CN117327679A - 碱基编辑工具及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括Cas蛋白和脱氨酶，所述融合蛋白中的Cas蛋白为核酸酶活性失活的Cas突变蛋白。本发明通过对Cas蛋白的改进，使其与脱氨酶融合，能够用于靶核酸的单碱基编辑，具有广泛的应用前景。

Description

碱基编辑工具及其应用
本申请要求申请日为2022年11月21日的中国发明专利申请CN202211451897.0的优先权。本申请引用上述中国专利的全文。
技术领域
本发明涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明涉及一种碱基编辑工具，尤其是基于Cas12蛋白的碱基编辑工具。
背景技术
CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
单碱基基因编辑工具的开发，能够在不引起DNA双链断裂的情况下实现对特定基因位点的精确修饰。单碱基基因编辑技术的基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)或腺苷脱氨酶与Cas蛋白融合而形成，依赖于CRISPR原理使得靶点的单个碱基发生修改的基因编辑技术。
单碱基基因编辑***中碱基编辑器主要由两个部分组成：Cas蛋白和DNA修饰酶。迄今为止，已经开发出两类碱基编辑器：基于胞嘧啶脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)，实现C>T(由C到T)的转化；基于腺苷脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，实现A>G(由A到G)的转化。
目前，单碱基基因编辑工具中常用的Cas酶为具有切口酶活性的Cas9nickase(Cas9n)；本发明基于Cas12i蛋白，构建了可以进行碱基编辑的单碱基编辑工具，首次实现了利用Cas12i蛋白进行单碱基编辑，极大扩展了单碱基编辑技术的应用范围。
发明内容
一方面，本发明提供了一种核酸酶活性失活的Cas突变蛋白。
在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第7位氨基酸位点以及第619位氨基酸位点或第844位氨基酸发生突变。
在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第7位氨基酸位点和第619位氨基酸位点发生突变。
在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第7位氨基酸位点和第844位氨基酸位点发生突变。
在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第7位氨基酸位点、第619位氨基酸位点和第844位氨基酸位点发生突变。
在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第233位氨基酸位点、第267位氨基酸位点、第369位氨基酸位点和第433位氨基酸位点处存在突变。
在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第7位氨基酸位点以及第619位氨基酸位点或第844位氨基酸发生突变；进一步的，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第233位氨基酸位点、第267位氨基酸位点、第369位氨基酸位点和第433位氨基酸位点处存在突变。
在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第7位氨基酸位点、第619位氨基酸位点、第233位氨基酸位点、第267位氨基酸位点、第369位氨基酸位点和第433位氨基酸位点处存在突变。
在一个实施方式中，所述第7位氨基酸突变为非S的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
在一个实施方式中，所述第233位氨基酸或第267位氨基酸突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，N，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，所述第233位氨基酸或第267位氨基酸突变为R。
在一个实施方式中，所述第369位氨基酸突变为非N的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
在一个实施方式中，第433位氨基酸突变为非S的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
在一个实施方式中，所述第619位氨基酸突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，N，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，A。
在一个实施方式中，所述第844位氨基酸突变为非E的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，T，M，K，C，P，H，R，I；优选，A。
在一个实施方式中，所述亲本Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述亲本Cas蛋白为天然野生型Cas蛋白；在其他的实施方式中，所述亲本Cas蛋白为经过工程化改造后的Cas蛋白。
来自多种生物体的Cas蛋白或Cas12i蛋白都可以用作亲本Cas蛋白，在一些实施方式中，所述亲本Cas蛋白或Cas12i蛋白具有核酸酶活性。在一些实施方案中，所述亲本Cas蛋白是核酸酶，即切割靶双螺旋核酸(例如，双螺旋DNA)的两条链。在一些实施方案中，所述亲本Cas蛋白是切口酶，即切割靶双螺旋核酸(例如，双螺旋DNA)的单链。
在一个实施方式中，所述亲本Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括Cas蛋白和脱氨酶。
在一个实施方式中，所述融合蛋白中的Cas蛋白为上述核酸酶活性失活的Cas突变蛋白。
在一个实施方式中，所述脱氨酶选自腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶中的任意一种。
本发明中，腺苷脱氨酶，又称之为腺嘌呤脱氨酶，其催化腺嘌呤或腺苷的水解脱氨基作用。本文提供的腺苷脱氨酶(例如，工程化的腺苷脱氨酶、演化的腺苷脱氨酶)可以来自任何生物体，例如细菌。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是天然存在的腺苷脱氨酶，也可以是发生突变但仍具有腺苷脱氨酶活性的变体。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来自原核生物。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来自细菌。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来自大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是TadA脱氨酶。在一些实施方案中，TadA脱氨酶是大肠杆菌TadA脱氨酶，也可以是TadA脱氨酶的变体，例如TadA7-10，例如，TadA9。
