊断更有优势。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
动物免疫及阳性克隆筛选
2019年5月,新基(Celgene)公司和Bluebird bio公司联合开发出针对多发性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法bb2121,其中CAR结构中所使用的scFv序列为C11D5.3。本发明实施例中制备的抗体均靶向该scFv序列。
C11D5.3序列信息为:
DIVLTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLQSRIFPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1)
制备C11D5.3-hFc蛋白,此蛋白为scFv-hFc结构的单链形式,并在第0周、第3周、第5周、第7周免疫兔子。免疫完成后取脾脏组织提取其中的RNA逆转录合成cDNA,扩增其中的抗体可变区序列连接至噬菌体载体pCANTAB-5E上,利用Bio-Rad电转仪将连接有抗体可变区的pCANTAB-5E质粒库转入大肠杆菌TG1菌株中,构建噬菌体抗体库。
在辅助噬菌体M13K07的协助下,从噬菌体抗体库中制备并纯化出衣壳蛋白上共表达相应抗体scFv结构的噬菌体库。并将所得的噬菌体库与10%-30%左右阳性率的BCMACAR-Jurkat细胞共孵育,然后利用流式分选技术从构建的噬菌体抗体库中筛选出BCMACAR-C11D5.3特异性的噬菌体一轮筛选库。然后重复之前的操作依次获得噬菌体二轮筛选库、噬菌体三轮筛选库。最后从二轮或者三轮噬菌体筛选库中挑取单克隆菌落,利用辅助噬菌体M13K07制备对应的单克隆噬菌体,并借助流式分析技术筛选出其中的BCMA CAR-C11D5.3特异性的单克隆噬菌体。
在检测了8*94个噬菌体单克隆后,最终获得A3、B1、E7这三株阳性噬菌体克隆(如图1所示)。
实施例2
单抗序列的测定和分析
为了鉴定阳性单抗噬菌体中的抗体序列,提取出对应甘油菌中的质粒,利用pCANTAB-R1/R2引物进行序列测定,并使用IgBLAST工具确定互补决定区(CDR)的位置。
经测序,得A3克隆中的抗体重链可变区氨基酸序列为:
QSLEESGGRLVTPGTPLRLTCTVSGIDLNSYVMAWVRQAPGEGLEFIGWISGGGTSYYAGWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARLAYDGGDYLDIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)
轻链可变区氨基酸序列为:
AQGPTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQNVANNKNLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGDYSGSIISFGGGTELEIL(SEQ ID NO:3)
下划线处为该抗体的六个CDR区:(GIDLNSYV(SEQ ID NO:4)、ISGGGTS(SEQ ID NO:4)、ARLAYDGGDYLDI(SEQ ID NO:6)、QNVANNKN(SEQ ID NO:7)、SAS、AGDYSGSIIS(SEQ ID NO:8))。
实施例3
单抗制备
分别扩增出上述质粒中的抗体重轻链的可变区,并连接至已含有兔抗重轻链恒定区的pcDNA3.4载体上,构建兔全抗表达质粒并利用ExpiCHO-S(Invitrogen,美国)细胞系表达对应的兔单抗rA3、rB1、rE7。纯化前取小量培养上清检测抗体特异性及表达情况,结果发现E7噬菌体对应的单抗rE7并不是BCMA CAR-C11D5.3特异性的。这可能是由于噬菌体展示技术筛选出的抗体重轻链并非天然配对状态,在改造成IgG形式时会出现抗体不表达或不识别原抗原表位的情况。
然后将所得的rA3、rB1细胞培养上清利用HiTrapTMrProtein A FF亲和层析柱(GEHealthcare,美国)纯化其中的兔抗,结果发现rB1抗体的表达量过低,每25ml的细胞培养上清所得抗体不足500μg,需要进行表达条件的优化后再做后续的功能检测实验。同时,发现每25ml的细胞培养上清rA3抗体的表达量可达到7mg,约为rB1抗体表达量的14倍。
配制SDS-PAGE凝胶,电泳检测纯化所得的rA3兔单抗的纯度。如图2所示,纯化所得的rA3兔单抗的纯度大于95%。
实施例4
酶联免疫吸附试验(ELISA)测定兔单抗的结合特异性
