CN117327552A - 用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及方法 - Google Patents

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CN117327552A CN202311066388.0A CN202311066388A CN117327552A CN 117327552 A CN117327552 A CN 117327552A CN 202311066388 A CN202311066388 A CN 202311066388A CN 117327552 A CN117327552 A CN 117327552A
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何荣祥
赵兴中
杜欣
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Abstract

一种用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，包括组合式三维纳米界面微流芯片，所述微流芯片由第二基片和具有三维纳米界面的下层底片封合而成；第二基片包括有一条可用于处理母血的微流通道；具有三维纳米界面的下层底片由下法获得：将包括有数条可用于制备三维纳米界面的微流通道的第一基片和下层底片封合，将具有纳米复合材料的溶液通入由第一基片和下层底片封合而成的第一微流芯片的微流通道后在下层底片表面形成三维纳米界面，拆卸所述夹具并分离所述第一基片，得到带有三维纳米界面的下层底片。在三维纳米界面表面化学嫁接特异性识别单元后，本发明能够分选出母血中的胎儿细胞。本发明易于构建、成本低、可重复使用、通用性强。

Description

用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及方法
技术领域
本发明涉及微流芯片领域，尤其涉及一种用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及使用方法。
背景技术
近年来，我国各地出生缺陷发生率约为1-2%，全国每年新增出生缺陷病例超10万例，给社会、家庭及个人都带来了沉重的精神和经济负担。产前诊断能够及时发现胎儿缺陷从而实施治疗或干预，对实现优生优育、维系家庭幸福和推进社会可持续发展具有重大意义。
通过羊水穿刺、绒毛膜穿刺术等有创技术获取胎儿物质开展核型分析、基因组分析等是临床上现行的产前诊断方式。但这些技术存在一定的流产、致畸、感染等风险，且检测窗口期短、灵活性和实时性受到较大限制，因此寻求更加安全和便捷的无创式产前诊断技术已经成为当前临床关注的热点。母血中存在来源于胎儿的DNA片段和细胞，为无创方式实现产前诊断提供了潜在分析靶标。虽然基于胎儿游离DNA的无创产前诊断技术已经逐步应用于染色体非整倍体的检测中，但这些DNA片段只包含部分胎儿基因，并且母血中存在大量母体DNA干扰、难以和胎儿DNA区分，导致该类技术能够诊断的疾病非常有限，同时还存在一定的假阳性率。相对地，胎儿细胞不仅包含胎儿的全部遗传信息，还具有各类细胞器和蛋白质、脂质、糖类等生物分子和代谢物，携带着丰富而完整的胎儿信息。这些胎儿细胞中，有核红细胞和滋养层细胞在妊娠期持续存在于母血中，非妊娠期则迅速消失，胎-胎之间则不存在干扰，同时两者都有较为明确的抗原标志物，能够和其他母体细胞有效区分，因此是实施无创性产前诊断的理想靶细胞。
健康母亲的血液中有核红细胞和滋养层细胞的数量非常稀少（与正常血细胞的数量比为1:109– 1:106），需要进行分选后才能够开展各项生化和医学分析。除传统的密度梯度离心、流式细胞术、磁性分选等方法外，能够精密操控微量液体的微流芯片以及和细胞之间存在特殊相互作用的三维纳米结构能够以更高的效率和纯度获取母血中的胎儿细胞。然而这些芯片以及三维纳米结构一般需要特殊的制作和加工工艺以及专用的化学试剂和材料，复杂程度高，需要配备专门的设备和人员，难以在临床上开展母血中胎儿细胞的分选工作。同时当前使用的芯片和三维纳米结构只能一次性使用，会造成较大的浪费和较高的成本。此外，当前使用的芯片和三维纳米结构一般为不可逆的封闭结构，在其内部分选到的细胞等目标物难以直接进行分析。
发明内容