在一个实施方式中，所述腺苷脱氨酶的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％、或至少99.9％的序列同一性。
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAH AEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYSTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGS LMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRRVFNAQKKAQSSIN(SEQ IDNo.2)。
在优选的实施方式中，所述腺苷脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明中，胞苷脱氨酶，又称之为胞嘧啶脱氨酶，催化胞苷或脱氧胞苷水解脱氨基化为尿苷或脱氧尿苷。在一些实施方案中，胞苷脱氨酶催化胞嘧啶水解脱氨基化为尿嘧啶。在一些实施方案中，胞苷脱氨酶是来自生物体，如人、黑猩猩、大猩猩、猴、牛、狗、大鼠或小鼠的天然存在的脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶域是来自生物体的天然存在的脱氨酶的变体，但仍保留了胞苷脱氨酶的活性。
在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶包括APOBEC。在一个实施方式中，所述APOBEC选自下组：APOBEC1(A1)、APOBEC2(A2)、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3H、APOBEC4(A4)、活化诱导脱氨酶(activation inducedcytidine deaminase,AID)、或其组合。
在另一优选例中，所述胞苷脱氨酶包括CBE2.0、CBE2.1、CBE2.2、CBE2.3、CBE2.4。
在一个实施方式中，所述胞苷脱氨酶的氨基酸序列与SEQ ID No.3相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％、或至少99.9％的序列同一性。
STDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFSNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWVCKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMFQVKILHTTKSPAV(SEQ IDNo.3)。
在优选的实施方式中，所述胞苷脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
在一个实施方式中，所述融合蛋白中的Cas蛋白融合在脱氨酶的N端；在其他的实施方式中，所述融合蛋白中的Cas蛋白融合在脱氨酶的C端。在一些实施方案中，所述Cas蛋白和脱氨酶通过接头连接。
本发明中，接头可以用于连接本发明的任何肽或蛋白结构域。在某些实施方案中，接头是多肽。在某些实施方案中，接头是共价键(例如，碳-碳键、二硫键、碳-杂原子键等)。在某些实施方案中，接头是酰胺连接的碳-氮键。在某些实施方案中，接头是环状或无环的、取代或未取代的、支链或无支链的脂族或杂脂族接头。在某些实施方案中，接头是聚合的(例如聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯等)。在某些实施方案中，接头包含氨基链烷酸的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头包含氨基链烷酸(例如甘氨酸、乙酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸等)。在某些实施方案中，接头包含氨基己酸(Ahx)的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头基于碳环部分(例如环戊烷，环己烷)。在其他实施方案中，接头包含聚乙二醇部分(PEG)。在其他实施方案中，接头包含氨基酸。在某些实施方案中，接头包含肽。在某些实施方案中，接头包含芳基或杂芳基部分。在某些实施方案中，接头基于苯环。接头可以包含官能化部分以促进来自肽的亲核体(例如硫醇，氨基)与接头的附接。任何亲电体可以用作接头的一部分。
在一个实施方式中，接头为XTEN接头，优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(SEQ ID No.4)。
在一个实施方式中，本发明的融合蛋白还包含核定位序列(NLS)。在一些实施方案中，NLS与融合蛋白的N端融合。在一些实施方案中，NLS与融合蛋白的C端融合。在其他的实施方式中，融合蛋白的N端和C段均连接有NLS。
在一些实施方案中，NLS与Cas蛋白的N端融合。在一些实施方案中，NLS与Cas蛋白的C端融合。在一些实施方案中，NLS与脱氨酶的N端融合。在一些实施方案中，NLS与脱氨酶的C端融合。在一些实施方案中，NLS经由一个或多个接头与融合蛋白融合。在一些实施方案中，NLS与融合蛋白在没有接头的情况下融合。
核定位序列(NLS)是本领域已知的并且对于技术人员是显而易见的，在一些实施方案中，NLS的序列包含氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID No.5)，或者，KRPAATKKAGQAKKKK(SEQID No.12)。
在一个实施方式中，所述融合蛋白中的脱氨酶为胞苷脱氨酶；所述融合蛋白包括Cas蛋白和胞苷脱氨酶，进一步的，所述融合蛋白还包括尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)。
术语“尿嘧啶糖基化酶抑制剂”或“UGI”指能够抑制尿嘧啶-DNA糖基化酶碱基切割修复酶的蛋白质。
在一些实施方案中，UGI与Cas蛋白的N端或C端融合。在一个实施方式中，经由接头融合UGI和Cas蛋白；在其他的实施方式中，UGI和Cas蛋白不经接头融合。所述接头优选为XTEN接头。
在一些实施方案中，UGI与脱氨酶的N端或C端融合。在一个实施方式中，经由接头融合UGI和脱氨酶；在其他的实施方式中，UGI和脱氨酶不经接头融合。所述接头优选为XTEN接头。
在一个实施方式中，所述UGI可以为1个或多个UGI，例如，可以为2个、3个、4个或更多个UGI连接而成。
在一个实施方式中，所述UGI的氨基酸序列与SEQ ID No.6相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％、或至少99.9％的序列同一性。
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(SEQ ID No.6)。
在优选的实施方式中，所述UGI的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在上述Cas突变蛋白或融合蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或***)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从Cas突变蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。