为了测定单抗结合的特异性,在微量ELISA板(Nunc,美国)中包被50ng/孔的C11D5.3-hFc蛋白、对照鼠IgG和对照人IgG,4℃过夜。然后用溶在PBS-Tween20(PBST)中的5%脱脂奶粉进行封闭。用PBST洗涤后,加入100μL/孔的10ng/μL的纯化兔单抗rA3、对照兔IgG,然后37℃温育2小时。洗涤后,加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG(1:10,000稀释;Sigma-Aldrich,美国)并在37℃温育1小时。显色后,用酶标仪监测450nm处的吸光值。
如图3所示,ELISA实验结果显示兔单抗rA3可以结合C11D5.3蛋白,且与对照的人、鼠IgG均不结合。充分说明rA3可以特异性的识别C11D5.3-hFc蛋白,对其他的鼠源或人源IgG无交叉反应。
实施例5
免疫荧光试验(IFA)测定兔单抗与BCMA CAR阳性细胞的结合
将BCMA CAR-Jurkat细胞以1×PBS洗涤,然后在4%多聚甲醛中于室温固定20分钟。用1×PBS洗涤细胞,随后用封闭液(含10%牛血清的PBS)于室温孵育30分钟。用1×PBS洗涤细胞后,加入兔单抗rA3于室温孵育1小时,1×PBS洗涤后用山羊抗兔IgG(H+L)-Cy3二抗孵育30分钟。细胞涂片后用共聚焦显微镜观察拍照。
如图4所示,rA3可清晰染出BCMA CAR阳性T细胞,膜上红色信号代表BCMA CAR在细胞膜上的定位。BCMA CAR阴性的T细胞则无红色荧光信号。蓝色荧光代表细胞核。
实施例6
流式细胞术检测兔单抗的特异性、准确性、灵敏度和精密度
(1)兔单抗rA3与BCMA CAR-Jurkat细胞结合
用BCMA CAR慢病毒、CD19 CAR慢病毒或CD20 CAR慢病毒感染Jurkat细胞,获得相应CAR-Jurkat细胞。其中2C6-Jurkat细胞为CD20 CAR+细胞,DUAL CAR-Jurkat细胞是CD19CAR+CD20 CAR+Jurkat细胞。将rA3以及同型对照(Rabbit IgG)抗体稀释到50μL预冷的FACS缓冲液中。将2×105个细胞悬于50μL的FACS缓冲液中。然后把50μL抗体溶液加入至50μL细胞悬液中,并将混合物在冰上孵育30分钟。然后用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次。加入相应二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L),Alexa Fluor 647),并将混合物在冰上孵育30分钟,之后用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次。以200μL的FACS缓冲液重悬细胞,进行流式细胞仪检测。
如图5所示,rA3特异性识别细胞表面的BCMA CAR结构,而不识别CD19 CAR结构和CD20 CAR结构(图5A),三者的区别仅在于scFv部分。因此rA3特异性识别包含C11D5.3 scFv序列的BCMA CAR阳性细胞。此外,rA3可以清晰区分BCMA CAR阳性和阴性细胞群,两者信号峰不重叠(图5B),检测准确性高。
由于rA3具有高特异性和准确性,且能够明显区分BCMA CAR阳性和阴性细胞群,因此可以方便而准确地统计BCMA CAR阳性细胞,这对于BCMA CAR-T药物生产质量控制,以及临床治疗辅助诊断十分重要。
(2)rA3检测灵敏度分析
取BCMA CAR-Jurkat细胞和Jurkat阴性细胞混合,用FACS缓冲液洗涤并稀释至每个样本约为2×105cells/test。取兔单抗rA3稀释至1mg/ml浓度,而后用FACS缓冲液从1:1000稀释比开始依次做两倍连续稀释。然后用稀释好的抗体重悬细胞,并将混合物在冰上孵育30分钟。然后用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次。加入相应二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L),Alexa Fluor 647),并将混合物在冰上孵育30分钟,之后用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次。以200μL的FACS缓冲液重悬细胞,进行流式细胞仪检测。
如图6所示,兔单抗rA3的稀释比达1:2048000到时,也可以看见明显的阴性阳性细胞分群,可见rA3在流式检测BCMA CAR阳性细胞中具有高灵敏度。因此可以方便而准确地统计低丰度BCMA CAR阳性细胞,这对于检测体内BCMA CAR-T细胞,进行临床治疗监控和辅助诊断十分重要。
(3)rA3检测准确度分析