本发明的目的在于提供用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及方法，以解决现有的用于分选母血中胎儿细胞的微流芯片和三维纳米结构需要特殊的制作和加工工艺以及专用的化学试剂和材料、复杂程度高、同时需要配备专门的设备和人员、难以在临床上开展的问题，当前使用的芯片和三维纳米结构只能一次性使用造成的较大浪费和较高成本的问题，以及当前使用的芯片和三维纳米结构一般为不可逆的封闭结构、在其内部的细胞等目标物难以直接进行分析的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，包括组合式纳米微流芯片，所述组合式纳米微流芯片由用于分选母血中胎儿细胞的第二基片和具有三维纳米界面的下层底片通过夹具的机械作用封合而成；所述第二基片包括有一条可用于处理母血的微流通道；所述具有三维纳米界面的下层底片由下法获得：将包括有数条可用于制备三维纳米界面的微流通道的第一基片和下层底片通过夹具封合，将具有纳米复合材料的溶液通入由第一基片和下层底片封合而成的第一微流芯片的微流通道后在下层底片表面形成。
所述第一基片的材料为高分子聚合物材料（如聚二甲基硅氧烷）；所述第一基片包括1-20条微流通道，每条通道的宽度为200-900μm，长度为10000-15000μm，横截面高度为100-500μm，相邻通道之间的间距为1000-5000μm。
所述第二基片的材料为高分子聚合物材料（如聚二甲基硅氧烷）；所述第二基片包括1条S型微流通道，通道宽度为300-1000μm，横截面高度为100-500μm，S型通道相邻部分的间距为1000-5000μm。
所述第一基片和所述第二基片的大小相同；所述第二基片的微流通道的直线部分的数量和所述第一基片的微流通道数量相同；所述第二基片的微流通道相邻直线部分的间距与所述第一基片相邻微流通道之间的间距相同；所述第二基片的微流通道的每一段直线部分的长度和所述第一基片微流通道长度相同; 所述第二基片的微流通道的每一段直线部分的排列和第一基片的微流通道相同；所述第二基片的微流通道宽度比所述第一基片微流通道宽50-100μm。
所述下层底片材料为玻璃片；所述下层底片的大小和所述第一基片以及所述第二基片的大小相同。
所述第一基片和所述下层底片可以通过夹具的机械作用进行封合；所述第二基片和所述下层底片可以通过夹具的机械作用进行封合。
所述夹具由上夹板和下夹板以及六对螺丝和螺母组成；所述夹具的上夹板设有多个孔，位置分别对应于所述第一基片和所述第二基片中微流通道的液体流入孔和液体流出孔；所述上夹板和下夹板的四角及上下边缘的中间共设有六个固定孔，螺丝穿过固定孔并通过拧紧螺母使得所述上夹板和下夹板相互夹紧，从而固定并封合所述第一基片和所述下层底片或者所述第二基片和所述下层底片；松开所述螺母后可以使得所述上夹板和下夹板相互分开，从而将所述第一基片和所述下层底片分离或者将所述第二基片和所述下层底片分离。
所述纳米复合材料为纳米级羟基磷灰石和壳聚糖的混合物。
所述纳米级羟基磷灰石和壳聚糖的混合物由0.5g羟基磷灰石、0.1g壳聚糖溶于10mL 2%乙酸的去离子水溶液中得到。
所述三维纳米界面是利用夹具的机械作用封合所述第一基片和所述下层底片，通过所述第一基片中微流通道的液体流入孔向微流通道中注入所述纳米复合材料的溶液并加热烘干后在所述下层底片上形成的。
所述母亲血液是指母亲外周血或母亲分娩时采集的脐带血。
所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***的制作方法包括以下步骤：
第一步，利用计算机软件设计好所述第一基片和所述第二基片的结构，利用3D打印机制作所述第一基片和所述第二基片；
第二步，利用计算机软件设计好所述夹具的结构，通过3D打印机制作所述夹具的上夹板和下夹板；
第三步，组合所述第一基片与所述下层底片，利用所述夹具的机械作用力将所述第一基片和所述下层底片进行封合；
第四步，混合纳米级羟基磷灰石和壳聚糖配制所述纳米复合材料溶液；
第五步，将所述纳米复合材料溶液通过所述第一基片的液体流入孔注入微流通道中并加热烘干，拆卸所述夹具并分离所述第一基片和下层底片，得到所述带有三维纳米界面的下层底片；
第六步，组合所述第二基片与所述带有三维纳米界面的下层底片，利用夹具的机械作用力将所述第二基片和所述带有三维纳米界面的下层底片进行封合。
所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***的使用方法，包括以下步骤：
第一步，将牛血清白蛋白溶液通过所述第二基片的液体流入孔注入微流通道中并孵育，之后用去离子水清洗2-3次；
第二步，依次将（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷溶液、4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液、链霉亲和素溶液和生物素化的特异性识别分子溶液通过所述第二基片的液体流入孔注入微流通道中并孵育，之后用磷酸盐缓冲液清洗2-3次；
第三步，获取包含胎儿细胞的溶液，直接通过所述第二基片的液体流入孔注入微流通道中孵育，之后用磷酸盐缓冲液清洗2-3次；