应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和***，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***。
领域技术人员能够理解，本发明Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定本发明Cas突变蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。
本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。
术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如D619A表示第619位的D突变为A。多个氨基酸位点同时存在突变时，可以采用S7R-D619A类似的形式进行表述，例如，S7R-D619A代表第7位S突变为R同时第619位的D突变为A。
本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与目标序列(例如，SEQ ID No.1)进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapidsimilarity searches of nucleic acid and protein databanks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。本领域人员可以用本领域常用的软件，如Clustal Omega,将任一亲本Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1进行序列同一性比较和对齐(alignment),进而得到与本申请中所述基于SEQ ID NO.1所定义的氨基酸位点相对应的所述亲本Cas蛋白中的氨基酸位点。
本发明的融合蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。
本发明还提供了包含上述融合蛋白的碱基编辑工具，例如，单碱基编辑工具。
核酸
另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含：
(a)编码本发明的Cas突变蛋白或融合蛋白的多核苷酸序列；
或者，与(a)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在一个实施方式中，所述的核苷酸序列经密码子优化用于在原核细胞中进行表达。在一个实施方式中，所述的核苷酸序列经密码子优化用于在真核细胞中进行表达。
在一个实施方式中，所述细胞是动物细胞，例如，哺乳动物细胞。
在一个实施方式中，所述细胞是人类细胞。
在一个实施方式中，所述细胞是植物细胞，例如栽培植物(如木薯、玉米、高粱、小麦或水稻)、藻类、树或蔬菜具有的细胞。
在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。
指导RNA(gRNA)
另一方面，本发明提供了一种gRNA，所述gRNA包括第一区段和第二区段；所述第一区段又称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复(DirectRepeat)序列”；所述第二区段又称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”，或者“靶向靶序列的引导序列”。
所述gRNA的第一区段能够与本发明融合蛋白中的Cas蛋白相互作用，从而使Cas蛋白和gRNA形成复合物。
本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列。换言之，本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段经过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可改变，或可被修饰以杂交靶核酸内的任何希望的序列。所述核酸选自DNA或RNA。
靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段与靶核酸的靶序列之间的互补百分比可为至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。
本发明gRNA的“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复序列”可以与CRISPR蛋白(或者，Cas蛋白)相互作用。本发明gRNA经过靶向核酸的靶向序列的作用将其相互作用的Cas蛋白引导至靶核酸内的特异性核苷酸序列。
优选的，所述指导RNA从5’至3’方向包含第一区段和第二区段。
本发明中，所述第二区段还可以理解为与靶序列杂交的引导序列。
本发明的gRNA能够与所述Cas蛋白形成复合物。
载体
本发明还提供了一种载体，其包含如上述的Cas突变蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子或多核苷酸；优选的，其还包括与之可操作连接的调控元件。
在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。
在一个实施方式中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体。
在一些实施方案中，所述***中包括的载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体)，还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
CRISPR***
本发明提供了一种工程化的非天然存在的载体***，或者是CRISPR-Cas***，该***包括上述融合蛋白或编码所述融合蛋白的核酸序列以及编码一种或多种上述指导RNA的核酸。
在一种实施方式中，所述编码所述融合蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸是人工合成的。
在一种实施方式中，所述编码所述融合蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸并不共同天然存在。
该一种或多种指导RNA在细胞中靶向一个或多个靶序列。所述一个或多个靶序列与编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位杂交，并且引导该融合蛋白到达所述一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位部位，融合蛋白到达靶序列位置后对靶序列进行修饰、编辑，由此该一种或多种基因产物的表达被改变或修饰。
本发明的细胞包括动物、植物或微生物中的一种或多种。
在一些实施例中，该融合蛋白是密码子优化的，用于在细胞中进行表达。
本发明还提供了一种工程化的非天然存在的载体***，该载体***可以包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：