分别取BCMA CAR-Jurkat细胞和Jurkat细胞,洗涤后,计数,调整细胞密度为1×106细胞/毫升。分别取1×105个细胞CAR-Jurkat细胞和阴性Jurkat细胞混合,配制成阳性率为50%的BCMA CAR-Jurkat样本。以不染色的细胞为阴性对照;使用rA3抗体染色作为待测组。染色后,洗涤两次,然后加入相应二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L),Alexa Fluor647)染色,然后洗涤三次,上机检测。
如图7所示,待测组的阳性结果为49.0%,在45.0%~55.0%之间,可以看出兔单抗rA3在流式检测BCMA CAR-Jurkat细胞时,准确度极高。
(4)rA3检测精密度分析
分别取CAR-Jurkat阳性细胞和Jurkat阴性细胞,洗涤后,计数,调整细胞密度为1.0×106cells/mL。取CAR-Jurkat与Jurkat细胞混合作为检测细胞。精密度检测实验的样本设12个重复。每个样本约为2×105cells/test。取rA3-AF647抗体染色,室温避光孵育30分钟后,洗涤两次后,上机检测。
如图8所示,12个复孔的检测结果相似,可以看出兔单抗rA3在流式检测BCMA CAR-Jurkat细胞时,具有极高的精密度。
实施例7
生物膜干涉测量(BLI)测定兔单抗的结合亲和力
在BLI测定之前,按照制造商的说明,用EZ-Link TM 64 Sulfo-NHS-LC-LC-生物素试剂盒(Thermo Fisher Scientific,美国)标记纯化的C11D5.3-hFc蛋白,然后使用ZebaTM离心脱盐柱(Thermo 66 Fisher Scientific)去除多余的未反应的生物素。
为了测定抗体rA3与C11D5.3-hFc的结合亲和力,根据制造商的说明,在OctetRED96机器(PallFortéBio,美国)上进行BLI测定。简言之,将生物素化的C11D5.3-hFc蛋白固定在链霉亲和素包被的生物传感器(PallFortéBio)上直至饱和。将结合上抗原(C11D5.3-hFc蛋白)的生物传感器置于含有一系列稀释单抗样品的孔中以允许抗原抗体结合,然后浸入解离缓冲液(补充有0.1%牛血清白蛋白和0.02%吐温20的0.01M PBS)来解离。使用Octet数据分析软件(PallFortéBio)计算平衡解离常数(KD)。
结果显示rA3以高亲和力结合C11D5.3-hFc。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种特异性靶向BCMACAR的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体的重链可变区包含以下三个互补决定区CDR:
如SEQ ID NO:4所示的H-CDR1,
如SEQ ID NO:5所示的H-CDR2,和
如SEQ ID NO:6所示的H-CDR3;以及
所述抗体的轻链可变区包含以下三个互补决定区CDR:
如SEQ ID NO:7所示的L-CDR1,
氨基酸序列为SAS的L-CDR2,和
如SEQ ID NO:8所示的L-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
3.在如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体为兔源的单克隆抗体。
5.如权利要求1-4任一项所述的抗体,其特征在于,所述抗体特异性结合BCMA CAR中的scFv,所述BCMACAR中的scFv为C11D5.3,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.一种用于检测BCMACAR阳性细胞的检测试剂,所述检测试剂包括:
第一检测试剂,所述第一检测试剂是如权利要求1所述抗体作为第一抗体。
7.如权利要求6所述的抗体,其特征在于,所述检测试剂还包括第二检测试剂,所述第二检测试剂特异性结合于第一抗体或偶联于第一抗体的标记物。
8.一种用于检测BCMACAR阳性细胞的试剂盒,所述试剂盒包含:
(t 1)第一容器,所述第一容器内含有如权利要求1所述的抗体,并且所述抗体特异性结合于BCMACAR的胞外的抗原结合域,
以及任选的(t0)说明书。
9.一种如权利要求1所述的抗体的用途,用于制备检测BCMACAR阳性细胞的检测试剂或试剂盒。
10.一种检测BCMACAR阳性细胞的方法,包括步骤:
(I)提供如权利要求6所述的检测试剂;
(II)用所述的检测试剂对待检测的细胞群进行检测,从而获得BCMACAR阳性细胞的定性或定量检测结果。
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