第四步，拆卸所述夹具并分离所述第二基片和下层底片，得到分选有胎儿细胞的下层底片。
所述胎儿细胞为胎儿有核红细胞或胎儿滋养层细胞。
所述特异性识别分子包括特异性抗体和核酸适配体。
所述包含胎儿细胞的溶液包括母亲外周血液、母亲分娩时采集的脐带血以及母亲外周血或母亲分娩时采集的脐带血经过磷酸盐缓冲液稀释后的溶液，或者母亲外周血或母亲分娩时采集的脐带血经过去除红细胞处理后的溶液。
与现有技术相比，本发明提供了用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及方法，具备以下有益效果：
1、本发明采用3D打印方式加工制作所述微流芯片以及所述夹具，制作简单、加工便捷，所述微流芯片通过所述夹具进行机械封合和分离，可以实现微流芯片的组合和拆解，便于对分选的胎儿细胞进行后续生化分析，临床医生可以直接进行相关操作。
2、本发明采用临床上常用的羟基磷灰石和壳聚糖作为三维纳米界面的构成材料，获取容易，成本低廉，并且这两种材料具有很高的生物安全性和生物兼容性，可以保证分选到的胎儿细胞的生物活性，同时这两种材料采用灌注加热方式即可在所述微流芯片中形成三维纳米界面，易于操作。
附图说明
图1为本发明用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及方法的示意图。
图2为本发明所述第一基片和下层底片实物图以及羟基磷灰石-壳聚糖纳米复合材料在下层底片表面形成的三维纳米界面的扫描电镜和原子力显微镜实物图。
图3为本发明用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及方法的实物图。
图4为本发明用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***及方法分选出的胎儿细胞的荧光染色图片。
实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
如图1-图3所示，本发明提供用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，包括用于制备三维纳米界面的第一基片100，用于分选母血中胎儿细胞的第二基片200，用于分别与第一基片、第二基片进行封合与分离的下层底片300，以及用于封合第一基片与下层底片的夹具400。
所述第一基片100包括有9条可用于制备三维纳米界面的微流通道101，所述第二基片包括有1条可用于处理母血的微流通道201；所述三维纳米界面通过将具有纳米复合材料的溶液通入由第一基片100和下层底片300封合而成的第一微流芯片的微流通道后在下层底片表面形成；所述组合式三维纳米界面微流芯片由第二基片200和具有三维纳米界面的下层底片300通过夹具的机械作用封合而成。
所述第一基片100的材料为聚二甲基硅氧烷；所述第一基片包括9条微流通道，每条通道的宽度为900μm，长度为15000μm，横截面高度为150μm，相邻通道之间的间距为5000μm。
所述第二基片200的材料为聚二甲基硅氧烷；所述第二基片200包括1条S型微流通道，通道宽度为1000μm，横截面高度为200μm，S型通道相邻部分的间距为5000μm。
所述第一基片100和所述第二基片200的大小相同；所述第二基片200的微流通道的直线部分的数量和所述第一基片100的微流通道数量相同；所述第二基片200的微流通道相邻直线部分的间距与所述第一基片100相邻微流通道之间的间距相同；所述第二基片200的微流通道的每一段直线部分的长度和所述第一基片100微流通道长度相同; 所述第二基片200的微流通道的每一段直线部分的排列和第一基片100的微流通道相同；所述第二基片200的微流通道宽度比所述第一基片100微流通道宽100μm。
所述下层底片300材料为玻璃片；所述下层底片300的大小和所述第一基片100以及所述第二基片200的大小相同。
所述第一基片100和所述下层底片300可以通过夹具400的机械作用进行封合；所述第二基片200和所述下层底片300可以通过夹具400的机械作用进行封合。
所述夹具400由上夹板401和下夹板402以及6对螺丝403、螺母404组成；所述夹具的上夹板设有多个固定孔405，位置分别对应于所述第一基片100和所述第二基片200中微流通道的液体流入孔102、202和液体流出孔103、203；所述上夹板和下夹板的四角及上下边缘的中间共设有6个固定孔406，螺丝403穿过固定孔并通过拧紧螺母404使得所述上夹板401和下夹板402相互夹紧，从而固定并封合所述第一基片100和所述下层底片300或者所述第二基片200和所述下层底片300；松开所述螺母404后可以使得所述上夹板401和下夹板402相互分开，从而将所述第一基片100和所述下层底片300分离或者将所述第二基片200和所述下层底片300分离。