a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与gRNA连接，
b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与所述融合蛋白连接；
其中组分(a)和(b)位于该***的相同或不同载体上。
所述第一和第二调控元件包括启动子(例如，组成型启动子或诱导型启动子)、增强子(例如35S promoter或35S enhanced promoter)、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。
在一些实施方案中，所述***中的载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体)，还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施例中，本文提供的***处于递送***中。在一些实施方案中，递送***是纳米颗粒，脂质体，外体，微泡和基因枪。
在一个实施方式中，所述靶序列是来自原核细胞或真核细胞的DNA或RNA序列。在一个实施方式中，所述靶序列是非天然存在的DNA或RNA序列。
在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞内。在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞核内或细胞质(例如，细胞器)内。在一个实施方式中，所述细胞是真核细胞。在其他实施方式中，所述细胞是原核细胞。
蛋白-核酸复合物/组合物
另一方面，本发明提供了一种复合物或者组合物，其包含：
(i)蛋白组分，其选自：上述融合蛋白；和
(ii)核酸组分，其包含(a)能够与靶序列杂交的引导序列；以及(b)能够与本发明融合蛋白中的Cas蛋白结合的同向重复序列。
所述蛋白组分与核酸组分能够相互结合形成复合物。
在一个实施方式中，所述核酸组分是CRISPR-Cas***中的指导RNA。
在一个实施方式中，所述复合物或组合物是非天然存在的或经修饰的。在一个实施方式中，所述复合物或组合物中的至少一个组分是非天然存在的或经修饰的。在一个实施方式中，所述第一组分是非天然存在的或经修饰的；和/或，所述第二组分是非天然存在的或经修饰的。
递送及递送组合物
本发明的融合蛋白、gRNA、核酸分子、载体、***、复合物和组合物，可以通过本领域已知的任何方法进行递送。此类方法包括但不限于，电穿孔、脂转染、核转染、显微注射、声孔效应、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状转染、热激转染、核转染、磁转染、脂转染、穿刺转染、光学转染、试剂增强性核酸摄取、以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒、人工病毒体等的递送。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种递送组合物，其包含递送载体，以及选自下列的一种或任意几种：本发明的融合蛋白、gRNA、核酸分子、载体、***、复合物和组合物。
在一个实施方式中，所述递送载体是粒子。
在一个实施方式中，所述递送载体选自脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒、蛋白颗粒、脂质体、外泌体、微泡、基因枪或病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒)。
宿主细胞
本发明还涉及一种体外的、离体的或体内的细胞或细胞系或它们的子代，所述细胞或细胞系或它们的子代包含：本发明所述的融合蛋白、核酸分子、蛋白-核酸复合物、载体、本发明递送组合物。
在某些实施方案中，所述细胞是原核细胞。
在某些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是人类细胞。某些实施方案中，所述细胞是非人哺乳动物细胞，例如非人灵长类动物、牛、羊、猪、犬、猴、兔、啮齿类(如大鼠或小鼠)的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是非哺乳动物真核细胞，例如家禽鸟类(如鸡)、鱼类或甲壳动物(如蛤蜊、虾)的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是植物细胞，例如单子叶植物或双子叶植物具有的细胞或栽培植物或粮食作物如木薯、玉米、高粱、大豆、小麦、燕麦或水稻具有的细胞，例如藻类、树或生产植物、果实或蔬菜(例如，树类如柑橘树、坚果树；茄属植物、棉花、烟草、番茄、葡萄、咖啡、可可等)。
在某些实施方案中，所述细胞是干细胞或干细胞系。
在某些情况下，本发明的宿主细胞包含基因或基因组的修饰，该修饰是在其野生型中不存在的修饰。
基因编辑方法和应用
本发明的融合蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas***、上述载体***、上述递送组合物或者上述宿主细胞可用于以下任一或任意几个用途：靶向和/或编辑靶核酸；特异性地编辑双链核酸；碱基编辑双链核酸；碱基编辑单链核酸。在其他的实施方式中，还可以用于制备用于上述任一或任意几个用途的试剂或试剂盒。
本发明还提供了一种编辑核酸的方法，该方法包括使核酸(例如双链DNA序列)的靶区域与包含上述融合蛋白和gRNA的复合物接触的步骤；其中，所述靶区域包含靶向的碱基对，将靶区域中所述靶向的碱基对进行碱基替换。在一个实施方式中，所述融合蛋白中的脱氨酶为腺苷脱氨酶，所述靶向的碱基对由A:T替换为G:C；在一个实施方式中，所述融合蛋白中的脱氨酶为胞苷脱氨酶，所述靶向的碱基对由C:G替换为A:T。
上述A:T是指组成碱基对所配对的碱基为A和T；类似的，G:C是指组成碱基对所配对的碱基为G和C，C:G是指组成碱基对所配对的碱基为C和G。
本发明还提供了融合蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas***、上述载体***、上述递送组合物或者上述宿主细胞在基因编辑中的应用；或者，在制备用于基因编辑的试剂或试剂盒中的用途。
在一个实施方式中，所述基因编辑为在细胞内和/或细胞外进行基因编辑。
本发明还提供了一种编辑靶核酸的方法，所述方法包括将靶核酸与上述融合蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas***、上述载体***或上述递送组合物进行接触。在一个实施方式中，所述方法为在细胞内或细胞外编辑靶核酸。
所述基因编辑或编辑靶核酸包括对靶基因的单碱基进行编辑的步骤。
所述编辑可以在原核细胞和/或真核细胞中进行编辑。
另一方面，本发明还提供了一种用于基因编辑的试剂盒，所述试剂盒包括上述融合蛋白、gRNA、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas***、上述载体***、上述递送组合物或上述宿主细胞。
另一方面，发明提供了上述融合蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas***、上述载体***、上述递送组合物或上述宿主细胞在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：
(i)基因或基因组编辑；
(ii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物；
(iii)单碱基编辑；
(iv)疾病的治疗。
优选的，上述基因或基因组编辑为在细胞内或细胞外进行基因或基因组编辑。
优选的，所述疾病的治疗为治疗由靶基因座中的靶序列的缺陷引起的病症。
特异性修饰靶核酸的方法
另一方面，本发明还提供了一种特异性修饰靶核酸的方法，方法包括：使靶核酸与上述融合蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas***、上述载体***或上述递送组合物接触。
该特异性修饰可以发生在体内或者体外。
该特异性修饰可以发生在细胞内或者细胞外。
在一些情况下，细胞选自原核细胞或真核细胞，例如，动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
CRISPR***
如本文中所使用的，术语“规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR-相关(Cas)(CRISPR-Cas)***”或“CRISPR***”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义，其通常包含与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达有关的转录产物或其他元件，或者能够指导所述Cas基因活性的转录产物或其他元件。本发明中的Cas蛋白，即为Crisprassociated protein。
CRISPR/Cas复合物
如本文中所使用的，术语“CRISPR/Cas复合物”是指，指导RNA(guide RNA)或成熟crRNA与Cas蛋白结合所形成的复合体，其包含杂交到靶序列的引导序列上并且与Cas蛋白结合的同向重复序列，该复合体能够识别并切割能与该指导RNA或成熟crRNA杂交的多核苷酸。
指导RNA(guide RNA，gRNA)
如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA，gRNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列组成。
在某些情况下，指导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，指导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。
靶序列
“靶序列”是指被gRNA中的引导序列所靶向的多核苷酸，例如与该引导序列具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交将促进CRISPR/Cas复合物(包括Cas蛋白和gRNA)的形成。完全互补性不是必需的，只要存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR/Cas复合物的形成即可。
靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA。在某些情况下，所述靶序列位于细胞内或细胞外。在某些情况下，所述靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在某些情况下，该靶序列可位于真核细胞的一个细胞器例如线粒体或叶绿体内。可被用于重组到包含该靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一个实施方式中，所述编辑模板为外源核酸。在一个实施方式中，该重组是同源重组。
在本发明中，“靶序列”或“靶多核苷酸”或“靶核酸”可以是对细胞(例如，真核细胞)而言任何内源或外源的多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种存在于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。在某些情况下，该靶序列应该与原间隔序列临近基序(PAM)相关。
野生型
如本文中所使用的，术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，其表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征，其可从自然中的来源分离并且没有被人为有意地修饰。
非天然存在的
如本文中所使用的，术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表示人工的参与。当这些术语用于描述核酸分子或多肽时，其表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。
同一性
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
载体
术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等(例如，CRISPR转录物，如核酸转录物、蛋白质、或酶)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术***另外的DNA片段的环状双链DNA环。
另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。
其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。
宿主细胞
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如微生物细胞、真菌细胞、动物细胞和植物细胞的真核细胞。
本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。
调控元件
如本文中所使用的，术语“调控元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。
启动子
如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
NLS
“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。在一些实施例中，该NLS包含PKKKRKV序列。在一些实施例中，该NLS包含AVKRPAATKKAGQAKKKKLD序列。在一些实施例中，该NLS包含PAAKRVKLD序列。在一些实施例中，该NLS包含MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN序列。在一些实施例中，该NLS包含KLKIKRPVK序列。其他核定位序列包括但不限于hnRNP A1的酸性M9结构域、酵母转录抑制子Matα2中的序列KIPIK和PY-NLS。
可操作地连接
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译***中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
互补性
如本文中所使用的，术语“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克或其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。
严格条件