实施例
本发明还提供用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***的制作方法，包括以下步骤：
第一步，利用计算机软件设计好所述第一基片100和所述第二基片200的结构，利用3D打印机制作所述第一基片100和所述第二基片200；
第二步，利用计算机软件设计好所述夹具的结构400，通过3D打印机制作所述夹具的上夹板401和下夹板402；
第三步，组合所述第一基片100与所述下层底片300，利用所述夹具400的机械作用力将所述第一基片100和所述下层底片300进行封合；
第四步，称取0.5g羟基磷灰石、0.1g壳聚糖溶于10mL 2%（V/V）乙酸的去离子水溶液中，加入磁子常温搅拌过夜，得到羟基磷灰石-壳聚糖溶液；
第五步，将所述纳米复合材料溶液通过所述第一基片100的液体流入孔102注入微流通道101中并加热至80摄氏度烘干30分钟，拆卸所述夹具400并分离所述第一基片100和下层底片300，得到所述带有三维纳米界面的下层底片300；
第六步，组合所述第二基片200与所述带有三维纳米界面的下层底片300，利用夹具400的机械作用力将所述第二基片200和所述带有三维纳米界面的下层底片300进行封合。
实施例
本发明还提供用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***的制作方法，包括以下步骤：
第一步，将3%牛血清白蛋白溶液通过所述第二基片200的液体流入孔202注入微流通道201中并孵育6小时，之后用去离子水清洗3次；
第二步，依次将4%（v/v）的（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷溶液、1mg/mL的4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液、50μg/mL的链霉亲和素溶液和50μg/mL的生物素化的特异性识别分子溶液分别通过所述第二基片200的液体流入孔202注入微流通道201中并各自孵育1小时，之后用磷酸盐缓冲液清洗3次；
第三步，获取包含胎儿细胞的溶液，直接通过所述第二基片200的液体流入孔202注入微流通道201中孵育30分钟，之后用磷酸盐缓冲液清洗3次；
第四步，拆卸所述夹具400并分离所述第二基片200和下层底片300，得到分选有胎儿细胞的下层底片。
所述胎儿细胞为胎儿有核红细胞或胎儿滋养层细胞。
所述特异性识别分子包括特异性抗体和核酸适配体。
所述包含胎儿细胞的溶液包括母亲外周血液、母亲分娩时采集的脐带血以及母亲外周血或母亲分娩时采集的脐带血经过磷酸盐缓冲液稀释后的溶液，或者母亲外周血或母亲分娩时采集的脐带血经过去除红细胞处理后的溶液。
实施例
对按实施例三中分选得到的细胞进行免疫荧光染色分析首先对分选得到的细胞用4%的多聚甲醛溶液进行固定，常温下孵育10分钟，用磷酸盐缓冲液清洗三次；用3%的TritonX-100溶液对细胞进行通透化处理，常温下孵育10分钟，用磷酸盐缓冲液清洗三次；用10%山羊血清对细胞进行封阻处理，常温下孵育30分钟，用磷酸盐缓冲液清洗三次；将10μL的FITC-anti-CD71和5μL的PE-anti--HbF加到100μL的1.5%山羊血清中配成免疫荧光染料对细胞进行染色，避光反应2小时，用磷酸盐缓冲液清洗三次后再加入5μg/mL的细胞核燃料DAPI，常温下避光孵育10分钟，用磷酸盐缓冲液清洗三次。之后用荧光显微镜对细胞进行观察，都能够DAPI细胞核染色的荧光发出/>-HbF和CD71免疫染色的荧光的细胞为胎儿有核红细胞，其它细胞为白细胞干扰，结果如图4所示。。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，其特征在于：包括组合式三维纳米界面微流芯片，所述组合式三维纳米界面微流芯片由用于分选母血中胎儿细胞的第二基片和具有三维纳米界面的下层底片通过夹具的机械作用封合而成；所述第二基片包括有一条可用于处理母血的微流通道；所述具有三维纳米界面的下层底片由下法获得：将包括有数条可用于制备三维纳米界面的微流通道的第一基片和下层底片通过夹具封合，将具有纳米复合材料的溶液通入由第一基片和下层底片封合而成的第一微流芯片的微流通道后在下层底片表面形成三维纳米界面，拆卸所述夹具并分离所述第一基片，得到所述带有三维纳米界面的下层底片。
2.根据权利要求1所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，其特征在于：所述第一基片的材料为高分子聚合物材料；所述第一基片包括1-20条微流通道，每条通道的宽度为200-900μm，长度为10000-15000μm，横截面高度为100-500μm，相邻通道之间的间距为1000-5000μm；所述第二基片的材料为高分子聚合物材料；所述第二基片包括1条S型微流通道，通道宽度为300-1000μm，横截面高度为100-500μm，S型通道相邻部分的间距为1000-5000μm。