如本文中所使用的，对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。
杂交
术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如RNA、DNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。
杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多)。
应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100％。
靶序列与gRNA的杂交代表靶序列和gRNA的核酸序列至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的可以杂交，形成复合物；或者代表靶序列和gRNA的核酸序列至少有12个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个碱基可以互补配对，杂交形成复合物。
表达
如本文中所使用的，术语“表达”是指，藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
接头
如本文中所使用的，术语“接头”是指，由多个氨基酸残基通过肽键连接形成的线性多肽。本发明的接头可以为人工合成的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有铰链区功能的多肽。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2:1121-1123)。
治疗
如本文中所使用的，术语“治疗”是指，治疗或治愈病症，延缓病症的症状的发作，和/或延缓病症的发展。
受试者
如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物、植物和微生物。
动物
例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有病症(例如，疾病相关基因缺陷所导致的病症)。
植物
术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。
发明的有益效果
本发明通过对Cas蛋白的改进，使其与脱氨酶融合，能够用于靶核酸的单碱基编辑，具有广泛的应用前景。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
本申请涉及的序列信息如下：
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附图说明
图1.突变Cas蛋白核酸酶活性验证结果。
图2.ABE编辑工具结构示意图。
图3.CBE编辑工具结构示意图。
图4.基于核酸酶活性失活的Cas蛋白单碱基编辑效率结果；其中，BE4max为实施例中的CBE编辑载体，ABE9为实施例中的ABE编辑载体。
图5.优化的核酸酶活性失活的Cas蛋白的单碱基编辑效率；其中S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A-ABE是突变蛋白S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A与腺苷脱氨酶构成的ABE编辑载体。
具体实施方式
以下实施例仅用于描述本发明，而非限定本发明。除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.核酸酶活性失活的Cas蛋白的获得
针对已知的Cas蛋白(CN111757889B中的Cas12f.4，本实施例中，将其称之为Cas12i3)，野生型Cas12i3蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。申请人通过生物信息学预测可能影响其生物学功能的关键氨基酸位点，并将氨基酸位点进行突变，将第619位的D突变为A(D619A)，将第844位的E突变为A(E844A)，获得了Cas12i3的突变蛋白D619A和E844A。关于氨基酸位点的突变可以通过基于PCR的定点诱变产生Cas蛋白的变体，这可以采用本领域通用的定点突变方式。具体的方法是以突变的位点为中心将Cas12i3蛋白(SEQ ID No.1所示序列)的DNA序列设计分成两部分，设计两对引物分别扩增这两部分DNA序列，同时引物上引入需要突变的序列。突变体的组合则通过将DNA拆分成多段，使用PCR、Gibson clone实现构建。片段扩增试剂盒：TransStart FastPfu DNA Polymerase(含2.5mM dNTPs)，具体实验流程详见说明书。胶回收试剂盒：Gel DNA Extraction Mini Kit，具体实验流程详见说明书。载体构建所用试剂盒：pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(CU201-03)，具体实验流程详见说明书。
为了验证上述突变的Cas12i3蛋白D619A和E844A的核酸酶切割活性，采用SEQIDNo.11所示的PCR双链DNA产物，针对PCR双链产物设计gRNA，gRNA靶向序列为(agagaaugugugcauagucacacaugcagaguucacuuuug)。
实验方法：Cas蛋白的终浓度为50nM，gRNA的终浓度为50nM，dsDNA的终浓度300ng，加入T7酶切buffer进行酶切，酶切30min后，点样10ul跑胶进行测试。
结果如图1所示。泳道1为野生型Cas12i3实验组，其对双链DNA产生了明显的切割活性；泳道2为不添加gRNA的Cas12i3对照组，双链DNA没有被切割；泳道3为空白(水)对照组；泳道4为D619A实验组(添加gRNA),双链DNA未发生切割；泳道5为E844A实验组(添加gRNA),双链DNA未发生切割。由图1可以看出，D619A和E844A突变蛋白相对于野生型Cas12i3完全丧失了切割活性(称之为，dCas12i3)，可以作为单碱基编辑使用的Cas蛋白。
实施例2.基于dCas12i3的单碱基编辑体系的建立
利用实施例1中获得的核酸酶活性失活的dCas12i3(D619A或E844A)与脱氨酶(腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶)构建单碱基编辑体系。
在本实施方式中，腺苷脱氨酶采用TadA9(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，胞苷脱氨酶采用BE4max(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)；上述腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶只是示例性的脱氨酶，在其他的实施方式中，也可以采用其他的腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶。
采用腺苷脱氨酶TadA9所构建的ABE编辑元件的示意图如图2所示，采用胞苷脱氨酶采用BE4max所构建的CBE编辑元件的示意图如图3所示；其中，GFP是为了筛选阳性细胞所设计的标签。
如图2-图3所示，脱氨酶(腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶)在dCas12i3(D619A或E844A)的N端，通过XTEN接头连接；脱氨酶和dCas12i3的另一末端还连接有NLS。在胞苷脱氨酶的CBE编辑元件中，dCas12i3的C端还连接有UGI(dCas12i3和UGI通过接头连接)，本实施方式中，采用2个UGI串联。以上只是示例性的脱氨酶和dCas12i3的连接方式，在其他的实施方式中，本领域技术人员可以对上述元件的位置或连接顺序进行调整。
本实施方式中所设计的ABE编辑元件的氨基酸序列和DNA序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；所设计的CBE编辑元件的氨基酸序列和DNA序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。上述序列中的Cas12i3为野生型的序列，在实际使用时，分别替换为D619A或E844A蛋白即可。
在动物细胞中验证上述单碱基编辑体系的活性，针对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)FUT8基因设计两个靶点FUT8-6：TTGAAGCCAAGCTTCTTGGTGGTTTC，FUT8-3：TTCCA GCCAAGGTTGTGGACGGATCA；其中，斜体部分为PAM序列，下划线区域为gRNA的靶向区；gRNA的DR区域(与Cas蛋白结合的区域)为：GUCUAACUGCCAGAGAAUC GUGCCUGCAAUUGGCAC。
在本实施方式中，针对D619A和E844A蛋白的CBE载体的靶点均采用FUT8-6；针对D619A蛋白的ABE载体的靶点为FUT8-6；针对E844A蛋白的ABE载体的靶点为FU T8-3。
采用载体pcDNA3.3，经酶切位点XbaI和PstI***ABE或CBE编辑元件；经酶切位点Mfe1***U6启动子及gRNA序列。启动子EF-1α启动嘌呤霉素抗性基因表达。铺板：CHO细胞融合度至70-80％进行铺板，12孔板中接种细胞数为8*10^4细胞/孔。转染：铺板24h进行转染，100μl opti-MEM中加入6.25μl Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂，混匀；100μl opti-MEM中加入2.5ug质粒，混匀。稀释好的Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂与稀释后的质粒混合均匀，室温孵育20min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。加嘌呤霉素筛选：转染24h加嘌呤霉素，终浓度10μg/ml。嘌呤霉素处理24h更换成正常培养基继续培养24h。转染48h后，用胰蛋白酶-EDTA(0.05％)消化，用流式细胞仪(FACS)分选具有GFP信号的细胞。
提DNA、PCR扩增编辑区附近、送hiTOM测序：细胞经胰酶消化处理后进行收集，经细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(百泰克)进行基因组DNA提取。对基因组DNA扩增靶点附近区域。PCR产物进行hiTOM测序，统计靶点内ABE中A-G的突变及CBE中C-T的突变。结果如图4所示，利用D619A或E844A蛋白分别构建的ABE载体或CB E载体均没有表现出单碱基编辑效率；图4中的BE4max-i3(D619A)为利用D619A蛋白构建的CBE载体，BE4max-i3(E844A)为利用E844A蛋白构建的CBE载体，ABE9-i3(D619A)为利用D619A蛋白构建的ABE载体，ABE9-i3(E844A)为利用E844A蛋白构建的ABE载体；这可能是由于上述两个单位点的突变虽然获得了核酸酶失活的Cas蛋白，但其在与腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶融合时，还不足以使其表现出单碱基编辑活性。
为了获得具有单碱基编辑效率的Cas蛋白，申请人对Cas蛋白做了进一步的优化，具体的，在D619A或E844A蛋白的基础上，将SEQ ID No.1第7位氨基酸突变为R，分别获得了两个氨基酸位点突变的蛋白，S7R-D619A(相对于SEQ ID No.1，第7位氨基酸突变为R、第619位氨基酸突变为A)和S7R-E844A(相对于SEQ ID No.1，第7位氨基酸突变为R、第844位氨基酸突变为A)。
采用上述相同的方式，进一步验证了S7R-D619A或S7R-E844A蛋白在与腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶联合使用时的单碱基编辑效率；结果如图4所示，S7R-D619A或S7R-E844A蛋白不管是在ABE载体还是在CBE载体中都表现出了明显的单碱基编辑活性；图4中的BE4max-i3(S7R-D619A)为利用S7R-D619A蛋白构建的CBE载体，BE4max-i3(S7R-E844A)为利用S7R-E844A蛋白构建的CBE载体，ABE9-i3(S7R-D619A)为利用S7R-D619A蛋白构建的ABE载体，ABE9-i3(S7R-E844A)为利用S7R-E844A蛋白构建的ABE载体。
测序结果显示，S7R-D619A或S7R-E844A的CBE单碱基编辑载体将FUT8-6靶点(AAGCCAAGCTTCTTGGTGGTTTC)中的3’端第9位的C编辑成为T；S7R-D619A的ABE单碱基编辑载体将FUT8-6靶点(AAGCCAAGCTTCTTGGTGGTTTC)中的3’端第1位的A编辑成为G；S7R-E844A的ABE单碱基编辑载体将FUT8-3靶点(CAGCCAAGGTTGTGGACGGATCA)中的3’端第16位的A编辑成为G。
上述结果显示，采用S7R-D619A或S7R-E844A与腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶可以构建碱基编辑工具，用于单碱基编辑。
实施例3.进一步优化的单碱基编辑体系验证
在实施例1中获得D619A蛋白的基础上，将SEQ ID No.1的第7位、第233位、第267位、第369位以及第433位的氨基酸位点均突变为R，获得六个氨基酸突变的蛋白S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A(相对于SEQ ID No.1，第7位氨基酸突变为R、第233位氨基酸突变为R、第267位氨基酸突变为R、第369位氨基酸突变为R、第433位氨基酸突变为R以及第619位氨基酸突变为A)。
采用实施例2中相同的方式构建ABE载体，验证S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A与腺苷脱氨酶联合使用时的单碱基编辑效率，在293T细胞中验证其基因编辑的活性，针对293T细胞中CHK2、KLF4以及PCSK基因设计3个靶点，CHEK2：TGTTTCAACATTGAGAGCTGGGTC；KLF4：GTTTAAACACACCGGGTTAA；PCSK9：CCCAGAGCATCCCGTGGAAC；每个靶点分别进行三次重复取平均值，编辑效率如图5所示，S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A-ABE载体在CHK2靶点的单碱基编辑效率是9.15％，在KLF4靶点的单碱基编辑效率是38.43％，在PCSK9靶点的单碱基编辑效率是8.74％。