3.根据权利要求2所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，其特征在于：所述第一基片和所述第二基片的大小相同；所述第二基片的微流通道的直线部分的数量和所述第一基片的微流通道数量相同；所述第二基片的微流通道相邻直线部分的间距与所述第一基片相邻微流通道之间的间距相同；所述第二基片的微流通道的每一段直线部分的长度和所述第一基片微流通道长度相同; 所述第二基片的微流通道的每一段直线部分的排列和第一基片的微流通道相同；所述第二基片的微流通道宽度比所述第一基片微流通道宽50-100μm。
4.根据权利要求1或2或3所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，其特征在于：所述下层底片材料为玻璃片；所述下层底片的大小和所述第一基片或所述第二基片的大小相同。
5.根据权利要求1或2或3所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，其特征在于：所述夹具由上夹板和下夹板以及六对螺丝和螺母组成；所述夹具的上夹板设有多个孔，位置分别对应于所述第一基片和所述第二基片中微流通道的液体流入孔和液体流出孔；所述上夹板和下夹板的四角及上下边缘的中间共设有六个固定孔，螺丝穿过固定孔并通过拧紧螺母使得所述上夹板和下夹板相互夹紧，从而固定并封合所述第一基片和所述下层底片或者所述第二基片和所述下层底片；松开所述螺母后可以使得所述上夹板和下夹板相互分开，从而将所述第一基片和所述下层底片分离或者将所述第二基片和所述下层底片分离。
6.根据权利要求1或2或3所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，其特征在于：所述纳米复合材料为纳米级羟基磷灰石和壳聚糖的混合物。
7.根据权利要求6所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***，其特征在于：所述纳米级羟基磷灰石和壳聚糖的混合物由0.5g羟基磷灰石、0.1g壳聚糖溶于10mL 2%乙酸的去离子水溶液中得到。
8.权利要求1-7任一项所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，利用计算机软件设计好所述第一基片和所述第二基片的结构，利用3D打印机制作所述第一基片和所述第二基片；
第二步，利用计算机软件设计好所述夹具的结构，通过3D打印机制作所述夹具的上夹板和下夹板；
第三步，组合所述第一基片与所述下层底片，利用所述夹具的机械作用力将所述第一基片和所述下层底片进行封合；
第四步，混合纳米级羟基磷灰石和壳聚糖配制所述纳米复合材料溶液；
第五步，将所述纳米复合材料溶液通过所述第一基片的液体流入孔注入微流通道中并加热烘干，拆卸所述夹具并分离所述第一基片和下层底片，得到所述带有三维纳米界面的下层底片；
第六步，组合所述第二基片与所述带有三维纳米界面的下层底片，利用夹具的机械作用力将所述第二基片和所述带有三维纳米界面的下层底片进行封合。
9.权利要求1-7任一项所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将牛血清白蛋白溶液通过所述第二基片的液体流入孔注入微流通道中并孵育，之后用去离子水清洗2-3次；
第二步，依次将（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷溶液、4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液、链霉亲和素溶液和生物素化的特异性识别分子溶液通过所述第二基片的液体流入孔注入微流通道中并孵育，之后用磷酸盐缓冲液清洗2-3次；
第三步，获取包含胎儿细胞的溶液，直接通过所述第二基片的液体流入孔注入微流通道中孵育，之后用磷酸盐缓冲液清洗2-3次；
第四步，拆卸所述夹具并分离所述第二基片和下层底片，得到分选有胎儿细胞的下层底片。
10.根据权利要求9所述的用于分选母亲血液中胎儿细胞的微流控芯片***的使用方法，其特征在于：所述胎儿细胞为胎儿有核红细胞或胎儿滋养层细胞；所述特异性识别分子包括特异性抗体和核酸适配体；所述包含胎儿细胞的溶液包括母亲外周血液、母亲分娩时采集的脐带血以及母亲外周血或母亲分娩时采集的脐带血经过磷酸盐缓冲液稀释后的溶液，或者母亲外周血或母亲分娩时采集的脐带血经过去除红细胞处理后的溶液。
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