由图5可知，S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A与腺苷脱氨酶构成的ABE载体在不同靶点处表现出了优异的单碱基编辑效率，其编辑效率比实施例2中的S7R-D619A或S7R-E844A蛋白在与腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶联合使用时的单碱基编辑效率更高。
采用实施例2中相同的方式，利用S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A蛋白构建CBE载体，在动物细胞CHO细胞中验证S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A与胞嘧啶脱氨酶联合使用时的编辑效率，CBE单碱基编辑载体将FUT8-6靶点(AAGCCAAGCTTCTTGGTGGTTTC)中的3’端第9位的C编辑成为T。
另外，申请人还利用S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A蛋白构建CBE载体，在大豆中针对ALS基因进行了单碱基编辑，获得了ALS基因发生编辑的大豆，所述单碱基编辑的大豆能够表现出对除草剂的抗性。
上述结果显示，采用S7R-D233R-D267R-N369R-S433R-D619A与腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶可以构建碱基编辑工具，用于单碱基编辑，并且，其编辑效率与S7R-D619A或S7R-E844A蛋白在与腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶联合使用时的单碱基编辑效率更高。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (20)

1.一种核酸酶活性失活的Cas突变蛋白，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：
第7位氨基酸位点，以及选自第619位氨基酸位点或第844位氨基酸位点的任意1个或2个氨基酸位点。
2.根据权利要求1所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第233位、第267位、第369位和第433位氨基酸位点处存在突变。
3.根据权利要求1所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述亲本Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白和脱氨酶。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述脱氨酶选自腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶中的任意一种。
6.根据权利要求4或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述Cas突变蛋白和脱氨酶通过接头连接。
7.根据权利要求4或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括核定位序列(NLS)。
8.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述脱氨酶为胞苷脱氨酶，所述融合蛋白还包括尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)。
9.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白，或者，所述多核苷酸编码权利要求4-8任一所述的融合蛋白。
10.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求9所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。
11.一种CRISPR-Cas***，其特征在于，所述***包括权利要求4-8任一所述的融合蛋白以及至少一种gRNA；
所述gRNA能够结合权利要求4-8任一所述的融合蛋白中的Cas突变蛋白。
12.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：
(i)蛋白组分，其选自：权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白或权利要求4-8任一所述的融合蛋白；
(ii)核酸组分，其为gRNA，所述gRNA能够结合权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白。
13.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白，或权利要求4-8任一所述的融合蛋白，或权利要求9所述的多核苷酸，或权利要求10所述的载体，或权利要求11所述的CRISPR-Cas***，或权利要求12所述的组合物。
14.权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白，或权利要求4-8任一所述的融合蛋白，或权利要求9所述的多核苷酸，或权利要求10所述的载体，或权利要求11所述的CRISPR-Cas***，或权利要求12所述的组合物，或权利要求13所述的宿主细胞在基因编辑中的应用；或者，在制备用于基因编辑的试剂或试剂盒中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述基因编辑为对靶基因进行单碱基编辑。
16.一种用于基因编辑的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白，或权利要求4-8任一所述的融合蛋白，或权利要求9所述的多核苷酸，或权利要求10所述的载体，或权利要求11所述的CRISPR-Cas***，或权利要求12所述的组合物，或权利要求13所述的宿主细胞。
17.权利要求1-3任一所述的Cas突变蛋白，或权利要求4-8任一所述的融合蛋白，或权利要求9所述的多核苷酸，或权利要求10所述的载体，或权利要求11所述的CRISPR-Cas***，或权利要求12所述的组合物，或权利要求13所述的宿主细胞在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物，或疾病的治疗。
18.一种编辑核酸的方法，该方法包括使核酸的靶区域与权利要求4-8任一所述的融合蛋白和gRNA接触的步骤，所述gRNA包含能够结合权利要求4-8任一所述的融合蛋白中的Cas突变蛋白的以及能够结合所述核酸的靶区域的区段；其中，所述靶区域包含靶向的碱基对，所述融合蛋白能够将所述靶向的碱基对进行碱基替换。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白中的脱氨酶为腺苷脱氨酶，所述靶向的碱基对由A:T替换为G:C。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白中的脱氨酶为胞苷脱氨酶，所述靶向的碱基对由C:G替换为A:T。
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